專利名稱：檢測硫醇的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及硫醇檢測分析技術，具體屬于一種快速、定量地檢測硫醇的方法，以及檢測硫醇的試劑盒。
背景技術：
硫醇在生物體系中起著關鍵作用。三種結構相似的小分子硫醇半胱氨酸(Cys)、 同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)在維持生物系統中扮演著至關緊要的的角色。細胞內硫醇濃度的改變與一些疾病緊密相連，如白血球降低、牛皮癬、肝臟損傷、癌癥和艾滋病。 半胱氨酸(Cys)缺乏會引起很多綜合疾病，如兒童生長緩慢、白化病、水腫、嗜睡癥、肝臟損傷、肌肉和脂肪消損、皮膚損傷、虛弱。血漿中高水平的同型半胱氨酸(Hcy)是Alzheimer 癥、葉酸和維生素B12缺乏癥和心血管疾病的致病因素之一。血漿中總的同型半胱氨酸 (tHcy)濃度與出生缺陷、老年癡呆等疾病有關。谷胱甘肽(GSH)是細胞內含量最高的非蛋白質硫醇(1 lOmmol/L)，支持許多細胞功能，如維持細胞氧化還原動態平衡、異型生物質的新陳代謝、細胞內的信號傳導以及基因調節。更為重要的是，谷胱甘肽能保持蛋白質中半胱氨酸巰基處于還原態，和通過俘獲傷害DNA和RNA的自由基保護細胞免受氧化傷害。因此，定量檢測生物體系中硫醇的濃度在科研和臨床中具有重要意義，建立快速、準確、靈敏的硫醇檢測方法，也是預防和監測硫醇所引發的疾病的重要措施之一。目前已報道的用于檢測硫醇的檢測方法有高效液相色譜法、毛細管電泳法、電化學法、傅里葉變換紅外光譜、質譜法等。然而這些方法檢測過程需要大型儀器、檢測過程繁瑣、耗時、設備和藥品比較昂貴等。小型醫院及診所由于缺乏大型設備，而無法把測定病人體液中硫醇的含量作為臨床上的一個常規檢驗。所以，發展一種檢測過程簡單、靈敏、成本低、適合臨床、科研使用的的檢測硫醇的方法非常必要。
發明內容
本發明的目的是為了克服現有技術硫醇檢測中存在的問題，提供一種體系簡單、 操作方便、選擇性高、靈敏度高的硫醇定量檢測方法，并提供一種價格便宜、操作簡單、檢測過程迅速的硫醇檢測試劑盒。本發明提供的檢測硫醇的方法和試劑盒，是基于一種色烯衍生物NPC， 7-nitro_2,3-dihydro-ΙΗ-cyclopenta[b]chromen-l-one(F. J. Huo, C.X.Yin, P.Yang. ActaCryst. 2004，E60，o2087_o2089)，在HEPES緩沖溶液中定量地檢測硫醇。所述的硫醇為半光氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。本發明的技術方案是一種檢測硫醇的方法(光譜法檢測)，包括如下步驟(1)、配制pH = 7. 0-10. 0、濃度為I-IOOmM的HEPES緩沖溶液，配制濃度為2mM的 NPC乙醇溶液；(2)、把aiil的HEPES緩沖溶液和25 μ 1的NPC溶液加到干凈的紫外比色皿中，在紫外可見分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，最大吸收峰由292nm逐漸變為405nm，當 405nm吸收峰達到最大值時，停止加待測樣，此時加入待測樣的體積計為Vit3w μ 1 ；、按25Χ2Χ10_7ν·,計算出待測樣中硫醇的含量。另一種檢測硫醇的方法(比色法)，包括如下步驟(1)、配制ρΗ= 7.0、濃度為IOmM的HEPES緩沖溶液，標記為R1，配制濃度為2mM的 NPC乙醇溶液，標記為& ；O)、按照禮、1 2體積比為100 1，加入比色管中，此時溶液為無色；(3)、取&體積1/5的待測樣，用進樣器加到上述比色管中，搖振20-30s后，與標準色階進行對照，得出待測樣中硫醇濃度范圍；標準色階的制定在含有100 μ M的NPC、pH = 7. 0且濃度為IOmM的HEPES緩沖溶液中，依次向六個比色管中分別加入硫醇溶液，使硫醇的濃度分別為0、15、30、50、80、 ΙΟΟμΜ，得到標準的色階(見圖4)，即從左到右的顏色依次為，無色、淡黃色、淺黃色、黃色、亮黃色、深黃，代表相應的硫醇濃度為0、15、30、50、80、ΙΟΟμΜ。本發明提供的一種檢測硫醇的試劑盒，包括試劑瓶1、試劑瓶2、比色管、標準色階；所述的試劑瓶1裝有IOOmL濃度為IOmM的HEPES緩沖溶液，標記為試劑R1 ；所述的試劑瓶2裝有5mL濃度為2mM的NPC乙醇溶液，標記為試劑& ；標準的色階為從左到右的顏色依次為，無色、淡黃色、淺黃色、黃色、亮黃色、深黃，代表相應的硫醇濃度依次為0、15、30、50、80、10(^11(見圖4)。其制備方法同上。試劑盒的使用方法(比色法)(1)、按照禮、1 2體積比為100 1，加入比色管中，此時溶液為無色；O)、取&體積1/5的待測樣，用進樣器加到上述比色管中，搖振20-30s后，與標準色階進行對照，得出待測樣中硫醇濃度。所述的HEPES緩沖溶液可以用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、Tris_HCl、檸檬酸、磷酸緩沖溶液等代替。與現有技術相比，本發明具有如下優點和效果1、檢測體系成本低廉，試劑由 5-硝基水楊醛和2-環戊烯酮，在室溫下一步制得，原料便宜，反應條件簡單，易于大規模生產；2、本發明的檢測方法，對硫醇顯示了極高的靈敏性和選擇性，其它非巰基氨基酸和體液中的各種陰離子不干擾檢測結果；3、檢測過程簡便、靈敏、快速，有很低的檢測限和寬的線性范圍，檢測結果準確；4、檢測手段簡單，只需要借助紫外分光光度計或目視比色即可進行，并不需要任何大型儀器配套，克服了大型儀器和試劑盒配套的昂貴和不便，使得中小型的鄉鎮衛生院、診所乃至家庭都可使用該試劑盒進行病情的檢測，有很廣的應用范圍。
圖1 在含有25 μ M NPC和pH7. OHEPES (IOmM)緩沖溶液中逐漸加入半胱氨酸的紫外可見吸收圖。圖2 在含有25 μ M NPC和pH7. OHEPES (IOmM)緩沖溶液中逐漸加入同型半胱氨酸的紫外可見吸收圖。圖3 在含有25 μ M NPC和pH7. OHEPES (IOmM)緩沖溶液中逐漸加入谷胱甘肽的紫外可見吸收圖。圖4 本發明試劑盒標準色階圖。圖5 比色法檢測待測樣中半胱氨酸濃度的顏色圖。
具體實施例方式實施例1光譜法檢測半胱氨酸配制pH = 7.0的的HEPES(IOmM)緩沖溶液，并用乙醇配制2mM的NPC溶液；把2ml 的HEPES緩沖溶液和25 μ 1的NPC溶液加到干凈的紫外比色皿中，在紫外可見分光光度儀上檢測，292nm有最大吸收；取半胱氨酸待測樣，逐漸用微量進樣器加到此比色皿中，邊加樣邊在紫外可見分光光度儀上檢測，隨著半胱氨酸待測樣的加入，最大吸收峰由292nm逐漸變為405nm，當405nm吸收峰達到最大值時，此時加入半胱氨酸待測樣的體積計為25 μ 1 ； 按25 X 2 X 10_5/25計算出半胱氨酸的含量為20 μ Μ。紫外可見吸收圖見圖1.實施例2光譜法檢測同型半胱氨酸配制pH = 7. 0的的HEPES (IOmM)緩沖溶液，并用乙醇配制2mM的NPC溶液；把2ml 的HEPES緩沖溶液和25 μ 1的NPC溶液加到干凈的紫外比色皿中，在紫外可見分光光度儀上檢測，292nm有最大吸收；取同型半胱氨酸待測樣，逐漸用微量進樣器加到此比色皿中， 邊加樣邊在紫外可見分光光度儀上檢測，隨著同型半胱氨酸的加入，最大吸收峰由292nm 逐漸變為405nm，當405nm吸收峰達到最大值時，此時加入同型半胱氨酸待測樣的體積計為 20 μ 1 ；按25Χ2Χ10_5/20計算出同型半胱氨酸的含量為25 μ Μ。紫外可見吸收圖見圖2.實施例3光譜法檢測谷胱甘肽配制pH = 7. 0的的HEPES (IOmM)緩沖溶液，并用乙醇配制2mM的NPC溶液；把2ml 的HEPES緩沖溶液和25 μ 1的NPC溶液加到干凈的紫外比色皿中，在紫外可見分光光度儀上檢測，292nm有最大吸收；取谷胱甘肽待測樣，逐漸用微量進樣器加到此比色皿中，邊加樣邊在紫外可見分光光度儀上檢測，隨著谷胱甘肽待測樣的加入，最大吸收峰由292nm逐漸變為405nm，當405nm吸收峰達到最大值時，此時加入谷胱甘肽待測樣的體積計為50 μ 1 ； 按25X2X10_s/50計算出谷胱甘肽的含量為ΙΟμΜ。紫外可見吸收圖見圖3.實施例4比色法檢測半胱氨酸制備標準色階在含有100 μ M的NPC、pH = 7.0且濃度為IOmM的HEPES緩沖溶液中，依此向六個比色管中分別加入半胱氨酸溶液，使半胱氨酸的濃度分別為0、15、30、50、80、10(^11，得到標準的色階圖，即從左到右的顏色依次為無色、淡黃色、淺黃色、黃色、亮黃，深黃，代表相應的待測樣半胱氨酸濃度為0、15、30、50、80、100μΜ。標準色階見圖4。未知濃度半胱氨酸的測定(1)、配制pH = 7. 0、濃度為IOmM的HEPES緩沖溶液，標記為R1,配制2mM的NPC溶液，標記為R2 ；0)、取隊2000 μ UR2 20 μ 1，加入比色管中，此時溶液為無色；(3)、取半胱氨酸待測樣4μ 1，用進樣器加到上述比色管中，搖振30s后，與標準色階進行對照，得出待測樣中半胱氨酸濃度在30-50 μ M之間，約為43 μ Μ。比色圖見圖5。實施例5試劑盒法檢測谷胱甘肽
試劑盒的構成試劑瓶1 白色塑料瓶，瓶內封閉包裝HEPES緩沖溶液。準確稱取0. 238g的HEPES， 溶于IOOmL蒸餾水中，調節溶液pH = 7. 0，得到IOmM的HEPES緩沖溶液，此試劑為R1。試劑瓶2 無色玻璃瓶，瓶內封閉包裝NPC溶液。準確稱取0. 0022g的NPC，用乙醇為溶劑配制成5mL溶液，得到2mM的NPC乙醇溶液，此試劑為&。以上兩個試劑瓶、比色管、試劑盒說明書和標準色階(同實施例4) 一同放入一個盒子中，并用帶有圓孔的塑料泡沫板固定各試劑瓶。試劑盒的使用方法(比色法)(1)、取禮2000 μ 1、R2 20 μ 1，加入比色管中，此時溶液為無色;⑵、取4μ 1的谷胱甘肽待測樣，用進樣器加到上述比色管中，搖振30s后，與標準色階進行對照，得出待測樣中谷胱甘肽濃度約43 μ M。
權利要求
1.一種檢測硫醇的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)、配制pH= 7. 0-10. 0、濃度為I-IOOmM的HEPES緩沖溶液，配制濃度為2mM的NPC 乙醇溶液；所述的 NPC 代表 7-nitro_2, 3-dihydro-lH_cyclopenta[b] chromen-l-one ；(2)、把2ml的HEPES緩沖溶液和25μ 1的NPC乙醇溶液加到干凈的紫外比色皿中，在紫外可見分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，最大吸收峰由292nm逐漸變為405nm，當 405nm吸收峰達到最大值時，停止加待測樣，此時加入待測樣的體積計為Vit3w μ 1 ；、按25X2X10_7VOTt^算出待測樣中硫醇的含量。
2.一種檢測硫醇的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)、配制PH = 7. 0、濃度為IOmM的HEPES緩沖溶液，標記為隊，配制濃度為2mM的NPC 乙醇溶液，標記為O)、按照‘Ι體積比為100 1，加入比色管中，此時溶液為無色；(3)、取&體積1/5的待測樣，用進樣器加到上述比色管中，搖振20-30S后，與標準色階進行對照，得出待測樣中硫醇濃度；所述的標準色階，即從左到右的顏色依次為無色、淡黃色、淺黃色、黃色、亮黃色、深黃，代表相應的硫醇濃度為:0、15、30、50、80、100μΜ。
3.—種檢測硫醇的試劑盒，其特征在于，包括試劑瓶1、試劑瓶2、比色管、標準色階；所述的試劑瓶1裝有IOOmL濃度為IOmM的HEPES緩沖溶液，標記為試劑R1 ；所述的試劑瓶2裝有5mL濃度為2mM的NPC乙醇溶液，標記為試劑& ；所述的標準的色階從左到右的顏色依次為無色、淡黃色、淺黃色、黃色、亮黃色、深黃， 代表相應的硫醇濃度依次為0、15、30、50、80、100μΜ。
4.如權利要求1或2所述的檢測硫醇的方法，其特征在于，所述的HEPES緩沖溶液用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、Tris-HCl、檸檬酸、磷酸緩沖溶液代替。
5.如權利要求1或2所述的檢測硫醇的方法，其特征在于，所述的硫醇為半光氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。
6.如權利要求3所述的檢測硫醇的試劑盒，其特征在于，所述的HEPES緩沖溶液用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、Tris-HCl、檸檬酸、磷酸緩沖溶液代替。
7.如權利要求3所述的檢測硫醇的試劑盒，其特征在于，所述的硫醇為半光氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。
全文摘要
本發明提供了一種硫醇的定量檢測方法和試劑盒。該方法和試劑盒基于一種色烯衍生物NPC7-nitro-2，3-dihydro-1H-cyclopenta[b]chromen-1-one，在pH為7.0的緩沖溶液中定量地檢測硫醇的含量。硫醇檢測方法包括光譜法和比色法；試劑盒，包括裝有10mM的HEPES緩沖溶液的試劑瓶1、裝有2mM的NPC溶液的試劑瓶2和標準色階。本方法和試劑盒可應用于臨床、食品、生物樣品中硫醇的檢測。檢測過程簡單，方便，易于普及推廣。
文檔編號G01N21/27GK102183471SQ20111000884
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月11日 優先權日2011年1月11日
發明者孫遠強, 張建剛, 陰彩霞, 霍方俊 申請人:山西大學