專利名稱：橙黃網胞盤菌凝集素反應性免疫球蛋白檢測技術的建立及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質技術領域，涉及糖蛋白的檢測，具體涉及橙黃網胞盤菌凝集素反應性免疫球蛋白水平檢測方法及其在原發性肝癌中的創新性診斷價值。該方法盡管不能區分健康和乙型肝炎病毒(HBV)感染患者，但是可作為不能得出直接診斷結果的中間步驟用于同檢測HBV的步驟公用以區分經診斷是HBV感染者中的肝癌和肝硬化患者。
背景技術：
近年來人們逐漸清楚地認識到蛋白糖基化修飾在很多疾病的發生發展中扮演著重要角色。肝臟是重要的蛋白質合成、加工場所，與血清蛋白的糖基化狀態密切相關。我國是HBV感染大國，我們在前期研究中已分別發現了 HBV感染后、肝硬化及肝癌患者血液中的特征性N-糖結構標志物。但有關這種糖標志物的靶蛋白分子及其意義尚存在爭議。下面以免疫球蛋白G為例介紹本發明的技術背景。IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白類型(占人血清Ig的80%)，其結晶段(Fe) 含有唯一的N-糖基化修飾保守位點，即Asn-297。Asn-297糖鏈由于核心七糖上連接的末端糖基不同，存在著種屬、組織、年齡和性別特異性。研究提示IgG的Fc段糖基化修飾狀態與多種疾病密切相關，例如隨類風濕性關節炎的發生、發展，IgG低半乳糖基化修飾的程度增加；晚期卵巢癌病人擁有高水平不對稱寡糖結構的Con A結合(高甘露糖)的IgG，該異常糖鏈存在于IgG的恒定區。IgG糖基化與功能密切相關。連接在Asn197的糖鏈可維持抗體的四級結構以及Fc段的熱穩定性，并通過影響IgG分子與FcRs、Clq以及Fcfoi的結合而分別調節IgG分子的抗體依賴細胞毒作用(ADCC)、補體依賴的細胞毒作用(CDC)以及半衰期。HBV感染是亞洲太平洋地區的高發性疾病，全世界每年都會新增HBV感染病例五千萬例，其中10-40%將發展為慢性肝病，并最終發展為肝纖維化、肝硬化和原發性肝細胞癌(HCC)。由于缺乏有效的診斷標志物，經常要在原發性肝細胞癌發展到晚期才能發現， 這使得原發性肝細胞癌的五年生存率極低(只有6%左右)。早期診斷和治療是將顯著提高原發性肝細胞癌患者的生存質量。目前臨床上的常用血清標志物甲胎蛋白在1/3的人群中仍處于正常水平。這使得原發性肝細胞癌的早期診斷和治療更加困難。現有文獻沒有報道橙黃網胞盤菌凝集素反應性免疫球蛋白與HBV相關肝病(包括慢性乙肝、肝硬化和肝癌)的直接相關性。本發明人經過長期研究開發了橙黃網胞盤菌凝集素反應性免疫球蛋白的檢測方法，發現盡管該方法本身無法區分健康人群和乙型肝炎病毒(HBV)感染患者或HBV感染者中的肝癌和肝硬化患者，但是它在與HBV的檢測方法聯用的情況下，可以用于區分HBV感染者中的肝癌和肝硬化患者，從而可以作為診斷肝癌和肝硬化的中間步驟
發明內容
本發明的目的是提供一種橙黃網胞盤菌凝集素反應性免疫球蛋白水平的檢測方法，并將該方法用于慢性乙肝(CHB)、肝硬化(LC)、原發性肝細胞癌(HCC)橙黃網胞盤菌凝集素反應性免疫球蛋白水平的中間步驟檢測，可作為無創性原發性肝細胞癌(HCC)監測、 診斷中所需的中間結果，也為可能的免疫調控干預提供了潛在的治療靶點。具體而言，在第一方面，本發明提供了一種檢測血清橙黃網胞盤菌凝集素反應免疫球蛋白水平的非診斷方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(A)血清樣品通過凝集素親和層析，收集橙黃網胞盤菌凝集素反應糖蛋白；(B)檢測收集的橙黃網胞盤菌凝集素反應蛋白中的免疫球蛋白量(簡稱為 A-Ig)；(C)計算橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量/血清免疫球蛋白總量。其中，血清樣品是離體樣品，優選是人血清樣品。本發明的方法不包括從生物體取樣的步驟。優選其中，所述的凝集素是橙黃網胞盤菌凝集素(簡稱為A)。通常，Ig被表示為免疫球蛋白或其數量(在數學公式中)，因此在本文中，橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白或其數量被簡稱為A-Ig。優選其中，該方法不包括檢測血清樣品的HBV感染性。由于本發明的方法不能區分健康人群和慢性乙肝患者，而對于其他疾病患者(如，HIV感染者)也不具有診斷依據， 只能用于判斷HBV感染的患者中原發性肝細胞癌的傾向。因此，當不清楚血清樣品是否是來自HBV感染的患者中的時候，即使是有經驗的醫師，也無法根據與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量/血清免疫球蛋白總量這一比值直接診斷出是否患有原發性肝細胞癌或其傾向(包括其他誤診情況)。因此，本發明的方法是可以用于原發性肝細胞癌診斷過程中得出非充分中間結果的過程。優選其中，橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量通過免疫比濁法來檢測。在本發明的具體實施方式
中，就是通過優選的方式進行檢測。優選其中，該方法進一步包括橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量/血清中免疫球蛋白總量的比值與50%相比較的步驟。這樣，如果進一步檢測出血清樣品是來自 HBV感染患者的血清(盡管這一檢測不包括在本發明的方法中)，這可以直接判斷該患者是否有原發性肝細胞癌的傾向。另外其中，該方法也可以不包括與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量/血清中免疫球蛋白總量的比值與24. 50%相比較的步驟。在第二方面，本發明提供了用于本發明第一方面的方法的檢測系統，其特征在于該系統包括預裝凝集素親和層析柱、生化分析儀、輸入設備、計算設備和輸出設備，其中輸入設備能將與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量和血清免疫球蛋白總量輸入計算設備，計算設備能計算A-Ig/Ig值。這些儀器本身是常規設備，但是它們組合在一起的系統是本發明人對本發明第一方面的方法進行研究后的結果。計算設備可以是個人電腦、服務器，也可以是只能做除法的計算設備，后者已經能夠滿足本發明的系統對計算設備的要求。優選其中，凝集素親和層析柱是橙黃網胞盤菌凝集素親和層析柱。在另一個方面，本發明提供了本發明第二方面的檢測系統在制造用于本發明第一方面的方法的裝置中的應用。
在第三方面，本發明提供了本發明第一方面的檢測血清橙黃網胞盤菌凝集素反應免疫球蛋白水平的方法在診斷原發性肝細胞癌中的應用，其中還進一步包括檢測血清樣品是否是HBV感染者的血清樣品的步驟。優選其中，包括診斷個體是HBV感染者并采集血清樣品供本發明第一方面的檢測血清橙黃網胞盤菌凝集素反應免疫球蛋白水平的方法中使用。
圖1 四組患者 Ig、A_Ig 及 A-Ig/Ig 測定結果(χ士 s，g/L)。**表示與其它兩組均有統計學差異(P < 0. 05)圖2 從肝硬化(LC)中辨別診斷原發性肝細胞癌(HCC)時，A-Ig/Ig和AFP的ROC 曲線。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細描述。實施例1 正常對照組(Control)、慢性乙肝組(CHB) ,HBV肝硬化(LC)組和HBV肝癌(HCC)組與橙黃網胞盤菌凝集素反應免疫球蛋白的檢測分析。收集2006年9月 2009年9月來上海市東方肝膽外科醫院接受治療并明確診斷的慢性乙型肝炎(CHB)、LC(肝硬化)患者的血清各30例，原發性肝細胞癌(HCC)患者血清 49例，其中每組男/女為13 2;平均年齡51. 6士13. 2歲。所有入選患者還必須滿足以下標準(1)均為乙型肝炎病毒(HBV)感染的乙肝患者；(2)由于經研究發現，其他病毒的感染者與正常對照組的(橙黃網胞盤菌凝集素反應性)的TP，ALB和免疫球蛋白均不具有以下規律，因此排除人類免疫缺陷病毒，肝炎病毒丙型、丁型、戊型和梅毒等除HBV感染之外的病原體感染；C3)排除自身免疫性肝病、酒精性肝病、藥物性肝病和Wilson病。另外選擇健康體檢者30例作為對照組，平均年齡51. 2士 10. 3歲。肝癌組、肝硬化組、肝炎組及對照組之間性別、年齡等一般資料比較差異均無統計學意義(P > 0. 05)。試劑或儀器橙黃網胞盤菌凝集素親和柱、清洗液和洗脫液(均購自中國人民解放軍第二軍醫大學)，免疫球蛋白G測定試劑盒(免疫比濁法)購自德賽診斷系統(上海) 有限公司，儀器采用日本日立(Hitachi) 7170生化分析儀，應用spss軟件分析結果。1)以上人員均抽提空腹全血，靜置30分鐘，3000rpm，IOmin.吸取上層血清，_80°C 冰箱保存備用。2)分離純化與橙黃網胞盤菌凝集素反應的總蛋白a. 200ul血清加入300ul清洗液中，混勻待用；b.預裝橙黃網胞盤菌凝集素親和柱，并裝入離心柱外管，室溫以3000rpm/min離心20秒；c.將稀釋血清加入預裝橙黃網胞盤菌凝集素柱，靜置lOmin，以3000rpm/min離心 20秒；d.加入Iml清洗液，以3000rpm/min離心20秒；e.將預裝橙黃網胞盤菌凝集素柱裝入新離心柱外管，加500ul洗脫液，室溫以 3000rpm/min 離心 20 秒；f.收集離心柱外管內液體。
3)檢測分析采用日立(Hitachi) 7170生化分析儀檢測血清及離心柱外管內收集液體的免疫球蛋白。血清中免疫球蛋白免疫比濁法進行檢測[參見參考文獻1]。離心柱外管內收集液體中與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白檢測方法與與血清中相同成分的檢測相同。將原發性肝細胞癌組(HCC)檢測結果與肝硬化組(LC)檢測結果、慢性乙肝對照組 (CHB)和陰性對照組(健康正常組)比較分析。本發明檢測結果為①肝癌組的免疫球蛋白與肝硬化組、CHB和正常對照組相比雖存在差異，但無統計學意義(p>0. 05)(見圖1)。②正常對照組和CHB組的A-Ig/Ig平均值分別是19.和19. 69%，非常接近， 表明該值無法用于直接診斷出健康人群和乙型肝炎患者。然而，從已經確診為HBV感染的患者中鑒別原發性肝細胞癌時，發現A-Ig/Ig的臨界值為24. 50%，大于24. 50%被判斷為原發性肝細胞癌，而小于50%被判斷為一般性的乙肝攜帶者(包括肝硬化和慢性乙肝的患者)，這一判斷規律正確率為82. 28 %。與現在臨床所用的診斷指標AFP相比，具有一定的優勢(見表1)。表1從肝硬化(LC)中辨別診斷原發性肝細胞癌(HCC)的診斷結果評估
權利要求
1.一種檢測與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白水平的非診斷方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(A)血清樣品通過凝集素親和層析，收集與橙黃網胞盤菌凝集素反應的糖蛋白；(B)檢測收集的與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量；(C)計算與橙黃網胞盤菌凝集素反應免疫球蛋白量(A-IgG)/血清免疫球蛋白總量 (IgG)。
2.根據權利要求1所述的與橙黃網胞盤菌凝集素反應免疫球蛋白水平的非診斷方法， 其特征在于，所述的凝集素是橙黃網胞盤菌凝集素(A)。
3.根據權利要求1所述的與橙黃網胞盤菌凝集素反應免疫球蛋白水平的非診斷方法， 其特征在于，該方法不包括檢測血清樣品的HBV感染性。
4.根據權利要求1所述的與橙黃網胞盤菌凝集素反應免疫球蛋白水平的非診斷方法， 其特征在于，與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量通過免疫比濁法來檢測。
5.根據權利要求1所述的與橙黃網胞盤菌凝集素反應免疫球蛋白水平的非診斷方法， 其特征在于，該方法進一步包括與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量/血清免疫球蛋白總量的比值與24. 50%相比較的步驟。
6.根據權利要求1所述的與橙黃網胞盤菌凝集素反應免疫球蛋白水平的非診斷方法， 其特征在于，該方法不包括與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量/血清免疫球蛋白總量的比值與24. 50%相比較的步驟。
7.用于權利要求1-6之任一所述的方法的檢測系統，其特征在于該系統包括預裝凝集素親和層析柱、生化分析儀、輸入設備、計算設備和輸出設備，其中輸入設備能將與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量和血清免疫球蛋白總量輸入計算設備，計算設備能計算 A-Ig/Ig 值。
8.根據權利要求7所述的檢測系統，其中凝集素親和層析柱是橙黃網胞盤菌凝集素親和層析柱。
9.權利要求1-6之任一所述的檢測與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白水平在診斷肝癌中的應用，其中還進一步包括檢測血清樣品是否是HBV感染者的血清樣品的步驟。
10.權利要求7-8之任一所述的檢測系統在制造用于權利要求1-6之任一所述的方法的裝置中的應用。
全文摘要
本發明屬于蛋白質技術領域，涉及糖蛋白的檢測，具體涉及與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白水平的檢測方法及其應用，包括計算與橙黃網胞盤菌凝集素反應的免疫球蛋白量/血清免疫球蛋白總量。該方法盡管不能區分健康和乙肝感染患者，但是可用于鑒別診斷乙肝感染患者中的肝癌和非肝癌患者。
文檔編號G01N33/68GK102253218SQ20111009995
公開日2011年11月23日 申請日期2011年4月20日 優先權日2011年4月20日
發明者季君, 房萌, 王慧, 衣常紅, 趙云鵬, 顧星, 高春芳 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學東方肝膽外科醫院