專利名稱：抗人IL-1α單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物工程領域，具體涉及一種抗人IL-α單克隆抗體及其制備方法和應用。
背景技術：
IL-I (IL-Ια和IL-I β )是一種多功能的細胞因子。1972年Gery等人發現在人白細胞的培養上清中含有一種可溶性物質，起初命名為淋巴細胞激活因子或內源性熱原質、破骨細胞激活因子、黑素瘤細胞生長抑制因子等，1979年國際統一命名為IL-1。IL-I可由多種細胞合成和分泌，如單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等。小鼠和人的IL-I基因定位于2號染色體，含7個外顯子。IL-I在不同種屬中有較高同源性。在氨基酸水平上，IL-Ia和IL-Ιβ在不同種屬同源性分別為60%_70%和 75%-78% ；但在同一種屬中IL-I α與IL-1 β同源性只有20%_30%。IL-Ia是促炎癥細胞因子，能刺激與炎癥及免疫相關的基因的表達。IL_1 α的前體是由IL-IA基因合成的、無信號肽的31-kDa的分子。IL-Ia前體被Ca2+依賴的鈣蛋白激酶降解為17KD的成熟體和16KD的N氨基末端肽，而活化的細胞產生有活性的膜型的IL-I α。IL-I α無論是胞內的前體還是膜型的IL-I α均有活化作用，因為它的分泌量有限，所以分泌的成熟體的活化作用較陌生。膜型的IL-Ια具有免疫激活作用，而胞內的 IL-I α前體能調控內環境穩定，如基因的表達、細胞的增殖與分化。已證實包括白血病，肝癌，黑色素瘤，胃癌等在內的多種腫瘤均表達IL-I α。腫瘤細胞本身以及在細胞因子或細菌產物刺激下能表達IL-I α，而原代細胞需經過炎癥或細胞因子的刺激才會誘導表達IL-I α。至今仍不清楚IL-I α異常表達出現在腫瘤發生發展過程中哪一特定時期。而且IL-I α在惡性腫瘤細胞中的表達機制尚不清楚。為了更方便快捷地檢測IL-I α在腫瘤中的異常表達情況及對其功能進行研究， 制備IL-I α抗體顯得尤為重要。基于以上分析，需要制備一種高特異性、高效價的鼠抗人IL-I α單克隆抗體，使其能夠用于間接免疫酶聯吸附實驗(ELISA)，免疫細胞熒光(Immunocytoflurescence)，免疫熒光流式細胞分析(Flowcytometer Analysis)等多種研究手段，以實現IL-1 α表達的快速通量檢測。
發明內容
本發明目的是提供一種人IL-I α的單克隆抗體，利用該單克隆抗體通過免疫學方法檢測人IL-I α基因的蛋白表達水平；本發明的另一目的是提供能產生具有良好識別 IL-I α蛋白并能與其進行免疫學反應的單克隆抗體分泌型穩定雜交瘤細胞株，通過該細胞株大量生產均質的、穩定的、多用途的的單克隆抗體。為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是一種雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株的保藏信息為保藏單位中國典型培養物保藏中心；地址中國武漢大學；保藏日期2011年1月7日；保藏編號CCTCC NO :C201102 ；分類命名雜交瘤細胞株L-1F12。上述雜交瘤細胞株的制備方法包括以下步驟
(1)利用IL-I α基因(基因序列號是ΝΜ_000575. 3)原核表達產物免疫BALB/c小鼠以獲取能產生針對該蛋白特異性抗體的致敏B細胞；
⑵獲取融合細胞生長克隆從免疫合格小鼠無菌取其脾細胞作為抗原致敏的B細胞， 按常規方法，將B細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，然后利用常規的融合細胞HAT篩選方法進行篩選，進而獲取融合細胞生長克隆；
'3'分泌單克隆抗體融合細胞克隆的篩選①應用雙抗體夾心ELISA或間接ELISA檢測策略篩選分泌單克隆抗體融合細胞克隆是獲取分泌單抗細胞克隆常規手段，發明人選用了間接ELISA檢測手段進行檢測；②使用免疫熒光流式細胞分析加以篩選即以ELISA檢測陽性的作為候選克隆，再采用免疫熒光流式細胞分析陽性作為關鍵指標以確立其陽性克隆；
(1)單克隆抗體雜交瘤細胞株的獲得采用雙篩選方法，僅獲得三株合格細胞克隆，其中一株細胞9B12 (進行融合細胞培養時共用了 12塊96孔板，這里指的是第9塊板的B行 12列孔中的細胞)克隆免疫熒光信號均強于其他二株(4D3和3A7，同樣的方法編號)，將該克隆細胞按常規單細胞克隆方法進行了二輪亞克隆并對每輪亞克隆進行雙篩選直至所有的亞克隆均呈強雙陽性后，從中挑出一株生長最旺的單細胞克隆(編號L-1F12)擴大培養并進行傳代凍存。將上述技術方案中生長最旺的單細胞克隆(編號L-1F12)送交至武漢大學的中國典型培養物保藏中心保藏。上述技術方案中，采用步驟(D的策略是基于以下幾方面考慮
首先，原核表達產物作免疫原其表達量高(這是真核表達產物無法達到的)，易純化(通過蛋白制備電泳的方法可以獲取其純度大于85%純化物，純化周期僅需1天的時間，大大減少了該蛋白降解的可能性)。其次，該基因原核表達產物與天然表達蛋白能有相同的抗原識別位點完全滿足制備抗體的要求；
再次，用PCR產物直接免疫動物屬DNA疫苗的范疇，該技術到目前為止僅為探索階段其技術不成熟，因此不宜采用該策略；
最后，選BALB/c小鼠免疫制備檢測用單克隆抗體是通用策略，我們制備該抗體目的并不用于抗體的治療故無需制備人源化的單抗，即便需要亦可在此基礎上再進行研究。上述技術方案中，采用步驟￡3_的策略是基于以下幾方面考慮
ELISA的優點是可進行大量樣本檢測，操作時間短2 池內可出報告，但缺點是有一定的非特異性，考慮到ELISA檢測存在一定非特異性風險，本發明采用了雙篩選方法，與常規單抗篩選方法相比，雙篩選比單篩選提高了篩選的可靠性；此外，發明人制備的免疫原是一種融合蛋白，因此用ELISA法有可能篩選了融合蛋白的標簽的位點而非IL-I α蛋白的位點的風險，所以必須用另一方法確立識別的是IL-I α蛋白抗原表位來佐證。本發明同時要求保護一種人IL-I α的單克隆抗體，所述人IL_1 α的單克隆抗體由上述雜交瘤細胞株L-1F12產生，所述單克隆抗體為高特異性的鼠源抗IL-I α單克隆抗體，所述單克隆抗體為IgM亞類，kapa型，制備所述人IL-I α的單克隆抗體的方法有兩種 第一種方法包括以下步驟以上述雜交瘤細胞9Β12亞克隆的一株細胞1F12(即雜交瘤細胞株L-1F12 )作種子細胞用10%FBS+DMEM或10%FBS+RPMI-1640，在細胞培養設備(如轉瓶細胞培養設備)中進行擴大培養，在培養上清中可分泌鼠抗人IL-I α單克隆抗體； 第二種方法采用雜交瘤細胞株L-1F12誘生腹水的方法來生產該單抗蛋白； 對上述兩種方法進行比較用ELISA法進行效價比較發現腹水中抗體效價比培養上清(細胞濃度為106/ml)抗體的效價高出3000倍以上，故采用該方法生產極大的提高了單抗蛋白產量大大的降低了生產成本。上述技術方案中，用雜交瘤細胞株L-1F12反復進行誘生腹水試驗發現該株能良好誘導產生大量血性腹水且目標抗體蛋白占在腹水總蛋白的比例能達到15 20%，其每毫升抗體蛋白產量均已達到毫克級以上，為下一步進行商業化生產提供了可靠保證。本發明還保護一種利用上述抗人IL-I α的單克隆抗體檢測IL_1 α蛋白表達水平的應用。因此，本發明同時要求保護一種利用上所述單克隆抗體采用免疫學方法檢測 IL-Ia蛋白表達水平的方法。上述技術方案中，為檢測人IL-I α蛋白表達水平，優選地，可以使用以下免疫學方法，如間接免疫酶聯吸附試驗(ELISA)法，免疫細胞熒光試驗(Immunocytoflurescence) 法，免疫熒光流式細胞分析(Flow cytometer Analysis)等法對含多種形式IL-1 α蛋白的樣本進行檢測。上述技術方案中，所述人IL-I α蛋白包括人IL_1 α的原核表達產物、人IL_1 a 的真核表達產物、人IL-I α表達蛋白的變性蛋白和非變性蛋白。進一步的技術方案中，上述檢測IL-Ia蛋白表達水平的方法，可以分析在細胞或組織中IL-Ia的異常表達。上述技術方案中，所述免疫學方法屬于免疫學常見基本技術，屬于本領域技術人員公知的技術；另外根據本發明現有的試驗結果推測，所述抗體可以應用在免疫酶組織化學和免疫組織熒光化學試驗。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點
1、在檢測人IL-I α蛋白的時候，本發明由于得到了特異性高、親和力高的抗人IL-I a 單克隆抗體，因此，本發明所述檢測方法無需提取RNA那樣非常苛刻的試驗條件(主要防止 RNA降解)，也無需Real-time PCR技術那樣需設嚴格的內參和外參和利用昂貴的實時定量 PCR儀，不僅大大降低了檢測的成本，更重要的是對檢測時機的要求也大大降低了，沒有上述專利嚴格；同時由于該單抗可大量生產也可制備直標抗體，而不用二級免疫試劑來降低成本和提高檢測效率。2、本發明制備了一種抗人IL-I α的單克隆抗體，該單克隆抗體具有高特異性和高親和力，能夠識別人IL-I α的原核表達產物，人IL-I α的真核表達產物。因此，利用該單克隆抗體可以簡便快速準確地檢測出人IL-I α蛋白的表達水平。3、本發明制備了一種可以分泌抗人IL-I α單克隆抗體的雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株具有良好的傳代能力并能大量擴增培養，能穩定體外分泌抗體，并且分泌抗體的能力隨著培養代次增加沒有下降，誘生腹水的能力也不隨傳代次數的增加而改變。
雜交瘤細胞株的保藏信息為保藏單位中國典型培養物保藏中心；地址中國武漢大學；保藏日期2011年1月7日；保藏編號CCTCC NO :C201102 ；分類命名雜交瘤細胞株 L-1F12 ；
附圖1為實施例一中制備抗人IL-Ci的單克隆抗體的制備方案圖； 附圖2為實施例一中L-1F12細胞不同代次的生長曲線圖； 附圖3為實施例中單克隆抗體免疫球蛋白抗體亞型分類分析結果圖； 附圖4為實施例中流式細胞術試驗結果圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述 實施例一鼠抗人IL-I α蛋白單克隆抗體的制備
采用IL-I α基因原核表達產物作為免疫原免疫BALB/c小鼠的策略以獲取該免疫原致敏的B細胞，具體的操作方法 1.制備單克隆抗體免疫原 1.1 IL-Ia基因完整開放閱讀框片段的擴增
直接從組織或細胞中獲取純化IL-I α蛋白制備抗體十分困難，因而通過基因工程表達產物制備抗體是有效的方法，要獲得基因工程表達產物調取目的基因是先決條件。從人新鮮血液中分離外周單核淋巴細胞(PBMC)，然后經總RNA的提取、RT-PCR擴增和重組轉移載體PGEM-T-IL-Ia的構建，重組質粒的經測序，獲取IL_1 α基因完整開放閱讀框片段，具體包括以下步驟
aJ取2X IO6個分離的PBMC，用Trizol (Invitrogen公司產品)提取總mRNA，逆轉錄獲得mRNA互補第一鏈(cDNA)；
(2)以步驟⑴所得cDNA為模板，用上下游引物進行100 μ 1反應體系，使用高保真PCR 擴增酶(Roche公司產品)(比普通Taq保真性高6倍左右，故調取大目的基因特別是大于 500bp的基因時宜用，且能添加A尾巴，可用于T載體連接)進行PCR擴增，清潔； 所述上下游引物為
SEQ ID No. 1 :F :5_GGATCCATGGCCAAAGTTCCAGACATGTTTG SEQ ID No. 2 :R:5_GTCGACCTACGCCTGGTTTTCCAGTATCTGAAAG 上述引物是根據公布的IL-I α基因序列(基因序列號是NM_000575. 3)設計的將上述PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定在SOObp位置上有明顯的條帶，與預期分子量(816bp)—致，該結果表明我們已經獲得該基因的DNA片段。⑶將步驟⑵清潔所得的片段通過A尾巴連接到pGEM T (promega公司產品)載體上，轉化大腸桿菌DH5 α (由本室保存)，取3-4個重組菌落克隆的重組轉移載體pGEM T-IL-I α進行IL-I α基因的測序(測序工作由上海生工完成)，測序結果與GENBANK公布的 IL-I α (NM_000575. 3) cDNA 序列一致。1. 2重組表達載體pET3h (+) -IL-I α的構建將步驟1. 1構建的經測序正確的質粒pGEM T-IL-α和質粒pET3h ( + Xnovagen公司產品)用BamHI、Sail酶于37°C酶切3小時后，電泳，割膠回收目的片段，并用T4 DNA連接酶(Fermentas公司產品)4°C連接過夜，得到含有重組表達載體pET3h (+)-IL-1 α的連接產物；
繼而將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α (由本室保存)，挑單菌落，質粒提取酶切鑒定，陽性克隆菌保種備用。所述酶切鑒定包括以下步驟將所得重組質粒pET3h(+)-IL-I α用BamHI、Sail 酶切經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果在0. 8kb,5. 9kb位置上各有一條明顯的條帶；與此同時，將重組質粒進行基因測序(測序工作由上海生工完成)，測序結果與GENBANK公布的 IL-I α (NM_000575. 3) cDNA序列一致，且目的基因插入方向正確。該結果表明我們已將 IL-Ia基因片段正確克隆于原核表達載體pET3h(+)上。1. 3 IL-I α基因原核表達產物的獲得與純化鑒定
將上述已經酶切鑒定重組表達載體pET3h(+)-IL-la轉化原核表達菌大腸桿菌BL21 株(Invitrogen公司產品)，挑單個菌落至含氨芐霉素MDG (5ml)培養基中，搖床培養過夜；然后取該培養液Iml加至IOOml含氨芐霉素的ZYM-5052自動誘導表達培養基中，過夜培養(注MDG培養基，ZYM-5052自動誘導表達培養基及培養要求均參考文獻F William Studier. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures, Protein Expression and Purification. 2005，41:207 - 234)。加等體積的2XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液，于沸水浴中孵育15min，12，000r/min 4°C離心15min取上清，上樣于8塊12% SDS-PAGE制備膠(IOcmX 8cmX 1. 5mm)(每塊膠均上Iml蛋白樣本液，同時設預染蛋白分子量marker孔)于冰水浴中電泳，電泳后按預染蛋白分子量marker指示分子量割取含目標蛋白的膠條，上述膠條剪碎后置于蛋白透析袋 (14，000-20, 000D, Pharmacia公司產品)中，加適量電極緩沖液浸沒后扎緊，置于^iestern Blot轉移片中央，加滿電極緩沖液后，將電泳槽置于冰水浴中進行IlOmA電洗脫池，再將透析袋置于冰冷的0. OlM PBS(pH7. 2)中透析Mh，無菌取上清于12，000r/min 4°C離心 15min再取上清，用少許樣本進行BCA蛋白檢測(碧云天公司產品)進行含量分析和1 SDS-PAGE電泳純度，其余樣本按每份IOOul分裝_80°C凍存備用。上述純化物經測定其含量約為0.5mg/ml，經電泳鑒定發現在分子量50kd位置有一條明顯蛋白條帶，其純度約90%，該條帶與我們預計目標表達產物分子量一致 IL-I α (3IKd) +Tag標簽(約20Kd)=51Kd ；經購買的多抗(Abeam公司產品)進行^festern blot鑒定為目的條帶。該結果表明已經獲得了目的基因表達產物電泳純樣本，已經能滿足作免疫原免疫小鼠制備單克隆抗體的需要。2.抗原致敏B淋巴細胞的免疫小鼠獲得
無菌取步驟1. 3所得IL-I α基因原核表達并純化的蛋白樣本(蛋白濃度1. 0mg/ml)用 0.01M PBS(pH7. 2) 10X稀釋后加等體積的弗氏完全佐劑(Sigma公司產品)充分混勻后按 30 μ g/只蛋白劑量注射于5只5周齡雌性的SPF級BALB/c小鼠(由蘇州大學實驗動物中心提供)腹腔中，每隔二周后按上述等蛋白劑量加弗氏不完全佐劑(Sigma公司產品)腹腔免疫各一次，三次免疫后再隔一周按30 μ g/只蛋白劑量(無佐劑)進行四免，四免后5 7天， 眼眶靜脈采血取血清作待測抗體；以步驟1. 3所述IL-I α純化蛋白(0. 5mg/ml)作固定標準抗原，做間接ELISA，效價超過1 :1000的為合格小鼠，此時無菌取其脾細胞作為抗原致敏 B淋巴細胞。ELISA效價已達到1 :1000，該結果表明我們已經獲得了能產生較高效價針對原核表達產物特異性抗體的免疫小鼠，同時說明該小鼠脾臟內已有抗原致敏B淋巴細胞克隆。 至此已經完成了制備單抗第一重要階段。在此需說明的是免疫小鼠獲取抗原致敏B淋巴細胞有多種方法，本實驗采用了經典免疫方法，該方法的優點是免疫效果好，主要體現在B淋巴細胞受抗原免疫刺激時間長，受免疫刺激B淋巴細胞基因重排克隆穩定，為以后獲取優良穩定雜交瘤細胞克隆奠定了良好的基礎，其缺點是免疫期長需40-50天免疫周期；另外一種方法是將抗原直接注射小鼠脾臟免疫，該方法的優點是需要的抗原量少(10ng-2 μ g/只)，免疫期短20- 天即可，但缺點是操作困難，小鼠應激反應強、B淋巴細胞基因重排克隆穩定性差，在制備該抗體時，發明人考慮需要抗原易得故用經典免疫法以獲取高穩定性基因重排的抗原致敏B淋巴細胞。3.融合細胞克隆的獲取和分泌抗體克隆的篩選 3. 1融合細胞生長克隆培養
無菌取上述一只合格小鼠脾臟，將其置于無菌培養皿中，10%FBS+DMEM洗滌2_3次后剪成小塊，用無菌玻璃片研磨，擠出脾細胞，30-40ml 10%FBS+DMEM吹散重懸細胞，過尼龍膜進行細胞篩后(單細胞易于細胞融合)再用DMEM培養基洗滌2-3次并計數；
按脾細胞與骨髓瘤細胞系SP2/0細胞(來源于ATCC)5:1 10 1的比例將處于對數生長期的SP2/0細胞加入脾細胞懸浮液離心管中，用DMEM培養基離心洗滌2-3次，按常規PEG 細胞融合劑(北京賽馳公司產品)細胞融合法進行脾細胞與SP2/0融合；融合后離心去除融合液，重懸于120ml 20% FBS + DMEM培養液中，并按IOOul/孔植于12塊預先長有BALB/ c小鼠腹腔巨噬或胸腺細胞飼養層中的96孔板的孔中，(注融合前一天按3、X104個細胞/孔加入飼養細胞)種植12塊96孔板，每孔加100 μ 1含2XHAT (用100XHAT儲存液 (SIGMA公司產品)稀釋)10%FBS + DMEM培養液的飼養細胞懸浮液；)于37°C 5% CO2培養，一周后用含1 XHAT 20%FBS + DMEM培養液進行2/3換液并繼續培養，于2周后培養出多個HAT抗性克隆(細胞克隆生長面積約占孔面積的1/4時)待篩選。3. 2分泌抗體克隆的篩選與亞克隆
各取克隆孔上清分成二份(50μ1/份)作為待檢抗體，檢測前一天將IL-I α原核表達純化蛋白(0. 5mg/ml)用 0. IM Na2C03/NaHC03(ρΗ9· 6)作 1 10 稀釋并按 IOOul/ 孔包被于96孔酶標板(Corning公司產品)中，于4 °C包被過夜，用0. OlM PBS (pH7. 2)洗滌 2 次，加 200 μ 1/ 孔 5%FBS (GIBC0 公司產品)/0. OlM PBS (ρΗ7· 2)于 37 °C濕浮 2h，用 0. OlM PBS (pH7. 2)洗滌2次，每孔加一份待檢抗體，設SP2/0細胞培養上清對照孔，37°C 濕浮 lh，0. 02%Tween20/0. OlM PBS(pH7. 2)洗滌 4 次(4X5min)，各加 IOOul 的 1 :2000 HRP conjugated goat anti-mouse IgG( H+L) 二 ( Bioworld ^wJzfeBnn ) (0. OlM PBS (pH7. 2)稀釋)二抗，同上濕浮lh，洗滌4次后，加100 μ 1/孔OPD (上海生工產品)/H2O2 顯色液避光顯色，IOmin后用終止液(2 mol/L H2SO4溶液)終止反應，ELISA酶標儀(ΒΙ0ΤΕΚ 公司產品)測定OD492值，以試驗孔OD492值大于對照孔OD492值2倍判讀為陽性孔。準備檢測前一天將HL-60細胞擴增于細胞培養瓶(Corning公司產品)中，于37°C5% CO2培養；收集HL-60細胞，每管IX IO5個細胞，將細胞用0. OlM PBS(pH7. 2)洗滌2次， IOOOrpm離心5分鐘，棄上清；每管加100 μ 1待檢抗體(克隆孔細胞上清)并設SP2/0細胞培養上清對照孔，于4°C孵育0. 5h ；0.01M PBS (ρΗ7· 2)洗滌2次(2X5min)，每管加100 μ 1 3% FBS/0. OlM PBS (ρΗ7·2)，并加 Iul 的 FITC conjugated goat anti-mouse IgG ( H+L) (親和純FITC標記山羊抗小鼠IgG(重鏈和輕鏈)二抗)(Bioworld公司產品)二抗4°C避光孵育0.證，洗滌2次后，進行流式細胞術上樣分析，通過對照孔判讀陽性孔，篩選出雙陽性克隆。將上述雙陽性的克隆進行至少2輪單細胞亞克隆(方法同融合細胞生長克隆培養)，待細胞長至30%細胞單層時再進行上述雙篩選(同上方法)直至獲得100%雙陽性克隆后，取其中生長最旺盛一株克隆并命名為L，將該克隆進行擴大培養，并凍存和復蘇。4.雜交瘤細胞克隆不同代次的生長曲線及抗體分泌能力的穩定性分析 4.1不同代次的生長曲線
將1 X IOVml的第一代，第五代，第十代雜交瘤細胞株按2mL/孔分別種植于6孔標準細胞培養板(Corning公司產品)中，于37°C，5%0)2培養箱中培養，分別在12h，Mh，36h時間點每個代細胞各取3孔充分分散后用血球計數器計數，并以時間點作為橫坐標，細胞數作為縱坐標繪出生長曲線，得圖2。如附圖2所示用10%胎牛血清培養基對雜交瘤細胞株進行第一代，第五代，第十代生長曲線分析，細胞的倍增時約為3-4h，而各代次生長速率亦基本一致。上述結果說明實施例一獲得雜交瘤細胞能良好的傳代并能大量擴增培養；同時并不隨培養代次增加而生長能力下降。4. 2抗體分泌穩定性分析
首先對L-1F12雜交瘤細胞進行傳代，分別取第一代，第五代，第十代雜交瘤(初始細胞密度lX106/ml)培養過夜后的上清樣本，通過BCA蛋白測定法測定各樣本總蛋白的含量，同時將上清進行用SDS-PAGE電泳，操作步驟同Wfestern Blot中，電泳結束后進行考馬斯亮藍染色，利用Quantity One分析軟件分析抗體50Kd，25Kd 二條帶占總蛋白條帶中的比例；分析結果顯示三個代次培養上清平均總蛋白的含量分別為5. 25mg/ml,5. 19mg/ml, 5. 21mg/ml，而上述二條帶占總蛋白的百分比約為6. 87%,6. 95%,6. 58% ；從統計學分析四個代次的分泌抗體量無統計學上的差異；
其次，對細胞分泌上清進行ELISA鑒定，取第一代，第五代，第十代雜交瘤(初始細胞密度2X 106/ml)培養過夜后的上清樣本作為一抗，以1. 3中獲得的IL-I α原核純化蛋白包板，進行ELISA，每組別均做6個重復孔，抗原抗體使用量及操作步驟同3. 2中所描述；分析結果顯示OD492平均值分別為3. 687，3. 759，3. 453 ；從統計學分析三個代次的分泌抗體能力無統計學上的差異；
從以上結果可以說明實施例一獲得雜交瘤能穩定體外分泌抗體，同時說明隨著培養代次增加而分泌抗體的能力不下降。5.目標雜交瘤體內誘生腹水產生
5. 1小鼠的預處理選擇5周齡SPF級BALB/c小鼠(平均體重21g) 10只，接種細胞前 1-2周按0. 5ml/只預先腹腔注射液體石蠟(上海化學試劑公司產品)(我們用弗氏不完全佐劑、降植烷、液體石蠟等三種試劑進行致敏效果的比較發現三者無明顯差異，故選用廉價的液體石蠟)致敏。5.2接種雜交瘤細胞接種前一天，我們將上述雜交瘤細胞按1:8-10傳代待細胞處于對數生長期輕輕吹打懸浮細胞，1000r/min離心5min，棄培養液，用無血清培養基洗滌離心2次后，并用該培養基調細胞濃度至5X106/ml，按0. 5ml/只注射于上述的預處理的BALB/c小鼠腹腔中，注射后精心飼養。5.3腹水的采集注射后7-12天取腹水于5ml離心管中，1000 r/min離心5min 以去除腹水中的細胞，取上清4°C 12000 r/min離心15min，取少量上清并用BCA蛋白測定法和SDS-PAGE檢測其蛋白含量和純度，同時用間接ELISA法測定其效價，并分裝-80°C凍存6.單克隆抗體免疫球蛋白抗體亞型分類分析
取上述的L-1F12克隆細胞培養上清及腹水，利用亞類測定試紙(Roche公司產品)鑒定單克隆抗體免疫球蛋白亞型分類分析。檢測結果見附圖3，根據試紙顯示該抗體為IgM，kapa亞型。7.單克隆抗體的特異性分析
我們對L-1F12細胞培養上清及所制備腹水進行抗體特異性分析，這也同時涉及該單克隆抗體在檢測IL-I α蛋白表達水平時的應用。7. 1流式細胞術
操作步驟同3. 2中陽性克隆的流式細胞術篩選，細胞為人白血病細胞系HL-60，并設立對照試驗；腹水一抗稀釋比例為 1:200 ;affinity purified FITC conjugated goat anti-mouse IgM (親和純FITC標記山羊抗小鼠IgM (重鏈和輕鏈)二抗)二抗稀釋比例為 1:200 ；結果顯示，該單克隆抗體能夠特異的標記HL-60細胞，陽性標記率均達50%以上， 說明該抗體的特異性較高，且能很好識別IL-Ia (圖4)，這也為該單克隆抗體用于腫瘤 IL-Ia異常表達的通量檢測奠定基礎。7. 2細胞免疫熒光分析
取流式處理的HL-60的細胞涂片，進行熒光顯微鏡拍照，結果顯示，該單克隆抗體能很好的識別真核細胞中IL-Ia蛋白，在免疫熒光實驗中有很好的表現，這也說明該抗體能夠應用于免疫組化以及IL-I α的細胞定位研究。
權利要求
1.一種雜交瘤細胞株，其特征在于，所述雜交瘤細胞株的保藏信息為保藏單位中國典型培養物保藏中心；地址中國武漢大學；保藏日期2011年1月7日；保藏編號=CCTCC NO :C201102 ；分類命名雜交瘤細胞株L-1F12。
2.—種人IL-I α的單克隆抗體，所述人IL-I α的單克隆抗體由權利要求1所述雜交瘤細胞株L-1F12產生。
3.權利要求2所述抗人IL-Iα的單克隆抗體檢測IL-I α蛋白表達水平的應用。
全文摘要
本發明屬于微生物工程領域，具體涉及一種抗人IL-1α單克隆抗體及其制備方法和應用，所述單克隆抗體由雜交瘤細胞株L 產生，所述雜交瘤細胞株的保藏信息為保藏單位中國典型培養物保藏中心；地址中國武漢大學；保藏日期2011年1月7日；保藏編號CCTCC NOC201102；分類命名雜交瘤細胞株L-1F12。所述高特異性、高效價的鼠抗人IL-1α單克隆抗體，能夠采用間接免疫酶聯吸附實驗(ELISA)，免疫細胞熒光，免疫熒光流式細胞分析等多種手段實現對IL-1α表達的快速通量檢測。
文檔編號G01N33/577GK102296050SQ20111014253
公開日2011年12月28日 申請日期2011年5月30日 優先權日2011年5月30日
發明者劉春亮, 劉海燕, 林丹丹 申請人:劉海燕, 蘇州大學