專利名稱：一種用生物傳感器檢測脂酶非均相催化反應過程的方法
技術領域：
本發明涉及一種用生物傳感器檢測固定化脂酶非均相催化反應過程的方法。
背景技術：
隨著科學技術的發展，生物傳感器已經成為生物質技術必不可少的一種先進的檢測方法與監控方法，也是物質分子水平的快速、微量分析方法，具有較高的選擇性和靈敏度生物傳感器是一種特殊的器件或裝置，應用的是生物機理，與傳統的化學傳感器和離線分析技術落后相比，具有高選擇性、高靈敏度、較好的穩定性、能在復雜體系中進行快速在線監測等優點。基本工作原理是將生物敏感元件發生的特異性反應及信號經由物理元件——換能器，轉變為光、電、聲等易檢測信號，從而可將反映程度用離散或連續的數字信號表達出來，間接地獲知待測物的有關信息。目前生物傳感器主要應用于食物、農業、 生物技術、藥物和軍事領域。但目前還沒有利用生物傳感器檢測脂肪酶催化反應過程的方法。
發明內容
本發明提供一種用生物傳感器檢測脂酶非均相催化反應過程的方法，以解決目前還沒有利用生物傳感器檢測脂肪酶催化反應過程的方法的問題，將固定化脂肪酶催化底物所產生的電子轉移過程轉換成電流或電阻并輸出，從而判斷脂肪酶催化反應的終點。使用本發明方法的裝置包括恒溫水浴鍋1、敞口玻璃容器2、圓柱形石墨體3、鉬片 4、玻璃板、離子交換膜5、陰極室7以及陰極室內緩沖溶液、陽極室6以及陽極室內緩沖液、 電流表8、電阻9、單片機10、仿真機11、PC機12、電路板13、5V電源14和鉬絲15 ；敞口玻璃容器2置于恒溫水浴鍋1中，圓柱形石墨體3和鉬片4分別置于陰極室7和陰極室6中，陰極室7和陽極室6之間由玻璃板隔斷，且陰極室6與陰極室7之間由安裝在玻璃板上的離子交換膜5相連通，圓柱形石墨體3與鉬片4之間由鉬絲15相連接，電流表8和電阻9串聯在鉬絲15上，電阻9的中間抽頭連接在單片機10的信號輸入端上，仿真機11的一個通信端口連接單片機10，仿真機11的另一個通信端口連接PC機12，5V電源14給單片機10 提供電源；本發明的步驟如下步驟一水浴溫度65°C，采用恒溫水浴控制；步驟二 制取陽極液PBS 稱取磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉分別為1. 36g和1. 42g， 用200ml去離子水配制成濃度為0. lmol/L的緩沖溶液(PBS)；步驟三制取陰極液用去離子水將鐵氰化鉀配成過飽和溶液，陰極液為鐵氰化鉀過飽和溶液和PBS的混合液；步驟四測試將緩沖溶液的PH分別調到6、7、8，再將Novozym 435固定化脂肪酶 0. 09g與甘油三酯快速混勻，置于陰極室內；步驟五記錄電流強度采用靈敏電流表分別對三種不同PH環境下的電流強度進行測試進行測試，每隔半分鐘記錄一次數值；步驟六實驗過程五中取不同反應時間的混合液進行離心分離，得到的上層液用液相色譜測出脂肪酸和酯的含量，從而驗證電流值與脂肪酸和酯之間含量的對應關系。本發明是以固定化脂肪酶作為生物元件，以甘油三酯為反應底物，設計、研制了能將脂肪酶催化底物所產生的電子轉移轉換為電流或電阻輸出的電化學生物傳感器，并研究了 PH變化對其輸出數據的影響。固定化脂肪酶生物傳感器能夠將脂肪酶的專一性、靈敏性和電學的簡便、迅速巧秒地結合起來，可以在一個復雜的體系中，不受其他物質干擾，快速準確的測出某些物質的含量，并可測定酶與底物反應的程度。
圖1是本發明應用的裝置的結構示意圖。
具體實施例方式具體實施方式
一結合圖1說明，本實施方式如下使用本發明方法的裝置包括恒溫水浴鍋1、敞口玻璃容器2、圓柱形石墨體3、鉬片 4、玻璃板、離子交換膜5、陰極室7以及陰極室內緩沖溶液、陽極室6以及陽極室內緩沖液、 電流表8、電阻9、單片機10、仿真機11、PC機12、電路板13、5V電源14和鉬絲15 ；敞口玻璃容器2置于恒溫水浴鍋1中，圓柱形石墨體3和鉬片4分別置于陰極室7和陰極室6中，陰極室7和陽極室6之間由玻璃板隔斷，且陰極室6與陰極室7之間由安裝在玻璃板上的離子交換膜5相連通，圓柱形石墨體3與鉬片4之間由鉬絲15相連接，電流表8和電阻9串聯在鉬絲15上，電阻9的中間抽頭連接在單片機10的信號輸入端上，仿真機11的一個通信端口連接單片機10，仿真機11的另一個通信端口連接PC機12，5V電源14給單片機10 提供電源；步驟一恒溫水浴鍋1內的水浴溫度為65°C，采用恒溫水浴控制；步驟二 制取陽極液PBS 稱取磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉分別為1. 36g和1. 42g， 用200ml去離子水配制成濃度為0. lmol/L的緩沖溶液(PBS)；步驟三制取陰極液用去離子水將鐵氰化鉀配成過飽和溶液，陰極液為鐵氰化鉀過飽和溶液和PBS的混合液；步驟四測試將溶液的pH分別調到6、7、8，再將固定化脂肪酶0.09g與甘油三酯快速混勻，置于陰極室內；步驟五記錄電流強度采用靈敏電流表分別對三種不同PH環境下的電流強度進行測試進行測試，每隔半分鐘記錄一次數值；步驟六實驗過程五中取不同反應時間的混合液進行離心分離，得到的上層液用液相色譜測出脂肪酸和酯的含量，從而驗證電流值與脂肪酸和酯之間含量的對應關系。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一不同點在于步驟一中恒溫水浴的溫度為50 70°C，其它組成和步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同點在于步驟二中PBS的濃度為0. 01 lmol/L，其它組成和步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同點在于步驟四中的PH為5 9，其它組成和步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一不同點在于步驟四固定化脂肪酶加入量是甘油三酯的0. 1 0. 3%，其它組成和步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一不同點在于步驟五中記錄時間為 1 60秒。其它組成和步驟與具體實施方式
一相同。步驟一水浴溫度65°C，采用恒溫水浴控制；步驟二 陽極液PBS:稱取磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉分別為1.36g和1. 42g，用 200ml去離子水配制成濃度為0. lmol/L的緩沖溶液液(PBS)；步驟三陰極液用去離子水將鐵氰化鉀配成過飽和溶液，陰極液為鐵氰化鉀過飽和溶液和PBS的混合液；步驟四離子交換膜陽極室和陰極室之間安裝離子交換膜；步驟五按照說明書附圖連接反應裝置；步驟六測試將溶液的pH分別調到6、7、8，再將固定化脂肪酶0. 09g與甘油三酯 3ml快速混勻，置于陰極室內，分別對三種不同pH環境下的電流強度進行測試；步驟七記錄電流強度采用靈敏電流表對電路中的電流強度進行測試，每隔30 秒記錄一次數值；步驟八實驗過程中將混合液進行離心分離，得到的上層液用液相色譜測出脂肪酸和酯的含量，從而驗證實驗的結論。本實施方式中采用的主要設備為恒溫水浴鍋。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一不同點在于步驟一中恒溫水浴的溫度為50 70°C，其它組成和步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同點在于步驟二中PBS的濃度為0. 01 lmol/L，其它組成和步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同點在于步驟四中的pH為5 9，其它組成和步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一不同點在于步驟四固定化脂肪酶加入量是甘油三酯的0. 1 0. 3%，其它組成和步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一不同點在于步驟五中記錄時間為 1 60秒。其它組成和步驟與具體實施方式
一相同。
權利要求
1.一種用生物傳感器檢測脂酶非均相催化反應過程的方法，其特征在于在陰極室的緩沖液鐵氰化鉀過飽和溶液和PBS的混合液中，固定化脂肪酶催化底物產生離子，離子通過離子交換膜進入陽極室，在石墨和鉬片之間形成了循環電路，因此，電子轉移過程轉換成電流或電阻輸出。本方法基于下述裝置實現一種在線監控脂酶非均相催化反應生物傳感器裝置，其特征在于所述一種監測固定化脂肪酶水解過程的生物傳感器裝置，將敞口玻璃容器置于恒溫水浴鍋中，而圓柱形石墨和鉬片又分別置于陰極室和陽極室中，且陰極室與陽極室之間由離子交換膜相連通，石墨與鉬片之間由鉬絲相連接，電阻R和電源與之串聯。在電阻R上連一單片機，單片機又分別于5V電源、電路板和仿真機連接最后仿真機連接于PC 機上。此過程通過以下步驟實現步驟一水浴溫度65°C，采用恒溫水浴控制；步驟二 陽極液PBS 稱取磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉分別為1. 36g和1. 42g，用200ml去離子水配制成濃度為0. lmol/L的緩沖溶液液(PBS)；步驟三陰極液用去離子水將鐵氰化鉀配成過飽和溶液，陰極液為鐵氰化鉀過飽和溶液和PBS的混合液；步驟四離子交換膜陽極室和陰極室之間安裝離子交換膜；步驟五按照說明書附圖連接反應裝置；步驟六測試將溶液的PH分別調到6、7、8，再將固定化脂肪酶0. 09g與甘油三酯快速混勻，置于陰極室內，分別對三種不同PH環境下的電流強度進行測試；步驟七記錄電流強度采用靈敏電流表對電路中的電流強度進行測試，每隔半分鐘記錄一次數值；步驟八實驗過程中將混合液進行離心分離，得到的上層液用液相色譜測出脂肪酸和酯的含量，從而驗證實驗的結論。
2.根據權利要求1所述的一種用生物傳感器檢測固定化脂酶非均相催化反應過程的方法，其特征在于步驟一中恒溫水浴的溫度為50 70°C。
3.根據權利要求1所述的一種用生物傳感器檢測固定化脂酶非均相催化反應過程的方法，其特征在于步驟二中PBS的濃度為0. 1 lmol/L。
4.根據權利要求1所述的一種用生物傳感器檢固定化測脂酶非均相催化反應過程的方法，其特征在于步驟六中的pH為5 9。
5.根據權利要求1所述的一種用生物傳感器檢測固定化脂酶非均相催化反應過程的方法，其特征在于步驟六固定化脂肪酶加入量是甘油三酯的0. 01 0. 3%。
6.根據權利要求1所述的一種用生物傳感器檢測固定化脂酶非均相催化反應過程的方法，其特征在于步驟七中記錄時間為1 60秒。
全文摘要
一種脂酶非均相催化反應的生物傳感器的研究方法。本發明將固定化脂肪酶催化底物所產生的電子轉移過程轉換成電流或電阻并輸出，從而判斷脂肪酶催化反應的終點。本發明的步驟如下首先按照說明書附圖連接裝置，然后將PBS放入陽極室內；PBS和鐵氰化鉀過飽和溶液的混合液放入陰極室內。將底物和固定化脂肪酶快速混勻，置于陰極室內進行測試。用液相色譜測出脂肪酸和酯的含量，測出相對誤差僅為4.7％，驗證了本發明可快速準確地測定酶與底物反應過程中發生的酯鍵斷裂程度。本發明以固定化脂肪酶作為生物元件，將脂肪酶的專一性、靈敏性和電學的簡便、迅速巧秒地結合起來，可準確輸出電學信號，推算出反應底物的自重，從而決定反應終點。
文檔編號G01D5/12GK102212609SQ20111008150
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者于殿宇, 孔慶明, 富校軼, 張佳寧, 張敏, 時敏, 李振嵐, 李越, 王妍, 王玉, 王立琦, 王雪, 齊穎 申請人:哈爾濱商業大學