專利名稱：苯并芘金標檢測試紙及其制備方法以及檢測試紙盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及糧油、水體以及肉類制品中苯并芘(BaP)含量的檢測，具體涉及一種苯并芘金標檢測試紙及其制備方法以及檢測試紙盒，屬于生物工程產品技術領域。
背景技術：
目前已經檢查出的400多種主要致癌物中，一半以上屬于多環芳烴類化合物。苯并芘(BaP)是由一個苯環和一個芘分子結合而成的多環芳烴類化合物，是多環芳烴類化合物中的一種具有明顯致癌作用的有機化合物，是一種強致癌物。苯并芘釋放到大氣中以后， 總是和大氣中各種類型微粒所形成的氣溶膠結合在一起，在8 μ m以下的可吸入塵粒中，吸入肺部的比率較高，經呼吸道吸入肺部，進入肺泡甚至血液，導致肺癌和心血管疾病。根據國家《食用植物油衛生標準》，食用油中苯并芘含量的最高上限為10μ g/kg， 而國家質檢總局此前關于湖南省部分茶油的抽檢結果顯示，苯并芘含量已達到60 μ g/kg， 為最高上限的6倍。因此，建立快速方便的苯并芘檢測方法至關重要。目前，苯并芘的檢測方法主要是色譜分析法，包括薄層層析、液相色譜法、氣相色譜法以及氣相-質譜聯用等。色譜法雖然準確性較高，但是儀器昂貴、對操作人員技術水平要求高、樣品前處理復雜、耗時，不利于現場快速檢測。
發明內容
本發明針對上述問題，提供一種成本低、可快速檢測樣品中苯并芘含量是否超標的金標檢測試紙。為此，本發明還提供一種該金標檢測試紙的制備方法以及使用該金標檢測試紙的檢測試紙盒。本發明提供的一種苯并芘金標檢測試紙，在試紙條背襯上依次粘貼有樣品墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜及吸水紙；所述樣品墊為注樣區，所述玻璃纖維膜為反應區，所述硝酸纖維素膜為測試區，所述吸水紙為吸水區；所述硝酸纖維素膜處于所述背襯上的最下一層，其兩端分別搭接有所述玻璃纖維膜及所述吸水紙，所述玻璃纖維膜上搭接有所述樣品墊；所述玻璃纖維膜上吸附有膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物，所述硝酸纖維素膜上從反應區到吸水區方向依次噴涂有苯并芘-卵清蛋白作檢測線、羊抗兔IgG作質控線，再用牛血清白蛋白封閉所述硝酸纖維素膜。進一步地，所述試紙條背襯采用聚氯乙烯或聚乙烯，厚度為100 μ m ；所述硝酸纖維素膜的厚度為120 μ m，蛋白質負載量為5-20 μ g/cm2 ；所述試紙條的尺寸為(55-65) mmX (3-5) mm,所述檢測線及所述質控線的寬度為0. 5-lmm ；所述膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物的濃度為0. 5-2 μ g/mL，所述苯并芘-卵清蛋白的濃度為100-500 μ g/mL，所述羊抗兔IgG的濃度為50-200 μ g/mL，所述牛血清白蛋白的濃度為1%。本發明提供的一種苯并芘金標檢測試紙盒，包括盒殼體，所述盒殼體內封裝有所述試紙條，所述盒殼體上開有注樣孔及觀察孔，所述注樣孔的位置對應于所述試紙條的樣品墊，所述觀察孔的位置對應于所述試紙條的硝酸纖維素膜。
進一步地，所述注樣孔的形狀為橢圓形，所述觀察孔的形狀為矩形。本發明提供的一種苯并芘金標檢測試紙的制備方法，包括以下步驟
1、將苯并芘與牛血清白蛋白偶聯，作為免疫抗原，用該免疫抗原免疫獲得苯并芘多克隆抗體；在氯金酸溶液中加入檸檬酸三鈉溶液制得膠體金溶液；將苯并芘多克隆抗體加入膠體金溶液中，制得膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物，并用磷酸鹽緩沖液稀釋到 0.5-2 μ g/mL ；
2、將苯并芘與卵清蛋白偶聯，作為檢測抗原，該檢測抗原用磷酸鹽緩沖液稀釋到 100-500 μ g/mL ；
3、羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液稀釋到50-200μ g/mL ；
4、將玻璃纖維膜浸泡在上述膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物中10-20分鐘后烘
干；
5、在硝酸纖維素膜上噴涂上述苯并芘-卵清蛋白作檢測線，噴涂上述羊抗兔IgG作質控線，再用牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜，并烘干；
6、在試紙條背襯的測試區粘貼上述硝酸纖維素膜；在背襯的反應區粘貼上述玻璃纖維膜，并使玻璃纖維膜搭接在硝酸纖維素膜上；在背襯的注樣區粘貼樣品墊，并使樣品墊搭接在玻璃纖維膜上；在背襯的吸水區粘貼吸水紙，并使吸水紙搭接在硝酸纖維素膜上。本發明采用金標檢測法，通過金標檢測試紙上的檢測線和質控線的變色情況來確定樣品中苯并芘的含量是否超標，本發明不需要大型檢測儀器，樣品不需前期處理，試紙條及試紙盒制作方便、成本低，檢測快速、準確、明顯、靈敏度高。
圖1為本發明中的金標檢測試紙的結構示意圖。圖2為本發明中的金標檢測試紙盒的結構示意圖。圖3為本發明中的金標檢測試紙盒的檢測結果示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步的說明。圖廣圖3中，包括試紙條1、試紙條背襯2、玻璃纖維膜3、硝酸纖維素膜4、檢測線 5、質控線6、吸水紙7、注樣孔8、觀察孔9、盒殼體10、樣品墊11等。如圖1所示，是一種苯并芘金標檢測試紙，該試紙條1包括采用厚度為100 μ m的聚氯乙烯或聚乙烯制成的試紙條背襯2，試紙條1的尺寸為(55-65)mmX (3_5)mm。在試紙條背襯2上依次粘貼有樣品墊11、玻璃纖維膜3、硝酸纖維素膜4及吸水紙7，樣品墊11為注樣區，玻璃纖維膜3為反應區，硝酸纖維素膜4為測試區，吸水紙7為吸水區；樣品墊11 與玻璃纖維膜4、硝酸纖維素膜4與玻璃纖維膜3、硝酸纖維素膜4與吸水紙7的連接處設置有重疊區，硝酸纖維素膜4處于背襯2上的最下一層，其兩端分別搭接有玻璃纖維膜3及吸水紙7，玻璃纖維膜3上搭接有樣品墊11，樣品墊11重疊在玻璃纖維膜3上、玻璃纖維膜 3重疊在硝酸纖維素膜4上，吸水紙7重疊在硝酸纖維膜4上。玻璃纖維膜3上吸附有膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物，膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物的濃度為0. 5-2 μ g/mL,硝酸纖維素膜4上從反應區到吸水區方向依次噴涂有濃度為100-500 μ g/mL的苯并芘-卵清蛋白(BaP-OVA)作檢測線5、濃度為50-200 μ g/mL的羊抗兔IgG作質控線6。硝酸纖維素膜4的厚度為120 μ m，蛋白質負載量為5-20 μ g/cm2 ；檢測線5及質控線6的寬度為0. 5-lmm ；再用牛血清白蛋白(BSA)封閉硝酸纖維素膜4。如圖2所示，是使用如圖1所示的試紙條1制成的一種苯并芘金標檢測試紙盒，包括盒殼體10，盒殼體10內封裝有試紙條1，盒殼體10上開有注樣孔8及觀察孔9，注樣孔8 的位置對應于試紙條1的樣品墊11，觀察孔9的位置對應于試紙條1的硝酸纖維素膜4。注樣孔8與觀察孔9的形狀可以為任意一種形狀，本實施例中，注樣孔8的形狀為橢圓形，觀察孔9的形狀為矩形。本發明中的檢測試紙盒的使用方法如下將檢測樣品滴入注樣孔8中，稍許，即可在觀察孔9中觀察到試紙條1上的檢測線5和質控線6的變色情況，確定樣品中苯并芘含量是否超標。如果檢測線5和質控線6都呈紅色，則樣品中苯并芘含量未超標；如果檢測線 5不變色，僅質控線6變色，則樣品中苯并芘含量超標。本發明采用金標檢測法，通過金標檢測試紙上的檢測線和質控線的變色情況來確定樣品中苯并芘的含量是否超標，用于檢測糧油、水體以及肉制品中苯并芘的含量，與現有的檢測方法相比，本發明不需要大型檢測儀器，樣品不需前期處理，試紙條及試紙盒制作方便、成本低，檢測快速、準確、明顯、靈敏度高。如圖1所示的試紙條1的一種制備方法，包括以下步驟 1、免疫抗原5-氨基-3，4-苯并芘-牛血清白蛋白的合成 1)5-硝基_3，4-苯并芘的合成
50mg苯并芘先以少量的苯溶解，再加入5-8mL乙酸，然后加入硝酸溶液50-100 μ L硝化。混勻靜置反應，溶液首先變成暗紫紅色，然后逐漸變淺至橙色。反應過程中有黃色結晶析出。結晶析出完全后冷卻，收集結晶即得產物。2) 5-氨基-3，4-苯并芘的合成
上述制得的硝基苯并芘溶于10-20mL的冰乙酸中，加入含20-30g氯化亞錫的鹽酸溶液，將此混合液回流。在此過程中，橙黃色懸液變成淺黃色溶液。加入500-1000 μ L濃鹽酸， 形成大量微小的黃色沉淀。冷卻圓底燒瓶，加入水以使沉淀完全。用稀鹽酸和乙酸混合液洗滌后，混合物溶于2-5mL氨水，室溫下攪拌10-30min。加入苯萃取，干燥。石油醚重結晶。3) 5-氨基-3，4-苯并芘-牛血清白蛋白偶聯物的合成
將;3mg 5-氨基-3，4-苯并芘溶解于500-1000 μ L 0. 01mol/L碳酸鹽緩沖液中 (pH9. 6)，將6-10mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于l_3mL 0. Olmol/L碳酸鹽緩沖液中，將兩種溶液混合均勻，再加入碳化二亞胺(EDC)溶液ImL (1. 5mgEDC溶解于ImL 0. 01mol/L碳酸鹽緩沖液中)，混合均勻，室溫反應2小時。將溶液移入透析袋中，4°C，0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析，透析好后的溶液分裝，_20°C保存。2、苯并芘(BaP)多克隆抗體的制備 1)動物免疫
取雄性新西蘭大白兔，體重1.5-2 kg。免疫前一周從耳緣靜脈采血作陰性對照。初次免疫用Img BaP-BSA與等量的完全弗氏佐劑乳化完全，進行背部多點皮下注射。一個月后進行第一次加強免疫，用Img BaP-BSA與等量的不完全弗氏佐劑乳化完全，進行四肢內部肌
5肉注射。以后每隔2周加強免疫1次，方法同前。2)抗體的制備
效價合格后，兔頸動脈采血。將采集的血液于室溫下靜置，待血液凝集后放入37°C保溫箱靜置1 h，4°C靜置過夜后，4°C、3000 r/min離心20 min后，得上清液即為抗血清。抗血清再用33%以及50%的硫酸銨分級沉淀。4°C，0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析，得到苯并芘(BaP)多克隆抗體。3、抗體與膠體金結合物的制備 1)膠體金的制備
用新制雙蒸水配制IOOmL 0.01%氯金酸溶液，置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸(110°C左右)，在lOOr/min磁力攪拌下，迅速加入預先在37°C保溫的1%檸檬酸三鈉溶液4. 5mL，保持溫度和轉速不變，繼續攪拌加熱15min左右，直至溶液呈現清亮的酒紅色。室溫冷卻，4 °C冰箱保存備用。2)抗體的準備
標記前抗體用葡聚糖凝膠(S^hadex) G-25脫鹽。3)抗體與膠體金結合物的制備
取純化好的抗體加入膠體金溶液中，體積比為1:50，總濃度為30-45 μ g/mL，室溫攪拌均勻。加入10%BSA，終濃度為0. 4%，再加入10%PEG (MW20000),終濃度為0. 2%，室溫攪拌均勻。加入與膠體金-抗體結合物溶液同體積的10%NaCl，靜置1小時。12000r/min離心 60min，沉淀溶解于適量0. 01mol/L PBS中，用0. 45 μ m濾膜過濾，終濃度為20-25 μ g/mL。 用0. 01mol/L PBS稀釋到所需濃度0. 5-2 μ g/mL，用于浸泡玻璃纖維膜使之吸附。4、檢測抗原5-氨基-3，4-苯并芘-卵清蛋白的合成
合成方法與免疫抗原相同，所用偶聯蛋白為卵清蛋白(0VA)。產物同樣以O.Olmol/L PBS透析，分裝保存于-20°C。用0. 01mol/L PBS稀釋到所需濃度100-500 μ g/mL，用于噴涂檢測線。5、羊抗兔 IgG
羊抗兔IgG為市售產品，購買于上海華美試劑公司。羊抗兔IgG用O.Olmol/L PBS稀釋到所需濃度50-200 μ g/mL，用于噴涂質控線。6、試紙條的組裝
用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯，在背襯上先將干燥好的硝酸纖維素膜粘貼在相應位置， 再將吸水紙和干燥好的玻璃纖維膜(吸附有膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物)粘貼在相應位置并稍微壓住硝酸纖維素膜，最后將樣品墊粘好并壓住玻璃纖維膜，吸水紙粘好并壓住硝酸纖維膜上，即制得苯并芘金標檢測試紙。
權利要求
1.一種苯并芘金標檢測試紙，在試紙條背襯(2)上依次粘貼有樣品墊(11)、玻璃纖維膜(3)、硝酸纖維素膜(4)及吸水紙(7)；所述樣品墊(11)為注樣區，所述玻璃纖維膜(3) 為反應區，所述硝酸纖維素膜(4)為測試區，所述吸水紙(7)為吸水區；所述硝酸纖維素膜 (4)處于所述背襯(2)上的最下一層，其兩端分別搭接有所述玻璃纖維膜(3)及所述吸水紙(7)，所述玻璃纖維膜(3)上搭接有所述樣品墊(11)，其特征是所述玻璃纖維膜(3)上吸附有膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物，所述硝酸纖維素膜(4)上從反應區到吸水區方向依次噴涂有苯并芘-卵清蛋白作檢測線(5)、羊抗兔IgG作質控線(6)，再用牛血清白蛋白封閉所述硝酸纖維素膜(4)。
2.按照權利要求1所述的苯并芘金標檢測試紙，其特征是所述試紙條背襯(2)采用聚氯乙烯或聚乙烯，厚度為100 μ m。
3.按照權利要求1所述的苯并芘金標檢測試紙，其特征是所述硝酸纖維素膜4的厚度為120 μ m，蛋白質負載量為5-20 μ g/cm2。
4.按照權利要求1所述的苯并芘金標檢測試紙，其特征是所述試紙條(1)的尺寸為 (55-65) mmX (3-5) mm，所述檢測線(5)及所述質控線(6)的寬度為0. 5_lmm。
5.按照權利要求1所述的苯并芘金標檢測試紙，其特征是所述膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物的濃度為0. 5-2 μ g/mL，所述苯并芘-卵清蛋白的濃度為100-500 μ g/mL, 所述羊抗兔IgG的濃度為50-200 μ g/mL，所述牛血清白蛋白的濃度為1%。
6.一種使用權利要求1所述的苯并芘金標檢測試紙制成的檢測試紙盒，包括盒殼體 (10)，其特征是所述盒殼體(10)內封裝有所述試紙條(1 )，所述盒殼體(10)上開有注樣孔(8)及觀察孔(9)，所述注樣孔(8)的位置對應于所述試紙條(1)的樣品墊(11)，所述觀察孔(9)的位置對應于所述試紙條(1)的硝酸纖維素膜(4)。
7.按照權利要求6所述的檢測試紙盒，其特征是所述注樣孔(8)的形狀為橢圓形，所述觀察孔(9)的形狀為矩形。
8.—種權利要求1所述的苯并芘金標檢測試紙的制備方法，其特征是，包括以下步驟(1)將5-氨基-3，4-苯并芘與牛血清白蛋白偶聯，作為免疫抗原，用該免疫抗原免疫獲得苯并芘多克隆抗體；在氯金酸溶液中加入檸檬酸三鈉溶液制得膠體金溶液；將苯并芘多克隆抗體加入膠體金溶液中，制得膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物，并用磷酸鹽緩沖液稀釋到0. 5-2 μ g/mL ；(2)將5-氨基-3，4-苯并芘與卵清蛋白偶聯，作為檢測抗原，該檢測抗原用磷酸鹽緩沖液稀釋到 100-500 μ g/mL ；(3)羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液稀釋到50-200μ g/mL ；(4)將玻璃纖維膜浸泡在上述膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物中10-20分鐘后烘干；(5)在硝酸纖維素膜上噴涂上述苯并芘-卵清蛋白作檢測線，噴涂上述羊抗兔IgG作質控線，再用牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜，并烘干；(6)在試紙條背襯的測試區粘貼上述硝酸纖維素膜，在背襯的反應區粘貼上述玻璃纖維膜，并使玻璃纖維膜搭接在硝酸纖維素膜上；在背襯的注樣區粘貼樣品墊，并使樣品墊搭接在玻璃纖維膜上；在背襯的吸水區粘貼吸水紙，并使吸水紙搭接在硝酸纖維素膜上。
全文摘要
本發明涉及一種苯并芘金標檢測試紙及其制備方法以及檢測試紙盒。本發明的檢測試紙，用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯，在背襯上依次粘貼有樣品墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜及吸水紙；樣品墊為注樣區，玻璃纖維膜為反應區，硝酸纖維素膜為測試區，吸水紙為吸水區；玻璃纖維膜上吸附有膠體金-抗苯并芘多克隆抗體結合物；硝酸纖維素膜上噴涂苯并芘-卵清蛋白作檢測線、羊抗兔IgG作質控線，再用牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜。本發明采用金標檢測法，通過金標檢測試紙上的檢測線和質控線的變色情況來確定樣品中苯并芘的含量是否超標，本發明不需要大型檢測儀器，樣品不需前期處理，試紙條及試紙盒制作方便、成本低，檢測快速、準確、明顯、靈敏度高。
文檔編號G01N33/558GK102175857SQ20111002212
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月19日 優先權日2011年1月19日
發明者周智慧, 毛飛君, 王捷, 王欣, 趙曉聯, 金萍 申請人:無錫市金坤生物工程有限公司