專利名稱：高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B<sub>12</sub>含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物含量測(cè)定領(lǐng)域，具體涉及一種高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法。
背景技術(shù)：
復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片產(chǎn)品為外貿(mào)出口品種，主要市場(chǎng)在非洲大陸尼日利亞等國(guó)家，在當(dāng)?shù)厥且粐?guó)際名牌產(chǎn)品，每年銷量5000萬(wàn)片以上，價(jià)格上有強(qiáng)勁優(yōu)勢(shì)。但由于該產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有現(xiàn)成的法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，按照外國(guó)公司提供的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)只能檢出維生素&與維生素 及雙氯芬酸鈉的含量，維生素B12的含量沒(méi)有方法檢測(cè)和做鑒別的要求。由于沒(méi)有方法檢驗(yàn)出復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12的含量，本申請(qǐng)人曾發(fā)生過(guò)出口產(chǎn)品被尼日利亞國(guó)家海關(guān)扣封的事件。于是，本申請(qǐng)人痛定思痛，決定對(duì)該產(chǎn)品檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行技術(shù)攻關(guān)，填補(bǔ)該標(biāo)準(zhǔn)上維生素B12檢驗(yàn)的空白。本處方制劑最主要的難點(diǎn)是維生素B12在處方中用量極少(50 μ g/510mg)，理論上僅有可能做色譜鑒別或者理化辨別。維生素B12及其制劑在CP2005、BP2009、USP31中均收載有檢驗(yàn)方法，但均是以單方和規(guī)格量較大形式建立的法定標(biāo)準(zhǔn)，且最小單元重量合理，便于檢驗(yàn)上樣品純化處理，檢驗(yàn)方法相對(duì)成熟。上述標(biāo)準(zhǔn)中的方法經(jīng)過(guò)試驗(yàn)結(jié)果不好，一是量小檢不出，如果加大稱樣量，樣品溶液非常難純化處理，不符合微量分析思維邏輯；二是雖然客服了操作方法純化處理好樣品溶液，但維生素仏與維生素 及雙氯芬酸鈉有干擾峰出現(xiàn)，無(wú)法給維生素B1定位和計(jì)算含量。試驗(yàn)成功希望渺小?；ǜ邇r(jià)請(qǐng)上級(jí)部門藥檢所和國(guó)外藥檢實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)做維生素B12鑒別或含量，均檢測(cè)不出維生素B12。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提出一種高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，以準(zhǔn)確可靠地測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12的含量。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出的高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法包括(1)在避光條件下往維生素B12對(duì)照品中加流動(dòng)相溶解制備對(duì)照品溶液(2)在避光條件下將復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片樣品除去包衣，研細(xì)后加入流動(dòng)相并用超聲波溶解，搖勻后離心沉淀，取上清液，稱定重量，加熱煮沸后放冷，再滴加流動(dòng)相至煮沸前的重量，搖勻，過(guò)濾，制得供試品溶液(3)色譜條件色譜柱選用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；以甲醇和0.05moL/L磷酸二氫鉀溶液體積比為22 78作為流動(dòng)相，磷酸二氫鉀溶液的PH值為6.4 ；柱溫為:35°C;
檢測(cè)波長(zhǎng)為36 Inm;流速為 1. OmL/min ；進(jìn)樣量為20 μ L。本發(fā)明方法對(duì)復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，方法簡(jiǎn)便、科學(xué)，試驗(yàn)時(shí)間短，無(wú)干擾峰，分離度、拖尾因子、不對(duì)稱度均符合中國(guó)藥典求，檢測(cè)結(jié)果良好。
具體實(shí)施例方式1.儀器與試藥采用LC-lOATvp日本島津高效液相色譜儀，SPD-lOAvp紫外檢測(cè)器，美國(guó)制造P/ N(7725i)手動(dòng)進(jìn)樣器，浙江大學(xué)N-2000數(shù)據(jù)工作站，柱溫箱，電子天平為十萬(wàn)分之一分析天平，DD80型超聲脫氣機(jī)，800型離心機(jī)。維生素^2對(duì)照品從中國(guó)藥物生物制品檢定所購(gòu)買(批號(hào)100248-200802，供HPLC法含量測(cè)定，含量95.5% )，復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片樣品自產(chǎn)(批號(hào)為091011)，甲醇為一級(jí)色譜純(產(chǎn)地天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司出品)， 水為雙蒸餾水(自制)，其他試劑為分析級(jí)試劑。2.色譜條件色譜柱選用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，尺寸為4. 60mmX 250mm，填料為Hypersil 0DS2，填料的粒徑為5 μ m。以甲醇和0. 05moL/L磷酸二氫鉀溶液體積比為22 78作為流動(dòng)相，用10%磷酸溶液或者2moL/L氫氧化鉀溶液把磷酸二氫鉀溶液的PH調(diào)為6. 4，流動(dòng)相使用前先用超聲脫氣機(jī)超聲脫氣處理30分鐘，以去除流動(dòng)相中的氣泡，柱溫為35°C，紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為361nm，流速為1. OmL/min，進(jìn)樣量為20 μ L。對(duì)于流動(dòng)相的選擇，進(jìn)行了幾次摸索試驗(yàn)，先以甲醇和0. 028mol/L磷酸氫二鈉溶液的體積比為26 74作為流動(dòng)相，用磷酸把磷酸氫二鈉溶液的PH值調(diào)為3. 5，維生素B12 的出峰時(shí)間提前在10分鐘左右，而且不能和同類水溶性維生素B1與 有效分離開(kāi)，結(jié)果不是很理想。后選擇以甲醇和0. 05mol/L磷酸氫二鉀溶液的體積比為35 65作為流動(dòng)相， 用10%磷酸溶液或2mol/L氫氧化鉀溶液把磷酸氫二鉀溶液的PH值調(diào)為6. 4，維生素B12的出峰時(shí)間仍在前面，有類似干擾。最后再把流動(dòng)相中甲醇和0.05mol/L磷酸氫二鉀溶液的體積比調(diào)為22 78，用10%磷酸溶液或2mol/L氫氧化鉀溶液把磷酸氫二鉀溶液的PH值調(diào)為6. 4，能夠有效分開(kāi)干擾峰，試驗(yàn)結(jié)果滿意。對(duì)于紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)選擇，用線性項(xiàng)下3mL置20mL量瓶中的溶液用紫外分光光度計(jì)在200-400nm波長(zhǎng)段掃描，發(fā)現(xiàn)在361nm波長(zhǎng)處均有最大的吸收值，故選擇該波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。3.樣品含量測(cè)定對(duì)照品溶液的制備精密稱取維生素B12對(duì)照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為25 μ g/mL的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備取復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片樣品20片除去包衣，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉5. 0849g置50mL量瓶中，精密加20mL流動(dòng)相用超聲波溶解，搖勻后用離心機(jī)離心沉淀，取上清液置50mL干燥燒杯中，稱定重量，加熱煮沸后放冷，再滴加流動(dòng)相至煮沸前的重量，搖勻，過(guò)濾，即得供試品溶液。
對(duì)照品溶液和供試品溶液均在避光條件下制備。在上述色譜條件下，取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μ L，注入高效液相色譜儀， 記錄色譜圖，再經(jīng)分析計(jì)算得出維生素A2的含量，結(jié)果測(cè)得復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片樣品中的維生素B12含量95. 49%。本方法測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片樣品中的維生素B12含量方法簡(jiǎn)單且科學(xué)，含量測(cè)定準(zhǔn)確可靠。4.專屬性試驗(yàn)對(duì)照品溶液的制備精密稱取維生素B12對(duì)照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為25 μ g/mL的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備取復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片樣品20片除去包衣，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉5. OOOg (相當(dāng)于B12O. 5mg)置50mL量瓶中，精密加20mL流動(dòng)相用超聲波溶解，搖勻后用離心機(jī)離心沉淀，取上清液置50mL干燥燒杯中，稱重，加熱煮沸后放冷，再滴加流動(dòng)相至煮沸前的重量，搖勻，過(guò)濾，即得濃度為25 μ g/mL的供試品溶液。對(duì)照品溶液和供試品溶液均在避光條件下制備。按復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片處方制得不含維生素B12的陰性樣品顆粒，按上述供試品溶液的制備方法制成空白樣品溶液，按上述色譜條件，精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白樣品溶液各20 μ L，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明空白樣品溶液不干擾供試品的含量測(cè)定。5.線性考察儲(chǔ)備溶液的制備精密稱取維生素B12對(duì)照品7. 5mg置IOOmL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到儲(chǔ)備溶液。避光操作制備儲(chǔ)備溶液。分別精密吸取儲(chǔ)備溶液0. 5mL、l. OmL,3. OmL,5. OmL,7. OmL,9. OmL 置 20mL 量瓶中，
加流動(dòng)相至刻度搖勻，得到各濃度溶液。分別精密吸取20 μ L，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。 每一濃度溶液分別各進(jìn)樣二次，求峰面積平均值，再以系列峰面積進(jìn)行線性考察。以維生素 B12的濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明維生素B12進(jìn)樣量在1. 875 33. 75 μ g范圍內(nèi)呈現(xiàn)良線性關(guān)系，回歸方程為Y = 20M04X-99700，相關(guān)系數(shù) r = 0. 9994。6.檢測(cè)限及最低檢測(cè)濃度精密吸取線性關(guān)系試驗(yàn)項(xiàng)下0. 5mL置20mL量瓶中的溶液lmL，置IOmL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，為樣品溶液，進(jìn)樣量為20 μ L。當(dāng)峰信號(hào)噪音與基線噪音比約為 3 1時(shí)得最小檢測(cè)濃度為0. 1875 μ g/mL，最小檢測(cè)量為3. 75ng。7.精密度試驗(yàn)(避光操作)以線性關(guān)系項(xiàng)下7. OmL到20mL量瓶中的溶液為樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，求取峰值面積，計(jì)算RSD = 0.57% (n = 6)，表明該方法精密度良好。8.重現(xiàn)性試驗(yàn)(避光操作)對(duì)照品溶液的制備精密稱取維生素B12對(duì)照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備取復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片樣品20片除去包衣，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉5. OOOg (相當(dāng)于B12O. 5mg)置50mL量瓶中，精密加20mL流動(dòng)相用超聲波溶解，搖勻后用離心機(jī)離心沉淀，取上清液置50mL干燥燒杯中，稱重，加熱煮沸后放冷，再滴加流動(dòng)相至煮沸前的重量，搖勻，過(guò)濾，即得供試品溶液。取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按色譜條件各進(jìn)樣20 μ L，測(cè)定維生素B12的含量， RSD = 0. 9% (n = 5)。表明本發(fā)明方法測(cè)定維生素B12的含量能達(dá)到真實(shí)、準(zhǔn)確的分析要求。9.穩(wěn)定性試驗(yàn)(避光操作)對(duì)照品溶液的制備精密稱取維生素B12對(duì)照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備取復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片樣品20片除去包衣，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉5. OOOg (相當(dāng)于B12O. 5mg)置50mL量瓶中，精密加20mL流動(dòng)相用超聲波溶解，搖勻后用離心機(jī)離心沉淀，取上清液置50mL干燥燒杯中，稱重，加熱煮沸后放冷，再滴加流動(dòng)相至煮沸前的重量，搖勻，過(guò)濾，即得供試品溶液。取照品溶液和供試品溶液，按色譜條件項(xiàng)下方法操作，每隔池進(jìn)樣檢測(cè)，分別求取面積值，RSD為1. 3% (n = 5)。表明供試品溶液在他內(nèi)穩(wěn)定性良好。10.回收率試驗(yàn)精密稱取維生素B12對(duì)照品6份，分別精密加入一定量處方中混合均勻的空白輔料顆粒，按含量方法測(cè)定，按外表一法計(jì)算回收率。結(jié)果表明維生素B12回收率平均為 99. 80%，RSD為1.84%，回收率良好。結(jié)果如表1所示。表1回收率試驗(yàn)結(jié)果(n = 6)
權(quán)利要求
1.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，包括(1)在避光條件下往維生素B12對(duì)照品中加流動(dòng)相溶解制備對(duì)照品溶液(2)在避光條件下將復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片樣品除去包衣，研細(xì)后加入流動(dòng)相并用超聲波溶解，搖勻后離心沉淀，取上清液，稱定重量，加熱煮沸后放冷，再滴加流動(dòng)相至煮沸前的重量，搖勻，過(guò)濾，制得供試品溶液(3)色譜條件色譜柱選用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；以甲醇和0. 05moL/L磷酸二氫鉀溶液體積比為22 78作為流動(dòng)相，磷酸二氫鉀溶液的PH值為6. 4 ；柱溫為:35°C ；檢測(cè)波長(zhǎng)為36 Inm ；流速為 1. OmL/min ；進(jìn)樣量為20 μ L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，其特征在于，用10%磷酸溶液或者2moL/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)磷酸二氫鉀溶液的 PH值。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，其特征在于，所述色譜柱的尺寸為4. 60mmX 250mm,填料粒徑為5 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，其特征在于，所述流動(dòng)相在使用前先超聲脫氣處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，其特征在于，所述水為雙蒸餾水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，包括(1)在避光條件下制備對(duì)照品溶液(2)在避光條件下將復(fù)合維B+雙氯芬酸鈉片樣品除去包衣，研細(xì)后加入流動(dòng)相并用超聲波溶解，搖勻后離心沉淀，取上清液，稱定重量，加熱煮沸后放冷，再滴加流動(dòng)相至煮沸前的重量，搖勻，過(guò)濾，制得供試品溶液(3)色譜條件色譜柱選用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；以甲醇和0.05mol/l磷酸二氫鉀溶液體積比為22∶78作為流動(dòng)相，磷酸二氫鉀溶液的pH值為6.4；柱溫為35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為361nm；流速為1.0ml/min；進(jìn)樣量為20μl。本發(fā)明測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，方法簡(jiǎn)便、科學(xué)，符合中國(guó)藥典求，檢測(cè)結(jié)果良好。
文檔編號(hào)G01N30/36GK102226795SQ201110082370
公開(kāi)日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者孫偉東, 艾建高 申請(qǐng)人:寧波雙偉制藥有限公司