專利名稱：心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是危害人類生命和健康的第一殺手，發(fā)病趨勢(shì)也在逐年上升，美國(guó)急診部門就有4. 5億急性心肌梗塞(AMI)病人，有4億病人被確診為急性心肌梗塞，其中 2-3%的人真正有AMI，并且由于AMI的癥狀的多樣性，合并癥躲在臨床存在著相當(dāng)大的誤診和漏診，有些心肌損傷因?yàn)椴坏湫投会t(yī)生和患者忽視，而沒(méi)有及時(shí)救治，出現(xiàn)很多的生命危險(xiǎn)。急性心肌梗死發(fā)病急，死亡率高，AMI的早期診斷和及時(shí)救治對(duì)降低AMI死亡率非常重要。肌鈣蛋白是由肌鈣蛋白I，T，C三種亞基組成，在肌肉運(yùn)動(dòng)中起重要調(diào)節(jié)作用。當(dāng)心肌受到損失后，心肌肌鈣蛋白復(fù)合物釋放到血液中，在三種亞基中，肌鈣蛋白I( CTnI)是唯一存在心肌細(xì)胞中，迄今為止診斷AMI靈敏度和特異性最高的血清生化指標(biāo)，被廣泛研究作為心肌損傷的確定性標(biāo)志物，文獻(xiàn)表面，正常人血液中的cTnl水平在0. 5ng/ml以下， 發(fā)生心肌梗死后會(huì)在4-6小時(shí)內(nèi)上升，所以0、ng/ml WcTnI濃度的定量對(duì)知道醫(yī)生用藥，和病人就診非常重要。心肌肌鈣蛋白I常規(guī)檢測(cè)方法有放射性免疫法，高效液相色譜法，電化學(xué)分析法， 蛋白分析儀，ELISA診斷試劑盒和免疫層析試紙條等，這些方法有的存在放射性污染，需要專業(yè)大型儀器，耗時(shí)長(zhǎng)，需要專業(yè)人員，不能定量等缺點(diǎn)。在臨床上廣泛應(yīng)用具有一定局限， 不易廣泛推廣，也不適合家庭使用。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有類似的心肌肌鈣蛋白檢測(cè)方法的相關(guān)專利，申請(qǐng)?zhí)?00310119332. 3、名稱為“人體心肌肌鈣蛋白I的快速測(cè)定的方法”的專利，它提供的一種快速測(cè)定心肌肌鈣蛋白I的方法，但是該方法的步驟繁瑣，而且還需要專業(yè)設(shè)備才能測(cè)定含量。申請(qǐng)?zhí)朇N201020185781.3的專利雖能定量，但是制備過(guò)程繁雜。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服當(dāng)前膠體金免疫層析試紙條在實(shí)際推廣使用中只能定性不能定量檢測(cè)的不足，提供一種不要特定的儀器和專業(yè)設(shè)備，就能快速評(píng)定檢測(cè)結(jié)果，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量水平的測(cè)定，同時(shí)提供該試紙的制備方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的一種心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙，主要由樣品墊，結(jié)合墊，吸水墊，底板，硝酸纖維膜五部分組成，其特征在于所述硝酸纖維膜上分別劃有兩條平行的抗體捕獲線，靠近結(jié)合墊的一條含有經(jīng)過(guò)確定了濃度的第一抗心肌肌鈣蛋白 I單克隆抗體，作為檢測(cè)線，另一條含有經(jīng)確定了濃度的羊抗兔IgG抗體，作為標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線，兩條線相距4-7mm ；所述結(jié)合墊噴有膠體金或彩色乳膠標(biāo)記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標(biāo)兔IgG兩種物質(zhì)。優(yōu)選的，所述硝酸纖維膜與上部的吸水墊，硝酸纖維膜與下端的結(jié)合墊，結(jié)合墊與下部的樣品墊之間分別部分重疊交接，所述重疊寬度為l_4mm。
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所用的膠體金或彩色乳膠標(biāo)記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的金顆粒或乳膠大小在20nm— 120nm之間。進(jìn)一步優(yōu)選的，分別調(diào)整所述羊抗兔IgG抗體、抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體、金標(biāo)心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標(biāo)兔IgG的濃度，在檢測(cè)樣品時(shí)，當(dāng)樣品中的心肌肌鈣蛋白I激素濃度為2ng/ml時(shí)，檢測(cè)線與標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線的紅顏色深淺相同；當(dāng)樣品中的心肌肌鈣蛋白I激素濃度低于2ng /ml時(shí)，檢測(cè)線的紅色淺于標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線的紅色； 當(dāng)樣品中心肌肌鈣蛋白I激素濃度高于2ng /ml時(shí)，檢測(cè)線的紅色深于標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線的紅色。一種與權(quán)利要求4所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙配合使用的比色卡，該比色卡中含有多種紅色梯度的紅色塊，每種深淺的紅色塊，對(duì)應(yīng)用心肌肌鈣蛋白I半定量檢測(cè)試紙檢測(cè)不同濃度心肌肌鈣蛋白I抗原檢測(cè)所顯示的紅色；通過(guò)對(duì)照比色卡，可以半定量確定檢測(cè)樣品中的心肌肌鈣蛋白I的濃度。本發(fā)明的檢測(cè)方法為將血液等樣品滴4-5滴到樣品墊上，含心肌肌鈣蛋白I抗原的血液通過(guò)樣品墊的毛細(xì)作用，向硝酸纖維膜方向移動(dòng)，經(jīng)過(guò)金標(biāo)結(jié)合墊時(shí)，與金標(biāo)結(jié)合墊上的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體特異性結(jié)合，并使結(jié)合物一起向硝酸纖維膜移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)硝酸纖維膜上包被有抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的檢測(cè)線時(shí)，發(fā)生雙抗夾心特異性結(jié)合，樣品中的抗原和金標(biāo)的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體被包被在硝酸纖維膜的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體固定，從而使檢測(cè)線顯示膠體金的紅色，其檢測(cè)線的紅色深淺與樣品中的心肌肌鈣蛋白I抗原濃度程正比。未被檢測(cè)線固定的金標(biāo)心肌肌鈣蛋白I單抗和心肌肌鈣蛋白I激素抗原結(jié)合物或金標(biāo)心肌肌鈣蛋白I單抗繼續(xù)沿硝酸纖維膜上移，達(dá)到質(zhì)控線時(shí)，金標(biāo)心肌肌鈣蛋白I單抗不與質(zhì)控線上的羊抗兔IgG抗體反應(yīng)，而是定量的金標(biāo)兔 IgG與質(zhì)控線羊抗兔反應(yīng)，而被質(zhì)控線固定，顯示紅色，無(wú)論樣品中是否含有心肌肌鈣蛋白 I抗原，或抗原的濃度如何變化，質(zhì)控線始終顯色，且色值固定，如果質(zhì)控線不顯色，說(shuō)明試紙條無(wú)效。本發(fā)明還提供上述心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙的制備方法，包括以下步驟 選擇兩株抗心肌肌鈣蛋白I鼠源性特異單克隆抗體，即抗心肌肌鈣蛋白I單抗1和抗
心肌肌鈣蛋白I單抗2;
選擇抗心肌肌鈣蛋白I單抗1作為膠體金標(biāo)記抗體，使用檸檬酸鈉還原法制備為 20nm^l20nm大小的納米金顆粒，10000RPM/MIN離心10分鐘，制備為儲(chǔ)備液，將膠體金標(biāo)記單抗，并加入聚乙二醇PEG，牛血清白蛋白BSA做穩(wěn)定劑；
將標(biāo)記號(hào)的金標(biāo)抗體1，噴聚酯膜或玻璃纖維紙，低溫干燥，制得金標(biāo)結(jié)合墊； 將玻璃纖維膜浸泡在磷酸鹽緩沖液PBS加表面活性劑的溶液中5分鐘，再撈出30度左右烘干，制得樣品墊；
將2cm寬的硝酸纖維膜粘在PVC片材中間位置，并定量噴涂抗心肌肌鈣蛋白I單抗2 和定量的羊抗兔抗體兩條相距5mm的Imm寬的條帶，低溫干燥10小時(shí)；
裁剪一定寬度的吸水紙，黏貼在PVC片材上硝酸纖維素膜的上部，并交疊硝酸纖維膜 l-3mm ；
將金標(biāo)結(jié)合墊裁剪成5mm-13mm左右的條帶，黏貼在PVC片材上硝酸纖維膜的下部，交疊硝酸纖維膜l_3mm ；將樣品墊裁剪成25mm-30mm寬的條帶，再黏貼在金標(biāo)結(jié)合墊的下部，交接金標(biāo)結(jié)合墊 3mm-5mm ；
再用40mm左右的帶MAX線的不干膠，粘在金標(biāo)結(jié)合墊和樣品墊上； 用切割機(jī)將上面制得的大板，切成2. 5mm-6mm的條帶，即制備成了所述心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙，然后用鋁箔袋密封干燥備用。本發(fā)明心肌肌鈣蛋白定量檢測(cè)試紙的制備方法簡(jiǎn)單、成本低，檢測(cè)使用方便、能夠快速簡(jiǎn)便，半定量的靈敏檢測(cè)人體血液樣本中的心肌肌鈣蛋白I的含量，適合家庭使用和推廣。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體說(shuō)明。圖1為本發(fā)明心肌肌鈣蛋白定量檢測(cè)試紙的主視圖。圖2為本發(fā)明心肌肌鈣蛋白定量檢測(cè)試紙的側(cè)視圖。圖3為心肌肌鈣蛋白定量檢測(cè)試紙配合使用的比色卡主視圖。
具體實(shí)施例方式結(jié)合圖1、2所示，本發(fā)明心肌肌鈣蛋白定量檢測(cè)試紙主要由樣品墊01，結(jié)合墊 02，吸水墊06，底板07，硝酸纖維膜04五部分組成，硝酸纖維膜04上分別劃有兩條平行的抗體捕獲線，靠近結(jié)合墊的一條含有經(jīng)過(guò)確定了濃度的第一抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，作為檢測(cè)線03，另一條含有經(jīng)確定了濃度的羊抗兔IgG抗體，作為標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線05，也稱為質(zhì)控線，兩條線相距4-7mm ；結(jié)合墊02上噴有膠體金標(biāo)記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標(biāo)兔IgG兩種物質(zhì)。硝酸纖維膜04與上部的吸水墊06，硝酸纖維膜04與下端的結(jié)合墊02，結(jié)合墊02與下部的樣品墊06之間分別部分重疊交接，重疊寬度分別為l-4mm。所用的膠體金標(biāo)記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的金顆粒大小為 20nm—120nm。分別調(diào)整所述羊抗兔IgG抗體、抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體、金標(biāo)心肌肌鈣蛋白 I單克隆抗體和金標(biāo)兔IgG的濃度，在檢測(cè)樣品時(shí)，當(dāng)樣品中的心肌肌鈣蛋白I濃度為2ng/ ml時(shí)，檢測(cè)線與標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線的紅顏色深淺相同；當(dāng)樣品中的心肌肌鈣蛋白I激素濃度低于2ng /ml時(shí)，檢測(cè)線的紅色淺于標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線的紅色；當(dāng)樣品中心肌肌鈣蛋白I濃度高于2ng /ml時(shí)，檢測(cè)線的紅色深于標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線的紅色。心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙的制備方法，包括以下步驟
購(gòu)買心肌肌鈣蛋白I免疫小鼠，分別得到抗心肌肌鈣蛋白I鼠源性特異單克隆抗體兩株，抗心肌肌鈣蛋白I單抗1和抗心肌肌鈣蛋白I單抗2。選擇抗心肌肌鈣蛋白I單抗2 作為膠體金標(biāo)記抗體，使用檸檬酸鈉還原法制備最20nnTl20nm大小，適合標(biāo)記該抗體的納米金顆粒。10000RPM/MIN離心10分鐘，制備儲(chǔ)備液，將膠體金標(biāo)記單抗，并加入PEG，BSA做穩(wěn)定劑。將標(biāo)記號(hào)的金標(biāo)抗體1，噴聚酯膜或玻璃纖維紙。低溫干燥，制的金標(biāo)結(jié)合墊。將玻璃纖維膜浸泡在PBS加表面活性劑的溶液中5分鐘，再撈出30度左右烘干，制得樣品墊。 將2cm寬的硝酸纖維膜粘在PVC片材中間位置，并定量噴涂抗心肌肌鈣蛋白I單抗2和定量的羊抗兔抗體兩條相距5mm的約Imm寬的條帶。低溫干燥10小時(shí)。裁剪一定寬度的吸
6水紙，黏貼在PVC片材上，硝酸纖維素膜的上部，并交疊硝酸纖維膜l-3mm。將金標(biāo)結(jié)合墊裁剪成5mm-13mm左右的條帶，黏貼在PVC片材上，硝酸纖維膜的下部，交疊硝酸纖維膜l_3mm 左右。將樣品墊裁剪成25mm-30mm寬的條帶，再黏貼在金標(biāo)結(jié)合墊的下部，交接金標(biāo)結(jié)合墊 3mm-5mm左右。再用40mm左右的帶MAX線的不干膠，粘在金標(biāo)結(jié)合墊和樣品墊上，防止其脫落。用切割機(jī)將上面制得的大板，切成2. 5mm-6mm左右的條帶，即制備成了半定量檢測(cè)人心肌肌鈣蛋白I半定量檢測(cè)試紙條。用鋁箔袋密封干燥備用。在檢測(cè)前將鋁箔包裝袋拿出，室溫放置5min左右，取出試紙，將樣品墊下部浸于樣品溶液中，不超過(guò)MAX線，5秒鐘拿出，水平放置，5分鐘肉眼觀察檢測(cè)線和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控線。如果檢測(cè)線紅色大于質(zhì)控線，說(shuō)明樣品中肌鈣蛋白I濃度高于2ng/ml，樣品的來(lái)源人有心肌損傷的可能。如果檢測(cè)線紅色淺于質(zhì)控線，說(shuō)明樣品中的肌鈣蛋白I濃度低于 2ng/ml。如果想知道樣品中心肌肌鈣蛋白I的具體濃度，可以將檢測(cè)線的顯色結(jié)果與色卡對(duì)照，色卡中顏色與檢測(cè)線相近的色塊值，即為樣品中肌鈣蛋白I的濃度。即能快速，方便， 快捷的檢測(cè)樣品中肌鈣蛋白I的具體濃度，估量出心肌損傷程度。本發(fā)明制備的心肌肌鈣蛋白I半定量分析檢測(cè)層析試紙條和與ELISA試劑盒，對(duì)選取157份武漢市內(nèi)九家醫(yī)院的心梗急診部的血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如下
心肌肌鈣蛋白I半定量分析檢測(cè)層析試紙條142份陽(yáng)性，15陰性。ELISA試劑盒141份陽(yáng)性，16份陰性。心肌肌鈣蛋白I半定量分析檢測(cè)層析試紙條檢測(cè)結(jié)果與ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果總符合率為99. 4%。最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上具體實(shí)施方式
僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制， 盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙，主要由樣品墊，結(jié)合墊，吸水墊，底板，硝酸纖維膜五部分組成，其特征在于所述硝酸纖維膜上分別劃有兩條平行的抗體捕獲線，靠近結(jié)合墊的一條含有經(jīng)過(guò)確定了濃度的第一抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，作為檢測(cè)線，另一條含有經(jīng)確定了濃度的羊抗兔IgG抗體，作為標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線，兩條線相距4-7mm ；所述結(jié)合墊噴有膠體金或彩色乳膠標(biāo)記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標(biāo)兔IgG兩種物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙，其特征在于，所述硝酸纖維膜與上部的吸水墊，硝酸纖維膜與下端的結(jié)合墊，結(jié)合墊與下部的樣品墊之間分別部分重疊交接，所述重疊寬度為l_4mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙，其特征在于，所用的膠體金或彩色乳膠標(biāo)記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的金顆?；蛉槟z大小在20nm—120nm 之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙，其特征在于，分別調(diào)整所述羊抗兔IgG抗體、抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體、金標(biāo)心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標(biāo)兔IgG的濃度，在檢測(cè)樣品時(shí)，當(dāng)樣品中的心肌肌鈣蛋白I激素濃度為2ng/ml時(shí)，檢測(cè)線與標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線的紅顏色深淺相同；當(dāng)樣品中的心肌肌鈣蛋白I激素濃度低于 2ng /ml時(shí)，檢測(cè)線的紅色淺于標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線的紅色；當(dāng)樣品中心肌肌鈣蛋白I激素濃度高于2ng /ml時(shí)，檢測(cè)線的紅色深于標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線的紅色。
5.一種與權(quán)利要求4所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙配合使用的比色卡，該比色卡中含有多種紅色梯度的紅色塊，每種深淺的紅色塊，對(duì)應(yīng)用心肌肌鈣蛋白I半定量檢測(cè)試紙檢測(cè)不同濃度心肌肌鈣蛋白I抗原檢測(cè)所顯示的紅色；通過(guò)對(duì)照比色卡，可以半定量確定檢測(cè)樣品中的心肌肌鈣蛋白I的濃度。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于包括以下步驟選擇兩株抗心肌肌鈣蛋白I鼠源性特異單克隆抗體，即抗心肌肌鈣蛋白I單抗1和抗心肌肌鈣蛋白I單抗2;選擇抗心肌肌鈣蛋白I單抗1作為膠體金標(biāo)記抗體，使用檸檬酸鈉還原法制備為 20nm^l20nm大小的納米金顆粒，10000RPM/MIN離心10分鐘，制備為儲(chǔ)備液，將膠體金標(biāo)記單抗，并加入聚乙二醇PEG，牛血清白蛋白BSA做穩(wěn)定劑；將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體1，噴聚酯膜或玻璃纖維紙，低溫干燥，制得金標(biāo)結(jié)合墊；將玻璃纖維膜浸泡在磷酸鹽緩沖液PBS加表面活性劑的溶液中5分鐘，再撈出30度左右烘干，制得樣品墊；將2cm寬的硝酸纖維膜粘在PVC片材中間位置，并定量噴涂抗心肌肌鈣蛋白I單抗2 和定量的羊抗兔抗體兩條相距5mm的Imm寬的條帶，低溫干燥10小時(shí)；裁剪一定寬度的吸水紙，黏貼在PVC片材上硝酸纖維素膜的上部，并交疊硝酸纖維膜 l-3mm ；將金標(biāo)結(jié)合墊裁剪成5mm-13mm左右的條帶，黏貼在PVC片材上硝酸纖維膜的下部，交疊硝酸纖維膜l_3mm ；將樣品墊裁剪成25mm-30mm寬的條帶，再黏貼在金標(biāo)結(jié)合墊的下部，交接金標(biāo)結(jié)合墊3mm-5mm ；再用40mm左右的帶MAX線的不干膠，粘在金標(biāo)結(jié)合墊和樣品墊上； 用切割機(jī)將上面制得的大板，切成2. 5mm-6mm的條帶，即制備成了所述心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙，然后用鋁箔袋密封干燥備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種心肌肌鈣蛋白半定量檢測(cè)試紙，主要由樣品墊，結(jié)合墊，吸水墊，底板，硝酸纖維膜五部分組成，硝酸纖維膜上分別劃有兩條平行的抗體捕獲線，靠近結(jié)合墊的一條含有經(jīng)過(guò)確定了濃度的第一抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，作為檢測(cè)線，另一條含有經(jīng)確定了濃度的羊抗兔IgG抗體，作為標(biāo)準(zhǔn)濃度顯色對(duì)照線，兩條線相距4-7mm；結(jié)合墊噴有膠體金或彩色乳膠標(biāo)記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標(biāo)兔IgG兩種物質(zhì)。本發(fā)明心肌肌鈣蛋白定量檢測(cè)試紙的制備方法簡(jiǎn)單、成本低，檢測(cè)使用方便、能夠快速簡(jiǎn)便，半定量的靈敏檢測(cè)人體血液樣本中的心肌肌鈣蛋白I的含量，適合家庭使用和推廣。
文檔編號(hào)G01N33/532GK102207507SQ20111007176
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者周軍, 王健斌, 龔貽洲 申請(qǐng)人:武漢璟泓萬(wàn)方堂醫(yī)藥科技有限公司