單個生物分子反應實時原位表征方法

專利名稱：單個生物分子反應實時原位表征方法
技術領域：
本發明涉及一種單個生物分子反應實時原位表征方法。
背景技術：
到目前為止，大多數單分子研究依然采用光學顯微鏡的方法，其標記步驟不可避免，而熒光壽命也是必須考慮的問題。同時，針對單分子研究的特點還需要對檢測體系中的某些組分固定、對捕獲分子、檢測分子等進行細致的調節，以獲取高的信噪比；另外，困擾檢測的非特異性吸附也是必須特別考慮的。而另一方面，基于原子力顯微鏡(AFM)的力譜方法可對分子間的相互作用力給出定量的描述，精度可達到PN量級，是研究單分子的重要方法之一；但是，檢測速度相對較慢，通量低。最近發展起來的快速掃描AFM在單分子成像研究獲得了很大的進展，可實時記錄蛋白質構象變化的動態過程，為研究生物單分子行為及其機理提供了非常有價值的實驗數據；但是，對于蛋白質構型變化不夠顯著，如小于1納米的構型變化，就比較困難了。DNA折紙術是最近幾年得到迅猛發展的納米技術，利用一條單鏈DNA(通常為 M13mpl8)與相配對的200多條寡核苷酸鏈自組裝而成。一般通過設計不同的寡核苷酸鏈， 可使DNA組裝成不同的結構；同時由于寡核苷酸鏈末端可被多種分子修飾，所以具有圖案可控和編碼可循的特征，具有反應位點精確可控的優勢；而AFM具有納米級的分辨率，通過檢測折紙上特定位置的形貌變化就能夠準確判斷反應變化的情況，如反應是否發生，以及反應速度快慢等。但是，現有技術中并沒有一種能夠針對單個生物分子反應的實時原位成像方法， 該現狀亟待解決。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服了現有技術中對于單個生物分子反應實施動態實時原位納米尺度成像方法存在空白的缺陷，提供了一種能夠進行實時檢測，準確記錄描述單個分子反應過程，并便利研究界面上單分子反應動態過程的單個生物分子反應實時原位表征方法。本發明的單個生物分子反應實時原位表征方法包括如下步驟將反應物I固定于 DNA折紙設計位點，然后對修飾有反應物I的DNA折紙進行原子力顯微鏡成像，之后加入與所述反應物I對應結合的反應物II，并持續掃描成像收集數據即可。本發明中，所述的反應物I、反應物II為本領域常規所述的生物單分子之間可反應結合的一對物質，如抗原-抗體反應，DNA-蛋白質反應，較佳的為生物素-親和素系統、 或凝血酶-適配體反應系統。本發明中，所述的反應物I固定于DNA折紙設計位點的方式為本領域常規操作條件進行選擇，一般為修飾于DNA折紙上(也稱反應物I修飾的DNA折紙)。所述的DNA折紙、及其反應物I固定位點的設計均可為本領域常規操作方式設計。
本發明的單個生物分子反應原位表征方法較佳的為包括如下步驟將生物素固定于DNA折紙設計位點，對修飾有生物素的DNA折紙進行原子力顯微鏡成像，之后加入鏈霉親和素，并持續掃描成像收集數據即可。其中，所述的生物素為本領域常規所述，小分子、分子量對4;所述的親和素本領域常規所述，分子量為65kD，理論值大小為5nmX4nmX4nm。其中，所述的DNA折紙為本領域常規所述。所述的DNA折紙的圖案可根據需要設計，本實驗中較佳的為IOOnmX 70nm長方形圖案。所述的DNA折紙按本領域常規，一般由腳手架鏈M13mpl8 DNA和訂書釘單鏈自組裝形成，訂書釘單鏈用于固定腳手架鏈形成目標圖形。其中，所述的生物素固定的DNA折紙的設計位點一般按DNA折紙的圖案形狀設計， 本領域技術人員可按本領域常規操作具體進行，一般在DNA折紙制備時將目標設計位點的訂書釘單鏈替換為生物素修飾的訂書釘單鏈即可。所述的腳手架鏈M13mpl8 DNA、訂書釘單鏈(未修飾生物素)和生物素修飾的訂書釘單鏈均市售可得，例如，腳手架鏈M13mpl8 DNA(N4040S)可購自NEB公司、訂書釘單鏈和生物素修飾的訂書釘單鏈可購自上海生工公司ο其中，所述的生物素固定于DNA折紙的制備按本領域常規操作，一般于IXTAE/ Mg2+緩沖液中進行。所述的1 XTAE/Mg2+緩沖液一般包括如下組分Tris 40mM,乙酸20mM， EDTA 2mM, MgCl212. 5mM,且pH值為8。所述的生物素固定于DNA折紙的制備方法較佳的包括如下步驟將腳手架鏈M13mpl8 DNA與訂書釘單鏈(包括訂書釘單鏈和生物素修飾的訂書釘單鏈)混合后置于1 XTAE/Mg2+緩沖液體系，再置于PCR儀(Eppendorf Mastercycler Personal machine)上從95°C退火至20°C即可，其中退火速度為0. 1°C/10s。所述的有生物素的DNA折紙制備后一般于4°C保存。所述的腳手架鏈M13mpl8 DNA與訂書釘單鏈較佳的按摩爾比1 10 1 5混合，更佳的為1 10。其中，所述的原子力顯微鏡為本領域常規所述，例如NANC^cope IIIa系統 (Digital htrument，美國)、或者V型系統均可。所述的原子力顯微鏡掃描頭、原子力顯微鏡(AFM)探針均為本領域常規，例如原子力顯微鏡掃描頭為J型掃描頭、AFM探針為NP-S 氮化硅針尖(彈性系數0. 58ΝΠΓ1，Veeco公司)。其中，所述的原子力顯微鏡成像為本領域常規操作，一般為將修飾有生物素的DNA 折紙溶液滴加于云母片上吸附，之后置于原子力顯微鏡下，于液相輕敲模式進行成像操作。其中，所述的原子力顯微鏡成像的條件為本領域常規，一般影響不大，較佳的為溫 25 C ο其中，所述的原子力顯微鏡成像的各種溶液均按按本領域常規脫氣處理。其中，所述的修飾有生物素的DNA折紙溶液的濃度較佳的為3. 2nM 1. 6nM，更佳的為1. 6nM。其中，所述的修飾有生物素的DNA折紙溶液的用量為本領域常規，較佳的為大于0 且彡5 μ L，更佳的為2 μ L。其中，所述的吸附的時間為本領域常規，較佳的為aiiin 5min，更佳的為5min。其中，所述的原子力顯微鏡成像的云母襯底按本領域常規，一般為新解離的云母片。使用時，云母片粘于鐵片上，之后即可置于原子力顯微鏡載樣臺上進行AFM成像。
其中，所述的成像操作為本領域常規，較佳的為將ΙΧΤΑΕ/Mg2+緩沖液注入固定好的液體槽中進行成像操作。所述的1 XTAE/Mg2+緩沖液的用量較佳的為30uL 50uL，更佳的為50yL。其中，所述的液體槽為本領域常規使用，較佳的為配有細口徑導管的兩孔的液體槽。液體槽一般在使用時固定于載有樣品的云母片上方，之后注入成像時的各種溶液隨后即可進行成像操作。其中，所述的鏈霉親和素(str印tavidin，SA)溶液的濃度較佳的為7. 6nM 76nM。 所述的鏈霉親和素溶液的用量較佳的為30uL 50uL，更佳的為50uL。所述的鏈霉親和素溶液在成像過程中加入較佳為待吸附修飾有生物素的DNA折紙的云母片成像穩定后加入。 所述的鏈霉親和素溶液加入速度較佳的為以不影響成像為準。所述的鏈霉親和素溶液加入時，較佳的將液體槽的大孔堵住。所述的鏈霉親和素市售可得，如可購自上海生工公司。其中，所述的原子力顯微鏡成像模式為本領域常規，較佳的為AFM輕敲模式。所述的原子力顯微鏡成像使用力較佳的為最小力成像。其中，所述的原子力顯微鏡成像參數為本領域常規，較佳的為掃描速率2Hz，驅動振幅400mV,電壓0. 3V，掃描數256。本發明中所用原料和試劑均市售可得。在符合本領域常識的基礎上，本發明中上述的各技術特征優選條件可以任意組合得到較佳實例。本發明的積極進步效果在于本發明的單個生物分子反應原位表征方法能夠對單分子反應進行實時檢測，納米尺度下準確記錄描述單個分子反應過程，研究界面上的單分子反應動態過程，有希望提供一種非標記的單分子反應檢測方法進而為生物分子動力學研究提供有效的信息。


圖1為實施例IDNA折紙上生物素化訂書釘單鏈位點的示意圖。圖2為實施例1固定于DNA折紙上的生物素與鏈霉親和素動態實時原位的AFM圖像。圖3為實施例1固定于DNA折紙上的生物素與鏈霉親和素的結合率隨時間變化曲線圖。
具體實施例方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下述實施例中，腳手架鏈M13mpl8 DNA (N4040S)購自NEB公司，鏈霉親和素、未修飾生物素的訂書釘單鏈和生物素化的訂書釘單鏈購自上海生工公司。實施例11、本實施例設計的DNA折紙利用M13mpl8 DNA和訂書釘單鏈自組裝形成長方形圖案，長寬分別為IOOnm和70nm，如圖1所示，在DNA折紙的四個位置上，訂書釘鏈的末端為生物素化修飾，用于與鏈霉親和素的結合。具體生物素化的方塊DNA折紙的制備
將M13mpl8 DNA單鏈和訂書釘單鏈(包括生物素化訂書釘單鏈)按1 10摩爾濃度混合起來，并置于ΙΧΤΑΕ/Mg2+緩沖體系(Tris 40mM，乙酸20mM，EDTA 2mM, MgCl2 12. 5mM，且pH值為8)中，總體積為61uL，之后再置于PCR儀上以退火速度0. 1°C /IOs從 95°C退火至20°C，反應完成后4°C保存即可。2、實時原位檢測鏈霉親和素與生物素修飾的DNA折紙上的生物素動態反應過程滴2 μ L修飾有生物素的DNA折紙于新解離的云母上，吸附5分鐘后，在50 μ L ΙΧΤΑΕ/Mg2+緩沖液中，以AFM的液相輕敲模式成像，成像穩定后，向液體槽中緩慢注入一定7. 6nM的50uL鏈霉親和素溶液，連續掃描觀測鏈霉親和素與折紙術上的生物素位點結合過程，觀測結果記錄于圖2。其中，原子力顯微鏡為NANC^cope IIIa系統(Digital htrument，美國)，原子力顯微鏡掃描頭為J型掃描頭，AFM探針為NP-S氮化硅針尖(彈性系數0. 58ΝΠΓ1，Veeco公司)，成像條件為溫度25°C，濕度40 % 50 %，成像參數為掃描速率 2Hz，驅動振幅400mV，電壓0. 3V，掃描數256，且使用設備最小力成像。如圖2所示，圖加為加入鏈霉親和素之前的AFM圖像，圖像中的DNA折紙襯底表面上沒有鏈霉親和素，DNA折紙高度、長和寬的大小分別為2.4士0. lnm，102. 5士3. 3nm, 71. 1 士 1. 8nm ；圖2b為加入鏈霉親和素2分鐘后的AFM圖像，由圖可見有57個生物素位點上有白色圓點狀物顯現出來，其表觀高度在2. 5nm 4. Onm間，與理論值相當，說明鏈霉親和素已經與生物素結合。隨著時間的延長，白色顆粒狀物逐漸增多，最后結合率幾乎可達到100%，如圖2 的c、d、e、f分別為加入鏈霉親和素7. 5min、10min、20min和25min后的AFM圖像；其中，圖 2g為圖2d圖像中的放大圖像；圖池為圖2g圖像中相對應截面圖，對圖2g中折紙的高度分析，顯示出鏈霉親和素高3. Ixm, DNA折紙與鏈霉親和素的總高度達到6. Onm。3、鏈霉親和素與生物素的結合率待反應完成后，統計出掃描區域范圍內結合到DNA方塊折紙上的鏈霉親和素的總數，記為N。假設掃描時間為t時結合了的鏈霉親和素的個數為n，則(η/Ν) X 100%為該t 時間的鏈霉親和素與生物素結合的效率。以掃描時間為橫坐標，鏈霉親和素和生物素結合的效率為縱坐標，即可得到鏈霉親和素與生物素結合率隨時間變化的曲線圖。如圖3所述記錄為同一濃度(7. 6nM)鏈霉親和素溶液，做五組平行實驗求平均值所得到的曲線圖。從圖3中可以看到，剛加入鏈霉親和素時，兩者間的結合速度最快，在15 分鐘內一直維持在較高的水平，隨著生物素位點的減少，其與鏈霉親和素結合的速度也隨之下降，最后，在約30分鐘時，結合率基本已經達到100%的水平。結論由上述實驗結果可知，本發明的單個生物分子反應實時原位表征方法使用生物素-鏈霉親和素體系，生物素與親和素結合特異性非常高，只與DNA折紙上的生物素結合，由此也說明此系統中的非特異性吸附極其少，甚至可達到幾乎為零的程度，無生物素修飾的位置，無論是在DNA折紙表面上或者云母片的其他區域，都無可見的新物質出現；并且，本發明可直接在DNA折紙上生物素修飾的位置觀察到高度的變化，且該高度增加與理論值接近，由此，只要通過比較DNA折紙上設計的生物素位點數與AFM圖像中結合有親和素的生物素位點數，就可測定結合率，進而可通過計數的方法獲取反應動力學參數，更有望成為真正的單分子水平的生物分子動力學研究方法。
權利要求
1.一種單個生物分子反應實時原位表征方法，其特征在于其包括如下步驟將反應物I固定于DNA折紙設計位點，然后對修飾有反應物I的DNA折紙進行原子力顯微鏡成像， 之后加入與所述反應物I對應結合的反應物II，并持續掃描成像收集數據即可。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的反應物I和反應物II為生物素-親和素系統或凝血酶-適配體反應系統。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟將生物素固定于 DNA折紙設計位點，對修飾有生物素的DNA折紙進行原子力顯微鏡成像，之后加入鏈霉親和素，并持續掃描成像收集數據即可。
4.如權利要求1 3任一項所述的方法，其特征在于所述的DNA折紙為IOOnmX70nm 長方形圖案，由腳手架鏈M13mpl8 DNA和訂書釘單鏈自組裝形成，訂書釘單鏈用于固定腳手架鏈形成目標圖形。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述的生物素固定于DNA折紙的制備于 ΙΧΤΑΕ/Mg2+緩沖液中進行；所述的生物素固定于DNA折紙的制備方法包括如下步驟將腳手架鏈M13mpl8 DNA與訂書釘單鏈混合后置于1 X TAE/Mg2+緩沖液體系，再置于PCR儀上從 95°C退火至20°C即可，其中退火速度為0. I0C /IOs ；其中，所述的腳手架鏈M13mpl8 DNA與訂書釘單鏈按摩爾比1 10 1 5混合，較佳的為1 10。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述的原子力顯微鏡成像為將修飾有生物素的DNA折紙溶液滴加于云母片上吸附，之后置于原子力顯微鏡下，于液相輕敲模式進行成像操作。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述的修飾有生物素的DNA折紙溶液的濃度為3. 2nM 1. 6nM，較佳的為1. 6nM ；所述的修飾有生物素的DNA折紙溶液的用量為大于 0且彡5μ L，較佳的為2μ L ；所述的吸附的時間為ailin 5min，較佳的為5min。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述的成像操作為將ΙΧΤΑΕ/Mg2+緩沖液注入固定好的液體槽中進行成像操作，其中，所述的ΙΧΤΑΕ/Mg2+緩沖液的用量為30uL 50uL ；所述的液體槽為配有細口徑導管的兩孔的液體槽。
9.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述的鏈霉親和素的溶液的濃度為 7. 6nM 76nM ；所述的鏈霉親和素溶液的用量為30uL 50uL ；所述的鏈霉親和素溶液在成像過程中加入，為待吸附修飾有生物素的DNA折紙的云母片成像穩定后加入；所述的鏈霉親和素溶液加入速度為以不影響成像為準；所述的鏈霉親和素溶液加入時將液體槽的大孔堵住。
10.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述的原子力顯微鏡成像使用力為最小力成像；所述的原子力顯微鏡成像參數為掃描速率2Hz，驅動振幅400mV，電壓0. 3V，掃描數 256。
全文摘要
本發明公開了一種單個生物分子反應實時原位表征方法。該方法包括如下步驟將反應物I固定于DNA折紙設計位點，然后對修飾有反應物I的DNA折紙進行原子力顯微鏡成像，之后加入與所述反應物I對應結合的反應物II，并持續掃描成像收集數據即可。該方法能夠進行實時原位檢測，準確記錄描述單個分子反應過程，并有利于研究界面上單分子反應動態過程。
文檔編號G01N33/68GK102252954SQ20111006986
公開日2011年11月23日 申請日期2011年3月22日 優先權日2011年3月22日
發明者吳娜, 李賓, 胡鈞 申請人:中國科學院上海應用物理研究所