Angptl4作為血清學檢測肝癌轉移的標志物及其應用的制作方法

專利名稱：Angptl4作為血清學檢測肝癌轉移的標志物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤學和診斷領域。更具體地，本發明涉及一種可用于檢測肝癌轉移的血清標記物及其用途。
背景技術：
ANGPTL4基因(最初該基因被發明人的實驗室命名為ppll58)[朱洪新等，中華腫瘤雜志(2002)24(2) =123-125]就是利用此功能篩選技術平臺從人胎盤cDNA文庫中克隆到的新基因，該基因cDNA全長為1943bp，開放閱讀框含1218bp，編碼406個氨基酸，預計分子量為45.2kDa。N端有一疏水信號肽和卷曲(Coiled-Coil)結構域，C端有一纖維蛋白原樣 (Fibrinogen-like)結構域。并于2000年首先將該基因(原基因名為ppll58)的cDNA序列在GenBank上登錄(登錄號為AF202636)。現已同Yoon等克隆的PGAR[Mol. Cell. Biol.， Jul 2000 ；20 :5343-5349]和 Kim 等克隆的 HFARP [Biochem. J，2000，346 :603-610]由 HUGO 統一正式命名為 ANGPTL4 (angiopoietin-like 4)。
ANGPTL4在腫瘤轉移中的作用越來越引起人們的關注。目前的研究表明ANGPTL4 對腫瘤轉移的影響是非常復雜的，在不同的腫瘤中有不同的作用對Lewis肺癌細胞和黑色素瘤細胞B16R)的研究表明ANGPTL4能夠通過對血管和腫瘤細胞的雙重影響，即改變血管的滲透及腫瘤細胞的運動和侵潤能力，來抑制腫瘤細胞的轉移。與此相反，在乳腺癌的最新研究表明，TGFii I在乳腺癌中誘導ANGPTL4的上調，乳腺癌細胞分泌的ANGPTL4能夠破壞內皮細胞之間的連接，增加肺毛細管的滲透性，促進腫瘤細胞的跨血管內皮細胞的遷移， 與TGFii I共同啟動了乳腺癌的肺轉移。原發性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我國最常見惡性腫瘤之一，占居民腫瘤死亡第二位。肝癌出現癥狀時多屬中晚期，切除后復發、轉移率高。因此，肝癌(包括癌癥轉移)的早期診斷對延長患者的生存時間和降低肝癌死亡率具有重要意義。目前肝癌的診斷主要依靠影像學檢查、肝穿刺組織學檢查等方法，然而這些檢測方法均具有一定的局限性。例如即使是很好的細針穿刺仍因取材有限而有較高的假陰性率，并且有使腫瘤擴散和針道種植的危險。癌癥的血清學檢測技術一直是研究的重點。然而，目前現有的針對癌癥(如HCC)檢測尚缺乏令人滿意的血清標志物，更缺乏可用于檢測或判斷肝癌轉移的血清標志物。因此，本領域迫切需要開發可用于檢測或判斷肝癌轉移的血清特異標志物。

發明內容
本發明的目的就是提供一種可用于檢測或判斷肝癌轉移的血清特異標志物。在本發明的第一方面，提供了血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)或其特異性抗體的用途，它們被(a)用于制備檢測肝癌轉移的診斷試劑或試劑盒；和/或(b)用于制備血清檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒。在另一優選例中，所述的ANGPTL4蛋白或其特異性抗體偶聯有或帶有可檢測標記。在另一優選例中，所述可檢測標記選自下組生色團、化學發光基團、熒光團、同位素或酶。在另一優選例中，所述診斷試劑是單克隆抗體。在另一優選例中，所述的特異性抗體是單克隆抗體。在另一優選例中，所述的檢測肝癌轉移是血清檢測。在另一優選例中，所述的血清檢測是ELISA法、或雙抗夾心時間分辨免疫熒光法 (TRFIA 法)。

在本發明的第二方面，提供了一種用于檢測肝癌轉移的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有ANGPTL4蛋白或其特異性抗體；以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于檢測或診斷肝癌轉移。在另一優選例中，所述的標簽或說明書中注明以下內容⑴如果檢測對象的血清ANGPTL4濃度高于93. 5ng/ml，則該對象發生肝癌的幾率大于正常人群；和/或(ii)如果檢測對象的血清ANGPTL4濃度高于130ng/ml，則該對象發生肝癌轉移的幾率大于正常人群(或一般肝癌患者)。在另一優選例中，所述肝癌包括肝細胞肝癌，尤其是原發性肝細胞肝癌。在另一優選例中，所述的ANGPTL4蛋白或其特異性抗體偶聯有或帶有可檢測標記。在另一優選例中，所述可檢測標記選自下組生色團、化學發光基團、熒光團、同位素或酶。在另一優選例中，所述的抗體是單克隆抗體。在本發明的第三方面，提供了一種血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)的用途，它被用作血清檢測肝癌轉移的標志物。在本發明的第四方面，提供了一種血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)的拮抗劑的用途，它被用于制備抑制肝癌細胞轉移的藥物或用于制備抑制肝癌細胞轉移的抑制劑。在另一優選例中，所述的拮抗劑包括針對ANGPTL4的siRNA、反義RNA、抗體、或其組合。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I顯示了 ANGPTL4在高轉移潛能的肝癌細胞系中高表達。其中，采用定量 PCR(a)和Western blot (c)分別檢測ANGPTL4在各肝癌細胞系中mRNA和蛋白的表達；采用ELISA (b)的方法檢測細胞培養基上清中分泌性ANGPTL4蛋白的表達。結果表明ANGPTL4 在高轉移潛能的肝癌細胞系(MHCC-LM3，MHCC-97，MHCC-97L，MHCC-97H)中高表達。圖2顯示了外源性表達ANGPTL4促進Huh7和SMMC-7721肝癌細胞的跨血管內皮細胞遷移。各圖如下
a. Western blot 檢測 ANGPTL4 及分泌性 ANGPTL4 蛋白(sANGPTL4)在穩定過表達細胞系Huh7-lenti-ANGPTL4和SMMC-7721-lenti_ANGPTL4及相應對照細胞中的表達水平。b.采用定量PCR檢測ANGPTL4在穩定過表達細胞系Huh7-lenti_ANGPTL4和 SMMC-7721-lenti-ANGPTL4及相應對照細胞中ANGPTL4 mRNA的表達水平。c.采用ELISA方法檢測細胞培養基上清中分泌性ANGPTL4蛋白的表達。d. Huh7-1 enti-ANGPTL4細胞和對照組Huh7-lenti_control細胞跨血管內皮細胞遷移實驗代表性圖片(標尺為100 μ m)及遷移細胞數統計圖(*指P < O. 001)。e. SMMC-7721-lenti-ANGPTL4 細胞和對照組 SMMC-7721-lenti-control 細胞跨血管內皮細胞遷移實驗代表性圖片(標尺為100 μ m)及遷移細胞數統計圖(*指P<0. 001)。
圖3顯示了 ANGPTL4促進SMMC-7721細胞在裸鼠體內的肝內轉移及肺轉移。肝原位接種SMMC-7721-lenti-ANGPTL4細胞及其相應對照組細胞的肝內轉移和肺轉移(左圖， 標尺為100 μ m);右圖為統計圖(*指P <0.05)。圖4顯示了裸鼠血清中人SANGPTL4的水平。其中，肝原位接種 SMMC-7721-lenti-ANGPTL4細胞及其相應對照組細胞，6周后檢測其血清中人sANGPTL4水平。*P < O. 01圖5顯示了干擾ANGPTL4和ANGPTL4抗體均能抑制MHCC-97L細胞的跨血管內皮細胞遷移。各圖如下a.在MHCC-97L細胞中干擾ANGPTL4后跨血管內皮細胞遷移實驗代表性圖片 (200 X)及遷移細胞數統計圖(*指P < O. 05)。b. ANGPTL4抗體處理MHCC-97L細胞后，跨血管內皮細胞遷移實驗代表性圖片 (200X)及遷移細胞數統計圖，*指P < O. 05。圖6顯示了分泌性ANGPTL4蛋白促進Huh7和SMMC-7721的跨血管內皮細胞遷移。 各圖如下a.蛋白印跡檢測C0S7-lenti_ANGPTL4和C0S7-lenti_control細胞裂解液中和條件性培養基上清中ANGPTL4的表達。b.含人SANGPTL4蛋白的條件性培養基上清(CM-ANGPTL4)和對照組 (CM-control)處理Huh7后跨血管內皮細胞遷移實驗代表性圖片(200X)(左圖)；右圖為細胞遷移數統計圖。c. CM-ANGPTL4處理SMMC-7721和對照組后跨血管內皮細胞遷移實驗代表性圖片 (200X)(左圖);右圖為細胞遷移數統計圖；*指？ < 0.05。圖7顯示了分泌性ANGPTL4蛋白促進MHCC-97L細胞在體內的肺轉移。其中，條件性培養基上清處理實驗中，尾靜脈接種MHCC-97L細胞導致肝轉移和肺轉移。圖8顯示了 HCC患者血清和健康對照組血清中ANGPTL4的濃度。各圖如下a HCC患者血清和健康對照組血清中ANGPTL4的濃度的統計分析圖；b HCC患者伴發肝內轉移和未伴發肝內轉移患者血清中ANGPTL4的濃度的統計分析圖。*指P < O. 05。圖9顯示了血清ANGPTL4的ROC曲線。其中，ROC曲線下面積為O. 709±0. 026(95% 可信區間為O. 659和O. 759). cut-off值設定在93. 5ng/ml以區分健康對照組和肝癌患者，其敏感性和特異性為44. 7%和87. 4% .箭頭指示血清ANGPTL4的閾值(cut-off)為93.5ng/ml。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現，在肝癌細胞中分泌性ANGPTL4 能夠促進肝癌細胞的體外跨血管內皮細胞遷移和在動物體內的肝轉移和肺轉移；此外，肝癌患者血清中ANGPTL4濃度與肝癌患者是否發生肝內轉移密切相關。因此，血清ANGPTL4 可以作為檢測肝癌轉移和/或肝癌的標志物。在此基礎上完成了本發明。ANGPTL4蛋白和基因在本發明中，術語“本發明蛋白”、“ ANGPTL4蛋白”、“ ANGPTL4多肽”或“血管生成素樣蛋白ANGPTL4”可互換使用，都指具有人血管生成素樣蛋白ANGPTL4氨基酸序列 AAG22490(gi =10732648)的蛋白或多肽。它們 包括含 有或不含起始甲硫氨酸的血管生成素樣蛋白ANGPTL4。此外，該術語還包括全長的ANGPTL4及其片段。本發明所指的ANGPTL4蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突變體以及其功能上活性的片段。在本發明中，術語“ANGPTL4基因”、“ANGPTL4多核苷酸”或“血管生成素樣蛋白基因ANGPTL4”可互換使用，都指具有人ANGPTL4核苷酸序列(AF202636)的核酸序列。需理解的是，當編碼相同的氨基酸時，密碼子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而產生保守的氨基酸取代時，核苷酸的變換也是可被接受的。在得到了 ANGPTL4的氨基酸片段的情況下，可根據其構建出編碼它的核酸序列， 并且根據核苷酸序列來設計特異性探針。核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的ANGPTL4核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，衍生物)的 DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(如載體)和細胞中。通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的ANGPTL4多肽。一般來說有以下步驟(I).用本發明的編碼人ANGPTL4多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。本發明中，ANGPTL4多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含ANGPTL4編碼DNA序列和合適的轉錄 /翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞；動物細胞等。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收D NA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導) 誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結
口 ο特異性抗體在本發明中，術語“本發明抗體”和“抗ANGPTL4的特異性抗體”可互換使用。本發明還包括對人ANGPTL4多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人ANGPTL4基因產物或片段。較佳地，指那些能與人ANGPTL4基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。 本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制人ANGPTL4蛋白的分子，也包括那些并不影響人 ANGPTL4蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人ANGPTL4基因產物結合的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4，946，778);或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人ANGPTL4基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人ANGPTL4蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見 Kohler 等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Rur. T. Tmmunol. 6 511,1976 ；Kohler 等人，F.ur. T. Tmmunol. 6 :292,1976 ； Hammer I ing 等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. , 1981)。本發明的抗體包括能阻斷人 ANGPTL4蛋白功能的抗體以及不影響人ANGPTL4蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人ANGPTL4基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人ANGPTL4基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E. Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。抗人ANGPTL4蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測標本(尤其是血清樣本)中的人ANGPTL4蛋白。檢測方法利用ANGPTL4存在于血清中，且與肝癌轉移密切相關這一特點，本發明還提供了檢測或判斷肝癌轉移的方法，尤其是血清學檢測方法。
在本發明的一個優選例中，本發明提供一種檢測血清ANGPTL4的ELISA法以及時間分辨免疫熒光法(TRFIA)。檢測試劑盒本發明還提供了一種檢測肝癌轉移的試劑盒，它含有本發明的抗ANGPTL4的免疫球蛋白或免疫偶聯物，或其活性片段。本發明的人肝癌血清學診斷試劑盒，已完成實驗上百例，陽性率為約55%。用本發明的人肝癌轉移的血清學診斷試劑盒檢測為陽性的對象，其肝癌轉移的幾率明顯高于正常人群或一般肝癌患者。藥物組合物本發明還提供了一種藥物組合物，它含有上述的ANGPTL4的拮抗劑，以及藥學上可接受的載體。所述的藥物組合物可用于抑制肝癌細胞的轉移。在本發明中，所述的拮抗劑包括針對ANGPTL4的siRNA、反義RNA、抗體、或其組合。 此外，所述的拮抗劑還包括可以降低ANGPTL4表達或活性的小分子化合物。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內、靜脈內、或局部給藥。本發明的藥物組合物可直接用于抑制肝癌細胞的轉移。此外，還可與其他腫瘤治療劑聯用。本發明的藥物組合物含有安全有效量的本發明上述的ANGPTL4拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約I微克 /千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發明的ANGPTL4拮抗劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約I毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。抑制或促進肝癌細胞的遷移的方法和組合物

本發明還提供了 ANGPTL4激動劑及其在促進肝癌細胞遷移中的用途，尤其是在制備促進肝癌細胞遷移的促進劑或組合物的用途。在本發明中，用ANGPTL4激動劑或含該激動劑的組合物，可以促進肝癌細胞在體外或體內遷移。在一優選例中，提供了一種體外促進肝癌細胞遷移的方法，包括步驟在ANGPTL4 蛋白或其激動劑存在下，培養肝癌細胞。本發明還提供了 ANGPTL4拮抗劑及其在抑制肝癌細胞遷移中的用途，尤其是在制備抑制肝癌細胞遷移的抑制劑或組合物的用途。在本發明中，用ANGPTL4拮抗劑或含該拮抗劑的組合物，可以抑制肝癌細胞在體外或體內遷移。在一優選例中，提供了一種體外抑制肝癌細胞遷移的方法，包括步驟在ANGPTL4 拮抗劑存在下，培養肝癌細胞。本發明的主要優點包括(I)首次提供了通過血清標志物檢測和判斷肝癌轉移的方法，有助于早期檢測或輔助檢測肝癌轉移，從而有助于盡早確診并采取相應治療措施。(2)血清檢測方法更方便快速，更容易為病人接受。(3)便于動態監察HCC患者的病情進展。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。實驗方法SDS-PAGE電泳和Western免疫印跡分析細胞裂解和蛋白電泳用冰預冷的PBS洗滌培養細胞，收集后將其懸在含有蛋白酶抑制劑混合物(cocktail)的RIPA緩沖液(購自Pierce公司)中裂解，裂解過程在冰上進行30分鐘。4°C條件下12，000r/min離心10分鐘后收集上清，然后采用常規BCA法蛋白定量。定量后的樣品與5X上樣緩沖液混合并在95-100°C水浴中變性5分鐘。蛋白電泳在 SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)及緩沖體系中進行，樣品按30-60 μ g/孔上樣，80/120V恒壓電泳。免疫印跡電泳結束后，采用濕轉法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。轉膜條件 220mA恒流作用30分鐘。結束后將膜在PBST (0. I % Tween 20)中漂洗一次，浸入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉I小時。然后將膜浸入用封閉液稀釋的適當濃度的一抗，4°c孵育過夜。次日以PBST洗膜三次，每次10分鐘。之后與封閉液稀釋的過氧化物酶偶聯二抗進行反應，室溫孵育I小時后，再以PBST洗膜三次。目標蛋白條帶的發光顯影利用SuperSignal 化學發光試劑(購自Pierce公司)進行。所有Western免疫印跡實驗均以β-actin作為內參。實時定量PCR檢測逆轉錄用PrimeScript RT reagent Kit (Takara 公司)，在 200 μ I 微量離心管中配置混合液5XPrimeScript Buffer (for Real Time) 2 μ I ；PrimeScript RT Enzyme Mix I 0. 5 μ I ；01igo dT Primer (50 μ M) 0. 5 μ I ；Random 6 mers (100 μ M) 0. 5 μ I ;總 RNA 500ng ;DEPC水補足10μ I。37 V反應15分鐘，85°C處理5秒鐘，然后冰浴冷卻。其中，總 RNA用常規方法抽提。定量PCR:將逆轉錄得到的cDNA反應液I : 50稀釋備用。PCR反應在20 μ I體系中進行2μ1 cDNA稀釋液(相當于50ng起始RNA量)；上下游引物各O. 4 μ I ;2 X SYBR Premix Ex Taq Solutions (Takara 公司)10 μ I ;滅菌蒸懼水 7. 2 μ LPCR反應在ABI 7300 定量PCR儀上進行，反應條件為兩步法PCR擴增標準程序第一步95°C，30秒，I個循環；第二步95°C，5秒，60°C，31秒，40個循環。反應測得的基因表達水平使用內源性甘油醛_3_磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為參照標化。 條件性培養基上清的收取將生長狀態良好的細胞消化計數，每種細胞均以相同細胞數接至IOcm的細胞培養皿中。到第二天約達到90%左右的融合度，換含O. 02% FBS的DMEM。在37°C，5% CO2 和飽和濕度條件下培養24小時，收取培養基上清，4°C條件下3000r/min離心備用。若用于 Western blot實驗的樣品，與5X上樣緩沖液混合并在95_100°C水浴中變性5分鐘。分泌性ANGPTL4蛋白的ELISA檢測細胞培養基上清以及裸鼠血清中SANGPTL4的濃度測定均按照R&D公司DuoSet ELISA Development System說明書進行，方法如下I)在不含任何蛋白的PBS中稀釋捕獲抗體(濃度為0. 8yg/ml)，將該稀釋后的捕獲抗體100 μ I/孔加入到酶標板內。2)將酶標板封好防止蒸發，在室溫孵育過夜。3)吸干每一孔的液體并加400 μ I洗液洗滌，重復3次。最后一步，將板中液體移出并將酶標板在干凈的紙巾上吸附。4)加300 μ I/孔封閉液封板,室溫孵育I小時。5)重復步驟3。6)每孔加100μ I適當稀釋的標準品和標本，輕輕敲打酶標板I分鐘。貼上封板膜，室溫孵育2小時。本研究中樣本的稀釋度為I : 10或I : 50。7)重復步驟3。8)每孔加100μ1檢測抗體(濃度為400ng/ml)，貼上新的封板膜，室溫孵育2小時。9)重復步驟3。10)每孔加 100 μ I 鏈親和素(Streptavidin)-HRP。
11)重復步驟3。12)每孔加100 μ I底物(TMB液體底物系統，Sigma Aldrich公司)，避光，室溫孵育5-30分鐘進行顯色反應。13)每孔加50 μ I終止液(2Ν H2SO4)，輕輕振蕩酶標板確保充分混勻。14)在30分鐘內在酶標儀上采用450nm波長對結果進行判讀。15)數據分析和計算。重組表達載體pWPXL-ANGPTL4的構建用肝細胞eDNA為模板，設計和合成引物擴增人ANGPTL4的完整的全長序列，并在 5’端和3’端分別引入Pmel/Ndel酶切位點。通過常規PCR法擴增ANGPTL4開放閱讀框。 將擴增的PCR擴增片段純化后用Pmel/Ndel酶切，與同樣經過Pmel/Ndel酶切的pWPXL載體(可購自Addgene公司)連接，16°C連接過夜，獲得pWPXL_ANGPTL4，并經酶切檢驗和測序驗證。
pLVTHM-shANGPTL4的構建(用于在體內產生siRNA干擾片段)使用siRNA的方法篩選有效干擾ANGPTL4表達的片段。根據篩選出的有效序列， 合成核苷酸序列如下的單鏈DNA 5，-cgcgtccccgaggcagagtggactatttttcaagagaaaatagtccactctgcctctttttggaaa t_3，(SEQ ID NO. :I,其中第 6-28 位為干擾 ANGPTL4 的有效序列)，5’_cgatttccaaaaagagg cagagtggactattttctcttgaaaaatagtccactctgcctcgggga-3> (SEQ ID NO. :2)構建克隆方法如下I)退火將上述寡核苷酸單鏈分別溶于去離子水，至濃度為ΙΟρΜ。互補的寡核苷酸各取2 μ 1，加48 μ I退火緩沖液(IOOmM乙酸鉀，30mM pH7. 4的HEPES，2mM乙酸鎂)。95°C 孵育4分鐘，70°C孵育10分鐘，4°C冷卻。2)磷酸化取5 μ I已退火的寡核苷酸，加12 μ I水，2 μ I Τ4連接酶緩沖液(含ImM ATP)，I μ I小牛腸堿性磷酸酶(CIP)，37°C孵育30分鐘，然后70°C孵育10分鐘滅火CIP。3)連接與經過Mlul/Clal酶切的pLVTHM載體(可購自Addgene公司)連接， 16 °C連接過夜。感受態細菌的轉化按常規方法，用常規的大腸桿菌HBlOl感受態細菌進行轉化。所得克隆用質粒小抽試劑盒抽提，酶切鑒定是否插入外源性片段。對于有插入外源性片段的克隆進行測序。包裝病毒本發明中使用的慢病毒包裝體系是購自Addgene公司的三質粒系統，包括pWPXL/ pLVTHM(攜帶目的基因或干擾片段)，psPAX2和pMD2. G。將生長狀態良好的HEK-293T細胞(ATCC =CRL-11268)接至IOcm的細胞培養皿中，到第二天約達到95%以上的融合度，進行轉染。轉染試劑用Lipofectamine 2000，三質粒的用量的摩爾比為I : I : 1，總量為 24. 6 μ g。操作過程參照Lipofectamine 2000的操作說明將12 μ g的pffPXL/pLVTHM或相應的 pWPXL-ANGPTL4/pLVTHM-shRNA，9 μ g psPAX2 和 3· 6 μ gpMD2. G 與 I. 5ml 的 Opti-ΜΕΜ 混合，60 μ I的Lipofectamine 2000與I. 5ml的Opti-MEM混合，室溫放置5分鐘；將以上兩種混合液輕柔混合,室溫孵育20分鐘，形成轉染復合物；將混合液加入到已接好的HEK-293T 細胞中，再加DMEM至總體積IOml ;轉染6小時后換IOml含10% FBS的DMEM，終止轉染；24小時后觀察熒光，轉染效率要達到90%以上；60小時收取培養液，4°C條件下3000r/min離心，O. 4 μ m的濾膜過濾，濾液分裝，_70°C凍存備用。腫瘤細胞的病毒感染將生長狀態良好的腫瘤細胞，接至6孔板，第二天約達到60-70%的融合度，進行感染。用含10% FBS的DMEM將病毒液I : 4稀釋，在稀釋液中加polybrene至終濃度為
10μ g/ml ;將稀釋液加到細胞中，培養6小時后換10% FBS的DMEM。24小時可觀察熒光。
跨血管內皮細胞遷移實驗所用腫瘤細胞均由質粒pLGS標記,該質粒是Iuciferase和GFP雙標的質粒,是將含Iuciferase和GFP兩個基因的DNA片段通過BamHI/XhoI酶切位點裝入pWPXL載體而形成)。取對數期生長的常規的人內皮HUVEC細胞(ATCC CRL-1730)接入Trans-well小室 (3 X IO4細胞，100 μ I DMEM培養基)，培養至細胞融合(約24h);接種懸于100 μ I DMEM的 IXlO5腫瘤細胞，下室加含10% FBS的DMEM，三孔重復；20小時后，小室用4%的福爾馬林固定；將小室外側的細胞刮掉，在倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機選拍6個視野，進行計數并分析。ANGPTL4抗體處理實驗HUVEV細胞的接種同前。接種腫瘤細胞時，在腫瘤細胞的懸液中加兔抗ANGPTL4抗體(可購自Santa Cruz, M-200, sc-66807),至終濃度為40 μ g/ml ;對照組加相同濃度的不針對ANGPTL4的兔IgG對照抗體；其余步驟同上。條件性培養基處理實驗HUVEV細胞的接種同前。接種腫瘤細胞時，用100 μ I條件性培養基重懸I X IO5腫瘤細胞，其余步驟同上。細胞免疫化學分析細胞接種在包被有多聚賴氨酸的滅菌載玻片上，培養24小時；培養結束后去除培養基，在PBS中輕柔浸洗載玻片；用4%中性多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，然后用 SuperBlocking封閉液(可購自Pierce公司)封閉細胞30分鐘。切片在4°C條件下與一抗反應過夜；次日在PBS中洗滌三次共15分鐘；加二抗，室溫孵育I小時，然后DAB顯色； 然后采用蘇木素復染，漂洗風干后中性樹膠封片，染色結果在正置光學顯微鏡下觀察。小鼠肝原位接種試驗取生長狀態良好的細胞，每份IX IO6細胞，用無血清DMEM和Matrigel等比配成混合液40 μ I懸浮細胞，置于冰上；28只裸鼠分為實驗組和對照組，每組14只，30. 5% (wt)戊巴比妥鈉腹腔麻醉，劍狀突下橫行切開小鼠腹腔，用兩支醫用棉簽輕輕拖出，顯露肝臟；在左肝葉實質內注入細胞，拔針后用干棉簽壓迫止血；縫合腹腔，3天觀察一次，接種細胞后 6周無痛苦犧牲裸鼠，采集血清、肝和肺，血清用于ELISA檢測，肝、肺組織做常規病理學檢查，常規石蠟切片、蘇木素/伊紅(HE)染色，顯微鏡下統計小鼠肝內轉移和肺轉移結節數。小鼠尾靜脈接種試驗每周三次裸鼠腹腔內注射所收取含ANGPTL4條件性培養基或相應對照。一周后， 取生長狀態良好的MHCC-97L細胞，每份4X IO6細胞，用無血清DMEM 300ul懸浮細胞，尾靜脈接種細胞，之后持續每周三次裸鼠腹腔內注射條件性培養基，維持8周。無痛苦犧牲實驗動物，采集肝和肺組織。
數據處理實驗獲得數據按常規方法進行整理和統計分析。計量數據以平均值土標準差的形式表示，采用Student’s t_test分析其統計學意義；分類數據采用Chi-square檢驗。統計檢驗得到的概率P < O. 05認為具有統計學意義。實施例II. ANGPTL4在高轉移潛能的肝癌細胞系中高表達采用定量PCR方法和Western blot檢測了多種常用的肝癌細胞系中ANGPTL4 mRNA和蛋白 的表達水平。結果如圖Ia和Ic所示。ANGPTL4在人高轉移潛能肝細胞系MHCC-LM3，MHCC-97， MHCC-97L和MHCC-97H的表達相對較高，而在其他非高轉移性的肝癌細胞系中HepG2， H印3B，Huh-7, SMMC-7721, FOCUS 和 PLC/PRF/5 低表達。鑒于ANGPTL4是分泌性蛋白，還利用ELISA方法檢測了分泌性ANGPTL4蛋白水平是否與細胞本身表達水平相一致。結果表明，分泌性SANGPTL4在細胞培養基上清中的分泌水平與Western印跡檢測結果的趨勢是一致的(圖lb)。上述結果表明，ANGPTL4在人轉移潛能肝細胞系MHCC-LM3，MHCC-97，MHCC-97L和 MHCC-97H的胞內和分泌的表達水平相對較高，提示ANGPTL4的表達與肝癌細胞的轉移潛能密切相關。實施例2外源性表達ANGPTL4促進肝癌細胞的跨血管內皮細胞遷移(trans-endothelial migration)本實施例中，根據ANGPTL4在各個肝癌細胞系的表達情況，選取ANGPTL4低表達的肝癌細胞Huh7和SMMC-7721，利用慢病毒載體構建了 ANGPTL4穩定過表達細胞系，分別命名為Huh7-lenti-ANGPTL4和SMMC-7721-lenti_ANGPTL4，相應的對照命名為 Huh7-lenti_control 和 SMMC-7721-lenti-control。分別采用定量PCR和Western blot檢測了在ANGPTL4穩定過表達細胞系中 ANGPTL4的表達水平(圖2a，b)，證實過表達ANGPTL4成功。為驗證分泌性ANGPTL4蛋白的表達，同時采用ELISA和Western blot方法檢測了在ANGPTL4穩定過表達細胞系的細胞培養基上清中SANGPTL4蛋白的水平(圖2a，c)。結果表明 Huh7-lenti-ANGPTL4 和 SMMC-7721-lenti_ANGPTL4 中 sANGPTL4 的表達水平顯著高于相應的對照組。對Huh7-lenti-ANGPTL4 和 SMMC-7721-lenti_ANGPTL4 細胞進行了跨血管內皮細胞遷移實驗，檢測各組細胞跨過血管內皮細胞層的數量。結果表明Huh7-lenti-ANGPTL4和 SMMC-7721-lenti-ANGPTL4與各自的對照組相比具有更強的遷移能力，具有顯著性差異(P < 0.001)(圖2d，e)。這表明，在低遷移能力的兩種肝癌細胞Huh7和SMMC-7721中，過表達ANGPTL4都顯著增強了肝癌細胞的遷移能力。實施例3外源性表達ANGPTL4促進SMMC-7721細胞在裸鼠體內的肝內轉移和肺轉移體外實驗證實了 ANGPTL4能夠促進肝癌細胞的跨血管內皮細胞遷移，本實施例進一步研究了 ANGPTL4在體內對肝癌細胞轉移的影響。方法如下在裸鼠體內原位接種SMMC-7721-lenti-ANGPTL4細胞和相應對照組 SMMC-7721-lenti-control細胞，術后6周無痛苦犧牲實驗動物，采集血清、肝和肺組織。對肝和肺組織進行常規病理組織學檢查，統計實驗組和對照組裸鼠發生肝內轉移和肺轉移的結節數。結果表明，雖然實驗組和對照組所有裸鼠均發生肝內轉移，實驗組有6只裸鼠可以檢測到肺轉移，甚至有多個轉移灶，而對照組均未觀察到肺轉移(表1，圖3)。進一步統計分析實驗組和對照組發生肝內轉移和肺轉移的差異，發現實驗組肝內轉移灶個數(59)明顯高于對照組(33) (P = O. 016);實驗組發生肺轉移的例數以及肺轉移灶個數(17)與對照組(O)相比有明顯差異(P = O. 038)(圖3)。這些結果表明，ANGPTL4在裸鼠體內能明顯促進SMMC-7721細胞的肝內轉移和肺轉移。表I.裸鼠肝內轉移和肺轉移歸納表
、。 ^ — 肝_轉夢*4個？— — — — —啤轉f多電個？——— 裸鼠
S麗C-7721- S麗C-7721- S麗C-7721- S麗C-7721-
Ι
lenti-control lenti_ANGPTL4 lenti-control lenti_ANGPTL4
15800
22702
3170I
4I500
51502
62406
72400
84400
92300
102305
11230I
122 2 0 0
13I200
146200 小·^ 33 59 0 17采用ELISA方法檢測了裸鼠血清中sANGPTL4水平，發現實驗組裸鼠血清中的 SANGPTL4水平明顯高于對照組(P < 0.01)，實驗組的平均值為181 ±81ng/ml (平均數土 SD)，范圍從 87-325ng/ml ;對照組為 30±5ng/ml (平均數土 SD)，范圍從 25_36ng/ml (圖 4)。表明在裸鼠體內SMMC-7721-lenti-ANGPTL4細胞能夠有效分泌ANGPTL4到血液中，從而影響裸鼠血清中人SANGPTL4水平。該結果提示，血清中ANGPTL4水平與肝癌轉移存在一定相關性。實施例4干擾ANGPTL4的表達可抑制MHCC-97L細胞的跨血管內皮細胞遷移在已證明外源性表達ANGPTL4能夠促進肝癌細胞系的跨血管內皮細胞遷移和裸鼠體內轉移的基礎上，本實施例進一步驗證內源性表達的ANGPTL4在跨血管內皮細胞遷移中的作用。在相對高表達ANGPTL4且具有高轉移潛能的肝癌細胞系的MHCC-97L細胞中，采用 shRNA的方法干擾和降低了 ANGPTL4的表達。與對照組相比，干擾ANGPTL4表達后MHCC-97L 跨血管內皮細胞遷移能力明顯降低，具有顯著差異(P < O. 01)(圖5a)。分泌性蛋白的抗體能夠拮抗該蛋白誘導的功能。因此，在進行跨血管內皮細胞遷移實驗中，將市售的ANGPTL4抗體加入到MHCC-97L細胞的培養液中，檢測其對MHCC-97L細胞跨血管內皮細胞遷移能力的影響。 結果表明，與在MHCC-97L細胞中干擾ANGPTL4的效果是一致的，ANGPTL4抗體處理后能顯著降低MHCC-97L細胞跨血管內皮細胞遷移能力(P < O. 001)(圖5b)。以上實驗結果表明，無論是降低內源性ANGPTL4表達或添加外源性的抗ANGPTL4 抗體，均降低了肝癌細胞的遷移能力。實施例5分泌性ANGPTL4蛋白促進肝癌細胞的跨血管內皮細胞遷移ANGPTL4是分泌性蛋白，前述實驗結果表明肝癌細胞自身表達的ANGPTL4能有效的分泌到培養基上清中，而且ANGPTL4抗體處理后能顯著降低MHCC-97L細胞跨血管內皮細胞遷移能力。因此，在本實施例中，收集條件性培養基(Condition medium, CM)上清處理ANGPTL4低表達的肝癌細胞，檢測分泌性ANGPTL4蛋白對肝癌細胞跨血管內皮細胞遷移的影響。本實驗中所用培養基上清來源于穩定過表達ANGPTL4的細胞系C0S7，簡寫為 C0S7-lenti-ANGPTL4，選擇C0S7細胞可以排除腫瘤細胞其他分泌性因子的影響。首先驗證了 ANGPTL4在C0S7-lenti_ANGPTL4及其對照組細胞中的表達水平，與對照組相比，ANGPTL4不管是在細胞裂解液中還是培養基上清液中，C0S7-lenti-ANGPTL4中的表達水平顯著增高(圖6a)。在進行跨血管內皮細胞遷移實驗時，用條件性培養基上清分別處理Huh7和 SMMC-7721細胞，結果發現，與對照組相比，含ANGPTL4的條件性培養基上清能明顯促進 Huh7和SMMC-7721細胞的跨血管內皮細胞遷移(圖6b，c)。這提示即使肝癌細胞本身不表達或低表達ANGPTL4，當其處于含有較高濃度ANGPTL4的環境中，肝癌細胞的跨血管內皮細胞遷移的能力也會增強。實施例6分泌性ANGPTL4蛋白促進肝癌細胞在裸鼠體內的肺轉移體外實驗證實了分泌性ANGPTL4蛋白能夠促進肝癌細胞的跨血管內皮細胞遷移， 本實施例采用尾靜脈接種法，進一步研究了分泌性ANGPTL4蛋白在裸鼠體內對肝癌細胞轉移的影響。每周三次裸鼠腹腔內注射條件性培養基，一周后尾靜脈接種MHCC-97L細胞，之后持續每周三次裸鼠腹腔內注射條件性培養基，維持8周。無痛苦犧牲實驗動物，采集肝和肺組織。對肝和肺組織進行常規病理組織學檢查，統計實驗組和對照組裸鼠發生肝內轉移和肺轉移的結節數。結果表明，實驗組I只裸鼠發生肝轉移，對照組未檢測到肝轉移；實驗組有7只裸鼠可以檢測到肺轉移，而對照組只觀察到一例肺轉移(表2，圖7)。這說明，分泌性ANGPTL4 蛋白在裸鼠體內明顯促進MHCC-97L細胞的肺轉移。表2.裸鼠肝轉移和肺轉移歸納表
肝轉移肺轉移CM-control 0/8*1/8
CM-ANGPTL4 1/87/8
發生轉移的小鼠數目/小鼠總數目。實施例7血清中ANGPTL4濃度與肝癌患者發生肝內轉移密切相關本實施例采用抗ANGPTL4的特異性單抗，通過ELISA方法(雙抗夾心法)檢測了 463例肝癌患者和90例健康對照組血清中ANGPTL4的濃度。結果表明在HCC血清中ANGPTL4的濃度為115. 0±117. Ong/ml (平均數土SD)； 健康對照組血清中ANGPTL4的濃度為55. 6 ±30. 9ng/ml (平均數土 SD)。肝癌患者血清中 ANGPTL4濃度明顯高于對照組血清(P < O. 05)(圖8a)。對于檢測的HCC患者進一步分析表明，伴有肝內轉移的肝癌患者血清ANGPTL4濃度(145. 8±16. 3ng/ml)明顯高于未發生肝內轉移的患者(106. 5±6· 8ng/ml) (P < O. 05) (圖 8b)。這提示，血清ANGPTL4濃度高于130ng/ml，這提示該對象發生肝癌轉移的幾率顯
著上升。實施例8血清ANGPTL4濃度與各項臨床指標的關系為進一步探索血清ANGPTL4濃度與各項臨床指標的關系，根據ROC曲線(圖9)設定了 ANGPTL4的cut-off值為93. 5ng/ml，其敏感性和特異性分別為44. 7%和87. 4%，陽性率約為55% (80/144)。納入統計分析的臨床病理指標主要有患者性別、年齡、血清甲胎蛋白、乙肝病毒表面抗原、腫瘤大小、Edmondson組織學分級、肝內轉移和伴發肝硬化。統計分析結果顯示，血清ANGPTL4濃度與肝癌患者伴發肝內轉移，Edmondson組織學分級以及伴發肝硬化等指標密切相關(表3)。結合上述體內外實驗研究，可以得出結論，分泌性ANGPTL4在肝癌轉移過程中起到了重要的作用，可以作為肝癌轉移的標志物。表3血清ANGPTL4濃度與肝癌患者臨床病理指標的相關性分析
權利要求
1.血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)或其特異性抗體的用途，其特征在干，(a)用于制備檢測肝癌轉移的診斷試劑或試劑盒；(b)用于制備血清檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒。
2.如權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的ANGPTL4蛋白或其特異性抗體偶聯有或帶有可檢測標記。
3.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述可檢測標記選自下組生色團、化學發光基團、熒光團、同位素或酶。
4.如權利要求I所述的用途，其特征在于，所述診斷試劑是單克隆抗體。
5.如權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的檢測肝癌轉移是血清檢測。
6.一種用于檢測肝癌轉移的診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有ANGPTL4蛋白或其特異性抗體；以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于檢測或診斷肝癌轉移。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的ANGPTL4蛋白或其特異性抗體偶聯有或帶有可檢測標記。
8.—種血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)的用途，其特征在于，它被用作血清檢測肝癌轉移的標志物。
9.ー種血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)的拮抗劑的用途，其特征在于，用于制備抑制肝癌細胞轉移的藥物。
10.如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑包括針對ANGPTL4的siRNA、反義RNA、抗體、或其組合。
全文摘要
本發明涉及一種ANGPTL4作為血清學檢測肝癌轉移的標志物及其應用。具體地，本發明提供了血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)在(a)制備檢測肝癌轉移的診斷試劑或試劑盒以及(b)制備血清檢測肝癌的診斷試劑或試劑盒中的用途。本發明還提供了相應檢測試劑盒。本發明還提供了用ANGPTL4蛋白的拮抗劑抑制肝癌細胞轉移的方法。
文檔編號G01N33/574GK102692500SQ20111006804
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月21日 優先權日2011年3月21日
發明者姚明, 李紅, 李錦軍, 田華, 葛超, 趙方瑜, 郝向芳, 閆明霞, 顧健人 申請人:上海市腫瘤研究所