專利名稱：胱氨酸蛋白酶抑制劑c檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫學免疫學領域，涉及一種免疫檢測試劑，進一步地，本發明涉及一種胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒。
背景技術：
肌酐，到目前為止被廣泛作為腎小球濾過濾(GFR)的標志物，它是一種由肌肉產生的小分子物質，因此肌酐形成和分泌的速率和機體內肌肉含量密切相關。眾所周知，在一個種群中，個體的肌肉含量是相對不同的，老年人比青壯年的肌肉含量要低，許多病人在他們疾病的進程存在肌肉含量的損失，孩子的肌肉含量也與成人不同，男人的肌肉平均含量要比女人高。當血清肌酐濃度作為腎小球濾過率標志物時，檢測到的血清肌酐值要比實際低50%。而且飲食能夠顯著影響血清肌酐水平，特別是富含蛋白質的飲食。因此，血清肌酐濃度作為腎小球濾過率標志物時，受影響的因素很多，不易檢測準確。目前，檢測肌酐的方法中，有“金標法”和“靜脈內注射放射性物質的方法”兩種，但是“金標法” 一般存在檢測的可靠性差的不足；而采用在靜脈內注射放射性物質的方法目前雖然受到普遍歡迎，但是，該方法昂貴、耗時，并且必須要進行注射、給患者帶來痛苦。有文獻報道，胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cyS-c，分子量為13kD)，能夠濾過正常的腎小球，是一種反映腎小球濾過率變化的理想的內源性標志物，采用簡單的透射比濁法檢測血清中胱氨酸蛋白酶抑制劑C含量可以代替目前復雜的腎小球濾過率測定方法。應用最多的就是膠乳增強免疫透射比濁法，其基本原理是將抗體包被在膠乳顆粒上，與相應抗原發生免疫反應后，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物所產生的濁度，即可測出標本中被檢物的含量。而胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體包被到膠乳上，一般可以采用物理吸附法和化學偶聯法，采用物理吸附法得到的致敏膠乳顆粒穩定性較化學偶聯法要差，抗體容易從膠乳顆粒上脫落下來；而且用物理吸附法得到的膠乳，有可能受到類風濕性因子(RF)和嗜異性抗體的干擾，IgM.IgG型RF可以與包被在膠乳上的抗體的Fc段直接結合，從而導致檢測結果假陽性或假性升高。嗜異性抗體可與嚙齒類動物IgG的Fc段結合，這樣嗜異性抗體可與包被在膠乳上的抗體結合，造成檢測結果假陽性或假性升高。目前采用的化學偶聯法多為隨機偶聯法，因隨機偶聯的抗體隨機偶聯到抗體不同部位，將導致抗體損失結合力；所以，完全隨機偶聯會損失抗體大部分結合力，增加了抗體用量和生產成本。同時，若將上述方法得到的致敏膠乳顆粒用于檢測試劑盒中，會造成特異性差、準確性低、抗干擾能力弱或生產成本高的缺陷。
發明內容
本發明針對現有技術的上述不足，提供一種靈敏度高、特異性好、準確性好、抗干擾能力強及生產成本低的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒。為了解決上述技術問題，本發明的技術方案為一種胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，所述的試劑盒包括試劑R1、試劑R2，所述的試劑Rl為適當的緩沖液；所述的試劑 R2是用胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，置于適當的緩沖液中組成。本發明上述試劑盒中Rl與R2的容積比為5 1。本發明所述的緩沖液包括但不限于PBS緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸 (MES)緩沖液、氯化銨緩沖液以及其他具有相似性質的緩沖液中的一種或幾種。本發明上述試劑盒中Rl所用的緩沖液與配置R2所用的緩沖液只要為上面的緩沖液中的一種任意搭配均可。本發明上面所述的聚苯乙烯膠乳顆粒(該聚苯乙烯膠乳顆粒為市售常規產品)， 其平均粒徑在0. 01 1. 5 μ m之間，粒徑小于0. 01 μ m時，膠乳顆粒聚集產生的光密度變化太小，結果很難達到試驗敏感度要求，在制備試劑的時候，需要花費過多的離心時間，延長了試劑生產的時間，增加了試劑成本且不利于重復性。而粒徑大于1. 5μπι的膠乳顆粒在測量高濃度檢測物時，其聚集產生的光密度變化超過了檢測限，結果很難獲得對應于分析物濃度的光密度變化，而且顆粒太大會加速自聚集，導致分散性降低。膠乳顆粒粒徑隨著試驗方法和設備的改變而改變。所選擇的顆粒粒徑最好是介于0. 05 0. 5 μ m之間。本發明上面所述的抗體包括但不限于多克隆抗體(人、羊、兔、雞)及單克隆抗體。在本發明所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒中，還包括胱氨酸蛋白酶抑制劑C校準品；進一步的，所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C校準品中胱氨酸蛋白酶抑制劑C含量為 0 8mg/L。本發明所述的試劑R2是用胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，置于適當的緩沖液中組成，該試劑R2制備步驟包括(1)膠乳顆粒的激活在帶有羧基的膠乳顆粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺(EDAC)，混合反應后加入己二酸二酰胼，繼續混合反應，得到激活的膠乳顆粒；(2)抗體的氧化用高碘酸鈉將抗體非結合活性區域Fc端羧基氧化成醛基；(3)抗體與膠乳顆粒的偶聯將步驟⑴激活的膠乳顆粒和步驟⑵氧化的抗體混合反應，待反應結束后，再加入葡萄糖封閉膠乳微球上未反應的基團，得到偶聯抗體的膠乳微球。本發明上述制備方法各個步驟中物料配比為步驟(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺膠乳(帶有羧基的膠乳顆粒原料) =0. 5 5 100(重量比)；己二酸二酰胼膠乳(帶有羧基的膠乳顆粒原料)=50 250 100(重量比)；步驟O)中高碘酸鈉膠乳(帶有羧基的膠乳顆粒原料)=0.5 3 100(重量比)；步驟(3)中抗體激活的膠乳顆粒=2 22 100 (重量比)，葡萄糖激活的膠乳顆粒=(25 50) 100。加入的是原料膠乳，可以改成抗體膠乳。都是重量比本發明所述膠乳增強免疫透射比濁法，其原理是包被了抗原或抗體的膠乳微粒， 與標本中相應抗體或抗原發生免疫反應后，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物形成所產生的濁度，即可測出標本中被檢物的含量。在本發明中，血清中的胱氨酸蛋白酶抑制劑C與結合在膠乳顆粒表面的抗人胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體結合，產生抗原抗體反應，使膠乳顆粒形成聚集；在546nm，700nm波長處測定吸光度，對照標準曲線可求出胱氨酸蛋白酶抑制劑C的含量。本發明的優點和有益效果1.本發明的試劑盒是一種靈敏度高、特異性好、準確性高、抗干擾能力強及生產成本低的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒。2.本發明試劑盒中的試劑R2制備是一種抗原抗體反應試驗方法，特別之處在于， 本發明采用定向偶聯法將胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體包被到膠乳顆粒上；本發明將抗體的非結合活性區域的Fc端定向偶聯到膠乳顆粒上，不會發生類風濕性因子(RF)和嗜異性抗體的干擾所導致的檢測結果假陽性或假性升高，該方法定向偶聯的抗體偶聯到膠乳顆粒上后，其抗原結合位點指向流動相，抗體偶聯部位為Fc片段，因此不會發生抗體結合力損失的情況，保持了抗體的活力，大大減少了抗體的用量，降低了生產成本。3.本發明試劑盒中的R2制備采用定向化學偶聯法，得到的致敏膠乳顆粒穩定性較好，抗體不會從膠乳顆粒上脫落，而且由于化學偶聯過程中，Fc段發生了結構上的改變， 因此不會受到類風濕性因子(RF)和嗜異性抗體的干擾，大大提升了檢測結果的準確性和可信性。
具體實施例方式下面通過實施例進一步詳細描述本發明，但本發明不僅僅局限于以下實施例。實施例1胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒的制備本發明的試劑盒涉及試劑的主要原材料如下1.胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體采用間接ELISA法測定效價為1 100000。2.膠乳本發明僅示例性的采用直徑為100 200nm帶羧基基團的聚苯乙烯膠乳顆粒進行實驗。本實施例的主要試劑的配制如下試劑Rl 含1. 5% PEG6000(聚乙二醇6000)，0. 8% NaCl的氯化銨緩沖液。該試劑為無色透明溶液。試劑R2 用抗人胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體致敏膠乳顆粒。該試劑為乳白色溶液。 具體步驟如下1.取 Iml (100mg/ml)膠乳，用 0. lM(mol/L)，ρΗ5· O 的 MES 溶液(2-嗎啉乙磺酸緩沖液)洗滌3次，超聲分散；2.加入0. 2ml用0. 1M，pH5. O的MES溶液新鮮配制的EDAC (10mg/ml)混合完全， 室溫混和15min ；3.加入0. 8ml用0. 1M，ρΗ5· O的MES溶液新鮮配制的己二酸二酰胼(83mg/ml)， 4 °C反應過夜；4.用0. 1M，ρΗ5· O的MES溶液洗滌2次，0. 1Μ，ρΗ7· 5的磷酸鹽溶液洗滌1次，超聲分散備用；5.取1. 5ml抗體(3. 9mg/ml)溶液，加入0. 2ml用0. 1Μ，ρΗ7· 5的磷酸鹽溶液配制的高碘酸鈉溶液(10mg/ml)，室溫混合15min，6.將步驟5中氧化好的抗體加入到步驟4中已激活的膠乳溶液中，4°C反應過夜；
7.加入0. 32ml 10% BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4°C混合4h ；8.加入0.鈿1 10%葡萄糖溶液，4°C混合過夜；9.用 0. 1M, pH7. 5Tris 溶液洗滌 3 次，加入 0. 1M, pH7. 5Tris 溶液(含 1 % BSA, 0. 2% NaN3的Tris緩沖液)至膠乳終濃度為0. 25%。胱氨酸蛋白酶抑制劑C校準品在緩沖溶液中加入不同含量的胱氨酸蛋白酶抑制劑C蛋白，除菌過濾，所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C校準品中胱氨酸蛋白酶抑制劑C含量控制在0 8mg/L之間，這些校準品均為無色透明液體。實施例2胱氨酸蛋白酶抑制劑C的測定檢測工具日立7060型自動分析儀。分析方法兩點終點法；主波長546nm，副波長700nm 樣品量3. Oul ；Rl 250ul ；R2 :50ul ；校準方式樣條函數Spline ；反應方向上升；測定溫度37°C ；樣品與Rl 混勻后，于第30秒讀取吸光度A1 ；于5分鐘時加入R2，于5分鐘時讀取吸光度A2。反應吸光度的計算為A2與A1的校準差值。計算方法多點定標，以樣條函數作為計算模式，根據吸光度與參考血清的值作劑量/響應曲線，樣品含量可根據其吸光度值在劑量/響應曲線上算出。參考范圍0·55 1. 05mg/L實施例3胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒各項性能指標測試1.靈敏度試驗測定6種不同胱氨酸蛋白酶抑制劑C含量的樣品，每個樣品測10次，通過計算均值和SD值(標準差值)，從表1可見，本發明檢測試劑盒的靈敏度為0. 08mg/L。表 權利要求
1.一種胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括試劑R1、試劑 R2，所述的試劑Rl為適當的緩沖液；所述的試劑R2是用胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，置于適當的緩沖液中組成。
2.根據權利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒中的Rl與R2的容積比為5 1。
3.根據權利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，其特征在于所述的緩沖液為PBS緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、氯化銨緩沖液中的一種或幾種。
4.根據權利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，其特征在于所述的聚苯乙烯膠乳顆粒的平均粒徑為0. 01 1. 5 μ m。
5.根據權利要求4所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，其特征在于所述的聚苯乙烯膠乳顆粒的平均粒徑為0. 05 0. 5 μ m。
6.根據權利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，其特征在于所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。
7.根據權利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，其特征在于所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒中，還包括胱氨酸蛋白酶抑制劑C校準品。
8.根據權利要求7所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，其特征在于所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C校準品中胱氨酸蛋白酶抑制劑C的含量為0 8mg/L。
9.根據權利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑R2是用胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，置于適當的緩沖液中組成， 該試劑R2的制備步驟包括(1)膠乳顆粒的激活在帶有羧基的膠乳顆粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺， 混合反應后加入己二酸二酰胼，繼續混合反應，得到激活的膠乳顆粒；(2)抗體的氧化用高碘酸鈉將抗體非結合活性區域Fc端羧基氧化成醛基；(3)抗體與膠乳顆粒的偶聯將步驟(1)激活的膠乳顆粒和步驟( 氧化的抗體混合反應，待反應結束后，再加入葡萄糖封閉膠乳微球上未反應的基團，得到偶聯抗體的膠乳微球。
10.根據權利要求9所述的胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，其特征在于步驟(1) 中乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺膠乳=0. 5 5 100(重量比)；己二酸二酰胼膠乳 =50 250 100 (重量比)；步驟O)中高碘酸鈉膠乳=0. 5 3 100 (重量比)；步驟(3)中抗體激活的膠乳顆粒=2 22 100(重量比)，葡萄糖激活的膠乳顆粒= 05 50) 100。
全文摘要
本發明公開一種胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒，該試劑盒包括試劑R1、試劑R2，所述的試劑R1為適當的緩沖液；所述的試劑R2是用胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，置于適當的緩沖液中組成。本發明具有靈敏度高、特異性好、準確性好、抗干擾能力強及生產成本低的優點。
文檔編號G01N33/531GK102353770SQ20111015112
公開日2012年2月15日 申請日期2011年6月3日 優先權日2011年6月3日
發明者夏佳音, 鄒炳德 申請人:寧波美康生物科技有限公司