專利名稱：一種檢測低密度脂蛋白膽固醇的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，具體涉及一種檢測低密度脂蛋白膽固醇的方法和試劑
品.O
背景技術：
膽固醇是人體不可缺少的重要物質，它不僅參與形成質膜，而且還是合成膽汁酸， 維生素D以及留體激素的原料。在正常血液中，膽固醇主要與低密度脂蛋白(LDL)結合以脂蛋白形式在血液中運轉，所結合的膽固醇稱為低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，當細胞需要利用膽固醇合成質膜等物質時，細胞制造出LDL受體蛋白，并把它安裝到質膜上。LDL與細胞表面受體結合后與溶酶體融合，將LDL上的膽固醇水解下來，用于質膜等物質合成。隨著生活水平的提高，人們的飲食趨于精致化，常常不自覺地攝取過量的、高于人體細胞需求的膽固醇，這使得LDL在血液中的濃度不斷升高。而高濃度的LDL易被氧化成 ox-LDL，然后被巨噬細胞吞噬，由于LDL上結合有膽固醇，所以會形成泡沫細胞沉積在動脈壁上，造成動脈粥樣硬化，最終引發心腦血管疾病。有研究表明，血液中LDL-C濃度每升高 1 %，患心腦血管疾病的風險增加2-3 %。因此，檢測血液中LDL-C濃度對預防和治療心腦血管疾病具有重要意義。目前，為了適應于全自動生化分析儀的普遍應用，出現了許多檢測LDL-C的方法。 如抑制法，它的反應原理是采用一種表面活性劑，使高密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇和乳糜微粒受到抑制，使其結合的膽固醇不水解，而LDL-C結合的膽固醇水解下來， 接著通過膽固醇氧化酶、過氧化物酶生成醌型有色化合物，然后檢測吸光度計算LDL-C的濃度。還有一種是利用兩種表面活性劑對高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇和乳糜微粒的親和力不同建立的消除法，它的反應原理是多聚陰離子與低密度脂蛋白膽固醇和表面活性劑I結合，在缺乏偶聯劑時不與膽固醇反應，而高密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇和乳糜微粒反應生成過氧化氫被消除，加入表面活性劑II使低密度脂蛋白膽固醇水解出膽固醇，這時整個反應體系中產物為低密度脂蛋白膽固醇，通過膽固醇顯色程度測定低密度脂蛋白膽固醇含量。但是，上述方法中所提及的表面活性劑均未公開，并且同時需要精密的全自動生化儀進行嚴格操作，這就使其在檢測LDL-C 中不能被廣泛應用。為了能夠使檢測方法廣泛應用，特別是能夠在一些基層醫療單位應用，現有技術利用沉淀劑與低密度脂蛋白反應生成懸濁液，然后檢測吸光度，由于反應產生的懸濁液吸光度與低密度脂蛋白膽固醇的濃度呈正比，所以通過比濁法計算就可以得到檢測結果。然而，這種沉淀劑法需要將血樣中干擾檢測的球蛋白、高密度脂蛋白等物質除去，使檢測步驟繁瑣、復雜，不利于快速檢測。同時，沉淀劑法在準確度上略低于抑制法和消除法。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種檢測低密度脂蛋白膽固醇的方法和試劑盒，使得該方法和試劑盒能夠不用除去血樣中干擾物質就能檢測，并且獲得較高準確度。為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案一種檢測低密度脂蛋白膽固醇的方法，將磷鎢酸與瓊脂膠組成pH值為6. 1-6. 2的混合液，待測樣品在鎂離子的作用下與混合液和聚乙二醇20000混合，得到懸濁液，然后在 630nm波長下檢測吸光度，與經上述相同處理的標準溶液比池，計算待測樣品的低密度脂蛋白膽固醇濃度。其中，樣品低密度脂蛋白膽固醇濃度(mmol/L)=標準溶液濃度XA#/Afe，所述待測樣品、混合液和聚乙二醇20000的體積比為1 48 12。本發明所述混合液中瓊脂膠的濃度為0. 2-0. 4g/L，所述混合液中磷鎢酸的濃度為4-5g/L，所述鎂離子濃度為2-4g/L，優選采用氯化鎂溶液，所述聚乙二醇20000濃度為 6-10g/L。現有沉淀劑法是利用低密度脂蛋白(LDL)與多聚陰離子和二價陽離子反應生成沉淀顆粒懸濁液的原理，通過比濁法檢測低密度脂蛋白膽固醇的濃度。但是，由于現有沉淀劑法中采用的沉淀劑是非特異性的，所以血樣中球蛋白、高密度脂蛋白等干擾蛋白同樣能與其反應生成懸濁液，對檢測造成干擾，因而需要提前去除干擾蛋白，這樣就使檢測變得繁瑣復雜。此外，由于干擾蛋白去除的不徹底，使得現有沉淀劑法的檢測結果也出現偏差。本發明針對這一問題，選擇一種新型聯合沉淀劑，即磷鎢酸、氯化鎂和聚乙二醇20000。該聯合沉淀劑具有只與LDL反應的特異性，因而可以不用去除雜蛋白，使檢測簡單、準確。其中，磷鎢酸為多聚陰離子，而氯化鎂中的鎂離子為二價陽離子，聚乙二醇20000具有協同沉淀的作用。同時，本發明在檢測時還加入瓊脂膠，瓊脂膠為溶膠性長鏈大分子物質，能夠促使反應生成的沉淀顆粒均勻分散于溶液中，防止產生大顆粒沉淀，使檢測更加準確。由于低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)是結合在LDL上的，所以LDL反應產生的懸濁液吸光度與LDL-C的濃度呈正比，只要通過與標準溶液比濁即可檢測出LDL-C的濃度。本發明所述標準溶液為低密度脂蛋白膽固醇濃度為2. 6mmol/L的滅活人血清或豬血清。本發明還提供了一種檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒，包括2-4g/L 的氯化鎂、6-10g/L 的聚乙二醇 20000、4_5g/L 的磷鎢酸和 0. 2-0. 4g/L 的瓊脂膠。作為優選，本發明所述試劑盒還包括7_9g/L的氫氧化鈉、0. 5-1. Og/L的疊氮鈉和標準溶液。其中，氫氧化鈉用于調節檢測時試劑的PH值，而疊氮鈉作為防腐劑保證試劑穩定性，所述標準溶液為低密度脂蛋白膽固醇濃度為2. 6mmol/L的滅活人血清或豬血清。本發明所述試劑盒可以配制成雙試劑，也可以配制成單試劑。配制成雙試劑時，由 4-5g/L的磷鎢酸、7-9g/L的氫氧化鈉、0. 2-0. 4g/L的瓊脂膠和0. 5-1. Og/L的疊氮鈉組成試劑1 ；由2-4g/L的氯化鎂、6-10g/L的聚乙二醇20000和0. 5-1. Og/L的疊氮鈉組成試劑2 ； 由低密度脂蛋白膽固醇濃度為2. 6mmol/L的滅活人血清或豬血清組成標準溶液。當配制成單試劑時，由4_5g/L的磷鎢酸、7_9g/L的氫氧化鈉、0. 2-0. 4g/L的瓊脂膠、2-4g/L的氯化鎂、6-10g/L的聚乙二醇20000和0. 5-1. Og/L的疊氮鈉組成單一試劑；由低密度脂蛋白膽固醇濃度為2. 6mmol/L的滅活人血清或豬血清組成標準溶液。本發明所述方法檢測LDL-C濃度具有較高準確度和精密度，試驗結果顯示，本發明所述方法檢測的結果與采用日本和光進口 LDL-C液體雙試劑試劑盒(抑制法)檢測結果無明顯差異。此外，本發明對同一樣品進行重復性檢測，各結果之間的標準差率(變異系數)為1.46%，小于標準的3%。上述試驗結果表明本發明具有很高的準確度和精密度。由以上技術方案可知，本發明所述方法能夠不用去除雜蛋白，特異性的與LDL反應，使LDL-C的檢測簡單、快速、準確，能夠廣泛應用于LDL-C的檢測中。
具體實施例方式本發明公開了一種檢測低密度脂蛋白膽固醇的方法和試劑盒，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明所述方法及試劑盒已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。以下就本發明所提供的一種檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒和方法做進一步說明。實施例1 本發明所述方法將磷鎢酸與瓊脂膠組成混合液(磷鎢酸濃度為4. 4g/L，瓊脂膠濃度為0. 25g/L、 PH 6. 1)，在濃度為3g/L的氯化鎂溶液中，待測樣品與混合液和聚乙二醇20000(8g/L)按體積比，待測樣品混合液聚乙二醇20000 = 1 48 12的比例混合，得到的懸濁液在 630nm波長下檢測吸光度A#，然后與經上述相同處理的標準溶液(低密度脂蛋白膽固醇濃度為2. 6mmol/L的滅活人血清)的Afe比池，計算待測樣品的LDL-C濃度，公式為樣品LDL-C 濃度(mmol/L)=標準溶液濃度(2. 6mmol/L) X A樣/A標。實施例2 本發明所述方法將磷鎢酸與瓊脂膠組成混合液(磷鎢酸濃度為4g/L，瓊脂膠濃度為0. 3g/L、pH 6. 2)，在濃度為2g/L的氯化鎂溶液中，待測樣品與混合液和聚乙二醇20000(6g/L)按體積比，待測樣品混合液聚乙二醇20000 = 1 48 12的比例混合，得到的懸濁液在630nm 波長下檢測吸光度A#，然后與經上述相同處理的標準溶液(低密度脂蛋白膽固醇濃度為 2. 6mmol/L的滅活人血清)的Afe比池，計算待測樣品的LDL-C濃度，公式為樣品LDL-C濃度 (mmol/L)=標準溶液濃度(2. 6mmol/L) XA樣/A標。實施例3 本發明所述方法將磷鎢酸與瓊脂膠組成混合液(磷鎢酸濃度為5g/L，瓊脂膠濃度為0. 4g/L、pH 6. 1)，在濃度為4g/L的氯化鎂溶液中，待測樣品與混合液和聚乙二醇20000 (10g/L)按體積比，待測樣品混合液聚乙二醇20000 = 1 48 12的比例混合，得到的懸濁液在 630nm波長下檢測吸光度A#，然后與經上述相同處理的標準溶液(低密度脂蛋白膽固醇濃度為2. 6mmol/L的滅活人血清)的Afe比池，計算待測樣品的LDL-C濃度，公式為樣品LDL-C 濃度(mmol/L)=標準溶液濃度(2. 6mmol/L) X A樣/A標。實施例4 本發明所述方法的準確度(符合度)分析試驗儀器01ympus400全自動生化分析儀；檢測樣品20名體檢者血樣； 對比方法試劑盒日本和光進口 LDL-C液體雙試劑試劑盒(抑制法)；
01ympus400全自動生化分析儀參數設置見表1。
表1 01ympus400全自動生化分析儀參數
權利要求
1.一種檢測低密度脂蛋白膽固醇的方法，其特征在于，將磷鎢酸與瓊脂膠組成PH值為 6. 1-6. 2的混合液，待測樣品在鎂離子的作用下與混合液和聚乙二醇20000混合，得到懸濁液，然后在630nm波長下檢測吸光度，與經上述相同處理的標準溶液比濁，計算待測樣品的低密度脂蛋白膽固醇濃度。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述待測樣品、混合液和聚乙二醇20000的體積比為1 48 12。
3.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述混合液中瓊脂膠的濃度為0.2-0. 4g/L。
4.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述混合液中磷鎢酸的濃度為4-5g/L。
5.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述鎂離子濃度為2-4g/L。
6.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述聚乙二醇20000濃度為6-10g/L。
7.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述標準溶液為低密度脂蛋白膽固醇濃度為2. 6mmol/L的滅活人血清或豬血清。
8.—種檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒，其特征在于，包括2-4g/L的氯化鎂、6-10g/L的聚乙二醇20000、4-5g/L的磷鎢酸和0. 2-0. 4g/L的瓊脂膠。
9.根據權利要求8所述試劑盒，其特征在于，還包括 7-9g/L的氫氧化鈉、0. 5-1. Og/L的疊氮鈉和標準溶液。
10.根據權利要求9所述試劑盒，其特征在于，所述標準溶液為低密度脂蛋白膽固醇濃度為2. 6mmol/L的滅活人血清或豬血清。
全文摘要
本發明涉及生物化學領域，公開了一種檢測低密度脂蛋白膽固醇的方法和試劑盒。該方法將磷鎢酸與瓊脂膠組成pH值為6.1-6.2的混合液，待測樣品在鎂離子的作用下與混合液和聚乙二醇20000混合，得到懸濁液，然后在630nm波長下檢測吸光度，與經上述相同處理的標準溶液比濁，計算待測樣品的低密度脂蛋白膽固醇濃度。本發明所述試劑盒包括2-4g/L的氯化鎂、6-10g/L的聚乙二醇20000、4-5g/L的磷鎢酸和0.2-0.4g/L的瓊脂膠。本發明所述方法能夠不用去除雜蛋白，特異性的與低密度脂蛋白反應，使低密度脂蛋白膽固醇的檢測簡單、快速、準確，能夠廣泛應用于低密度脂蛋白膽固醇的檢測中。
文檔編號G01N21/31GK102323225SQ20111015341
公開日2012年1月18日 申請日期2011年6月9日 優先權日2011年6月9日
發明者董理 申請人:董理