專利名稱：蛋白質復合物及其在腫瘤診斷和/或預后評估中的應用的制作方法
技術領域：
本發明提供了蛋白質復合物，還提供了所述蛋白質復合物在制備用于診斷和/或預后評估癌癥的試劑中的用途，及利用所述蛋白質復合物的相關信息診斷和/或預后評估哺乳動物包括人的癌癥的方法。本發明通過分析血清中蛋白質復合物的存在形式和定量分析，可以對肺癌、胃癌、結直腸癌、胰腺癌和甲狀腺癌等及其它慢性疾病進行輔助診斷和/或預后評估。
背景技術：
目前使用的癌癥標志物主要指癌細胞分泌或脫落到體液或組織中的物質，或是宿主對體內新生物反應而產生并進入到體液或組織中的物質。臨床上常用的癌癥標志物有前列腺特異性抗原(PSA，可輔助診斷前列腺癌)；甲胎蛋白(AFP，可輔助診斷急慢性肝炎、 原發性肝癌等)；癌胚抗原(CEA，在結腸癌、胰腺癌、胃癌、肺癌和乳腺癌中有較高的表達)；糖蛋白抗原CA125(可輔助診斷卵巢癌)；CA19-9(在胰腺癌、結腸癌、肝癌、胃癌、膽囊癌、肺癌和乳腺癌等中均有高表達)；鱗狀細胞相關抗原(SCC，可輔助診斷鱗狀上皮癌)；細胞角蛋白19 (與CEA聯合應用可輔助診斷肺癌)。這些標志物都是單一肽鏈蛋白，其檢測方法是利用免疫發光法檢測，其操作復雜，費用較高，敏感性或特異性不高(Sturgeon，C.M. etal.Serumtumour markers how to order and interpret them. BMJ. 2009,339 :852-858.Hartwell, L et al.Cancer biomarkers a systems approach. Nat Biotechnol.2006，24(8) :905-908.)。這些標志物有的不存在于正常人體內，有的在癌癥病人體內含量超過健康人體內含量。通過測定其存在或含量可輔助診斷腫瘤、分析病程、指導治療、監測復發或轉移、判斷預后。一般認為好的癌癥標志物應具有下列特點(I)敏感性高，能早期測出癌癥患者；(2)特異性好；(3)有器官特異性，能對癌癥定位；(4)血清中濃度與瘤體大小、臨床分期相關，可用以判斷預后；(5)半衰期短，能反映癌癥的動態變化，監測治療效果、復發和轉移；(6)測定方法準確性高，操作簡便，價廉。但至今為止，還沒有發現這類癌癥標志物。蛋白質復合物(protein complex)是指具有兩個或兩個以上多肽鏈非共價鍵相互作用所形成的復合物。一般蛋白質復合物可分為結構型蛋白質復合物和功能型蛋白質復合物。蛋白質復合物在多種生物學過程中發揮著重要作用。這種相互作用存在于機體細胞的生命活動過程中，參與代謝、物質轉移、信息傳遞等，不同的蛋白質復合物具有不同的生物學功倉泛(Babusiak, M. , et al. Native proteomic analysis of protein complexesin murine intestinalbrush border membranes. Proteomics. 2007, 7(I) :121-129.)。血液中蛋白質復合物在調節凝血過程、疾病發生過程中發揮著重要的生物學功能，例如甲胎蛋白-IgM的復合物在原發性肝細胞癌患者血清中含量升高，利用免疫學方法檢測此復合物可診斷原發性肝細胞癌，其靈敏性和特異性優于單獨使用甲胎蛋白(Jingting，J.，et al. Clinical evaluation of serumalpha—fetoprotein—IgM immune complexes onthe diagnosis of primary hepatocellular carcinoma. JClin Lab Anal. 2009，23 (4)213-218.)。因此，如果能發現新的可用于診斷惡性疾病，特別是腫瘤的蛋白質復合物及利用所述蛋白質復合物簡便地診斷和/或輔助診斷或預后評估惡性疾病，特別是腫瘤的方法將具有重要的經濟、健康和社會效益
發明內容
因此，本發明的技術目的在于發現新的蛋白質復合物及其在慢性疾病，特別是腫瘤診斷和/或預后評估中的用途。因此，本發明的第一方面涉及一種蛋白質復合物，其具有通式I :[ (HPT) nl (CFH) n2 (C3) n3 (C4A) n4 (C5) n5 (C7) n6 (IgGl)n7 (ApoA-I) n8 (IgAl)n9],其中，HPT代表觸珠蛋白，Apo A-I代表載脂蛋白A_I，CFH代表補體H，C3代表補體3，C4A代表補體4A，C5代表補體5，Cl代表補體7，IgGl代表免疫球蛋白Gl, IgAl代表免疫球蛋白Al ；其中，nl= 1、2、3、4 或 5, n2 = 0 或 I, n3 = 0 或 I, n4 = 0 或 I, n5 = 0 或 I, n6=0或1,117 = 0、1、2、3、4或5,118 = 0或1,119 = 0或1;且其中該蛋白質復合物的分子量范圍為140 1400kDa。優選地，所述蛋白質復合物具有選自通式II至VII的通式，其中通式II [ (HPT)nl (CFH)n2(C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n2 = l，n3 =1，n4 = 1，n7 = 1，n9 = I ；通式III [ (HPT)nl(C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (Apo A_I)n8 (IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3，n3 = 1，n4 = 1，n7 = 1，n8 = 1，n9 = I ；通式IV :[ (HPT)nl (C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n3 = 1，n4 = 1，n7=1，n9 = I ;通式V:[ (HPT)nl (C3)n3(C4A)n4(C5)n5(C7)n6 (IgGl)n7 (IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3，n3= 1，n4 = 1，n5 = 1，n6 = 1，n7 = 1，n9 = I ；通式VI [ (HPT)nl (C3)n3(Apo A_I)n8(IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3,n3 = I, n8 = I, n9 = I或通式VII:[ (HPT)nl (CFH)n2(C3)n3 (IgGl)n7 (IgAl)n9L 其中 nl = 1、2、3、4 或 5，n2 = l，n3 = 1，n7 = 1、2、3、4 或 5，n9 = I。本發明的第二方面涉及上述的蛋白質復合物，其用于制備診斷和/或預后評估哺乳動物包括人癌癥的試劑，優選地，所述癌癥選自肺癌、結直腸癌、胰腺癌、胃癌或甲狀腺癌。本發明的第三方面涉及上述的蛋白質復合物在制備診斷和/或預后評估哺乳動物包括人癌癥的試劑中的用途，優選地，所述癌癥選自肺癌、結直腸癌、胰腺癌、胃癌或甲狀腺癌。本發明的第四方面涉及一種診斷和/或預后評估哺乳動物包括人癌癥的方法，其包括以下步驟A)獲取患者或健康狀況未知的哺乳動物包括人血液，經離心后得到血清或血漿，作為樣本；B)分別取0. 5 100 ii L樣本和等體積的0. 5 100 U L外參照血清，進行native-PAGE電泳,所述外參照血清為混合的健康人血清,其中native-PAGE電泳的條件按本領域的常規條件進行，分離膠的濃度為4% -10%質量體積比；C)電泳完畢后，用本領域已知的凝膠染色方法將凝膠染色，然后掃描凝膠，獲得凝膠電泳圖，優選地，所述凝膠染色方法為銀染或考馬斯亮藍染色；D)根據上述步驟C)電泳圖中的凝膠條帶，對照說明書附圖
I中的條帶類型，將樣本血清歸類，其中標記凝膠條帶時按條帶分子量從大到小的順序從I開始進行；E)利用Quantity One軟件分析上述步驟C)凝膠電泳圖中樣本和對照的目標條帶，以代表轉鐵蛋白相關復合物的第19個凝膠條帶為內參照，將其含量歸一化，利用軟件，輸出歸一化后每個凝膠條帶的光密度值，記為NQn，其中n為凝膠條帶的標記；F)利用下面的公式依次計算樣本中每個凝膠條帶的相對表達量，記為ratio，
ration = [NQn]樣本/[NQn]外參照,其中n為凝膠條帶的標記；G)根據上述步驟D)中樣本血清的類型，選擇相應的相對表達量值帶入到回歸方程，計算分值，記為score，然后對比下表中癌癥的閾值，判斷樣本是否為癌癥或其它慢性疾病，
權利要求
1.一種蛋白質復合物，其具有通式I: [(HPT) nl (CFH) n2 (C3) n3 (C4A) n4 (C5) n5 (C7) n6 (IgGl)n7 (ApoA-I) n8 (IgAl)n9], 其中，HPT代表觸珠蛋白，Apo A-I代表載脂蛋白A-I，CFH代表補體H，C3代表補體3，C4A代表補體4A，C5代表補體5，C7代表補體7，IgGl代表免疫球蛋白Gl，IgAl代表免疫球蛋白Al ； 其中，nl = 1、2、3、4或5,112 = 0或1,113 = 0或1,114 = 0或1,115 = 0或1,116 = 0或 l,n7 = 0、1、2、3、4 或 5,n8 = 0 或 l,n9 = 0 或 I ; 且其中該蛋白質復合物的分子量范圍為140 1400kDa。
2.根據權利要求I所述的蛋白質復合物，其特征在于所述蛋白質復合物具有選自下述通式II至通式VII的通式，其中 通式II [(HPT)nl (CFH)n2(C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n2 = 1，n3 = 1，n4 = I, n7 = I, n9 = I ； 通式III [(HPT)nl (C3)n3 (C4A)n4 (IgGl)n7 (Apo A_I)n8 (IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3，n3 = l，n4 =I, n7 = I, n8 = I, n9 = I ； 通式IV [(HPT)nl (C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n3 = l，n4 = l，n7 = 1，n9 = I ； 通式V [(HPT)nl (C3)n3 (C4A)n4 (C5)n5 (C7)n6 (IgGl)n7 (IgAl)n9]，其中 nl = I、2 或 3，n3 = I，n4 =I, n5 = I, n6 = I, n7 = I, n9 = I ； 通式VI [(HPT)nl (C3)nS (Apo A-I)n8 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3, n3 = I, n8 = I, n9 = I 或 通式VII [(HPT)nl (CFH)n2(C3)n3 (IgGl)n7 (IgAl)n9L 其中 nl = 1、2、3、4 或 5，n2 = 1，n3 = 1，n7=1、2、3、4 或 5,n9 = I。
3.根據權利要求I或2所述的蛋白質復合物，其用于制備診斷和/或預后評估哺乳動物包括人癌癥的試劑。
4.根據權利要求3所述的蛋白質復合物，其特征在于所述癌癥選自肺癌、結直腸癌、胰腺癌、胃癌或甲狀腺癌。
5.根據權利要求I或2所述的蛋白質復合物在制備診斷和/或預后評估哺乳動物包括人癌癥的試劑中的用途。
6.根據權利要求5所述的用途，其特征在于所述癌癥選自肺癌、結直腸癌、胰腺癌、胃癌或甲狀腺癌。
7.—種診斷和/或預后評估哺乳動物包括人癌癥的方法，其包括以下步驟 A)獲取患者或健康狀況未知的哺乳動物包括人血液，經離心后得到血清和血漿，作為樣本； B)分別取0.5 100 ii L樣本和等體積的0. 5 100 ii L外參照血清，進行native-PAGE電泳，所述外參照血清為混合的健康人血清，其中native-PAGE電泳的條件按本領域的常規條件進行，分離膠的濃度為4% -10%質量體積比； C)電泳完畢后，用本領域已知的凝膠染色方法將凝膠染色，然后掃描凝膠，獲得凝膠電泳圖，優選地，所述凝膠染色方法為銀染或考馬斯亮藍染色； D)根據上述步驟C)電泳圖中的凝膠條帶，對照說明書附圖I中的條帶類型，將樣本血清歸類，其中標記凝膠條帶時按條帶分子量從大到小的順序從I開始進行； E)利用QuantityOne軟件分析上述步驟C)凝膠電泳圖中樣本和對照的目標條帶，以代表轉鐵蛋白相關復合物的第19個凝膠條帶為內參照，將其含量歸一化，利用軟件，輸出歸一化后每個凝膠條帶的光密度值，記為NQn，其中n為凝膠條帶的標記； F)利用下面的公式依次計算樣本中每個凝膠條帶的相對表達量，記為ratio， ration = [NQJ樣本/[NQn]外參照,其中n為凝膠條帶的標記； G)根據上述步驟D)中樣本血清的類型，選擇相應的相對表達量值帶入到回歸方程，計算分值，記為score，然后對比下表中癌癥的閾值，判斷樣本是否為癌癥或其它慢性疾病
8.根據權利要求7所述的診斷和/或預后評估哺乳動物包括人癌癥的方法，其特征在于所述癌癥選自肺癌、結直腸癌、胰腺癌、胃癌或甲狀腺癌。
全文摘要
本發明涉及蛋白質復合物及其在腫瘤診斷和/或預后評估中的應用。具體而言，本發明涉及一種蛋白質復合物、用于制備診斷和/或預后評估哺乳動物包括人癌癥的試劑的蛋白質復合物、診斷哺乳動物包括人癌癥的方法。本發明利用積累的資料總結出了人類血清或血漿在非變性PAGE電泳上蛋白質復合物的主要類型及主要蛋白質復合物的組成并建立了蛋白質復合物含量與腫瘤間的關系，為腫瘤及其它慢性疾病的診斷和/或預后評估提供一種新的方法。
文檔編號G01N33/68GK102633882SQ20111003763
公開日2012年8月15日 申請日期2011年2月14日 優先權日2011年2月14日
發明者李智立, 王彥英 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所