專利名稱：一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法
技術領域：
本發明涉及傳感器技術領域，尤其涉及一種乙酰膽堿酯酶生物傳感器。
背景技術：
隨著我國經濟的快速穩定增長，人民生活水平不斷提高，對食物消費的要求也越 來越高。回歸大自然、消費無公害食品，已成為新時期消費的潮流和市場走向。但是環境污 染對農產品的衛生質量造成了很大威脅，食物中毒事件不斷見諸報道，已引起人們的廣泛關注。為了保障人們的食用安全，很多農產品批發市場、賓館、飯店等場所都應用檢測設 備檢測農產品的農藥殘留情況。目前，我國農藥殘留的速測方法是酶抑制試紙法和酶抑制 分光光度法(農殘快速檢測儀)，可以實現有機磷農藥及氨基甲酸酯類農藥的現場快速檢 測，具有較好的實用價值。速測卡是通過肉眼觀察卡片的顏色變化，因此一般只能用于嚴重 超標的蔬菜樣品進行定性測量。酶抑制分光光度法的應用也比較廣泛，國內已有多種農藥 殘留速測儀均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的變化進行檢測的，但蔬菜水 果中大量的色素會對分光光度法造成很大的影響，導致檢測結果的不準確。但是上述方法 存在回收率低、錯檢、漏檢比例較高、重復性差、難以滿足低殘留和定量檢測的要求等缺點。
發明內容
本發明的目的在于提供一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，以解決 上述技術問題。本發明所解決的技術問題可以采用以下技術方案來實現一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，包括以下步驟酶膜的制作工 藝、玻碳電極的修飾工藝、酶膜的固定工藝，所述玻碳電極的修飾工藝采用功能化多壁碳對 所述玻碳電極進行修飾，包括以下步驟1)多壁碳納米管的功能化稱取IOmg的多壁碳納米管(MWNTs)，放入IOOmL的燒 杯中，量取40mL濃HNO3和H2SO4混合液(V V = 1 3)加入所述燒杯中混合后，超聲4h、 120°C離心回流3h，水洗至中性，紅外爐干燥，室溫下保存待用；2)清洗所述玻碳電極修飾前，用0. 3 μ m、30nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面， 拋光后用雙蒸水洗去表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次2 3min，重復三次，最后依 次用1 1乙醇、1 IHNO3和去離子水超聲清洗，氮氣環境下干燥；3)測試清洗后，所述玻碳電極要在0.5mol/L&H2S04溶液中用循環伏安法活化， 掃描范圍為-0. 6 1. 0V,掃速0. 1V/S，反復掃描直至達到穩定的循環伏安圖為止；最后在 0. 20mol/L KNO3中記錄lX10_3mol/L K3Fe (CN)6溶液的循環伏安曲線，以測試所述玻碳電極 的性能，掃描速度50mV/S，掃描范圍為-0. IV 0. 6 ；當所述循環伏安曲線中的峰電位差在 SOmV以下，所述玻碳電極可使用，否則要重新返回步驟2)中，處理所述玻碳電極，直到符合 要求；
4)修飾取2yL包含功能化的多壁碳納米管0. 12(w/v)%、殼聚糖0.48(w/v)%、 戊二醛4. 7 (ν/ν) %的凝膠狀混合物懸滴在清洗干凈的所述玻碳電極表面，室溫下干燥8h， 隨后用0. Imol L—1磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)沖洗，4°C保存備用，完成所述玻碳電極的修飾。本發明采用功能化多壁碳對玻碳電極進行修飾，與傳統的采用修飾方法相比，能 在較低的電壓下獲得較高的氧化峰電流，有效地防止了其他氧化物的干涉，提高本發明農 藥殘留檢測的精度。將采用功能化多壁碳修飾過的玻碳電極，制成乙酰膽堿酯酶生物傳感 器后，檢測農藥的精度更高、實現小型、便捷、適用于現場檢測的目的。采用本發明生物傳感 器制成的相應快速檢測儀可以在蔬果采收、上市前，進行農藥殘留的快速測定，直接對有機 磷農藥殘留是否超標量進行檢測，避免因食含有殘留農藥的蔬果而引起中毒，為農產品安 全生產與消費提供殘留檢測的技術支撐。所述酶膜的制作工藝包括殼聚糖膜的制作工藝、乙酰膽堿酯酶溶液的制作工藝、 乙酰膽堿酯酶的固定工藝。所述殼聚糖膜的制作工藝包括以下步驟1)將醋酸纖維膜置于0. lmol/L、pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，3°C下浸泡4 以上， 完成醋酸纖維膜的預處理；2)取0. Ig殼聚糖粉末，加入IOml 1% (m/m)的醋酸水溶液，攪拌IOmin至形成黃 色的溶膠，室溫下3000r/min離心5min除去不溶顆粒；3)將所述醋酸纖維膜置于所述溶膠中浸泡12h，取出晾干后再置于0. lmol/L、 pH8. 0的PBS浸泡12h，取出晾干，制得所述殼聚糖膜。所述乙酰膽堿酯酶溶液的制作工藝包括以下步驟1)依次取200 μ L的AChE、20 yL 5% (體積分數)的戊二醛、60 yLl% (質量分 數)的牛血清蛋白(BSA)于ImL塑料離心管中，離心管置于冰浴上；2)添加0. lmol/L、pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液720 μ L，將上述物質充分混勻，當液體 的上部出現泡沫時，表示已經混勻，制得乙酰膽堿酯酶溶液。所述乙酰膽堿酯酶的固定工藝包括以下步驟1)取預處理好的殼聚糖膜一片浸入乙酰膽堿酯酶溶液中，4°C下保持他；幻他后，取出所述殼聚糖膜，分別用0. lmol/L、pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗至少 兩次，直到液體中沒有泡沫為止；3)將所述殼聚糖膜浸泡在0. lmol/L、pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，4°C下保存，制 得酶膜，完成固定。所述酶膜的固定工藝采用以下方法將固定有乙酰膽堿酯酶的酶膜通過0型圈固 定在功能化多壁碳修飾過的玻碳電極上，制得乙酰膽堿酯酶生物傳感器。有益效果由于采用上述技術方案，本發明制成的乙酰膽堿酯酶生物傳感器具有 結構簡單、靈敏度高、能重復檢測等優點。采用本發明制得的相應檢測儀檢測農藥殘留是具 有靈敏度高、操作簡單等優點。
圖1為本發明的制作流程示意圖；圖2為本發明功能化多壁碳修飾過的玻碳電極的結構示意5
圖3為本發明經酶膜固定后的玻碳電極的結構示意圖。
具體實施例方式為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結 合具體圖示進一步闡述本發明。參照圖1、圖2、圖3，一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，包括以下 步驟第一步，酶膜的制作工藝，第二步，玻碳電極的修飾工藝，第三步，酶膜的固定工藝。 第二步中，玻碳電極的修飾工藝采用功能化多壁碳對玻碳電極4進行修飾，包括以下步驟 第21步，多壁碳納米管的功能化稱取IOmg的多壁碳納米管5，放入IOOmL的燒杯中，量 取40mL濃HNO3和H2SO4混合液(V V = 1 3)加入燒杯中混合后，超聲4h、120°C離心 回流3h，水洗至中性，紅外爐干燥，室溫下保存待用。第22步，清洗玻碳電極4修飾前，用 0. 3 μ m、30nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，拋光后用雙蒸水洗去表面污物，再移入超聲 水浴中清洗，每次2 ;3min，重復三次，最后依次用1 1乙醇、1 IHNO3和去離子水超聲 清洗，氮氣環境下干燥。第23步，測試清洗后，玻碳電極4要在0. 5mol/L的H2SO4溶液中 用循環伏安法活化，掃描范圍為-0. 6 1. 0V，掃速0. 1V/S，反復掃描直至達到穩定的循環 伏安圖為止；最后在0. 20mol/L KNO3中記錄lX10_3mol/L K3Fe (CN)6溶液的循環伏安曲線， 以測試玻碳電極4的性能，掃描速度50mV/S，掃描范圍為-0. IV 0. 6 ；當循環伏安曲線中 的峰電位差在SOmV以下，玻碳電極4可使用，否則要重新返回第22步，直到符合要求。第 24步，修飾取2 μ L包含功能化的多壁碳納米管50. 12 (w/v) %、殼聚糖0. 48 (w/v) %、戊二 醛4. 7 (ν/ν) %的凝膠狀混合物懸滴在清洗干凈的玻碳電極4表面，室溫下干燥8h，隨后用 0. Imol L—1磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)沖洗，4°C保存備用，完成玻碳電極4的修飾。本發明采用功能化多壁碳對玻碳電極4進行修飾，與傳統的采用普魯士藍修飾方 法相比，能在較低的電壓下獲得較高的氧化峰電流，有效地防止了其他氧化物的干涉，提高 本發明農藥殘留檢測的精度。將采用功能化多壁碳修飾過的玻碳電極4，制成乙酰膽堿酯酶 生物傳感器后，檢測農藥的精度更高、實現小型、便捷、適用于現場檢測的目的。采用本發明 制成的監測儀可以在蔬果采收、上市前，進行農藥殘留的快速測定，直接對有機磷農藥殘留 是否超標量進行檢測，避免因食含有殘留農藥的蔬果而引起中毒，為農產品安全生產與消 費提供殘留檢測的技術支撐。第一步中，酶膜的制作工藝包括第11步，殼聚糖膜的制作工藝，第12步，乙酰膽堿 酯酶溶液的制作工藝，第13步，乙酰膽堿酯酶的固定工藝。第11步，殼聚糖膜的制作工藝包 括以下步驟第111步，將醋酸纖維膜置于0. lmol/L、pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，3°C下浸 泡48h以上，完成醋酸纖維膜的預處理。第112步，取0. Ig殼聚糖粉末，加入IOml 1% (m/ m)的醋酸水溶液，攪拌IOmin至形成黃色的溶膠，室溫下3000r/min離心5min除去不溶顆 粒。第113步，將醋酸纖維膜置于溶膠中浸泡12h，取出晾干后再置于0. lmol/L、pH8. 0的 PBS浸泡12h，取出晾干，制得殼聚糖膜。第12步，乙酰膽堿酯酶溶液的制作工藝包括以下步驟第121步，依次取200 μ L 的AChE、20yL 5% (體積分數)的戊二醛、60yLl% (質量分數)的牛血清蛋白(BSA)于 ImL塑料離心管中，離心管置于冰浴上。第122步，添加0. lmol/L、pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶 液720 μ L，將上述物質充分混勻，當液體的上部出現泡沫時，表示已經混勻，制得乙酰膽堿酯酶溶液。第13步，乙酰膽堿酯酶的固定工藝包括以下步驟第131步，取預處理好的殼聚 糖膜一片浸入乙酰膽堿酯酶溶液中，4°C下保持他。第132步，他后，取出殼聚糖膜，分別用 0. lmol/L、pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗至少兩次，直到液體中沒有泡沫為止。第133步，將 殼聚糖膜浸泡在0. lmol/L、pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，4°C下保存，制得酶膜6，完成固定。第三步中，酶膜的固定工藝采用以下方法將酶膜6通過0型圈7固定在功能化多 壁碳修飾過的玻碳電極4上，制得乙酰膽堿酯酶生物傳感器。以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術 人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變 化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其 等效物界定。
權利要求
1.一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，包括以下步驟酶膜的制作工 藝、玻碳電極的修飾工藝、酶膜的固定工藝，其特征在于，所述玻碳電極的修飾工藝采用功 能化多壁碳對所述玻碳電極進行修飾，包括以下步驟1)多壁碳納米管的功能化稱取IOmg的多壁碳納米管(MWNTs)，放入IOOmL的燒杯中， 量取40mL濃HNO3和H2SO4混合液加入所述燒杯中混合后，超聲4h、120°C離心回流池，水洗 至中性，紅外爐干燥，室溫下保存待用；2)清洗所述玻碳電極修飾前，用0.3 μ m、30nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，拋光 后用雙蒸水洗去表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次2 3min，重復三次，最后依次用 1 1乙醇、1 IHNO3和去離子水超聲清洗，氮氣環境下干燥；3)測試清洗后，所述玻碳電極要在0.5mol/L的H2SO4溶液中用循環伏安法活化，掃 描范圍為-0. 6 1. 0V,掃速0. 1V/S，反復掃描直至達到穩定的循環伏安圖為止；最后在 0. 20mol/L KNO3中記錄lX10_3mol/L K3Fe (CN)6溶液的循環伏安曲線，以測試所述玻碳電極 的性能，掃描速度50mV/S，掃描范圍為-0. IV 0. 6 ；當所述循環伏安曲線中的峰電位差在 SOmV以下，所述玻碳電極可使用，否則要重新返回步驟2)中，處理所述玻碳電極，直到符合 要求；4)修飾取2μ L包含功能化的多壁碳納米管0. 12&八)％、殼聚糖0. 48(W/v)%、戊二 醛4. 7 (ν/ν) %的凝膠狀混合物懸滴在清洗干凈的所述玻碳電極表面，室溫下干燥8h，隨后 用0. Imol Γ\ρΗ 8. 0的磷酸鹽緩沖液沖洗，4°C保存備用，完成所述玻碳電極的修飾。
2.根據權利要求1所述的一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在 于，濃HNO3和H2SO4混合液的體積分數之比為V V=I 3。
3.根據權利要求1所述的一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在 于，所述酶膜的制作工藝包括殼聚糖膜的制作工藝、乙酰膽堿酯酶溶液的制作工藝、乙酰膽 堿酯酶的固定工藝。
4.根據權利要求3所述的一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在 于，所述殼聚糖膜的制作工藝包括以下步驟1)將醋酸纖維膜置于0.lmol/L、pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，3°C下浸泡48h以上，完 成醋酸纖維膜的預處理；2)取0.Ig殼聚糖粉末，加入IOml 1% (m/m)的醋酸水溶液，攪拌IOmin至形成黃色的 溶膠，室溫下3000r/min離心5min除去不溶顆粒；3)將所述醋酸纖維膜置于所述溶膠中浸泡12h，取出晾干后再置于0.lmol/L、pH8. 0的 PBS浸泡12h，取出晾干，制得所述殼聚糖膜。
5.根據權利要求4所述的一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在 于，所述乙酰膽堿酯酶溶液的制作工藝包括以下步驟1)依次取200μLWAChEdOyL 5% (體積分數)的戊二醛、60 μ Ll % (質量分數) 的牛血清蛋白(BSA)于ImL塑料離心管中，離心管置于冰浴上；2)添加0.lmol/L、pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液720 μ L，將上述物質充分混勻，當液體的上 部出現泡沫時，表示已經混勻，制得乙酰膽堿酯酶溶液。
6.根據權利要求5所述的一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在 于，所述乙酰膽堿酯酶的固定工藝包括以下步驟1)取預處理好的殼聚糖膜一片浸入乙酰膽堿酯酶溶液中，4°C下保持他；2) 后，取出所述殼聚糖膜，分別用0.lmol/L、pH8.0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗至少兩 次，直到液體中沒有泡沫為止；3)將所述殼聚糖膜浸泡在0.lmol/L、pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，4°C下保存，制得酶 膜，完成固定。
7.根據權利要求1至6中任意一項所述的一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備 方法，其特征在于，所述酶膜的固定工藝采用以下方法將固定有乙酰膽堿酯酶的酶膜通過 0型圈固定在功能化多壁碳修飾過的玻碳電極上，制得乙酰膽堿酯酶生物傳感器。
全文摘要
本發明涉及傳感器技術領域，尤其涉及一種乙酰膽堿酯酶生物傳感器。一種電化學乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，包括以下步驟酶膜的制作工藝、玻碳電極的修飾工藝、酶膜的固定工藝，玻碳電極的修飾工藝采用功能化多壁碳對玻碳電極進行修飾，包括以下步驟多壁碳納米管的功能化、清洗、測試、修飾。由于采用上述技術方案，本發明制成的乙酰膽堿酯酶生物傳感器具有結構簡單、靈敏度高、能重復檢測等優點。
文檔編號G01N27/36GK102103115SQ20111002803
公開日2011年6月22日 申請日期2011年1月26日 優先權日2011年1月26日
發明者劉君峰, 孫霞, 杜淑媛, 王相友, 趙文蘋 申請人:山東理工大學