專利名稱：一種檢測堿性磷酸酶的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢驗測定技術領域，具體的說是涉及一種檢測堿性磷酸酶的試劑
品.O
背景技術：
堿性磷酸酶幾乎存在于人體的各個組織中，其中以肝臟為最多其次為腎臟，骨骼、 腸、和胎盤等組織。正常人血清中堿性磷酸酶主要來自骨骼，由成骨骼產生，故骨骼病患，特別是當有新骨骼生成時或正在生長的兒童期，血液內的堿性磷酸酶活性增高。當肝臟受到損傷或者障礙時堿性磷酸酶經淋巴道和肝竇進入血液，故肝膽疾病，特別是膽道阻塞時，血清中堿性磷酸酶活性增高。因此堿性磷酸酶偏高的原因可以分為生理性原因和病理性原因，生理性原因即兒童骨骼發育期、孕婦和骨折愈合期骨組織中的堿性磷酸酶很活躍，檢測值偏高；病理性原因即當人體患有阻塞性黃疸、原發性肝癌、繼發性肝癌、膽汁淤積性肝炎等時，肝細胞過度制造ALP，經淋巴道和肝竇進入血液，同時由于膽汁排泄障礙，反流入血，引起血清中的堿性磷酸酶偏高。因此堿性磷酸酶主要用于阻塞性黃疸、原發性肝癌、繼發性肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查以及孕婦、骨折愈合期、骨軟化癥。佝僂病、骨細胞癌、骨質疏松等鑒別。目前，血清(漿)堿性磷酸酶的測定方法有很多，主要有以β-甘油磷酸鈉為基質的Bodansky氏測定法、以磷酸苯二鈉為基質的King氏測定法和以4-硝基苯磷酸鈉為基質的動力學法，但Bodansky氏測定法和King氏測定法不適用于全自動生化分析儀，使用起來不方便。而以4-硝基苯磷酸鈉為基質的動力學法適合于各種半、全自動生化分析儀，它的反應原理為堿性磷酸酶在堿性條件下水解對硝基苯磷酸鈉生成黃色的對硝基苯酚，對硝基苯酚的生成速率與血清中堿性磷酸酶活性成正比，通過在405nm下測定對硝基苯酚的生成速率來測定血清中堿性磷酸酶的含量。基于此方法的檢測試劑盒是國際臨床化學協會推薦的堿性磷酸酶檢測試劑盒，被廣泛應用。然而上述試劑盒中4-硝基苯磷酸鈉穩定性不好，自身易發生水解，致使檢測結果偏高，檢測準確性降低。
發明內容
有鑒于此，本發明目的是針對現有檢測堿性磷酸酶的試劑盒中對硝基苯磷酸鈉穩定性不好、檢測結果偏高、準確性低的問題，提供了一種檢測堿性磷酸酶的試劑盒。為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案一種檢測堿性磷酸酶的試劑盒，包括對硝基苯磷酸鈉和海藻糖、pH10. 0 10. 5的緩沖液和激活劑。優選的，本發明所述試劑盒中，所述海藻糖濃度為0. 25 2g/L，更優選為lg/L。優選的，本發明所述試劑盒的緩沖液為2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)緩沖液。優選的，本發明所述試劑盒中所述激活劑包括MgCl2 · 6H20、硫酸鋅和N-羥乙基乙二胺三乙酸。優選的，本發明所述試劑盒包括5 20mmol/L對硝基苯磷酸鈉、0. 25 2g/L海藻糖、100 140mmol/L ρΗΙΟ. 0 10. 5 2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、0. 4 1. 5mmol/L MgCl2 · 6H20、0. 2 0. 6mmol/L硫酸鋅和0. 5 2mmol/L N-羥乙基乙二胺三乙酸。更優選的，本發明所述試劑盒包括lOmmol/L對硝基苯磷酸鈉、lg/L海藻糖、 120mmol/L ρΗΙΟ. 0 10. 52-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、0. 5mmol/LMgCl2 · 6H20、 0. 5mmol/L硫酸鋅和lmmol/L N-羥乙基乙二胺三乙酸。從上述的技術方案可以看出，本發明提供的檢測堿性磷酸酶的試劑盒，包括對硝基苯磷酸鈉和海藻糖、ρΗΙΟ 10. 5的緩沖液和激活劑。海藻糖存在可以穩定對硝基苯磷酸鈉，避免對硝基苯磷酸鈉自身水解，提高對硝基苯磷酸鈉的穩定性。試驗表明，本發明所述試劑盒穩定性好，保存期長，應用本發明所述試劑盒檢測檢測結果準確性高、精密度好， 線性范圍寬。本發明所述試劑盒適用范圍廣，便于推廣使用，可應用于各級醫院、衛生預防部門和醫學生物科研單位測定血清中堿性磷酸酶含量。
具體實施例方式本發明實施例公開了一種檢測堿性磷酸酶的試劑盒。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的產品已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案一種檢測堿性磷酸酶的試劑盒，包括對硝基苯磷酸鈉和海藻糖、ρΗΙΟ. 0 10. 5的緩沖液和激活劑。對硝基苯磷酸鈉，又名對硝基苯磷酸二鈉、4-硝基苯磷酸二鈉，英文名為 PNPP-Na2、4-NPP，分子式為C6H4O6PNNa2,分子量為沈3. 05。然而對硝基苯磷酸鈉穩定性不好， 自身易發生水解。海藻糖是由兩個葡萄糖分子以α，α，1，1_糖苷鍵構成的非還原性糖，自身性質非常穩定。本發明人意外發現海藻糖存在可以穩定對硝基苯磷酸鈉，避免對硝基苯磷酸鈉自身水解，提高對硝基苯磷酸鈉的穩定性，保證堿性磷酸酶檢測結果的準確性。優選的，本發明所述試劑盒中，所述海藻糖濃度為0. 25 2g/L，更優選為lg/L。為了酶與底物很好的結合，酶和底物都需要緩沖液提供適宜的解離環境。因此本發明所述試劑盒還包括PH10. 0 10. 5緩沖液。緩沖液的離子強度也影響著酶的活性，離子強度過高，電解質干擾酶和底物結合，酶活性將逐步下降，但離子強度過低也可能無法激活酶活性。一般選擇與生理環境的體液比較接近的離子強度。作為優選，本發明所述試劑盒中的緩沖液為2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)緩沖液。2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液不僅起緩沖作用，還可作為磷酸的受體參與反應，增進酶促反應的速率。根據酶催化反應最適條件的要求，在酶測定體系中還需要加入一定量的激活劑。 激活劑可以是酶的活性中心，也可以通過其他機制激活酶的活性。激活劑最常見的是二價金屬離子如Mg2+、Zn2\ Mn2+、Ca2+、Fe2+等。優選的，本發明所述試劑盒中所述激活劑包括 MgCl2 · 6H20、硫酸鋅和N-羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)。MgCl2 · 6H20和硫酸鋅可以提供Mg2+、Zn2+0在一個具體實施方案中，所述試劑盒包括5 20mmol/L對硝基苯磷酸鈉、0. 25 2g/L海藻糖、100 140mmol/L ρΗΙΟ. O 10. 52-氨基-2-甲基丙醇緩沖液、0. 4 1. 5mmol/L MgCl2 · 6H20、0. 2 0. 6mmol/L 硫酸鋅和 0. 5 2mmol/L N-羥乙基乙二胺三乙酸。本發明提供的檢測堿性磷酸酶的試劑盒可以為單一試劑，也可以為雙試劑。例如， 將對硝基苯磷酸鈉和海藻糖與緩沖液、金屬離子激活劑制成單一試劑；或者，將對硝基苯磷酸鈉和海藻糖制成第一試劑，將緩沖液和金屬離子激活劑制成第二試劑，在利用該試劑盒檢測堿性磷酸酶時，將第一試劑與第二試劑混合，從而檢測待測樣品中的堿性磷酸酶。為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明進行詳細說明。實施例1 本發明所述檢測堿性磷酸酶的試劑盒。本發明所述檢測堿性磷酸酶的試劑盒為液體單一試劑，包括10mmol/L對硝基苯磷酸鈉、lg/L 海藻糖、120mmol/L ρΗΙΟ. 0 10. 5HC1-AMP 緩沖液、0. 5mmol/L MgCl2 · 6H20、
0.5mmol/L 硫酸鋅和 lmmol/L HEDTA。實施例2 本發明所述檢測堿性磷酸酶的試劑盒。本發明所述檢測堿性磷酸酶的試劑盒為雙試劑，第一試劑包括2g/L海藻糖和5mmol/L對硝基苯磷酸鈉，第二試劑包括140mmol/L ρΗΙΟ. 0 10. 5HC1-AMP緩沖液、
1.5mmol/L MgCl · 6Η20、0· 2mmol/L 硫酸鋅和 0. 5mmol/LHEDTA。實施例3 本發明所述檢測堿性磷酸酶的試劑盒。本發明所述檢測堿性磷酸酶的試劑盒為液體單一試劑，包括2g/L海藻糖、 20mmol/L 對硝基苯磷酸鈉、100mmol/L ρΗΙΟ. 0 10. 5HC1-AMP 緩沖液、0. 4mmol/L MgCl · 6Η20、0· 6mmol/L 硫酸鋅和 2mmol/L HEDTA。 實施例4 檢測堿性磷酸酶的方法。設定全自動生化分析儀反應溫度37°C，反應方法為速率法，測定主波長405nm，反應方向為正反應，延遲時間60s，測量時間為60s，理論因數為2757。然后取待測樣品與試劑盒中的試劑混合均勻后，置于全自動生化分析儀，檢測并記錄405nm波長下的吸光度變化值。根據計算公式C#= ΔΑ#/π ηΧΚ，計算待測樣品中堿性磷酸酶的濃度，其中，C#為待測樣本濃度；Λ A樣/min為樣品每分鐘吸光度變化率；K為理論因數，已設定為2757。實施例5 海藻糖加入量的比較試驗取IOmmol/L 對硝基苯磷酸鈉、120mmol/L ρΗΙΟ. 0 10. 5HC1-AMP 緩沖液、 0. 5mmol/L MgCl2 · 6H20、0. 5mmol/L硫酸鋅和lmmol/L HEDTA分別與不同濃度的海藻糖混合，在37°C條件下進行加速熱破壞試驗考察，加速試驗考察7天，檢測加入不同濃度海藻糖后空白吸光度的變化，結果見表1。表137°C加速實驗
權利要求
1.一種檢測堿性磷酸酶的試劑盒，其特征在于，包括對硝基苯磷酸鈉和海藻糖、 pHlO. 0 10. 5的緩沖液和激活劑。
2.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述海藻糖濃度為0.25 2g/L。
3.根據權利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述海藻糖濃度為lg/L。
4.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述緩沖液為2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液。
5.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述激活劑包括MgCl2· 6H20、硫酸鋅和 N-羥乙基乙二胺三乙酸。
6.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，包括5 20mmol/L對硝基苯磷酸鈉、 0. 25 2g/L海藻糖、100 140mmol/L ρΗΙΟ. 0 10. 5 2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、 0. 4 1. 5mmol/L MgCl2 · 6Η20、0· 2 0. 6mmol/L 硫酸鋅和 0. 5 2mmol/L N-羥乙基乙二胺三乙酸。
7.根據權利要求6所述試劑盒，其特征在于，包括lOmmol/L對硝基苯磷酸鈉、lg/L海藻糖、120mmol/L ρΗΙΟ. 0 10. 5 2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、0. 5mmol/L MgCl2 ·6Η20、 0. 5mmol/L硫酸鋅和lmmol/L N-羥乙基乙二胺三乙酸。
全文摘要
本發明涉及醫學檢測技術領域，公開了從上述的技術方案可以看出，本發明提供的檢測堿性磷酸酶的試劑盒，包括對硝基苯磷酸鈉和海藻糖、pH10～10.5的緩沖液和激活劑。海藻糖存在可以穩定對硝基苯磷酸鈉，避免對硝基苯磷酸鈉自身水解，提高對硝基苯磷酸鈉的穩定性。試驗表明，本發明所述試劑盒穩定性好，保存期長，應用本發明所述試劑盒檢測檢測結果準確性高、精密度好，線性范圍寬。本發明所述試劑盒適用范圍廣，便于推廣使用，可應用于各級醫院、衛生預防部門和醫學生物科研單位測定血清中堿性磷酸酶含量。
文檔編號G01N21/31GK102297962SQ20111013392
公開日2011年12月28日 申請日期2011年5月23日 優先權日2011年5月23日
發明者董理 申請人:董理