專利名稱：高效液相色譜法檢測蛋黃卵磷脂中磷脂酰膽堿的制作方法
技術領域：
本方法屬于功能因子檢測方法領域，涉及采用高效液相色譜法檢測蛋黃卵磷脂中磷脂酰膽堿的方法。
背景技術：
卵磷脂是一種含磷的極性脂類物質，通常指含磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇等不同磷脂組分的混合物。卵磷脂具有重要的營養保健功能。它是生物膜的重要成分， 具有延緩衰老，調節脂肪代謝，預防心腦血管疾病，提高大腦活力，提高免疫力等作用，廣泛的應用于食品、醫藥、化妝品、飼料、涂料、農業生產等領域。磷脂酰膽堿是卵磷脂中最重要的功能成分。目前對于大豆卵磷脂的研究較多，蛋黃來源的卵磷脂近年來才由于其含量高、 氧化穩定性較好而逐漸引起人們的重視。蛋黃卵磷脂的檢測方法主要有丙酮不溶物法，測磷法，紫外分光光度法，但都不能準確的檢測出其主要功能成分磷脂酰膽堿的含量。高效液相色譜法是目前分離磷脂各組分，檢測磷脂酰膽堿含量最為廣泛研究和應用的方法，分為正相色譜法和反相色譜法。常用流動相主要有氯仿/甲醇/氨水、正己烷 /異丙醇/水、乙腈/甲醇/水、乙腈/甲醇/磷酸等三元體系。但由于磷脂是一種脂類物質，由不同種類的脂肪酸以及雙鍵結構構成，即使同是磷脂酰膽堿分子也包括不同的分子種類，在液相分析時常會出現峰的延展、拖尾現象，甚至會將磷脂酰膽堿組分分出好幾個峰，給定量帶來了困難。而且目前常用的流動相體系也比較復雜。流速大多為lml/min。從磷脂酰膽堿標準曲線的線性范圍來看，使用紫外檢測器時其最低限濃度大多為幾百微克每毫升，所需標準品量較大。
發明內容
本發明要解決的技術問題是彌補現有磷脂酰膽堿的液相分析方法中流動相體系組成復雜，流速較大，使用紫外檢測器時所需標準品量較大的不足，本發明提供一種高效液相色譜與紫外檢測器聯用的方法對蛋黃卵磷脂中的磷脂酰膽堿進行定性和定量。該方法流動相采用甲醇/乙酸二元體系，組成更加簡單，加入的乙酸溶液改善了磷脂酰膽堿的峰形， 有效抑制了嚴重的拖尾現象。且流速較低，為0.5ml/min，在保證出峰時間較快的前提下 (14min以內)減少了流動相溶劑的使用量，降低了成本。在高效液相-紫外檢測器系統環境中確定了磷脂酰膽堿的最大吸收波長為200nm。磷脂酰膽堿標準曲線線性范圍是10 μ g/ ml 160μ g/ml。經方法學驗證性試驗，證明本方法精密度、穩定性良好，準確度較高。本發明所采用的技術方案是(1)、分析柱與流動相的選擇C18色譜柱作為應用最為廣泛的液相分析柱之一，也曾作為本發明的考察對象， 以甲醇/乙腈/水體系作為流動相分離檢測磷脂酰膽堿，結果磷脂酰膽堿標準品被分離出好幾個峰，不利于定量。后考察安捷倫ZORBAX RX-SIL硅膠柱作為分析柱，首先考察正己烷-異丙醇體系作為流動相，標準品不出峰，后改為甲醇作為流動相，標準品出峰，但由于其具有許多不同的分子種類，因此出現嚴重的拖尾現象。向甲醇中嘗試加入一定量的 0. 2mol/L的乙酸溶液后，可改善峰形。而乙酸的量太小時，峰形改善不明顯，乙酸的量太大時，雖峰形明顯改善，但發生基線向上漂移現象，因此最后選擇加入3. 75%的乙酸水溶液， 即甲醇與乙酸溶液的體積比為96. 25 3. 75，此時峰形與基線的效果最理想。如
圖1所示。(2)檢測波長的確定根據文獻記錄，磷脂酰膽堿在不同溶液中的紫外最大吸收波長在210nm以內。尤其集中在204nm 206nm。為避免高效液相與紫外檢測器系統與獨立的紫外檢測器效果不同，本發明摒棄預先用獨立的紫外檢測器掃描磷脂酰膽堿的最大吸收波長的做法，而直接在高效液相與紫外檢測器系統中根據磷脂酰膽堿標準品響應值的大小來篩選其最大吸收波長。從198nm到206nm范圍內，在每個納米波長下測定其峰面積和峰高響應值，結果顯示在200nm下磷脂酰膽堿峰面積和峰高響應值都達到最大。如圖2、圖3所示，因此確定磷脂酰膽堿的檢測波長為200nm。(3)流動相流速的選擇考察了流速從0. 4ml/min到1. Oml/min范圍內磷脂酰膽堿出峰情況的變化。結果表明流速的大小對峰形無影響，只對出峰快慢有影響，流速大則出峰快，流速小則出峰慢。 選擇較小的流速0. 5ml/min作為技術參數，既節省了溶劑使用的成本，且保證了出峰時間較快(14min以內)。(4)標準曲線的制作以峰面積為指標，采用外標法測定卵磷脂樣品中磷脂酰膽堿含量。準確吸取 400 μ g/ml的磷脂酰膽堿標準溶液0. 25、1、2、3、細1，分別置于五個IOml的容量瓶中，并用色譜純甲醇定容，得到濃度分別為10、40、80、120、160μ g/ml的磷脂酰膽堿標準系列溶液。 分別將其在已確定的色譜條件下進樣，測定峰面積。以磷脂酰膽堿標準系列溶液濃度為橫坐標，以響應的峰面積值為縱坐標，繪制峰面積-濃度曲線，如圖4所示，得到的線性回歸方程為y = 17996x-53820，相關系數R值為0. 9986。(5)方法學驗證性試驗及檢出限和定量限的計算精密度的考察，將120μ g/ml的磷脂酰膽堿標準溶液重復進樣6次，統計分析，RSD 值為1. 1269%,如表1所示。穩定性的考察，將120 μ g/ml的磷脂酰膽堿標準溶液分別在O、 2、4、8、1 進樣，統計分析，RSD值為3. 0261%，如表2所示。準確度的考察，進行加標回收率試驗，精確吸取3份各0. 2ml已測得磷脂酰膽堿濃度的卵磷脂樣品液，置于6個IOml的容量瓶中，向其中分別加入80、120、160 μ g/ml磷脂酰膽堿標準液各6ml，用色譜純甲醇定容， 進樣檢測，回收率為93. 5701% 104. 12 %，平均回收率為97. 5989%，如表3所示。檢出限和定量限的計算，檢出限為3倍信噪比，定量限為10倍信噪比。選取一段時間計算噪音峰面積平均值，測定10 μ g/ml磷脂酰膽堿標品的峰面積，通過此時的信噪比，換算成3倍和10 倍信噪比時的磷脂酰膽堿標品濃度，即分別為檢出限和定量限。測得檢出限為0. 5904 μ g/ ml，定量限為1.9680 μ g/ml，如表4所示。表1方法精密度結果
權利要求
1.一種磷脂酰膽堿的檢測方法，采用高效液相色譜法與紫外檢測器聯用的方法對蛋黃卵磷脂中的磷脂酰膽堿進行定性和定量，其特征是以甲醇/乙酸二元體系為流動相進行等度洗脫，流速為0. 5ml/min，紫外檢測波長為200nm，磷脂酰膽堿標準曲線的線性范圍為 10 μ g/ml 160 μ g/ml。
2.根據權利要求1所述的磷脂酰膽堿的檢測方法，其特征是采用ZORBAXRX-SIL純硅膠色譜柱作為分析柱時，流動相為甲醇和0. 2mol/L的乙酸水溶液，二者的體積比例為 96. 25 3. 75。
3.根據權利要求1所述的磷脂酰膽堿的檢測方法，其特征是流動相的流速為0.5ml/min。
4.根據權利要求1所述的磷脂酰膽堿的檢測方法，其特征是在高效液相_紫外檢測器系統中，磷脂酰膽堿的最大吸收波長為200nm。
5.根據權利要求1所述的磷脂酰膽堿的檢測方法，其特征是本方法采用外標法定量， 磷脂酰膽堿標準曲線的線性范圍是10 μ g/ml 160 μ g/ml。
全文摘要
一種磷脂酰膽堿的檢測方法，采用高效液相色譜與紫外檢測器聯用的方法對蛋黃卵磷脂中的磷脂酰膽堿進行定性和定量，其特征是采用安捷倫公司ZORBAX RX-SIL(4.6mm×250mm，5μm)硅膠柱為分析柱，以甲醇/乙酸為流動相進行等度洗脫，其他洗脫條件為紫外檢測波長為200nm，柱溫30℃，進樣量15μl，流速為0.5ml/min。該方法流動相采用二元體系，組成更加簡單，加入的3.75％的乙酸溶液改善了磷脂酰膽堿的峰形，有效抑制了嚴重的拖尾現象。且流速較低，為0.5ml/min，節約了溶劑的使用成本。出峰時間較快，在14分鐘以內。磷脂酰膽堿標準曲線的線性范圍是10μg/ml～160μg/ml。經方法學驗證性試驗，證明本方法精密度、穩定性良好，準確度較高。
文檔編號G01N30/36GK102156174SQ20111011614
公開日2011年8月17日 申請日期2011年5月6日 優先權日2011年5月6日
發明者劉靜波, 宮新統, 常皓 申請人:吉林大學