專利名稱：檢測腫瘤標志物的生物電化學傳感器及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種新型生物電化學傳感器及其制備方法，特別是一種檢測腫瘤標志物的生物電化學傳感器及其制備方法。
背景技術：
癌癥是嚴重威脅人類健康的具有高發病率和高死亡率的疾病之一，然而，若在癌癥發展的早期階段即能將其診斷出來，將大大提高病人的存活率。可以說，早期診斷和早期治療是預防癌癥發展和降低死亡率最有效的辦法之一。腫瘤標志物是在腫瘤發生和增殖過程中由腫瘤細胞所產生、分泌并釋放到血液、細胞、體液中，反映腫瘤存在和生長的一類物質。它是腫瘤細胞在人體內存在狀態的具體表征，可以直接反應腫瘤細胞在體內的發展以及患者治療效果等情況。目前已有少量腫瘤標志物被應用于臨床檢測。然而，單個腫瘤標志物的檢測往往導致腫瘤檢測的假陽性或假陰性，如果能同時檢測多種腫瘤標志物則可以大大提高腫瘤檢測的靈敏性、特異性和準確性。近來，研究人員報道了一種稱作適體的分子探針。適體為單鏈DNA、RNA或是經過修飾的核酸，是通過一種體外選擇過程SELEX(指數富集的配體系統進化)產生的。在SELEX 技術中，能從大量的單鏈隨機寡核苷酸文庫中篩選出能與靶物質高特異性、高親和力結合的核酸配基，即為適體。在已經報道的文獻中，適體可以結合小分子物質諸如三磷酸腺苷 (ATP)，或是大分子物質如蛋白質，甚至可以與細胞特異性結合。由于具有高特異性識別靶物質、低分子量、合成簡便、易于修飾、低毒性、高穩定性等特點，適體越來越多被應用于各項研究以及生物傳感器的設計。目前，已有多種腫瘤標志物的適體被篩選出來，為適體應用于腫瘤標志物的檢測奠定了基礎。電化學生物傳感器是一類以電極作為信號轉換器，以電位或電流加以測量的生物傳感器。電化學體系借助電極實現電能的輸入或輸出，從而獲得電極表面修飾物質的電信號，常用的為三電極體系。三電極體系包括工作電極、輔助電極(也稱對電極)和參比電極， 其中的對電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，電流流經工作電極和對電極。工作電極所測得的電位是相對于參比電極而言。電化學方法作為一種分析檢測方法，具有設備低廉、靈敏度高、簡便快捷等優點。其中，方波伏安法具有很高的靈敏度，因此常應用于高靈敏度的檢測。
發明內容
本發明的目的之一在于提供一種聯合檢測兩種腫瘤標志物的新型生物電化學傳感器。本發明的目的之二在于提供該傳感器的制備方法。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
一種檢測腫瘤標志物的生物電化學傳感器，為三電極體系傳感器，其特征在于所述的三電極中的對電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，在該金電極上修飾有與兩種腫瘤標志物的DNA適體互補的DNA鏈，即cDNA鏈，并在該cDNA鏈末端標記上電化學探針二茂鐵分子
在上述的金電極上修飾有兩種腫瘤標志物的DNA適體互補的DNA鏈。在上述的金電極上修飾有與兩種腫瘤標志物的DNA適體互補的DNA鏈，該DNA鏈為帶有巰基的cDNA鏈，其堿基序列分為兩部分，第一部分與第一種腫瘤標志物的適體鏈互補，第二部分與第二種腫瘤標志物的適體鏈互補。上述的第一種腫瘤標志物為粘蛋白1 (MUC1)，第二種腫瘤標志物血管內皮生長因子(VEGF165)；所述的帶有巰基的cDNA鏈的堿基序列具體為5’-SH-(CH2) 6_AGGAT CAACT GCGGC CAGCA CACCC AGATC CT-NH2-3'。一種制備上述的檢測腫瘤標志物的生物電化學傳感器的方法，其特征在于該方法的具體步驟為
a)將處理過的金電極置于0.5M H2SO4中，在0 - 1.6 V的電壓范圍內進行循環伏安掃描，掃速為100 mV/s，直至達到穩定；
b)將該金電極置于含有巰基cDNA鏈溶液的Eppendorf管中，該溶液含有濃度為1μ M 的巰基 cDNA 鏈、10 mM Tris_HCl，pH 為 7. 8、1 mM EDTA、0. 1 M NaCl 禾口 10 mM 的三氯乙基磷酸酯，倒置16小時，再浸入2 mM巰基己醇水溶液中1小時，用超純水沖洗，即得到cDNA 鏈修飾的金電極；
c)將cDNA鏈修飾的金電極浸入5mM 1_ (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)、25 mM N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、5 mM 二茂鐵羧酸的混合溶液中，37° C水浴2小時，得到所需的工作電極；
d)將該工作電極與對電極和參比電極一起組成三電極體系的生物電化學傳感器。上述的巰基cDNA 鏈的堿基序列具體為5’-SH-(CH2)6-AGGAt CAACT GCGGC CAGCA CACCC AGATC CT-NH2-3'。。本發明第一次在金電極表面修飾上與兩種腫瘤標志物MUCl和VEGF165的DNA適體互補的cDNA鏈，并在此cDNA末端帶有電化學探針二茂鐵，在檢測過程中，用二茂鐵作為電信號的探針分子。當樣品中無腫瘤標志物存在時，待測液中兩種腫瘤標志物的DNA適體鏈同時以自由狀態存在時，金電極上修飾的cDNA鏈將會與兩種適體鏈分別雜交，形成剛性結構的DNA雙鏈，拉遠Fc與金電極表面的距離，使檢測到的電信號減弱；而當樣品中有腫瘤標志物存在時，腫瘤標志物即會與相應的DNA適體鏈分別結合，從而使待測液中呈自由狀態的DNA適體鏈減少，金電極表面修飾的cDNA就不能與適體鏈雜交而依然保持單鏈，在一定條件下形成莖環結構，使cDNA鏈末端的Fc與金電極表面的距離靠近，使檢測到的電信號增強。由此，通過金電極上修飾的cDNA鏈構象的變化導致探針分子電信號的改變，實現對兩種腫瘤標志物的聯合檢測。本發明構建了一種聯合檢測兩種腫瘤標志物的新型電化學傳感器，取得了滿意的結果。同樣的原理還可推廣到其它兩種或多種腫瘤標志物的聯合檢測，應用前景廣泛。
圖1 為在 0. 1 M 磷酸緩沖液(PBS)和 5 mM 鐵氰化鉀(K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6]) 溶液中，a 裸金電極；b 修飾了 cDNA鏈的金電極的阻抗圖。圖2為在0. 1 M高氯酸鉀溶液中，a 修飾有cDNA鏈的金電極；b :cDNA鏈標記上Fc后的方波伏安曲線。圖3為在0. 1 M高氯酸鉀溶液中，a 修飾有cDNA鏈的金電極；b_f 依次為加入不同濃度的腫瘤標志物MUCl (InM, 5nM，IOnM, 20nM, 40nM) ；g :Fc_cDNA的方波伏安曲線。圖4為在0. 1 M高氯酸鉀溶液中，固定一種腫瘤標志物MUCl濃度為40 nM, a-e 依次為加入不同濃度的腫瘤標志物VEGF165 (InM, 5nM，IOnM, 20nM, 40nM);f :Fc_cDNA的方波伏安曲線。圖5為在0. 1 M高氯酸鉀溶液中，a 修飾有cDNA的金電極；b 加入100 nM的血清白蛋白(BSA) ；c :Fc-cDNA的方波伏安曲線。
具體實施例方式實施例一 cDNA鏈修飾的金電極的制備
將待處理的金電極在含有氧化鋁(粒度分別為1 μπι，0.3 μπι,Ο. 05 μ m)砂漿的絲綢上依次拋光，再用乙醇、超純水分別超聲清洗5分鐘，隨后在金電極的表面滴10 μ L水虎魚溶液( :&H2S04=3:1)作用2分鐘，用超純水沖去后，將金電極置于0.5 M硫酸溶液中， 在0 - 1.6 V電壓范圍內進行循環伏安掃描，掃速設置為100 mV/s，約20圈達到穩定，用氮氣吹干，即得到表面處理干凈的裸金電極，可以用于巰基cDNA的修飾。修飾過程為將處理干凈的金電極浸入含有1 μ M巰基cDNA鏈(5’-SH-(CH2)6-AGGAT CAACT GCGGC CAGCA CACCC AGATC CT-NH2_3，)的 Eppendorf■管中，其中包括 10 mM Tris-HCl (pH 7.8)，1 mM EDTA, 0. 1 M NaCl和10 mM TCEP，室溫放置16小時。之后，再浸入含有2 mM MCH水溶液的Eppendorf管中1小時，用超純水沖洗，即得到cDNA鏈修飾的金電極。這一過程可用交流阻抗法進行監測。如圖1所示，未修飾cDNA鏈之前的裸金電極阻抗很小，修飾了 cDNA鏈之后，金電極的阻抗大大增加，表明cDNA成功地修飾到金電極上。實施例二 電化學探針分子Fc的修飾
將上述cDNA鏈修飾的金電極浸入5 mM EDC, 25 mM NHS, 5 mM 二茂鐵羧酸的混合溶液中，37° C水浴2小時。此過程中修飾于金電極上的cDNA鏈3’端的-NH2與二茂鐵羧酸的-COOH發生縮合反應，使!^c連在cDNA鏈末端，這一修飾的結果可用電化學方法監測。如圖2中的a曲線，Fc修飾前，由于cDNA鏈在0 - 0.6 V電壓范圍內不能發生氧化還原反應， 因此，沒有出現明顯的電信號；而b曲線在0.31 V左右出現了一個明顯的方波伏安信號，這是連接于cDNA上的Fc所產生的，表明Fc分子成功修飾到cDNA鏈的末端。實施例三樣品中只含有一種腫瘤標志物MUCl的情況
首先將含有不同濃度的腫瘤標志物MUCl (InM, 5nM，IOnM, 20nM, 40nM)的樣品加入待測液(10 nM MUC 1適體、10 nM VEGF165適體)中，室溫下反應1小時。在此過程，待測液中部分MUCl適體與其靶蛋白即腫瘤標志物MUCl結合，其余MUCl適體及全部VEGF165適體則自由游離在待測液中。反應結束后，將修飾有Fc-cDNA的金電極浸入100 μ L上述待測液中，室溫下反應 1.5小時，測定電化學信號。結果如圖3所示，隨著MUCl濃度的增加，電信號也逐漸增大， 并且，MUCl濃度為20 nM時反應基本達到飽和，至40 nM時電信號增加微弱。因此，我們將 20 nM MUCl設為此反應體系的最佳濃度。實施例四固定MUCl多肽的濃度，檢測不同濃度的VEGF165首先將含有40 nM MUCl和不同濃度的腫瘤標志物VEGF165( InM，5nM, IOnM, 20nM, 40nM) 的樣品加入待測液(10 nM MUCl適體、10 nM VEGF165適體)中，室溫下反應1小時。此過程中，待測液中的兩種適體分別與其相應的靶蛋白即腫瘤標志物MUCl和腫瘤標志物VEGF165 結合，多余的適體則游離在待測液中。反應結束后，將修飾有Fc-cDNA的金電極浸入100 μ L上述待測液中，室溫下反應 1. 5小時，測定電化學信號。結果如圖4所示，隨著VEGF165濃度的增加，電信號也逐漸增大， 并且，當VEGF165濃度為40 nM時的信號與濃度為20 nM時的信號很相近，說明20 nM VEGF165 為此反應體系的最適濃度。實施例五其他蛋白對本檢測體系的影響
為了確定本檢測體系的特異性，選擇血清白蛋白BSA作為對照蛋白進行測定。首先將含有100 nM BSA的樣品加入待測液(10 nM MUCl適體、10 nM VEGF165適體)中，室溫下反應 1小時。此過程中兩種適體都不與BSA結合，從而游離在待測液中。反應結束后，將修飾有Fc-cDNA的金電極浸入100 μ L上述溶液中，室溫下反應 1.5小時，測定電化學信號。結果如圖5中的b曲線所示，雖然樣品中的BSA濃度很大，但是電化學信號卻很微弱，這是由于適體結合的特異性所決定的，BSA不是兩種適體的目標物， 因此加入BSA時，待測液中的適體并不與之結合，而是游離在待測液中，在第二步反應中與金電極上的cDNA雜交形成雙鏈，拉遠Fc與金電極表面的距離，得到非常弱的電信號。以上結果說明，基于適體與其靶蛋白高特異性結合的特性及電化學方法所設計的這一檢測方案，可以實現對兩種腫瘤標志物的聯合檢測。同樣的原理還可推廣到其它兩種或多種腫瘤標志物的聯合檢測，應用前景廣泛。
權利要求
1.一種檢測腫瘤標志物的生物電化學傳感器，為三電極體系傳感器，其特征在于所述的三電極中的對電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，在該金電極上修飾有與兩種腫瘤標志物的DNA適體互補的DNA鏈，即CDNA鏈，并在該cDNA鏈末端標記上電化學探針二茂鐵分子。
2.根據權利要求1所述的檢測腫瘤標志物的生物電化學傳感器，其特征在于在該金電極上修飾有與兩種腫瘤標志物的DNA適體互補的DNA鏈。
3.根據權利要求2所述的檢測腫瘤標志物的生物電化學傳感器，其特征在于在該金電極上修飾有與兩種腫瘤標志物的DNA適體互補的DNA鏈，該DNA鏈為帶有巰基的cDNA鏈， 其堿基序列分為兩部分，第一部分與第一種腫瘤標志物的適體鏈互補，第二部分與第二種腫瘤標志物的適體鏈互補。
4.根據權利要求3所述的檢測腫瘤標志物的生物電化學傳感器，其特征在于所述的第一種腫瘤標志物為MUCl，第二種腫瘤標志物VEGF165 ；所述的帶有巰基的cDNA鏈的堿基序列具體為5，-SH-(CH2)6-AGGAT CAACT GCGGC CAGCA CACCC AGATC CT-NH2-3'。
5.一種制備根據權利要求1所述的檢測腫瘤標志物的生物電化學傳感器的方法，其特征在于該方法的具體步驟為將處理過的金電極置于0.5 M H2SO4中，在0 - 1.6 V的電壓范圍內進行循環伏安掃描，掃速為100 mV/s，直至達到穩定；將該金電極置于含有巰基cDNA鏈溶液的Eppendorf管中，該溶液含有濃度為1 μ M的巰基 cDNA 鏈、10 mM Tris_HCl，pH 為 7.8、1 mM EDTA、0. 1 M NaCl 禾口 10 mM 的三氯乙基磷酸酯，倒置16小時，再浸入2 mM巰基己醇水溶液中1小時，用超純水沖洗，即得到cDNA鏈修飾的金電極；將cDNA鏈修飾的金電極浸入5 mM 1_ (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)、25 mM N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、5 mM 二茂鐵羧酸的混合溶液中，37° C水浴2小時，得到所需的工作電極；將該工作電極與對電極和參比電極一起組成三電極體系的生物電化學傳感器。
6.根據權利要求5所述的檢測腫瘤標志物的生物電化學傳感器的制備方法，其特征在于所述的巰基cDNA鏈的堿基序列具體為5'-SH-(CH2)6-AGGAT CAACT GCGGC CAGCA CACCC AGATC CT-NH2-3'。
全文摘要
本發明涉及一種檢測腫瘤標志物的生物電化學傳感器及其制備方法。為三電極體系傳感器，其特征在于所述的三電極中的對電極是鉑電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，在該金電極上修飾有與兩種腫瘤標志物的DNA適體互補的DNA鏈，即cDNA鏈，并在該cDNA鏈末端標記上電化學探針二茂鐵分子。本發明的檢測腫瘤標志物的新型生物電化學傳感器結合了DNA適體高特異性結合靶蛋白以及電化學檢測方法高靈敏度的特點，使癌癥的早期診斷成為可能。
文檔編號G01N27/406GK102262118SQ201110106060
公開日2011年11月30日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者吳瑤, 李根喜, 趙婧, 趙洪喜, 郭超, 陳陽陽 申請人:上海大學