專利名稱：一種快速檢測(cè)遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析試紙條及其制備和在遲緩愛德華氏菌檢測(cè)上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
遲緩愛德華菌氏病是養(yǎng)殖漁業(yè)中暴發(fā)性的一類細(xì)菌性疾病，流行于叉尾鲴科、鰻鱺科及牙鲆、鯉等經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，主要導(dǎo)致魚類的肝、腎病。該病多發(fā)于春夏之變、秋季等高水溫期，夏季達(dá)到高峰，其流行面積廣，死亡率較高，危害十分嚴(yán)重，已引起水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高度重視。對(duì)遲緩愛德華菌氏病的檢測(cè)鑒定，目前主要局限于細(xì)菌學(xué)檢查或病理觀察，按常規(guī)的細(xì)菌分離鑒定診斷復(fù)雜費(fèi)時(shí)，易延誤防治時(shí)機(jī)。另外，也有利用兔抗愛德華氏菌多克隆抗體、抗愛德華氏菌單克隆抗體建立的ELISA檢測(cè)方法應(yīng)用于愛德華氏菌的免疫學(xué)檢測(cè)。雖然ELISA檢測(cè)也能在幾小時(shí)內(nèi)診斷出愛德華氏菌病，具有較高的特異性和靈敏度，但存在操作技術(shù)要求高、設(shè)備比較昂貴等缺點(diǎn)，不便于基層生產(chǎn)應(yīng)用?；谶t緩愛德華菌在水產(chǎn)動(dòng)物中的流行狀況以及防治要求，開發(fā)研究便捷快速、靈敏特異的檢測(cè)技術(shù)已成為一種迫切的需要。本發(fā)明基于免疫學(xué)檢測(cè)原理和單克隆抗體、多克隆抗體制備技術(shù)及膠體金標(biāo)記技術(shù)，研制了一種遲緩愛德華氏菌的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條技術(shù)是20世紀(jì)90年代以來發(fā)展起來的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù)，近十多年來，膠體金標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展為繼同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記以及熒光標(biāo)記以后的一項(xiàng)重要的免疫標(biāo)記技術(shù)。由于其快速、便捷，不需特殊設(shè)備，結(jié)果判斷直觀等優(yōu)勢(shì)，近年來該方法得到快速發(fā)展，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用，但用于動(dòng)物疾病防控檢測(cè)領(lǐng)域的產(chǎn)品較少。本研究針對(duì)遲緩愛德華氏菌研制出了水產(chǎn)疾病檢測(cè)的免疫膠體金檢測(cè)試紙條，研制出相應(yīng)的快速診斷試劑盒將有力的促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對(duì)細(xì)菌性病害的有效控制防治。研究建立的膠體金檢測(cè)方法靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)，此方法建立后，同時(shí)可與經(jīng)典常規(guī)方法互補(bǔ)，預(yù)計(jì)將在水產(chǎn)動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)、水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖企業(yè)、檢驗(yàn)檢疫部門等具有較廣的應(yīng)用前景，有一定的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可用于檢測(cè)遲緩愛德華氏菌的靈敏、準(zhǔn)確、快速的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條及其制備方法和在遲緩愛德華菌氏檢測(cè)上的應(yīng)用。本發(fā)明提供了遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于該試紙條包括樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、底板，在底板上以樣品墊為起始端，依次重疊粘貼固定樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊。本發(fā)明提供了遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的制備包括以下步驟(1)制備抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體或多克隆抗體；(2)納米膠體金顆粒的制備；
(3)制備抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體或多克隆抗體的膠體金標(biāo)記物，形成金標(biāo)抗體；(4)將金標(biāo)抗體均勻噴涂到玻璃纖維素膜上，經(jīng)干燥形成金標(biāo)墊；(5)將抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體或抗遲緩愛德華氏菌多克隆抗體噴涂到硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線位置作為檢測(cè)線捕獲抗體，抗金標(biāo)抗體的二抗或葡萄球菌A蛋白噴涂到硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線位置作為質(zhì)控線捕獲抗體，封閉空白位點(diǎn)，充分干燥；(6)將吸收墊、帶有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊、底板組裝成膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。
圖1為本發(fā)明遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的組裝結(jié)構(gòu)圖，其中1 是樣品墊；2是金標(biāo)墊；3是檢測(cè)線顯色位置；4是質(zhì)控線顯色位置；5是硝酸纖維素膜；6是吸收墊；7是底板。圖2為本發(fā)明遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的外觀結(jié)構(gòu)圖，其中8 是塑料外殼；9是結(jié)果讀取窗口 ；10是檢測(cè)樣品加樣區(qū)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的具體實(shí)施方式
參照下面的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明，但并不局限于此。本檢測(cè)試紙條的制備包括以下步驟抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體細(xì)胞株的建立、兔抗遲緩愛德華氏菌多克隆抗體血清的制備、配對(duì)抗體的選擇、納米膠體金顆粒的制備、納米膠體金標(biāo)記PH值優(yōu)化、納米膠體金標(biāo)記蛋白濃度優(yōu)化、金標(biāo)墊的制備、硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線與質(zhì)控線抗體的噴涂及封閉、試紙條的組裝、檢測(cè)方法。實(shí)施例1、抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體細(xì)胞株的建立制備遲緩愛德華氏菌滅活抗原，免疫Balb/c小鼠，免疫之后制備脾細(xì)胞懸液；同時(shí)制備骨髓瘤細(xì)胞懸液；將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞雜交融合，篩選陽性單克隆細(xì)胞孔；經(jīng)進(jìn)一步的陽性克隆化及其篩選，建立抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2 株，分別命名為ETMcAb3A7、ETMcAb4Fll。該2株細(xì)胞株已于2010年6月6日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(中國.武漢.武漢大學(xué))，保藏編號(hào)分別為CCTCC NO :C201061和CCTCC NO :C201062。實(shí)施例2、抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體腹水的制備培養(yǎng)抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體細(xì)胞株ETMcAb3A7、ETMcAb4Fll，分別收集單克隆抗體細(xì)胞，分別腹腔注射Balb/c小鼠，潔凈環(huán)境飼養(yǎng)。約7-10d后觀察小鼠腹部，有明顯腹水者用12#針頭由腹腔下側(cè)穿刺回收腹水，3000r ^irT1離心5min，沉淀紅細(xì)胞及血細(xì)胞， 收集上層淡黃色的腹水，保存?zhèn)溆?。?shí)施例3、兔抗遲緩愛德華氏菌多克隆抗體血清的制備制備遲緩愛德華氏菌滅活抗原，首免加等量的完全弗氏佐劑，注射新西蘭兔，2-3 周內(nèi)進(jìn)行二免，抗原加等量不完全弗氏佐劑，一個(gè)月后三免。免疫結(jié)束后，通過頸動(dòng)脈割取血，經(jīng)5000r · miiT1離心后收集血清，無菌分裝，-80°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例4、配對(duì)抗體的選擇
配對(duì)抗體的選擇是選用已經(jīng)制備的抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體、多克隆抗體， 將所有相關(guān)抗體作配對(duì)實(shí)驗(yàn)后，選擇靈敏度、特異性較好的一組抗體，分別用于膠體金標(biāo)記和硝酸纖維素膜檢測(cè)線捕獲抗體的噴涂。我們選擇了實(shí)驗(yàn)室制備的抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體ETMcAb3A7、ETMcAb4Fll 與兔抗遲緩愛德華氏菌多克隆抗體，兩兩經(jīng)過夾心法實(shí)驗(yàn)與金標(biāo)抗體免疫層析實(shí)驗(yàn)，最后選擇一對(duì)效果最佳抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體ETMcAb3A7與 ETMcAb4Fll分別做為膠體金標(biāo)記抗體、檢測(cè)線抗體為最佳組合，該方案實(shí)施可降低樣品檢測(cè)中假陰性信號(hào)的出現(xiàn)，提高抗體的膠體金標(biāo)記效果，并能獲得可靠的結(jié)果。實(shí)施例5、納米膠體金顆粒的制備取250mL三角瓶一個(gè)，制備氯化金IOOmL,加熱沸騰；取ImL的檸檬酸鈉加入上述溶液中，迅速混合均勻，再保持沸騰15min，自然冷卻后蒸餾水恢復(fù)至IOOmL體積； 膠體金溶液用硅化過的試劑瓶4 °C保存，備用。膠體金燒制之后，靜置4h后觀察，若膠體金溶液表面有漂浮物，則棄取，重新燒制；4 °C保存的膠體金溶液表面若有漂浮物或絮狀沉淀，也應(yīng)棄取，重新燒制。實(shí)施例6、納米膠體金標(biāo)記pH值優(yōu)化取若干個(gè)5mL試管，分別加入1. 5mL 20nm膠體金；用0. 05moL · Γ1 K2CO3和 0. ImoL · L^1HCl將膠體金溶液的pH調(diào)為6 10 ；取1. 5ml離心管，按pH從低到高分別將上述膠體金分別取ImL加入管中，重復(fù)三次；每孔分別加入單克隆抗體200 μ L，濃度為 Img · mL—1，迅速混勻，混合，室溫下放置30min ；每孔分別加入5 % KCl 50 μ L，混勻后靜置 4h ；觀察膠體金顏色變化，記錄顏色變化較小的組，優(yōu)選PH為8. 0-9. 8 ；在優(yōu)選pH范圍內(nèi)調(diào)整，重復(fù)上述步驟，最適PH為8. 2。試驗(yàn)結(jié)果表明維持膠體金溶液穩(wěn)定的最佳pH值范圍為8. 2-9. 0，試驗(yàn)最優(yōu)pH值為 8. 2。實(shí)施例7、納米膠體金標(biāo)記蛋白濃度優(yōu)化本發(fā)明還在于提供一種獲得維持膠體金穩(wěn)定的抗體最佳標(biāo)記劑量的方法，包括取10支潔凈的1. 5mL離心管，分別加入最適pH值范圍的膠體金溶液ImL ；在1 10號(hào)管內(nèi)分別依次加入稀釋好的待標(biāo)記抗體20μ g、18y g、16y g、14y g、12y gUOy g、 8 μ g、6 μ g、4 μ g、0 μ g,混勻，靜置^Ilin ；在10個(gè)管內(nèi)分別加入10% KCl溶液50 μ L，混勻
后室溫靜置池；觀察顏色變化。未加抗體及加入量不足以穩(wěn)定膠體金的試管中的液體顏色呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的變化，而加入抗體量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定劑量的試管則保持紅色不變。與對(duì)照管(1號(hào)管)相比，顏色最接近、含抗體劑量最低的試管所含的抗體劑量，即為ImL膠體金所必須的抗體穩(wěn)定劑量，在此基礎(chǔ)上再加20%抗體，即為ImL膠體金所必須的抗體最佳標(biāo)記劑量。本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證和分析，得出的結(jié)果表明維持膠體金溶液適宜的蛋白抗體濃度為IOug-Iiir10實(shí)施例8、金標(biāo)墊的制備取兩個(gè)50mL的試管，分別加入IOmL 25nm膠體金；加入適量0. 05moL · L^1K2CO3調(diào)整PH為最適濃度；4°C條件下，加入最佳標(biāo)記濃度的抗體反應(yīng)20min，4°C 12000r · mirT1離心30min，棄去上清；每支離心管中加入IOmL重懸液懸浮沉淀后同上離心，棄上清液，管底得到暗紅色的疏松狀沉淀，重懸液為0. 2moL · L-1PB緩沖液(含BSA、0· 02% PEG、0. 3% Tween-20、0. ImoL .L-1NaCl)；重復(fù)離心 1 次，棄去上清；0. 05moL ·廠1PB(含 1% BSA,0. 02% PEG、0. 3% Tween-20、12%蔗糖、Na N3>0. ImoL ‘ T1NaCl)重懸沉淀，4°C冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?；取上述?biāo)記好的免疫膠體金溶液調(diào)整至一定濃度，均勻噴涂在玻璃纖維素膜上， 37°C溫箱中過夜干燥，密封包裝置于4°C冰箱備用。實(shí)施例9、硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線、質(zhì)控線抗體的噴涂及封閉將硝酸纖維素膜用的甲醇溶液浸泡飄洗后，迅速輕柔洗干，干燥；將抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體(2mg · mL-1)、兔抗鼠I gG抗體(Img · mL-1)分別加入bio-dot膠體金噴點(diǎn)系統(tǒng)的檢測(cè)線、質(zhì)控線的儲(chǔ)存瓶中，調(diào)整劃膜的位置，進(jìn)行噴膜劃線；將劃好檢測(cè)線、質(zhì)控線的硝酸纖維素膜置于37°C溫箱中烘干池；取出硝酸纖維素膜置于中性蛋白中浸泡潤濕后立即取出，置于37°C溫箱中封閉4h后，密封保存在4°C冰箱備用。試驗(yàn)結(jié)果制備了具有免疫活性的檢測(cè)線和質(zhì)控線，并用封閉液將空白位點(diǎn)封閉了的免疫硝酸纖維素膜。實(shí)施例10、試紙條的組裝將吸收墊、金標(biāo)墊、樣品墊分別裁成長條形2. 5cm、0. 5cm、1. 5cm ；將免疫硝酸纖維素膜沿不干膠底板的長軸方向、距不干膠底板上邊沿2. 2cm、下邊1. 8cm位置粘貼；將吸收墊與免疫硝酸纖維素膜重疊0. 3cm處粘貼在硝酸纖維素膜的上方；將金標(biāo)墊與免疫硝酸纖維素膜重疊0. Icm處粘貼在免疫硝酸纖維素膜的下方；樣品墊與金標(biāo)墊重疊0. Icm粘貼在金標(biāo)墊的下方；將從上到下依次固定有將吸收墊、免疫硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊的底板裁切成寬X長為0. 35cmX 6cm的長條，即成測(cè)試條，裝入塑料外殼，與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)，密封貯存。經(jīng)過組裝、剪裁、干燥、密封等步驟，即可組裝成遲緩愛德華氏菌膠體金快速檢測(cè)試紙條。實(shí)施例11、檢測(cè)方法待檢樣品的處理固態(tài)樣本如發(fā)病動(dòng)物病灶組織、水產(chǎn)品或細(xì)菌培養(yǎng)物等樣本， 加適量蒸餾水研磨離心或靜置待沉淀取上層清液；血液、腹水等液體樣本可直接抽取檢測(cè)樣本；含菌量較少的樣品可經(jīng)過培養(yǎng)基增菌后取菌液直接檢測(cè)；將遲緩愛德華氏菌膠體金快速檢測(cè)試紙條恢復(fù)室溫；抽取適量檢測(cè)樣本80-150 μ L，緩慢加入檢測(cè)卡上的加樣孔內(nèi)； 20min后觀察檢測(cè)試紙條的顯色情況，記錄結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果若含有遲緩愛德華氏菌，則與試紙上金標(biāo)抗體形成相應(yīng)的復(fù)合物，上行與包被在免疫硝酸纖維膜上的單克隆抗體結(jié)合，形成紅色線條，即在“T”處形成紅色條帶。 無論檢測(cè)樣品是否含有遲緩愛德華氏菌，金標(biāo)抗體繼續(xù)向上遷移與包被在膜上的兔抗鼠 I gG形成紅色沉淀線，即在“ C ”處形成紅色條帶。所以，若質(zhì)控線顯色，檢測(cè)線不顯色為陰性結(jié)果，檢測(cè)樣品不含有遲緩愛德華氏菌。若質(zhì)控線顯色，檢測(cè)線顯色為陽性結(jié)果，檢測(cè)樣品含有遲緩愛德華氏菌。若質(zhì)控線不顯色則檢測(cè)結(jié)果判定為試紙條變質(zhì)失效。
權(quán)利要求
1.一種遲緩愛德華氏菌的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于該試紙條包括樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、底板。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于樣品墊的材料選自玻璃纖維、濾紙纖維或聚脂膜，金標(biāo)墊的金標(biāo)抗體支持膜選自玻璃纖維、濾紙纖維或聚脂膜，吸收墊選用吸水濾紙，底板選用帶不干膠的PVC板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征在于底板上以樣品墊為起始端，依次重疊粘貼固定有樣品墊、金標(biāo)墊、帶有檢測(cè)線和質(zhì)控線抗體的硝酸纖維素膜、吸收墊。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征在于抗遲緩愛德華氏菌的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；質(zhì)控線抗體根據(jù)金標(biāo)抗體的來源可選擇羊抗兔、鼠抗兔、兔抗羊、羊抗鼠、兔抗鼠等的IgG或葡萄球菌A蛋白。
5.一種遲緩愛德華氏菌的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于該試紙條的制備步驟包括(1)制備抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體或多克隆抗體；(2)制備納米膠體金顆粒；(3)制備抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體或多克隆抗體的納米膠體金標(biāo)記物， 形成金標(biāo)抗體；(4)將金標(biāo)抗體均勻噴涂到金標(biāo)抗體支持膜上，經(jīng)干燥制備金標(biāo)墊；(5)將抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體或抗遲緩愛德華氏菌多克隆抗體噴涂到硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線位置作為檢測(cè)線捕獲抗體，抗金標(biāo)抗體的二抗或葡萄球菌A蛋白噴涂到硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線位置作為質(zhì)控線捕獲抗體，并封閉硝酸纖維素膜上的空白位點(diǎn)；(6)將吸收墊、帶有檢測(cè)線和質(zhì)控線抗體的硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊、底板組裝成膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。
6.一種遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的應(yīng)用，其特征在于該試紙條應(yīng)用于檢測(cè)遲緩愛德華氏菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試紙條，其特征在于該檢測(cè)步驟如下(1)取80-150μ L待檢樣本加在檢測(cè)試紙條的加樣區(qū)；(2)在20min內(nèi)觀察檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
一種快速檢測(cè)遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析試紙條，該發(fā)明涉及一種利用納米膠體金顆粒標(biāo)記抗體技術(shù)和雙抗體夾心免疫層析法檢測(cè)抗原模式，制備了遲緩愛德華氏菌的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。提供一種遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條及其制備方法與應(yīng)用。該試紙條含有樣品墊、金標(biāo)墊、帶有檢測(cè)線和質(zhì)控線抗體的硝酸纖維素膜、吸收墊、底板，將樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸收墊依次重疊相連粘貼在底板上組裝而成。本試紙條檢測(cè)應(yīng)用操作簡(jiǎn)單、特異性好、靈敏度高、方便快速，不需要特速儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨，易于推廣。適合用于對(duì)遲緩愛德華氏菌的感染、污染的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/544GK102288751SQ20111011321
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者吳斌, 張新艷, 曾占?jí)? 樊海平, 辛志明 申請(qǐng)人:福建省淡水水產(chǎn)研究所