專利名稱：厚革質葉片石蠟切片方法
技術領域：
本發明涉及一種植物石蠟切片方法，特別涉及一種厚革質葉片石蠟切片方法。
背景技術：
石蠟切片廣泛用于組織學常規制片技術中，主要用于觀察細胞組織的形態結構， 并可長期保存。石蠟切片制作程序及環節繁多，周期長，每個環節都會影響切片質量，例如切片制作過程中容易出現切片彎曲、切片裂紋等問題(吳民華、柯湛華.石蠟制片術中切片過程的常見問題及解決方法[J]海南醫學院學報，2006，12 (3) :255)，這些問題雖然可以克服，但是如果出現材料破碎，卻是無法補救，必須重新制作切片。材料破碎的原因追溯到石蠟制作過程的許多步驟，包括脫水(張玉英.制作石蠟切片易出現的問題及改進措施[J]. 中國科技信息，2007，3 (6) :91-92.)、透明、透蠟(陳業文.制作石蠟組織切片標本的體會 [J].咸寧學院學報(醫學版)，2006，20 (3) :210-211.)、包埋、切片、脫蠟及封片等等，只要其中一個步驟出錯，都可能導致材料破碎(王灶安.植物顯微技術[M].北京農業出版社， 1992 :15-16.)。其中脫水、透明、透蠟、包埋、脫蠟等步驟涉及試劑濃度、成分比例、浸泡時間等因素，切片、染色及封片等過程涉及實際的技術問題。厚革質葉片由于葉片特別厚，制作過程就會帶來相當大的困難。首先，試劑進入組織比較困難，但又不能以單純延長試劑浸泡時間來達到目的，因為浸泡時間過長，會給材料帶來不利的影響，比如二甲苯浸泡時間過長，會造成材料脆性增大，組織易碎。其次，脫水過程也比較不容易，而脫水不徹底也會形成空洞蠟片，所以厚革質葉片石蠟切片制作常會出現材料破碎，導致切片制作失敗。
發明內容
本發明的目的在于針對現有的石蠟切片制作方法中存在的上述問題，提供一種厚革質葉片石蠟切片方法。本發明包括以下步驟1)將葉片沿主脈兩側切開，將中央有葉脈的部分再橫切成小段；在步驟1)中，所述葉片可采用新鮮無病蟲害的成熟葉片；所述將葉片沿主脈兩側切開，可用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開；所述小段的長度可為5 6mm。2)將步驟1)所得到的葉片用固定劑固定；在步驟幻中，所述固定劑可采用萬能固定液(亦稱FAA固定液，配方為70%乙醇 90ml、冰醋酸5ml、福爾馬林5ml)；所述固定的時間可至少Mh。3)將步驟2)用固定劑固定的葉片脫水；在步驟幻中，所述脫水的具體方法可為以60%乙醇開始，5%遞增，每級3 證， 具體為60%乙醇3 釙一65%乙醇中3 釙一70%乙醇中3 釙一75%乙醇中3 5h — 80%乙醇中3 釙一85%乙醇中3 釙一90%乙醇中3 釙一95%乙醇中3 5h— 100%乙醇3 5h (第一次)一100%乙醇3 5h(第二次)。4)用二甲苯和乙醇的不同體積比的溶液作過渡，每級2 4h，具體過程為二甲苯100%乙醇為1 2溶液中浸泡2 4h—二甲苯100%乙醇為1 1溶液中浸泡 2 4h—二甲苯100%乙醇為2 1溶液中浸泡2 4h —純二甲苯中浸泡2 4h (第一次)一純二甲苯中浸泡2 4h(第二次)。5)透蠟和包埋透蠟采用熔點為52 的軟蠟，按體積比，二甲苯石蠟為 1 1溶液于37 40°C恒溫箱中過渡浸蠟48 72h，之后換成純石蠟于60 63°C恒溫箱中浸賭，期間要換1或2次純石蠟，透蠟后用硫酸紙，3張為一個厚度，折2cmX 2cmX 3cm大的紙盒，用于包埋；6)切片后展片，再貼片，然后烤片；在步驟6)中，所述切片可采用生物切片機切片，切片的厚度可為10 12μπι;所述展片可先在25% 35%乙醇過渡，后在水溫為48 55°C中的溫水中展片；所述貼片可直接用乙醇燈外焰輕微烘片；所述烤片可于35 39°C的溫箱內烤片M 36h。7)脫蠟復水；在步驟7)中，所述脫蠟復水的具體方法為按體積比，100%乙醇二甲苯為 1 2溶液中1 anin—100%乙醇二甲苯為1 1溶液中1 ^nin — 100%乙醇二甲苯為2 1溶液中1 2min—100%乙醇1 2min(第一次)一100%乙醇1 2min (第二次)—95%乙醇1 2min — 85%乙醇1 2min — 70%乙醇1 2min — 50%乙醇1 2min。8)染色后封片。在步驟8)中，所述染色的具體方法為番紅溶液染色2 4h —95%乙醇1 2min — 100 % 乙醇 1 2min (第一次)一100 % 乙醇(第二次)1 2min — 100 % 乙醇二甲苯為2 1溶液中1 anin — 100%乙醇二甲苯為1 1溶液中1 ^nin — 100% 乙醇二甲苯為1 2溶液中1 anin—二甲苯(第一次)10 15min—二甲苯(第二次)10 15min — 固綠復染35 45s ；所述封片可采用加拿大樹膠或透明指甲油進行封片。與傳統石蠟制片方法相比，本發明具有以下突出優點1)脫水程序采用乙醇脫水，以60%乙醇開始，5%遞增，每級3 證。各級乙醇濃度5 %遞增，增加乙醇的級數，使厚革質葉逐漸脫水至徹底。2)透明程序的確定由于厚革質葉片材料比較厚，二甲苯透入比較困難，采取二甲苯和乙醇的不同比例(體積比)溶液作過渡，具體依次為二甲苯100%乙醇為1 2溶液、二甲苯100%乙醇為1 1溶液、二甲苯100%乙醇為2 1溶液、純二甲苯兩次， 每級2 4h。3)透蠟采用熔點為52 的軟蠟，透蠟程序用二甲苯石蠟為1 1混合液于37 40°C恒溫箱中過渡浸蠟48 72h，這個過渡浸蠟是透蠟程序的關鍵。4)貼片不使用粘片劑，直接用乙醇燈外焰輕微烘片。5)脫蠟復水采取二甲苯和乙醇的不同比例(體積比)溶液作過渡，每級1 2min，具體為二甲苯兩次、100%乙醇二甲苯為1 2溶液、100%乙醇二甲苯為1 1 溶液、100%乙醇二甲苯為2 1溶液、100%乙醇兩次，之后以濃度由高到低的乙醇溶液復水。6)染色時間的確定為番紅染色2 4h，固綠染色35 45s，由于葉片厚革質，染色時間比常規染色時間延長，取到良好效果。7)以透明指甲油取代中性樹膠進行封片，浸過指甲油的組織，組織染色格外分明，清晰。
圖 1 為古巴牛乳樹(Manilkara roxburghiana(Wight)Dubard)葉片結構。在圖 1 中，標尺為200 μ m。圖 2 為古巴牛乳樹(Manilkara roxburghiana (Wight) Dubard)維管束結構。圖 3 為古巴牛乳樹(Manilkara roxburghiana (Wight) Dubard)葉片結構。圖 4 為古巴牛乳樹(Manilkara roxburghiana (Wight) Dubard)葉片結構。圖5為神秘果(Syns印alum dulcifcum Denill)葉片結構。在圖5中，標尺為 100 μ m0圖6為星蘋果(Chrysophyllum cainito L.)葉片結構。在圖6中，標尺為100 μ m。在圖1 6中，各標記為1.柵欄組織；2.維管束；3.海綿組織；4.導管；5.篩管； 6.導管；7.柵欄組織；8.葉肉組織；9.導管；10.柵欄組織；11.海綿組織。
具體實施例方式石蠟切片實例實施例1具體步驟如下1)取新鮮無病害的古巴牛乳樹(Manilkara roxburghiana (Wight) Dubard)葉片 (厚度450 500 μ m，革質)，用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開，將中央有葉脈的部分再橫切成5 6mm的小段。2)固定固定劑采用萬能固定液(亦稱FAA固定液，配方為70%乙醇90ml、冰醋酸5ml、福爾馬林5ml)，固定時間Mh，并可長期保存。3)脫水采用乙醇脫水，以60%乙醇開始，5%遞增，每級4h，具體為60%乙醇 4h — 65%乙醇中4h — 70%乙醇中4h — 75%乙醇中4h — 80%乙醇中4h — 85%乙醇中 4h — 90%乙醇中4h — 95%乙醇中4h — 100%乙醇4h(第一次)一100%乙醇4h(第二次)。4)透明采取二甲苯和乙醇的不同比例(體積比)溶液作過渡，每級池，具體過程為二甲苯100%乙醇為1 2溶液中浸泡汕一二甲苯100%乙醇為1 1溶液中浸泡汕一二甲苯100%乙醇為2 1溶液中浸泡汕一純二甲苯中浸泡汕(第一次)一純二甲苯中浸泡3h(第二次)。5)透蠟和包埋透蠟采用熔點為52 的軟蠟，采用二甲苯石蠟為1 1(體積比)溶液于37°C恒溫箱中過渡浸蠟48h，之后換成純石蠟于60°C恒溫箱中浸蠟，期間要換一至兩次純石蠟，透蠟后用硫酸紙，三張為一個厚度，折2cmX2cmX 3cm大的紙盒，用于包埋。6)切片采用普通生物切片機切片，切片厚度10 12μπι。7)展片先在30%乙醇過渡，后在水溫為50°C中的溫水中展片。
8)貼片不使用粘片劑，直接用乙醇燈外焰輕微烘片。9)烤片于37 °C的溫箱內烤片30h。10)脫蠟復水程序具體為100%乙醇二甲苯為1 2(體積比)溶液中 1. 5min — 100%乙醇二甲苯為1 1 (體積比)溶液中1. 5min — 100%乙醇二甲苯為 2 1(體積比)溶液中1. 5min—100%乙醇1. 5min(第一次)一100%乙醇1. 5min (第二次)—95% 乙醇 1. 5min — 85% 乙醇 1 2min — 70% 乙醇 1. 5min — 50% 乙醇 1. 5min。11)染色具體程序為番紅溶液染色汕一95%乙醇1.5min— 100%乙醇 1. 5min(第一次)一100% 乙醇 1. 5min(第二次)1. 5min—100% 乙醇二甲苯為 2 1 溶液中1. 5min—100%乙醇二甲苯為1 1溶液中1. 5min — 100 %乙醇二甲苯為1 2 溶液中1. 5min — 二甲苯12min (第一次)一二甲苯12min (第二次)一固綠復染40s。12)封片以透明指甲油進行封片(切片效果見附圖1)。實施例21) 4)如實施例1中描述。5)透蠟采用熔點為52 的軟蠟，采用二甲苯石蠟為1 1(體積比)溶液于37°C恒溫箱中過渡浸蠟72h，之后換成純石蠟于63°C恒溫箱中浸蠟，期間要換一至兩次純石蠟，之后包埋。6)如實施例1中描述。7)展片先在25%乙醇過渡，后在水溫為55 °C中的溫水中展片。8)如實施例1中描述。9)烤片于35 °C的溫箱內烤片36h。10)脫蠟復水程序具體為100%乙醇二甲苯為1 2(體積比)溶液中 Imin — 100%乙醇二甲苯為1 1 (體積比)溶液中Imin — 100 %乙醇二甲苯為 2 1 (體積比)溶液中Imin — 100 %乙醇Imin (第一次)一100 %乙醇Imin (第二次)一95% 乙醇 Imin — 85% 乙醇 Imin — 70% 乙醇 Imin — 50% 乙醇 lmin。11)染色具體程序為1 %番紅溶液染色汕一95%乙醇Imin — 100%乙醇 Imin(第一次)一100%乙醇Imin(第二次)一100%乙醇二甲苯為2 1溶液中 Imin — 100%乙醇二甲苯為1 1溶液中Imin — 100%乙醇二甲苯為1 2溶液中 lmin—二甲苯IOmin (第一次)一二甲苯IOmin (第二次)一固綠復染:35s。12)封片以加拿大中性樹膠進行封片(切片效果見附圖2)。實施例31) 6)如實施例1中描述。7)展片先在35%乙醇過渡，后在水溫為48°C中的溫水中展片。8)如實施例1中描述。9)烤片于35 °C的溫箱內烤片36h。10)脫蠟復水程序具體為100%乙醇二甲苯為1 2(體積比)溶液中 anin — 100%乙醇二甲苯為1 1 (體積比)溶液中^iin — 100 %乙醇二甲苯為 2 1 (體積比)溶液中aiiin — 100 %乙醇^iiin (第一次)一100 %乙醇^iiin (第二次)—95% 乙醇 2min — 85% 乙醇 2min — 70% 乙醇 2min — 50% 乙醇 2min。11)染色具體程序為1 %番紅溶液染色汕一95%乙醇anin — 100%乙醇2min(第一次)一100%乙醇aiiin(第二次)一100%乙醇二甲苯為2 1溶液中 2min — 100%乙醇二甲苯為1 1溶液中2min — 100%乙醇二甲苯為1 2溶液中 anin—二甲苯15min(第一次)一二甲苯15min(第二次)一固綠復染:35s。12)封片以透明指甲油進行封片(切片效果見附圖3)。實施例4具體步驟如下1) 2)如實施例1中描述。3)脫水采用乙醇脫水，以60%乙醇開始，5%遞增，每級4h，具體為60%乙醇 4h — 65%乙醇中4h — 70%乙醇中4h — 75%乙醇中4h — 80%乙醇中4h — 85%乙醇中 4h — 90%乙醇中4h — 95%乙醇中4h — 100%乙醇4h (第一次)一100%乙醇4h (第二次)。4)透明采取二甲苯和乙醇的不同比例(體積比)溶液作過渡，每級池，具體過程為二甲苯100%乙醇為1 2溶液中浸泡濁一二甲苯100%乙醇為1 1溶液中浸泡濁一二甲苯ιοο%乙醇為2 ι溶液中浸泡濁一純二甲苯中浸泡濁(第一次)一純二甲苯中浸泡2h(第二次)。5)透蠟和包埋透蠟采用熔點為52 的軟蠟，采用二甲苯石蠟為1 1(體積比)溶液于37°C恒溫箱中過渡浸蠟72h，之后換成純石蠟于63°C恒溫箱中浸賭，期間要換一至兩次純石蠟，透蠟后用硫酸紙，三張為一個厚度，折2cmX2cmX 3cm大的紙盒，用于包埋。6) 12)如實施例1中描述(切片效果見附圖4)。實施例5具體步驟如下1) 2)如實施例1中描述。3)脫水采用乙醇脫水，以60%乙醇開始，5%遞增，每級釙，具體為60%乙醇 5h — 65%乙醇中釙一70%乙醇中釙一75%乙醇中釙一80%乙醇中5h — 85%乙醇中 5h — 90%乙醇中5h — 95%乙醇中5h — 100%乙醇5h(第一次)一100%乙醇5h(第二次)。4)透明采取二甲苯和乙醇的不同比例(體積比)溶液作過渡，每級4h，具體過程為二甲苯100%乙醇為1 2溶液中浸泡4h—二甲苯100%乙醇為1 1溶液中浸泡 4h—二甲苯100%乙醇為2 1溶液中浸泡4h—純二甲苯中浸泡4h(第一次)一純二甲苯中浸泡4h(第二次)。5)透蠟和包埋透蠟采用熔點為52 的軟蠟，采用二甲苯石蠟為1 1(體積比)溶液于40°C恒溫箱中過渡浸蠟60h，之后換成純石蠟于60°C恒溫箱中浸蠟，期間要換一至兩次純石蠟，透蠟后用硫酸紙，三張為一個厚度，折2cmX2cmX 3cm大的紙盒，用于包埋。6) 12)如實施例1中描述。實施例6具體步驟如下1) 2)如實施例1中描述。
3)脫水采用乙醇脫水，以60%乙醇開始，5%遞增，每級釙，具體為60%乙醇 5h — 65%乙醇中釙一70%乙醇中釙一75%乙醇中釙一80%乙醇中釙一85%乙醇中釙一90%乙醇中釙一95%乙醇中釙一100%乙醇釙(第一次)一100%乙醇釙(第二次)。4)透明采取二甲苯和乙醇的不同比例(體積比)溶液作過渡，每級4h，具體過程為二甲苯100%乙醇為1 2溶液中浸泡4h—二甲苯100%乙醇為1 1溶液中浸泡 4h—二甲苯100%乙醇為2 1溶液中浸泡4h—純二甲苯中浸泡4h(第一次)一純二甲苯中浸泡4h(第二次)。5)透蠟和包埋透蠟采用熔點為52 的軟蠟，采用二甲苯石蠟為1 1(體積比)溶液于40°C恒溫箱中過渡浸蠟72h，之后換成純石蠟于63°C恒溫箱中浸蠟，期間要換一至兩次純石蠟，透蠟后用硫酸紙，三張為一個厚度，折2cmX2cmX 3cm大的紙盒，用于包埋。6) 9)如實施例1中描述。10)脫蠟復水程序具體為100%乙醇二甲苯為1 2(體積比)溶液中 anin — 100%乙醇二甲苯為1 1 (體積比)溶液中^iin — 100 %乙醇二甲苯為 2 1 (體積比)溶液中aiiin — 100 %乙醇^iiin (第一次)一100 %乙醇^iiin (第二次)—95% 乙醇 2min — 85% 乙醇 2min — 70% 乙醇 2min — 50% 乙醇 2min。11)染色具體程序為1 %番紅溶液染色汕一95 %乙醇anin — 100 %乙醇anin(第一次)一100%乙醇aiiin(第二次)一100%乙醇二甲苯為21溶液中 2min — 100%乙醇二甲苯為1 1溶液中2min — 100%乙醇二甲苯為1 2溶液中 anin—二甲苯12min (第一次)一二甲苯12min (第二次)一固綠復染40s。12)封片以加拿大中性樹膠進行封片。實施例7具體步驟如下1) 2)如實施例1中描述。3)脫水采用乙醇脫水，以60%乙醇開始，5%遞增，每級釙，具體為60%乙醇 5h — 65%乙醇中釙一70%乙醇中釙一75%乙醇中釙一80%乙醇中釙一85%乙醇中釙一90%乙醇中釙一95%乙醇中釙一100%乙醇釙(第一次)一100%乙醇釙(第二次)。4)透明采取二甲苯和乙醇的不同比例(體積比)溶液作過渡，每級4h，具體過程為二甲苯100%乙醇為1 2溶液中浸泡4h—二甲苯100%乙醇為1 1溶液中浸泡 4h—二甲苯100%乙醇為2 1溶液中浸泡4h—純二甲苯中浸泡4h(第一次)一純二甲苯中浸泡4h(第二次)。5)透蠟和包埋透蠟采用熔點為52 的軟蠟，采用二甲苯石蠟為1 1(體積比)溶液于40°C恒溫箱中過渡浸蠟72h，之后換成純石蠟于63°C恒溫箱中浸蠟，期間要換一至兩次純石蠟，透蠟后用硫酸紙，三張為一個厚度，折2cmX2cmX 3cm大的紙盒，用于包埋。6) 9)如實施例1中描述。10)脫蠟復水程序具體為100%乙醇二甲苯為1 2(體積比)溶液中anin — 100%乙醇二甲苯為1 1 (體積比)溶液中^iin — 100 %乙醇二甲苯為 2 1(體積比)溶液中anin— 100%乙醇anin(第一次)一100%乙醇anin(第二次)—95% 乙醇 2min — 85% 乙醇 2min — 70% 乙醇 2min — 50% 乙醇 2min。11)染色具體程序為1 %番紅溶液染色汕一95%乙醇anin — 100%乙醇 2min(第一次)一100%乙醇2min(第二次)一100%乙醇二甲苯為2 1溶液中 2min — 100%乙醇二甲苯為1 1溶液中2min — 100%乙醇二甲苯為1 2溶液中 2min — 二甲苯IOmin (第一次)一二甲苯IOmin (第二次)一固綠復染45s。12)封片以加拿大中性樹膠進行封片。實施例8具體步驟如下1) 2)如實施例1中描述。3)脫水采用乙醇脫水，以60%乙醇開始，5%遞增，每級池，具體為60%乙醇 3h — 65%乙醇中汕一70%乙醇中汕一75%乙醇中汕一80%乙醇中汕一85%乙醇中汕一90%乙醇中汕一95%乙醇中汕一100%乙醇汕(第一次)一100%乙醇汕(第二次)。4)透明采取二甲苯和乙醇的不同比例(體積比)溶液作過渡，每級池，具體過程為二甲苯100%乙醇為1 2溶液中浸泡濁一二甲苯100%乙醇為1 1溶液中浸泡濁一二甲苯ιοο%乙醇為2 ι溶液中浸泡濁一純二甲苯中浸泡濁(第一次)一純二甲苯中浸泡2h(第二次)。5)透蠟和包埋透蠟采用熔點為52 的軟蠟，采用二甲苯石蠟為1 1(體積比)溶液于37°C恒溫箱中過渡浸蠟60h，之后換成純石蠟于60°C恒溫箱中浸蠟，期間要換一至兩次純石蠟，透蠟后用硫酸紙，三張為一個厚度，折2cmX2cmX 3cm大的紙盒，用于包埋。6) 9)如實施例1中描述。10)脫蠟復水程序具體為100%乙醇二甲苯為1 2(體積比)溶液中 Imin — 100%乙醇二甲苯為1 1 (體積比)溶液中Imin — 100 %乙醇二甲苯為 2 1 (體積比)溶液中Imin — 100 %乙醇Imin (第一次)一100 %乙醇Imin (第二次)一95% 乙醇 Imin — 85% 乙醇 Imin — 70% 乙醇 Imin — 50% 乙醇 lmin。11)染色具體程序為1 %番紅溶液染色汕一95%乙醇anin — 100%乙醇 2min(第一次)一100%乙醇2min(第二次)一100%乙醇二甲苯為2 1溶液中 2min — 100%乙醇二甲苯為1 1溶液中2min — 100%乙醇二甲苯為1 2溶液中 anin—二甲苯12min (第一次)一二甲苯12min (第二次)一固綠復染38s。12)封片以透明指甲油進行封片。實施例9具體步驟如下1) 2)如實施例1所述3)脫水采用乙醇脫水，以60%乙醇開始，5%遞增，每級證，具體為60%乙醇 5h — 65%乙醇中釙一70%乙醇中釙一75%乙醇中釙一80%乙醇中釙一85%乙醇中釙一90%乙醇中釙一95%乙醇中釙一100%乙醇釙(第一次)一100%乙醇釙(第二次)。4)透明采取二甲苯和乙醇的不同比例(體積比)溶液作過渡，每級池，具體過程為二甲苯100%乙醇為1 2溶液中浸泡汕一二甲苯100%乙醇為1 1溶液中浸泡汕一二甲苯100%乙醇為2 1溶液中浸泡汕一純二甲苯中浸泡汕(第一次)一純二甲苯中浸泡3h(第二次)。5)透蠟和包埋透蠟采用熔點為52 的軟蠟，采用二甲苯石蠟為1 1(體積比)溶液于37°C恒溫箱中過渡浸蠟48h，之后換成純石蠟于60°C恒溫箱中浸蠟，期間要換一至兩次純石蠟，透蠟后用硫酸紙，三張為一個厚度，折2cmX2cmX 3cm大的紙盒，用于包埋。6)切片采用普通生物切片機切片，切片厚度10 12 μ m。7)展片先在25%乙醇過渡，后在水溫為50°C中的溫水中展片。8)貼片不使用粘片劑，直接用乙醇燈外焰輕微烘片。9)烤片于35 °C的溫箱內烤片36h。10)脫蠟復水程序具體為100%乙醇二甲苯為1 2(體積比)溶液中 1. 5min — 100%乙醇二甲苯為1 1 (體積比)溶液中1. 5min — 100%乙醇二甲苯為 2 1(體積比)溶液中1. 5min—100%乙醇1. 5min(第一次)一100%乙醇1. 5min (第二次)—95% 乙醇 1. 5min — 85% 乙醇 1 2min — 70% 乙醇 1. 5min — 50% 乙醇 1. 5min。11)染色具體程序為番紅溶液染色4h —95%乙醇Imin — 100%乙醇 Imin (第一次)一100%乙醇Imin (第二次)Imin — 100%乙醇二甲苯為2 1溶液中 Imin — 100%乙醇二甲苯為1 1溶液中Imin — 100%乙醇二甲苯為1 2溶液中 Imin — 二甲苯12min (第一次)一二甲苯12min (第二次)一固綠復染40s。12)封片以透明指甲油進行封片。實施例10具體步驟如下1) 2)如實施例1所述3)脫水采用乙醇脫水，以60%乙醇開始，5%遞增，每級池，具體為60%乙醇 3h — 65%乙醇中汕一70%乙醇中汕一75%乙醇中汕一80%乙醇中汕一85%乙醇中汕一90%乙醇中汕一95%乙醇中汕一100%乙醇汕(第一次)一100%乙醇汕(第二次)。4)透明采取二甲苯和乙醇的不同比例(體積比)溶液作過渡，每級池，具體過程為二甲苯100%乙醇為1 2溶液中浸泡汕一二甲苯100%乙醇為1 1溶液中浸泡汕一二甲苯100%乙醇為2 1溶液中浸泡汕一純二甲苯中浸泡汕(第一次)一純二甲苯中浸泡3h(第二次)。5)透蠟和包埋透蠟采用熔點為52 的軟蠟，采用二甲苯石蠟為1 1(體積比)溶液于40°C恒溫箱中過渡浸蠟72h，之后換成純石蠟于63°C恒溫箱中浸蠟，期間要換一至兩次純石蠟，透蠟后用硫酸紙，三張為一個厚度，折2cmX2cmX 3cm大的紙盒，用于包埋。6)切片采用普通生物切片機切片，切片厚度10 12μπι。7)展片先在35%乙醇過渡，后在水溫為48°C中的溫水中展片。
8)貼片不使用粘片劑，直接用乙醇燈外焰輕微烘片。9)烤片于37 °C的溫箱內烤片30h。10)脫蠟復水程序具體為100%乙醇二甲苯為1 2(體積比)溶液中 1. 5min — 100%乙醇二甲苯為1 1 (體積比)溶液中1. 5min — 100%乙醇二甲苯為 2 1(體積比)溶液中1. 5min—100%乙醇1. 5min(第一次)一100%乙醇1. 5min (第二次)—95% 乙醇 1. 5min — 85% 乙醇 1 2min — 70% 乙醇 1. 5min — 50% 乙醇 1. 5min。11)染色具體程序為1 %番紅溶液染色— 95%乙醇^iin — 100%乙醇 2min(第一次)一100%乙醇anin(第二次)2min — 100%乙醇二甲苯為2 1溶液中 2min — 100%乙醇二甲苯為1 1溶液中2min — 100%乙醇二甲苯為1 2溶液中 anin—二甲苯IOmin (第一次)一二甲苯IOmin (第二次)一固綠復染40s。12)封片以加拿大中性樹膠進行封片。實施例11具體步驟如下1)取新鮮無病害的神秘果(Syns印alum dulcifcum Denill)葉片(厚度100 130 μ m，紙質)，用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開，將中央有葉脈的部分再橫切成 5 6mm的小段。2) 12)如實施例1所述(切片效果見附圖5)。實施例12具體步驟如下1)取新鮮無病害的神秘果(Syns印alum dulcifcum Denill)葉片(厚度100 130 μ m，紙質)，用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開，將中央有葉脈的部分再橫切成 5 6mm的小段。2) 12)如實施例3所述。實施例13具體步驟如下1)取新鮮無病害的神秘果(Syns印alum dulcifcum Denill)葉片(厚度100 130 μ m，紙質)，用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開，將中央有葉脈的部分再橫切成 5 6mm的小段。2) 12)如實施例5所述。實施例14具體步驟如下1)取新鮮無病害的神秘果(Syns印alum dulcifcum Denill)葉片(厚度100 130 μ m，紙質)，用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開，將中央有葉脈的部分再橫切成 5 6mm的小段。2) 12)如實施例7所述。實施例15具體步驟如下1)取新鮮無病害的神秘果(Syns印alum dulcifcum Denill)葉片(厚度100 130 μ m,紙質)，用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開，將中央有葉脈的部分再橫切成5 6mm的小段。2) 12)如實施例9所述。實施例16具體步驟如下1)取新鮮無病害的星蘋果(Chrysophyllum cainito L.)葉片(厚度2OO 250 μ m,紙質)，用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開，將中央有葉脈的部分再橫切成 5 6mm的小段。2) 12)如實施例2所述(切片效果見附圖6)。實施例17具體步驟如下1)取新鮮無病害的星蘋果(Chrysophyllum cainito L.)葉片(厚度200 250 μ m,紙質)，用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開，將中央有葉脈的部分再橫切成 5 6mm的小段。2) 12)如實施例4所述。實施例18具體步驟如下1)取新鮮無病害的星蘋果(Chrysophyllum cainito L.)葉片(厚度200 250 μ m,紙質)，用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開，將中央有葉脈的部分再橫切成 5 6mm的小段。2) 12)如實施例6所述。實施例19具體步驟如下1)取新鮮無病害的星蘋果(Chrysophyllum cainito L.)葉片(厚度200 250 μ m,紙質)，用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開，將中央有葉脈的部分再橫切成 5 6mm的小段。2) 12)如實施例8所述。實施例20具體步驟如下1)取新鮮無病害的星蘋果(Chrysophyllum cainito L.)葉片(厚度200 250 μ m,紙質)，用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開，將中央有葉脈的部分再橫切成 5 6mm的小段。2) 12)如實施例10所述。
權利要求
1.厚革質葉片石蠟切片方法，其特征在于包括以下步驟1)將葉片沿主脈兩側切開，將中央有葉脈的部分再橫切成小段；2)將步驟1)所得到的葉片用固定劑固定；3)將步驟2)用固定劑固定的葉片脫水；4)用二甲苯和乙醇的不同體積比的溶液作過渡，每級2 4h，具體過程為二甲苯100%乙醇為1 2溶液中浸泡2 4h—二甲苯100%乙醇為1 1溶液中浸泡 2 4h—二甲苯100%乙醇為2 1溶液中浸泡2 4h—純二甲苯中浸泡2 4h—純二甲苯中浸泡2 4h ；5)透蠟和包埋透蠟采用熔點為52 的軟蠟，按體積比，二甲苯石蠟為1 1 溶液于37 40°C恒溫箱中過渡浸蠟48 72h，之后換成純石蠟于60 63°C恒溫箱中浸蠟，期間要換1或2次純石蠟，透蠟后用硫酸紙，3張為一個厚度，折2cmX 2cmX 3cm大的紙盒，用于包埋；6)切片后展片，再貼片，然后烤片；7)脫蠟復水；8)染色后封片。
2.如權利要求1所述的厚革質葉片石蠟切片方法，其特征在于在步驟1)中，所述將葉片沿主脈兩側切開，是用單面刀片沿主脈兩側各5 6mm處切開；所述小段的長度為5 6mm ο
3.如權利要求1所述的厚革質葉片石蠟切片方法，其特征在于在步驟2)中，所述固定劑為萬能固定液，配方為70%乙醇90ml、冰醋酸5ml、福爾馬林5ml ；所述固定的時間至少 24h。
4.如權利要求1所述的厚革質葉片石蠟切片方法，其特征在于在步驟3)中，所述脫水的具體方法為以60 %乙醇開始，5 %遞增，每級3 5h，具體為60 %乙醇3 5h — 65 %乙醇中3 釙一70%乙醇中3 釙一75%乙醇中3 釙一80%乙醇中3 釙一85%乙醇中3 釙一90%乙醇中3 釙一95%乙醇中3 釙一100%乙醇3 釙一100%乙醇3 5h。
5.如權利要求1所述的厚革質葉片石蠟切片方法，其特征在于在步驟6)中，所述切片采用生物切片機切片，切片的厚度為10 12 μ m。
6.如權利要求1所述的厚革質葉片石蠟切片方法，其特征在于在步驟6)中，所述展片是先在25% 35%乙醇過渡，然后在水溫為48 55 °C中的溫水中展片。
7.如權利要求1所述的厚革質葉片石蠟切片方法，其特征在于在步驟6)中，所述貼片是直接用乙醇燈外焰輕微烘片。
8.如權利要求1所述的厚革質葉片石蠟切片方法，其特征在于在步驟6)中，所述烤片是于；35 39 °C的溫箱內烤片M 36h。
9.如權利要求1所述的厚革質葉片石蠟切片方法，其特征在于在步驟7)中，所述脫蠟復水的具體方法為按體積比，100%乙醇二甲苯為1 2溶液中1 ailin— 100% 乙醇二甲苯為1 1溶液中1 2min — 100%乙醇二甲苯為2 1溶液中1 2min— 100% 乙醇 1 2min — 100% 乙醇 1 2min — 95% 乙醇 1 2min — 85% 乙醇 1 2min — 70% 乙醇 1 2min — 50% 乙醇 1 2min。
10.如權利要求1所述的厚革質葉片石蠟切片方法，其特征在于在步驟8)中，所述染色的具體方法為番紅溶液染色2 4h — 95%乙醇1 ailin — 100%乙醇1 anin — 100%乙醇1 2min — 100%乙醇二甲苯為2 1溶液中1 2min — 100 %乙醇二甲苯為1 1溶液中1 2min — 100%乙醇二甲苯為1 2溶液中1 2min — 二甲苯10 15min — 二甲苯10 15min — 固綠復染35 45s ；所述封片采用加拿大樹膠或透明指甲油進行封片。
全文摘要
厚革質葉片石蠟切片方法，涉及一種植物石蠟切片方法。操作程序固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、脫蠟、染色及封片。厚革質葉片石蠟切片過程中，對固定劑、脫水程序、透明程序、透蠟方法、染色方法及封片進行了改進，即進行了固定劑的選擇、脫水程序的確定、透明程序的確定、透蠟程序的確定、染色及封片方法的改進。該方法同樣適用于其它不同厚度及性質的葉片。該方法在實際上可以解決厚度性質不一的葉片石蠟切片制作，在石蠟制作理論上試行推廣一種統一的行之有效的制作方法。
文檔編號G01N1/28GK102175482SQ20111000100
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月5日 優先權日2011年1月5日
發明者劉育梅, 盧昌義 申請人:廈門大學