專利名稱：一種高效提取土壤樣品中磷脂脂肪酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種從鹽堿地土壤中提取磷脂脂肪酸(PLFA)的方法。
背景技術：
磷脂脂肪酸(PLFA)提取技術的發展，首先是脂類物質提取技術的發展。早在20世紀60年代以前，科學家們就在嘗試著建立測定食品中脂類物質的方法，但是，當時的方法并不十分令人滿意，存在著提取時間長、提取劑消耗大和只能提取部分脂類等缺點。1956年，Bligh和Dyer首次提出了一個簡單、快速地提取魚類中脂類物質的方法,但是，Blight和Dyer的方法在當時僅限于食品，特別是魚類的磷脂提取中，并未被應用于土壤。并且，這 個方法只能確定總脂類的含量，而如果只知道總脂類的含量，不能達到對土壤微生物群落結構進行分析的目的。White和Tunlid等在20世紀70年代末和80年代初發展了磷脂脂肪酸分析技術。White等分析了河口和海底沉積物中磷脂的含量，并與ATP和DNA合成等表沉積物微生物量的方法進行了比較，認為磷脂可以作為表征微生物生物量的一個指標。同時，還提出了該方法可以根據脂類物質的組成，對微生物群落結構進行分析。但是，他們并未對具體的脂肪酸進行測定。Tunlid等在《加拿大微生物學雜志》上發表的文章具有現代PLFA分析技術的雛形。他們利用磷脂脂肪酸技術對油菜根際微生物生物量和群落結構進行了定量分析，促進了 PLFA在土壤環境學中的應用。但上述磷脂脂肪酸分析技術存在諸多的不足，在以往的方法中采用購買SPE柱(Supelco公司)，消耗的溶劑雖少，然而，商業SPE柱相對較貴，購買過程復雜，對飽和脂肪酸收集效率較低，因此本發明中的自制柱可以在降低試驗成本的基礎上提高收集效率，適用于大批量土壤樣品的分析。
發明內容
本發明旨在提供一種從鹽堿地土壤中提取磷脂脂肪酸的方法。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案(I)稱取鹽堿地土壤，加入Bligh. Dyer提取液，避光震蕩，離心處理并取上清液；
(2)在上清液中加入檸檬酸和氯仿，室溫避光過夜，并收集下層氯仿，氮氣吹干，冷凍保存；
(3)將所述氯仿溶液加入到硅膠柱，進行柱層析，得到磷脂脂肪酸。其中，柱層析采用的硅膠柱的制備方法為，(I)稱取200-300目硅膠，加入氯仿并充分攪拌，所述硅膠與氯仿的重量比為I : 2; (2)裝柱；(3)待沉降完成后，加入氯仿，并用雙聯球或氣泵加壓，直至流速恒定，柱床被壓縮至9/10體積。進一步地，在柱層析分離步驟中，依次加入3-10cm的氯仿，IOcm左右的丙酮以及3-10cm甲醇，進行磷脂脂肪酸的提取。進一步地，鹽堿地土壤加入Bligh. Dyer提取液后，可以避光震蕩3個小時，然后以3600rpm的速度離心25分鐘。
進一步地，上清液中加入的檸檬酸體積為4. 8ml，加入的氯仿體積為4. 8ml。通過本發明提供的提取方法，可以提高磷脂脂肪酸的收集效率，降低試驗成本。通過本發明提供的磷脂脂肪酸提取方法，可有效濾除脂性醇、糖脂和中性脂等雜質，經過壓實后的柱子可以更充分地與硅烷醇中的活性位點接觸而被吸附，從而得到相對較高的含量。
具體實施例方式本發明涉及到一種提取磷脂脂肪酸的方法。本發明利用自制硅膠柱來提取土壤總磷脂脂肪酸，其收集效率高、工藝簡單、成本低廉。具體地說，本發明采用的技術方案如下I.稱取6g鹽堿地土壤，放入50ml離心管。加入20ml Bligh. Dyer提取液，避光震 蕩3小時左右，然后3600rpm離心25分鐘，取上清液。同樣方法加18ml Bligh. Dyer提取液，震蕩后，再次離心，合并兩次提取液，過濾至150ml三角瓶中，加入4. 8ml檸檬酸和4. 8ml氯仿，室溫避光過夜。用甲醇或乙醇潤洗氮吹儀針頭，第二天收集下層氯仿相于IOml試管中，N2吹干。-20°C保存。2.先用丙酮清洗玻璃管柱，然后用氯仿潤洗。將氯仿浸泡的硅膠加入柱中(氯仿壓柱，使硅膠柱長8cm左右)，三角瓶收集廢液，依次加入5cm左右的氯仿(濾出中性磷脂)，IOcm左右的丙酮(濾出醣酯類)，待丙酮消失后，加入IOcm甲醇(磷脂)，20ml試管收集甲醇液，N2吹干。-20°C保存。硅膠柱制作過程(I)稱量。200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠。(2)攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的氯仿用玻璃棒充分攪拌。(3)裝柱。將柱底用玻璃纖維塞緊(或玻璃柱自帶過濾纖維也可)，加入約1/3體積氯仿，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入玻璃柱內。隨著沉降，會有一些硅膠沾在玻璃管壁內，用氯仿將其沖入柱中。(4)壓實。沉降完成后，加入更多的氯仿，用雙聯球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。進行這一步可使分離度提高很多，且可以避免過柱時由于柱床萎縮產生開裂，這一步驟可使總的分離效率提高7.8%，其中表征細菌的16:0、il6:0、18:00飽和脂肪酸產量提高了 36.8%。表征真菌的18:lw9、18:2w6，9以及表征甲烷氧化菌的18:lw8的不飽和脂肪酸產量提高了 5. 3%，放線菌沒有顯著變化。(5)上樣。濕法上樣。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一玻璃纖維塞至接近硅膠表面。然后加入大量洗脫劑，也不會沖壞硅膠表面。(6)過柱和收集。柱層析實際上是在擴散和分離之間的權衡。太低的洗脫強度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子IOmg上樣量，Ig硅膠(200-300目)，0. 5ml收一餾分；l-2g上樣量，50g硅膠(200-300目),20-50ml收一餾分。采用這種方法得到的自制柱，分離到更多的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。硅烷醇(硅膠活化后產生的活性部位)包含有-0H，與硅原子可以直接綁定。硅烷醇與脂質的極性基團相結合，從而綁定滯留了脂質分子，脂質的非極性基團在分離純化過程中幾乎不起什么作用。當磷脂經過硅膠時，極性較小的不飽和脂肪酸在松散的自制柱中與活性位點接觸的可能性就減小，從而更容易被淋洗出，相反的，當它們經過壓實后的自制柱時，有更多機會與活性點接觸而被吸附，從而得到相對較高的含量。3.吹干樣加入Iml甲醇甲苯(I I)液和Iml 0. 5% KOH無水甲醇，37°C水浴30分鐘，冷卻至室溫，每個樣品中加入IOml乙酸中和，再加入2ml氯仿正己烷(I 4)和2ml超純水，靜置30分鐘分層，取上清液于IOml試管中，N2吹干。-20°C保存。4.每個樣品中加入I. 5ml內標，溶解后，注射器吸入，微孔過濾器過濾至GC/MS自動進樣瓶中，上機待測。
通過實驗證實，經過本發明提供的提取方法，磷脂脂肪酸的分離效率提高了7.8%，其中表征細菌的16:0、il6:0、18:00飽和脂肪酸產量提高了 36.8%。表征真菌的18:lw9U8:2w6,9以及表征甲烷氧化菌的18:lw8的不飽和脂肪酸產量提高了 5.3%。
權利要求
1.一種從鹽堿地土壤中提取磷脂脂肪酸的方法，其特征在于包括以下步驟(1)稱取鹽堿地土壤，加入Bligh.Dyer提取液，避光震蕩，離心處理并取上清液； (2)在所述上清液中加入檸檬酸和氯仿，室溫避光過夜，并收集下層氯仿，氮氣吹干，冷凍保存； (3)將所述收集物溶解于氯仿后加入到硅膠柱，進行柱層析分離，得到磷脂脂肪酸，其特征在于，所述硅膠柱的制備方法為a.稱取200-300目硅膠，加入氯仿并充分攪拌，所述硅膠與氯仿的重量比為I: 2; b.裝柱； c.待沉降完成后，加入氯仿，并用雙聯球或氣泵加壓，直至流速恒定，柱床被壓縮至9/10體積。
2.根據權利要求I所述的取上清液，其特征在于，避光震蕩3個小時，以3600rpm的速度離心25分鐘。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中加入的檸檬酸的體積為4.8ml,加入的氯仿體積為4. 8ml。
4.根據權利要求I所述的柱層析分離，其特征在于，依次加入3-10cm的氯仿，IOcm左右的丙酮以及3-10cm甲醇。
全文摘要
本發明提供一種從鹽堿地土壤中提取磷脂脂肪酸的方法，包括以下步驟(1)稱取鹽堿地土壤，加入Bligh.Dyer提取液，避光震蕩，離心處理并取上清液；(2)在上清液中加入檸檬酸和氯仿，室溫避光過夜，并收集下層氯仿，氮氣吹干后冷凍保存；以及(3)將收集物溶解于氯仿后加入到自制硅膠柱，進行柱層析分離，得到磷脂脂肪酸。通過本發明提供的磷脂脂肪酸提取方法，可有效濾除脂性醇、糖脂和中性脂，經過壓實后的柱子可以更充分的與硅烷醇中的活性位點接觸而被吸附，從而得到相對較高的含量，通過實驗我們發現磷脂脂肪酸總量的分離效率提高了7.8％。
文檔編號G01N1/40GK102798566SQ201110133719
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月23日 優先權日2011年5月23日
發明者李明, 孫兆軍, 王金枝, 姜麗麗, 王艷芬 申請人:中國科學院研究生院