專利名稱：一種在唾液、血清和尿液中檢測肝腫瘤的替代生物標志物的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測腫瘤的替代生物標志物的方法，具體涉及在唾液、血清和/ 或尿液中檢測肝腫瘤的替代生物標志物的方法。
背景技術：
目前，在臨床上缺乏靈敏、特異的早期肝癌診斷標志物，能檢測出的早期肝癌病例大約占所有肝癌病例的25%。盡管已經發現了很多可以作為肝癌診斷標志物的生物大分子，但是這些標志物檢測的結果仍舊停留在對晚期肝癌的診斷。甲胎蛋白(AFP)是目前肝癌診斷的特異性指標，但AFP測定存在假陽性和假陰性的問題。約20%的晚期肝癌病人，直至病故前，AFP測定仍為陰性。而在肝癌治療方面也未找到特異、有效的分子靶點。因此， 尋找和發現新的肝癌標志物和治療靶點用于肝癌早期診斷和治療顯得尤為重要。目前對于原發性肝癌經過抽血化驗，有4項指標可提供有價值的診斷。血清學檢測結合影像學檢查使肝癌在亞臨床期(還沒有出現癥狀)即可做出診斷，從而明顯提高了肝癌的遠期療效。目前醫院常用診斷肝癌血清指標有以下幾種甲胎蛋白(AFP)、異常凝血酶原(AP)、Y-谷氨酰轉移酶同工酶II (GGD)及血清巖藻糖苷酶(AFU)。甲胎蛋白(AFP)甲胎蛋白是1956年在胎兒血清中發現的一種胚胎專一性甲種球蛋白，1964年有人在肝癌患者血清中測得它。參考值<20yg/L。臨床意義正常情況下， 這種存在于胚胎早期血清中的甲胎蛋白在出生后即迅速消失，如重現于成人血清中，則提示有肝癌的可能。另外，在生殖腺胚胎瘤和少數轉移性腫瘤如胃癌，以及在孕婦、肝炎、肝硬化患者血清中甲胎蛋白可呈假陽性，但升高不如肝癌明顯。甲胎蛋白現已廣泛用于肝細胞癌的普查、診斷、判斷治療效果、預測復發。普查中陽性可早于癥狀出現8 11個月。甲胎蛋白對肝細胞癌的臨床價值可以歸納為①是一種僅次于病理檢查的診斷方法；②為目前最好的早期診斷方法之一，可在臨床癥狀出現前8 11個月做出診斷；③為反映病情變化和治療效果的敏感指標；④有助于檢出亞臨床期、復發性與轉移性肝癌。異常凝血酶原(AP)異常凝血酶原也稱Y -羧基凝血酶原。參考值< 250微克/ 升。臨床意義肝癌患者血清異常凝血酶原陽性率為69.4%。多數資料表明，異常凝血酶原對原發性肝癌有較高的特異性，而良性肝病、轉移性肝癌僅少數呈陽性，因此對亞臨床肝癌有早期診斷價值。γ -谷氨酰轉移酶同工酶II (GGT2) γ -谷氨酰轉肽酶同工酶II對原發性和轉移性肝癌診斷的陽性率可達90%，特異性達97. 1 %，非癌性肝病和肝外疾病患者的陽性率小于5%。Y-谷氨酰轉肽酶同工酶II與甲胎蛋白濃度無關，在甲胎蛋白低濃度和假陰性肝癌患者中，Y-谷氨酰轉肽酶同工酶II的陽性率也較高。血清巖藻糖苷酶(AFU)參考值3. 5 10. 3單位/升(U/L)。國內報道，血清巖藻糖苷酶診斷原發性肝癌的陽性率為70% 80%，該指標陽性與甲胎蛋白濃度及腫瘤大小無關。血清巖藻糖苷酶對甲胎蛋白陰性肝癌和小肝癌患者的陽性率分別為76. 和70. 8%0對轉移性肝癌和肝良性腫瘤均為陰性，但肝硬化、慢性肝炎患者出現假陽性率較高。甲胎蛋白、Y-谷氨酰轉肽酶同工酶II、異常凝血酶原對肝癌有肯定的診斷價值， 在普查中也有早期診斷意義。Y-谷氨酰轉肽酶同工酶II和異常凝血酶原若與甲胎蛋白聯合檢測，則可大大提高診斷準確率。血清巖藻糖苷酶對肝癌有一定的診斷價值，但特異性不高，若與甲胎蛋白聯合檢測，可用做甲胎蛋白陰性肝癌患者的輔助診斷。目前發現人的唾液中有1166種蛋白質。其中大部分蛋白質能同時在血漿和淚液中找到。從這些蛋白質中可以找到與心血管疾病、癌癥、腎臟病等疾病相關的生物標志物， 從而為今后的臨床診斷提供一種非侵襲性新方式。如在不久前發表于《蛋白組學研究雜志》 [J Proteome Res 2009,8(1) :239]的一項研究證實，唾液蛋白質與2型糖尿病相關。通過對2型糖尿病患者和對照者的唾液蛋白組學分析，發現了唾液中487種與2型糖尿病有關的蛋白。其中33%的蛋白以前從未被報告出現在人類唾液中。在這些蛋白中，有65種蛋白的水平在患者和對照者唾液中能相差2倍之多。進一步分析顯示，一些蛋白水平在2型糖尿病患者的唾液中顯著升高，在糖尿病前期患者中也有相應升高趨勢，因此，可能作為未來無創診斷2型糖尿病和發現糖尿病前期患者的生物標志物。科學家們通過一項動物研究，試圖挖掘唾液中蛋白隨腫瘤改變的機制。在癌癥模型小鼠中腫瘤與唾液中蛋白水平改變相關，推測腫瘤和內分泌器官一樣，可以分泌激素、淋巴因子和細胞因子，通過血液運輸到遠端器官，對其產生影響。一旦這些因子到達唾液腺， 則唾液中的基因轉錄譜會發生改變，導致某些蛋白的豐度或種類改變。這些豐度或種類改變的蛋白將可能成為唾液中檢測腫瘤的替代生物標志物。研究者在黑色素瘤和非小細胞肺癌的模型小鼠以及對照小鼠中比較了唾液中轉錄因子水平的差異。結果發現，腫瘤小鼠與正常小鼠相比，其唾液中轉錄組學改變顯著。進一步分析顯示，轉錄組學某些改變在腫瘤組織、血液、唾液腺和唾液中均存在。目前，相關的替代生物標志物的檢測仍處于試驗研究，檢測靈敏度、結論準確性不高，檢測方法需要高度專業、復雜的檢測操作才能夠實現；因此，亟需一種能夠快速、簡便、 準確檢測肝腫瘤的替代生物標志物的方法。
發明內容
本發明提供一種在唾液、血清和尿液中檢測肝腫瘤的替代生物標志物的方法，以快速、簡便、準確檢測肝腫瘤的替代生物標志物的表達信息。本發明的技術方案如下一種在唾液、血清和尿液中檢測肝腫瘤的替代生物標志物的方法，包括以下步驟1)制備分別對應于唾液、血清和尿液樣本檢測的凝集素芯片1. 1)取環氧化片基備用；1. 2)對應于唾液樣本，選取以下12種凝集素1 4、441^、1^^120、？擬4、1^1、^^、 SNA、MAL-II、BS-I、PTL-II、SBA和GNA中的至少四種配制成濃度為0. l-10mg/ml的點樣液；對應于血清樣本，選取以下9種凝集素HHL、AAL、GSL-I、PSA、SJA、PTL-II、ECA、P^ 和GNA中的至少四種配制成濃度為0. l-10mg/ml的點樣液；對應于尿液樣本，選取以下7種凝集素HHL、AAL、GSL-I, PSA、RCA120, DSA和WGA中的至少四種配制成濃度為0. l-10mg/ml的點樣液；1. 3)將配制得到的點樣液加到384孔板內；再用點樣儀器在環氧化片基上點樣得到芯片；1. 4)將點制好的芯片在濕度為55% -65%的環境中孵育2. 5-3. 5小時；1. 5)對孵育好的芯片在37°C的環境中抽真空使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；1. 6)將固定好的凝集素芯片放置于干燥器中以備用，作為分別對應于唾液、血清和尿液樣本檢測的凝集素芯片；2)分別對唾液、血清和尿液樣本原液進行預處理，去除雜質，純化蛋白，用熒光試劑進行標記，并用G-25柱去除多余熒光，得到相應的待檢測樣本；3)將三種待檢測樣本分別加載到對應的凝集素芯片上以獲得各待檢測樣本中糖蛋白糖鏈譜，根據其中任一待檢測樣本的反應結果即得出所述替代生物標志物的信息；對于任一待檢測樣本，具體操作步驟如下3. 1)將1-2%牛血清白蛋白溶解于磷酸鹽緩沖液-吐溫20中配制成封閉液，將制備好的凝集素芯片置于封閉液中；3. 2)將封閉后的凝集素芯片依次用磷酸鹽緩沖液-吐溫20和磷酸鹽緩沖液清洗， 以去除步驟3. 1)中未完全固定于芯片上的凝集素，再經甩干后備用；3. 3)對經步驟3. 2)甩干后的凝集素芯片加入3_5 μ g待檢測樣本和500-800 μ L 的孵育緩沖液，室溫孵育；3. 4)將孵育后的凝集素芯片依次用磷酸鹽緩沖液-吐溫20和磷酸鹽緩沖液清洗， 以去除步驟3. 3)中未完全結合于凝集素芯片上的待檢測樣本的蛋白，再經甩干后備用；3. 5)對經步驟3. 4)甩干后的凝集素芯片用GenePix4000B芯片掃描儀掃描，得到凝集素與標記后糖蛋白糖鏈結合的熒光圖像；3. 6)通過GenePix3. 0軟件對熒光圖像進行中值分析，對圖像中的凝集素所對應的糖鏈結構反復核對后得出所述替代生物標志物的表達信息。上述步驟3. 1)、3· 2)和3. 4)中的磷酸鹽緩沖液ρΗ7· 4，含有NaCl 8. Og/L，KCl 0. 2g/L，KH2PO4O. 2g/L，Na2HPO4 · 12H20 2. 9g/L ；磷酸鹽緩沖液-吐溫 20 :10mmol/L 磷酸鹽緩沖液中含質量分數0. 05-0. 5%吐溫20。上述步驟3. 3)中的孵育緩沖液磷酸鹽緩沖液-吐溫20中含質量分數1 %牛血清白蛋白和質量分數10-20%羥胺。上述熒光試劑采用Cy3或Cy5。上述點樣儀器采用晶芯48點樣系統為佳。上述步驟3. 3)的較佳取值是對甩干后的凝集素芯片加入4 μ g待檢測樣本和 780 μ L的孵育緩沖液，并在室溫孵育2小時。本發明具有以下優點唾液、血清、尿液分析檢查有非侵襲性、簡單、快速等優點， 而且具有安全、無損傷、標本收集簡便、容易保存等優點，檢測過程靈敏度高、檢測結論準確。
圖1為本發明實施例中唾液樣本檢測結果。
具體實施例方式凝集素是一類具有糖鏈專一性、可促使細胞凝集的蛋白質，它具有與糖鏈專一性、 非共價、可逆結合的能力。凝集素芯片是將各種不同來源的凝集素固定于醛基化、環氧化或經其它方式修飾后的玻璃片基上，再與標記后的糖蛋白、菌體、細胞等待檢測樣品反應，經后續處理后，以檢測待檢測樣品的糖鏈結構。凝集素芯片能簡便、快速、高通量的檢測分析蛋白質的糖基化修飾，在短時間內給出待檢測樣品的糖結構指紋圖譜。本發明通過下面的大量實驗研究發現(1)應用CCl4成功誘導小鼠肝纖維化模型研究發現凝集素MAL-II，LTL，SBA，PSA 和WGA識別的唾液酸(sialic acid) α-2，3連接，巖藻糖(Fucose) α-1,3乙酰葡萄糖胺 (GlcNAc)，Fucosea-l，6GlcNAc，多價唾液酸(multivalent Sia)和唾液酸化的路易斯寡糖-抗原(Sialyl-LewiSx antigen)糖鏈結構高表達，而STL識別的GlcNAc末端糖鏈結構則低表達。(2)通過轉化生長因子-β (TGF-β)誘導的發生纖維化肝星狀細胞系LX-2的研究發現凝集素LTL，AAL識別的α -1，3/1，4巖藻糖分支結構，凝集素DBA，PNA, VVA, MPL識別的Τη/Τ抗原，SNA識別的唾液酸α -2,6結構，PHA-E識別的平分型N乙酰葡糖胺和雙天線N-連糖鏈結構，SJA, BPL, GSL-I識別的末端N乙酰半乳糖胺及α半乳糖結構在纖維化的肝星狀細胞系LX-2中高表達；而MAL-II識別的唾液酸α -2，3結構，PSA識別的α -1,6 核心巖藻糖結構，HHL, GNA, NPA識別的Non-substituted α l_6Man結構，PWM，WGA識別的聚LacNAc和(GlcNAc)n結構在纖維化肝星狀細胞系LX-2中低表達。(3)通過對肝癌細胞系(SMMC-7721和H印G2)與正常肝細胞系(QZG)的對比研究發現肝癌細胞中凝集素MAL-II, PNA, AAL, LTL, LEL, STL識別的Sia α -2，3連接，Tn抗原，巖藻糖，Fucose α-1，3連接，聚N-乙酰乳糖胺(poly-LacNAc)和(GlcNAc)n糖鏈結構高表達，而PTL-I，RCA120, GSL-IjUEA-I識別的α -乙酰半乳糖胺(GalNA) c和α -半乳糖 (Galactose)，Gal β -l,4Glc (NAc)，α _1，2巖藻糖分支糖鏈結構低表達。(4)通過對60份肝癌病人血清和60份健康人血清的比較研究發現凝集素HHL， AAL, GSL-I和PSA識別的甘露糖(marmose) α-1，3 (-6)連接，巖藻糖，末端乙酰半乳糖胺 (GalNAc)和Tn抗原糖鏈結構在肝癌病人血清中高表達，而SJA，PTL-II識別α GalNAc和 α Galactose以及半乳糖苷(galactosides) β型的糖鏈結構低表達。(5)通過對2對肝癌病人肝癌組織樣本和癌旁正常組織的比較研究發現凝集素 PHA-E+L,PHA-E識別的平分型N-乙酰葡糖胺，分支N-糖鏈結構，MAL-I，MAL-II識別的唾液酸 α -2，3 結構，GNA，NPA 識別的是 Non-substituted α l_6Man 結構，SBA，VVA，DBA，Jacalin 識別的Τ/Τη抗原，AAL，LTL識別的巖藻糖α -1，3/1，4連接，SNA識別的唾液酸α -2，6結構，LCA, PSA識別的α _1，6核心巖藻糖結構在肝癌組織中高表達；而WFA識別的末端N乙酰半乳糖胺，DSA，STL, EEL識別的Poly-LacNAc，分支LacNAc和(GlcNAc) n結構在肝癌組織中低表達。(6)通過對2對肝癌病人唾液和同齡同性別健康人唾液的研究發現凝集素WFA， AAL, RCA120, PHA-E, LTL, LCA, SNA 識別的末端 GalNAc，巖藻糖，Gal β -1，4Glc (NAc)，平分型乙酰葡萄糖胺(bisecting GlcNAc)和雙天線型N-糖鏈(biantermary N-glycans)，巖藻糖 α-1,3,核心巖藻糖α -1，6和Sia α -2，6糖鏈結構在肝癌病人唾液中高表達，而MAL-II， BS-I，PTL-II，SBA，GNA 識別的 Siaa -2，3 連接，a -GalNAc 禾口 α Gal，Mana -1，3 連接的糖鏈結構低表達。(7)通過對11份肝癌病人尿液和33份健康人尿液的研究發現通過對11份肝癌病人尿液和33份健康人尿液的研究發現凝集素HHL，AAL, GSL-I和PSA識別的Man α -1， 3(-6)連接，巖藻糖，afeilNAc和a-Gal，Tn抗原以及Fucose a-l，6GlcNAc糖鏈結構在肝癌病人尿液中高表達，而RCA120, DSA和WGA識別的Gal β -1，4Glc (NAc)，β -1，4GlcNAc和乙酰乳糖胺(LacNAc)以及多價唾液酸(multivalent Sia)糖鏈結構低表達。以唾液樣本為例，本發明具體檢測步驟如下1)制備凝集素芯片1. 1)取環氧化片基備用；1. 2)將 12 種凝集素(WFA、AAL、RCA120, PHA-E, LTL、LCA、SNA、MAL-II, BS-I, PTL-II、SBA和GNA)配制成濃度為lmg/ml的點樣液；1. 3)將配制的點樣液加到384孔板內；再用晶芯48點樣系統在環氧化片基上點樣；1. 4)將點制好的芯片在濕度為60%的環境中孵育3小時；1. 5)對孵育好的芯片在37°C的環境中抽真空3小時，使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；1. 6)將固定好的凝集素芯片放置在4°C干燥器中以備用。2)唾液樣本原液的采集和處理；于收集前池禁飲食。0. 9%生理鹽水漱口，靜坐低頭，舌尖頂住上顎，用無菌離心管收集自然分泌全唾液。每份唾液樣本采集lml。運輸時密封離心管口，0°C冰袋冷藏，時間不超過30min。于4°C IOOOOg低溫離心lh，取上清。用 0.45 μ m的濾膜進行過濾，加入蛋白酶抑制劑。BCA法或Bradford法進行蛋白定量。分裝后保存于-80°C冰箱中；然后用熒光試劑Cy3對一份處理好的唾液樣本進行標記，用G_25柱去除多余熒光；分裝凍存于-20°C以下的環境中。3)將標記樣本加載到凝集素芯片上以獲得樣本中糖蛋白糖鏈譜3. 1)將2%牛血清白蛋白溶解到磷酸鹽緩沖液-吐溫20中配制成封閉液，將制備好的凝集素芯片置于封閉液1小時；3. 2)將封閉后的凝集素芯片用磷酸鹽緩沖液-吐溫20和磷酸鹽緩沖液分別清洗各2次，每次3分鐘，再經甩干后備用；3. 3)對甩干后的凝集素芯片加入4 μ g標記好的樣本和780 μ L的孵育緩沖液，并在室溫孵育3小時；3. 4)將孵育后的凝集素芯片用磷酸鹽緩沖液-吐溫20和磷酸鹽緩沖液分別清洗各2次，每次3分鐘，再甩干；3. 5)對甩干后的凝集素芯片用GenePiMOOOB芯片掃描儀掃描，得到凝集素與標記后糖蛋白結合的熒光圖像；參見圖1。3.6)通過GenePix3.0軟件對熒光圖像進行中值分析，對圖像中4種以上的凝集素所對應的糖鏈結構反復核對后得出受檢者肝腫瘤的替代生物標志物的表達信息。唾液樣本中糖鏈結構分析結果如下表一所示，通過這些糖鏈分析顯示此受檢者肝腫瘤呈陽性。表一
權利要求
1. 一種在唾液、血清和尿液中檢測肝腫瘤的替代生物標志物的方法，包括以下步驟1)制備分別對應于唾液、血清和尿液樣本檢測的凝集素芯片 1.1)取環氧化片基備用；1. 2)對應于唾液樣本，選取以下12種凝集素1 4、441^、1^^120、？擬4、1^1、^^、5嫩、 MAL-II、BS-I、PTL-II、SBA和GNA中的至少四種配制成濃度為0. l-10mg/ml的點樣液；對應于血清樣本，選取以下9種凝集素HHL、AAL、GSL-I、PSA、SJA、PTL-II、ECA、PWM和 GNA中的至少四種配制成濃度為0. l-10mg/ml的點樣液；對應于尿液樣本，選取以下7種凝集素HHL、AAL、GSL-I、PSA、RCA120, DSA和WGA中的至少四種配制成濃度為0. l-10mg/ml的點樣液；1.3)將配制得到的點樣液加到384孔板內；再用點樣儀器在環氧化片基上點樣得到芯片；1. 4)將點制好的芯片在濕度為55% -65%的環境中孵育2. 5-3. 5小時；1.5)對孵育好的芯片在37°C的環境中抽真空使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上； 1.6)將固定好的凝集素芯片放置于干燥器中以備用，作為分別對應于唾液、血清和尿液樣本檢測的凝集素芯片；2)分別對唾液、血清和尿液樣本原液進行預處理，去除雜質，純化蛋白，用熒光試劑進行標記，并用G-25柱去除多余熒光，得到相應的待檢測樣本；3)將三種待檢測樣本分別加載到對應的凝集素芯片上以獲得各待檢測樣本中糖蛋白糖鏈譜，根據其中任一待檢測樣本的反應結果即得出所述替代生物標志物的信息；對于任一待檢測樣本，具體操作步驟如下3. 1)將1-2%牛血清白蛋白溶解于磷酸鹽緩沖液-吐溫20中配制成封閉液，將制備好的凝集素芯片置于封閉液中；3. 2)將封閉后的凝集素芯片依次用磷酸鹽緩沖液-吐溫20和磷酸鹽緩沖液清洗，以去除步驟3. 1)中未完全固定于芯片上的凝集素，再經甩干后備用；3. 3)對經步驟3. 2)甩干后的凝集素芯片加入3-5 μ g待檢測樣本和500-800 μ L的孵育緩沖液，室溫孵育；3. 4)將孵育后的凝集素芯片依次用磷酸鹽緩沖液-吐溫20和磷酸鹽緩沖液清洗，以去除步驟3. 3)中未完全結合于凝集素芯片上的待檢測樣本的蛋白，再經甩干后備用；3. 5)對經步驟3. 4)甩干后的凝集素芯片用GenePiX4000B芯片掃描儀掃描，得到凝集素與標記后糖蛋白糖鏈結合的熒光圖像；3. 6)通過GenePiU. 0軟件對熒光圖像進行中值分析，對圖像中的凝集素所對應的糖鏈結構反復核對后得出所述替代生物標志物的表達信息。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3.1)、3. 2)和3. 4)中的磷酸鹽緩沖液 ρΗ7· 4，含有 NaCl 8. Og/L，KCl 0. 2g/L，KH2PO4O. 2g/L，Na2HPO4 · Iffl2O 2. 9g/L ；磷酸鹽緩沖液-吐溫20 :10mmol/L磷酸鹽緩沖液中含質量分數0. 05-0. 5%吐溫20。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3. 中的孵育緩沖液磷酸鹽緩沖液-吐溫20中含質量分數牛血清白蛋白和質量分數10-20%羥胺。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述熒光試劑采用Cy3或Cy5。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟1.3)所述點樣儀器采用晶芯48點樣系統。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于步驟3. 是對甩干后的凝集素芯片加入 4 μ g待檢測樣本和780 μ L的孵育緩沖液，并在室溫孵育2小時。
全文摘要
本發明提供一種在唾液、血清和尿液中檢測肝腫瘤的替代生物標志物的方法，以快速、簡便、準確檢測肝腫瘤的替代生物標志物的表達信息。該方法主要步驟有1)制備分別對應于唾液、血清和尿液樣本檢測的凝集素芯片；2)分別對唾液、血清和尿液樣本原液進行預處理，去除雜質，純化蛋白，用熒光試劑進行標記，并用G-25柱去除多余熒光，得到相應的待檢測樣本；3)將三種待檢測樣本分別加載到對應的凝集素芯片上以獲得各待檢測樣本中糖蛋白糖鏈譜，根據其中任一待檢測樣本的反應結果即得出所述替代生物標志物的信息。本發明檢測過程靈敏度高、檢測結論準確，具有安全、無損傷、標本收集簡便、容易保存等優點。
文檔編號G01N33/533GK102175879SQ20111002144
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月19日 優先權日2011年1月19日
發明者于漢杰, 張華 , 朱珉之, 李錚, 秦棪楠, 簡強 申請人:西北大學