專利名稱：一種酶信號循環放大高靈敏免疫檢測方法
技術領域：
本發明涉及免疫檢測技術領域，特別涉及一種基于酶信號循環放大超靈敏免疫檢測方法，屬于酶聯免疫(ELISA)技術領域。
背景技術：
酶聯免疫(ELISA)技術是現代免疫分析中較為重要的一項技術，尤其是基于ELISA技術的各種類型的初篩試劑盒在臨床檢驗、食品安全領域得到廣泛的應用。這項檢測技術中有3項必要的試劑①固相的抗原或抗體酶標記的抗原或抗體；③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法，如雙抗體夾心測抗原、雙抗原夾心測抗體、間接法測抗體、競爭法等模式。ELISA技術檢測不同的項目，其檢測靈敏度和相應的抗原及抗體有著緊密聯系，而隨著檢驗檢疫要求越 來越嚴格，對方法靈敏度的要求越來越高，而基于傳統的ELISA技術在靈敏度方面往往提聞空間有限，也只能依賴提聞抗原抗體的未和力，從而間接提聞其檢測靈敏度。
發明內容
針對當前ELISA技術發展趨勢的需求如何有效的提供其檢測靈敏度，本發明所要解決的技術問題就是在原有的ELISA檢測體系基礎之上，進行創新型設計以獲得更高的檢測靈敏度。本發明的創新主要在于在原有的ELISA檢測體系中引入“抗酶抗體-酶標記復合物”如兔抗辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)多抗-HRP復合物,兔抗HRP-堿性磷酸酶(Alkaline phosohatase, AP)復合物等，以達到更高的檢測靈敏度。本發明的目的在于提供一種基于酶信號循環信號放大的ELISA檢測系統。本發明的另一目的在于提供一類“抗酶抗體-酶標記物”制備方法及其應用于傳統ELISA技術中。本發明的再一目的是利用一類“抗酶抗體-酶標記物”實現傳統ELISA中酶信號的循環放大，從而提高檢測靈敏度。本發明的目的通過以下技術方案實現一類抗酶抗體-酶標記物的制備并應用于傳統ELISA技術中。針對HRP顯色體系，制備抗HRP多抗-HRP復合物；針對AP顯色體系，制備抗AP多抗-AP復合物；也可能制備其他類型顯色酶抗體酶標復合物及其不同類型顯色酶抗體-酶交叉制備的復合物，此類復合物能夠實現酶信號的循環放大，提供傳統ELISA檢測體系的靈敏度，本說明書以HRP為例進行來描述本發明的設計模型。本發明的技術方案是首先通過多抗制備技術獲得抗HRP多抗，并與一定量的HRP進行親和反應形成抗HRP多抗-HRP復合物。選取某一 ELISA檢測模型如雙抗夾心檢測HBsAg建立基于酶信號循環放大的新型ELISA檢測體系。上述抗HRP多抗-HRP復合物的制備流程及檢測系統構建具體可以包括下述步驟
(I )、用純化的HRP免疫兔，得到含有抗HRP抗體的兔血清；先用(NH4) 2S04沉淀法從兔的血清中初步純化免疫球蛋白IgG,再用ProteinA-Sepharose親和層析柱進一步純化抗HRP的IgG, SDS-PAGE及Western blotting鑒定分離純化的抗HRP多抗；(2)、取上述純化后的抗HRP多抗，加入一定量的HRP形成不飽和的抗HRP多抗-HRP復合物，此復合物不僅具有HRP酶活性，而且仍然具有與HRP酶反應的活性位點；(3)、應用舉例I :雙抗夾心法檢測乙肝表面抗原(HBsAg)的基礎之上，引入抗HRP多抗-HRP復合物，在ELISA顯色步驟之前加入上述抗HRP多抗-HRP復合物反應30min后進行洗滌，再進行酶顯色步驟；(4)、應用舉例2 :間接法測口蹄疫病毒(FMDV)抗體ELISA試劑盒基礎之上，引入抗HRP多抗-HRP復合物，在ELISA顯色步驟之前加入上述抗HRP多抗-HRP復合物反應30min后進行洗滌，再進行酶顯色步驟。本發明提供了抗HRP多抗-HRP復合物的制備方法，該復合物能夠用于ELISA檢測體系中，形成基于酶信號循環放大免疫檢測系統，能夠遠遠的提高檢測的靈敏度。
圖I酶信號循環放大應用實例I-雙抗體夾心ELISA模式。圖2酶信號循環放大應用實例2-間接法測抗體ELISA模式。
具體實施例方式實施例是對本發明所提供的抗HRP多抗-HRP復合物的制備及應用到酶信號循環放大系統應用舉例的進一步說明，但發明的實施方式不限于此，對于其他方式的ELISA，該發明策略同樣適用。實施例I抗HRP多抗-HRP復合物的制備 (O油包水抗原乳化劑的制備
用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑I. 2mL混合2 mg純化HRP，用勻漿器混合2小時，將制好的乳化劑滴入盛有冷水的燒杯中，若一滴乳化劑狀態完整地停留在水面上，而不擴散，表明形成穩定的油包水抗原乳化劑。(2)免疫新西蘭大白兔
選取4周大的，體重約I. 5Kg的健康新西蘭大白兔2只。先將新西蘭大白兔背部的毛小心剪去，然后取600 μ L制備好的油包水抗原乳化劑，用微量注射器多位點地進行皮下注射，一只動物背部兩側注射總數約為8 10點，使抗原能緩慢擴散，每隔Γ2周免疫一次，觀察注射點是否紅腫，如果糜爛可用紫藥水收干。在免疫3-4次后，從兔子的耳緣靜脈抽血約lmL，離心IOmin后，得血清可進行效價鑒定。共進行6次免疫，在末次免疫后5天后采用頸動脈放血法取血。(3)頸動脈放血法
在大白兔頸外側做皮膚切口，拉開皮膚后可見斜行的胸鎖乳突肌，將此肌鈍性分離并推向后方，即可見到淡紅色有彈性的總動脈。將此動脈輕輕游離(連同與之同行的迷走神經)，用絲線將遠心端結扎，近心端用止血鉗夾住，另一止血鉗夾住動脈迷走神經，用以固定。沿結扎處剪斷血管，用固定止血鉗將斷端鉗住，插入輸血針管，慢慢打開夾持的止血鉗，動脈血立即通過輸血針管流入瓶中。采用室溫自然凝固分離抗血清，然后放置37°C I小時,再4°C過夜，待凝塊收縮，4000rpm離心15分鐘，收集上清。
(4)抗血清的純化
飽和硫酸銨溶液取500ml蒸餾水加熱至70 80°C，將400g硫酸銨溶于其中，攪拌20min，冷卻。待硫酸銨結晶沉于瓶底,其上清即為飽和硫酸銨。在使用前用28%氨水調PH7. O。用55%飽和硫酸銨提取血清I份加生理鹽水I份混勻，然后逐滴加入飽和硫酸銨2份中，邊加邊攪拌，防止形成團塊降低沉淀物的特異性.混勻后靜置30min或置4°C冰箱過夜。低溫高速10 000/min離心IOmin,將上清液(含白蛋白)棄去，取沉淀物(含球蛋白)溶于少量生理鹽水中。用33%飽和硫酸銨提取將上述提取物生理鹽水溶液2份加I份飽和硫酸銨。然后再10 000/min離心，其余操作同上。用33%飽和硫酸銨重復上述步驟提取一次。將提取物裝入透析袋，在生理鹽水中透析，以除去其中所含的硫酸銨。放_20°C冰箱保存。按照ProteinA-Sepharose親和層析柱純化試劑盒操作說明書進行抗體的進一步純化。并采用SDS-PAGE及Western blotting鑒定分離純化的抗HRP多抗。
(5 )抗HRP抗體-HRP復合物的制備
取純化好的HRP抗體10mg，加入一定量的HRP，二者親和而成不飽和抗HRP抗體-HRP復合物，裝入透析袋，在生理鹽水中透析，放_20°C冰箱保存。實施例2酶信號循環放大高靈敏免疫檢測乙肝表面抗原系統(雙抗體夾心測抗原)
(I)材料準備
HBsAg包被板取抗HBsAg多抗，用PH 9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋終濃度5_8 ug /ml，包被體積為 100 150ul/孔。包被條件 4° C 過夜。1%BSA，0. OlM PBS，PH7. 4，37° C 封閉 2h，
甩干備用。抗HBsAg酶結合物①取5 mg HRP溶于0. 5ml雙餾水中，加入新配制的0. 06 Mol/L NaIOjjC溶液0.5 ml，混勻，置4 °C 30 min ;②取出后加入0. 16 Mol/L乙二醇水溶液0. 5ml,室溫放置30 min !③加入含5mg純化HBsAg抗體的水溶液Iml,混勻，并裝入透析袋,對
0.05 Mol/L pH 9. 5碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析6 h，使之結合；④加入NaBH4溶液(5 mg/ml) 0.2 ml,混勻，置4 °C 2 h ;⑤在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，40C 30 min，離心，去上清，沉淀以少許0.02 Mol/L pH7. 4 PBS液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4 °C透析除鹽過夜；⑥次日取出離心，以除去不溶物，即得抗HBsAg酶結合物，以0. 02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5 ml ;⑦效價測定合格后，加入等量優質甘油，分裝小瓶，低溫保存。顯色劑A 液醋酸鈉 13. 6g，檸檬酸 I. 6g，H202 (30%) 0. 3ml, dH20 500ml ；顯色劑B液EDTA-Na 0. 2g，檸檬酸0.95g，甘油50ml，TMB (四甲基聯苯胺)0. 2g終止液2M H2S04 ；
20X 濃縮洗滌液8 mM 磷酸鈉，2mM 磷酸鉀，0. 14 M NaCl, 100 mM KCl, 0. 05%Tween-20, pH 7. 4。(2)操作步驟
取出抗體包被板，預留空白孔I孔、陰性對照3孔，陽性對照2孔，其余各孔每孔加入50 u L待測樣本。陰陽性對照每孔加入50 ii L對照血清。然后每孔加入50 ii L抗HBsAg酶結合物(不包括空白孔)，空白孔空置。混勻后，37°C溫育30分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板I次，甩干后加入抗HRP抗體-HRP復合物50 u L/孔(稀釋比1000-10000)，37°C溫育30分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板4次，洗板時洗滌液應注滿板孔，但不應溢出，每次注入洗滌液后應浸泡15秒。每孔先加入50 ii L顯色劑A液，再加入50 ii L顯色劑B液，混勻后，37°C避光溫育30分鐘。每孔加入100 終止液，混勻。選擇酶標儀測定波長為450nm，參考波長630nm,測定各孔吸收值。實施例3酶信號循環放大高靈敏免疫檢測豬口蹄疫病毒抗體系統(間接法測抗體)
(I)材料準備
包被抗原取0型口蹄疫病毒VPl蛋白，用PH 9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋終濃度3-10 ug/ml，包被體積為150ul/孔。包被條件4° C過夜。5%脫脂奶粉，0. OlM PBS,0. 05% Tween20,PH7. 4,37° C封閉2h，甩干備用。 酶標二抗①取5 mg HRP溶于0. 5ml雙餾水中，加入新配制的0. 06 Mol/L NaIO4水溶液0.5 ml，混勻，置4 0C 30 min ;②取出后加入0. 16 Mol/L乙二醇水溶液0. 5 ml,室溫放置30 min 加入含5mg 二抗的水溶液Iml,混勻，并裝入透析袋,對0. 05 Mol/L pH9. 5碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析6 h，使之結合；④加入NaBH4溶液(5 mg/ml) 0.2 ml，混勻，置4 °C2 h ;⑤在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，4 0C 30 min，離心，去上清，沉淀以少許0.02 Mol/L pH7.4 PBS液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4 °C透析除鹽過夜；⑥次日取出離心，以除去不溶物，即得抗HBsAg酶結合物，以0.02 Mol/L pH 7.4PBS液加至5 ml ;⑦效價測定合格后，加入等量優質甘油，分裝小瓶，低溫保存。顯色劑A 液醋酸鈉 13. 6g，檸檬酸 I. 6g, H202 (30%) 0. 3ml, dH20 500mL ； 顯色劑B液=EDTA-Na 0. 2g，檸檬酸0. 95g，甘油50mL, TMB (四甲基聯苯胺)0. 2g 終止液1M HCl ；
20X 濃縮洗滌液8 mM 磷酸鈉，2mM 磷酸鉀，0. 14 M NaCl, 100 mM KCl, 0. 05%Tween-20, pH 7. 4。(2)操作步驟
取PVl抗原包被板，預留空白孔I孔、陰性對照3孔，陽性對照2孔，其余各孔每孔加入50 y L待測樣本。然后每孔加入50 y L酶標二抗(不包括空白孔)，空白孔空置。混勻后，37°C溫育30分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板I次，甩干后加入抗HRP抗體-HRP復合物50 u L/孔(稀釋比1000-10000)，37°C溫育30分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板4次，洗板時洗滌液應注滿板孔，但不應溢出，每次注入洗滌液后應浸泡15秒。每孔先加入50 y L顯色劑A液，再加A 50 u L顯色劑B液，混勻后，37°C避光溫育30分鐘。每孔加入100 u L終止液，混勻。選擇酶標儀測定波長為450nm，參考波長630nm，測定各孔吸收值。上述實施例為本發明的實施方式一部分，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化。均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種基于酶信號循環放大免疫檢測方法的構建，其特征在于米用抗HRP多抗-HRP復合物進行酶信號的循環放大，而不僅僅限于HRP，也可是其他類型的酶如堿性磷酸酶AP坐寸ο
2.根據權利要求I所述的酶信號循環放大免疫檢測方法，是在傳統ELISA檢測模式上再進行酶信號的循環放大，傳統的常見檢測模式有雙抗體夾心測抗原、雙抗原夾心測抗體、間接法測抗體、競爭法測抗體\抗原、親和素-生物素-ELISA等不同類型的ELISA檢測模zpf*坐坐工、O
3.—種如權利要求1，2所述的酶信號循環放大免疫檢測方法，其特征在于使用一種抗HRP多抗-HRP復合物(或等效的其他類型酶對應的復合物)，其所采用的是抗HRP的多抗，并與HRP形成不飽和類型復合物，此復合物具有HRP酶活性，同時還能與HRP進行結合。
4.根據權利要求I所述的抗HRP多抗-HRP復合物的制備方法，其特征在于用純化的HRP免疫兔，得到含有抗HRP抗體的兔血清；先用(NH4)2SO4沉淀法從兔的血清中初步純化免疫球蛋白IgG,再用ProteinA-Sepharose親和層析柱進一步純化抗HRP的IgG, SDS-PAGE及Western blotting鑒定分離純化的抗HRP多抗。
5.取上述純化后的抗HRP多抗，加入一定量的HRP形成不飽和的抗HRP多抗-HRP復合物。
6.根據權利要求1，2所述的酶信號循環放大免疫檢測方法，其特征在于能夠實現酶信號的循環放大，大大提高其檢測靈敏度，而不限制于采用何種ELISA檢測模式。
7.—種如權利要求1，2所述的酶信號循環放大方法，適用于各類ELISA試劑盒的研制，所要求是一種基于酶信號循環放大的新型ELISA檢測系統。
8.—種如權利要求I所述的抗HRP抗體，屬于多抗，而不局限于何種類型的多抗，即可為兔多抗，也可為鼠多抗、羊多抗等。
9.一種權利要求I所述的酶信號循環放大免疫檢測系統在臨床檢驗、食品安全、動物疫病等相關領域的應用。
全文摘要
本發明涉及酶聯免疫(ELISA)領域，特別是一種抗HRP多抗-HRP復合物應用于ELISA技術，從而獲得酶信號循環放大。基于酶信號循環放大免疫檢測方法，適合于各種類型的基于酶信號放大的免疫檢測系統，該免疫檢測系統的優勢是能夠最大程度上提高其檢測靈敏度。
文檔編號G01N33/53GK102809648SQ20111014449
公開日2012年12月5日 申請日期2011年5月31日 優先權日2011年5月31日
發明者張恒, 湯慕瑾, 呂敬章, 謝麗琪, 岳振峰, 萬志剛, 藍芳, 黃李華, 范放, 洪小柳, 蔡偉增, 陳昊翰 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術中心