專利名稱：一種葉片組織自由基測定的原位顯色和定量的方法
技術領域：
本發明涉及一種葉片組織的原位顯色和定量的方法，更具體的說是一種葉片組織 自由基測定的原位顯色和定量的方法。
背景技術：
植物組織的光合作用、呼吸、氧化磷酸化、脂肪酸的-β_氧化以及許多氧化酶的代 謝過程均可產生活性氧自由基(統稱為R0S)。愈來愈多的研究報道，ROS是植物體代謝的正 常部分，可作為信號分子誘導植物體對環境脅迫的應激響應，而過量ROS的積累卻能誘導 膜脂質過氧化、蛋白分子的氧化修飾或降解，以及DNA分子的氧化損傷等。因此，研究自由 基的產生、積累和代謝的變化，能夠反映植物體在逆境條件下的氧化脅迫和應激響應水平， 可為環境污染物的早期診斷提供預警信號。因此，準確測定植物組織ROS的產生和積累水 平具有十分重要的理論意義和應用前景。植物體內的ROS通常存在超氧陰離子自由基(02_ _)、過氧化氫(H2A )、羥基自由基 (0Η )、單線態氧(1O2)等類型，其中產生最早的是02__，氧化能力最強的是0Η。這些ROS類 型可以形成一個復雜的反應網絡，通過協同作用相互轉化。例如，02__和H2O2可通過!^nton 反應、Haber-Weiss反應、Winterbourn反應以及光解反應等過程轉換成0H_。ROS的測定 方法通常包括分光光度法、原位顯色法、自旋捕捉-電子順磁共振法(ΕΗΟ、流式細胞儀測 定等方法。其中關于植物體(V—和H2O2的研究報道最多，也最受到關注。自由基的半衰期十分短暫，而且在植物體內的存在濃度很低，直接捕捉十分困難。 因此，人們常常應用間接方法去檢測植物體內產生02__的速率。王愛國和羅廣華[1]應用植 物勻漿液的羥胺反應產生O2 -的中間產物，再應用分光光度法測定和推算植物體內O2 -的 產生速率。Able AJ[2]應用四唑類化合物捕捉人工培養的煙草細胞內的0廠，應用分光光度 法測定O2 -中間產物的含量。這兩種方法都是測定植物體產生O2 -速率的間接方法，被廣 泛引用。植物組織的0廠也能夠直接捕捉和定量。有研究報道，特異性捕獲劑結合EPR-自 旋捕捉技術是檢測生物和化學體系中02__產生量的最直接和最敏感的技術。02__的特異性 捕獲劑phenyl-N-i-butylnitrone (PBN)能夠與0廠迅速結合并形成穩定的中間產物，再 結合EPR-自旋捕捉技術就能夠克服O2-存在周期短暫而不易捕捉的局限性，能夠對02__進 行定性和定量分析 ]。然而這種方法所應用的設備十分昂貴，而且同一種捕獲劑對不同的 植物也具有其特異性，因此，限制了推廣。H2O2含量的測定主要應用分光光度法。1977年，Brerman T和Frenkel Cm建立 了應用TiCI4-分光光度法測定植物組織H2A的方法。之后，該方法被廣泛用于測定植物組 織在生物或非生物脅迫下H2O2的水平變化。還有人應用過氧化物酶-Amplex Red (N-乙酰 基-3，7- 二羥基吩噁嗪)-分光光度法測定煙草細胞外H2A的變化[5]以及應用二甲氨基苯 甲酸、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽以及辣根過氧化物酶混合溶液，結合分光光度法 測定玉米幼苗組織H2A的含量[6]。上述方法中雖然應用到的化學反應試劑不同，但最終都應用分光光度法對中間產物進行測定。對植物葉片組織O2 -和H2A進行原位顯色的研究也有報道，然而存在顯色后如何 對自由基反應產物進行科學定量的問題，對植物葉片中O2 -和H2O2的準確定量成為了難以 解決的難題。
發明內容
、本發明要解決的技術問題
針對植物葉片中自由基(O2 -和H2O2)的分布和準確定量的難題，本發明提供了一種葉 片組織自由基測定的原位顯色和定量的方法，并應用Image-Pro plus軟件對0廠和H2O2進 行定量分析，提高了對植物葉片自由基定量分析的準確性。、技術方案
一種葉片組織自由基測定的原位顯色和定量的方法，包含如下幾個步驟 步驟(1)，葉片采集，清洗干凈。剪取植物新鮮葉片，以幼嫩葉片為佳，用鑷子夾住葉柄或葉片基部用純水快速漂 洗干凈，用濾紙吸干。步驟(2)，葉片自由基顯色反應。設置空白對照組，根據所測自由基種類不同，顯色反應前對對照組葉片作如下預 處理1)超氧陰離子自由基將葉片置于真空抽濾裝置內，加入含1(T20 U/mL SOD酶和10 mM MnCl2的pH值為6. 5 7. 5的磷酸緩沖溶液(PBS)，抽真空3次，每次3 5 min，效果以葉 片表面冒出明顯氣泡為宜；2)過氧化氫自由基將葉片置于真空抽濾裝置內，加入含10 mM 抗壞血酸和廣5 mM過氧化氫酶的pH值為6. 5 7. 5的PBS溶液，抽真空3次，每次3飛min。將預處理過的對照組葉片和未處理待測葉片置于真空抽濾裝置內，根據所測自由 基種類不同，按如下處理1)超氧陰離子自由基立即應用含0. 5^1.0 mg/mL氮藍四唑(NBT) 的PH值為6. 5^7. 5的PBS溶液抽真空3次，每次5 10 min ；2)過氧化氫取自由基立即應 用含廣2 mg/mL 二氨基聯苯胺(DAB)的pH值為6. 5 7. 5的PBS溶液抽真空3次，每次5 10 min。抽真空結束后，將葉片連同溶液置于暗處，靜置5 12 h，使其充分顯色。步驟(3)脫除葉片葉綠素，清洗葉片并掃描成像用于軟件分析定量。顯色反應結束后，用鑷子將葉片從溶液中小心取出，洗去表面殘余溶液，置于煮沸 的80%的乙醇溶液(ν/ν)中，溶液加入沸石注意防止暴沸，并注意在整個過程中補充因揮發 損失的乙醇溶液。加熱時間隨植株種類不同有所變化，一般以葉片組織完全失綠并變得透 明，可見自由基反應色斑時停止加熱。葉片中的02__與NBT反應呈藍色斑點，葉片中的H2A與 DAB反應呈棕褐色斑點。用純水沖洗葉片后，掃描成像，應用圖像處理軟件Image-Pro plus 軟件對自由基著色區域進行光密度統計分析。葉片可置于10%的甘油(ν/ν)中，4°C下長期 保存備用。、有益效果
本發明公開了一種一種葉片組織自由基測定的原位顯色和定量的方法，可以在植物葉 片上顯示02__和H2A分布和定量，相比現有技術，具有以下明確的效果
(1)能夠直觀地顯示葉片組織中O2 -和H2A的非均勻分布狀況，有利于糾正對葉片自由 基均勻分布的錯誤觀點。該方法特別適合于對植物幼苗葉片組織氧化脅迫的研究；(2)脫色后對自由基反應產生的色素沉淀區，應用計算機軟件分析其其光密度，可實現 較為準確的半定量，有望在研究植物受氧化脅迫程度時得到廣泛應用；
(3)成本低，操作簡單，易推廣。該方法所涉及的試劑和儀器都不昂貴，而且操作比較簡 單，普通實驗室基本都能夠開展，因此容易推廣。
圖1是暴露于鉛污染土壤的蠶豆幼苗葉片0廠原位顯色示意圖，其中(a)空白對 照組，(b) 500mg/kg外源鉛處理組，(c) SOD酶預處理再顯色的500mg/kg劑量組；
圖2是暴露于鉛污染土壤的蠶豆幼苗葉片02__的比色檢測結果； 圖3是暴露于鎘污染土壤的水稻幼苗葉片02__的原位顯色(A)和光密度分析結果(B); 圖4鉛污染土壤對蠶豆幼苗葉片H2A的誘導，其中A表示蠶豆葉片組織H2A的DAB原 位顯色結果；B表示蠶豆葉片組織H2A的比色法檢測結果。
具體實施例方式以下通過實例進一步說明本發明的實施應用
實施例1鉛污染土壤暴露的蠶豆幼苗葉片組織O2-的積累水平和分布 選擇蠶豆幼苗作為受試生物，應用NBT原位顯色方法，研究了暴露于外源添加0，25， 125，250，500，1000, 2000 mg/kg鉛污染土壤中的蠶豆幼苗葉片組織02__的積累水平和分布 狀況。蠶豆種子播種一個月后，收集不同處理組和對照組植株的葉片，每一組均設置自由基 顯色對照，處理如下將葉片置于真空抽濾裝置內，加入含10 U/mL SOD酶和10 mM MnCl2 的PH值為6. 5的磷酸緩沖溶液(PBS)，抽真空3次，每次3 min，真空度大小以能使葉片表 面冒出微小氣泡為宜；將各組葉片連同自由基顯色對照組葉片一起，置于含0. 5 mg/mL氮 藍四唑(NBT)的pH值為6. 5的PBS溶液中，繼續抽真空3次，每次約5 min，之后將葉片連 同溶液置于暗處，靜置5 h，使其充分顯色；顯色反應結束后，用鑷子將葉片從溶液中小心取 出，洗去表面殘余溶液，置于煮沸的80%的乙醇溶液(ν/ν)中，溶液加入沸石注意防止暴沸， 煮沸至蠶豆葉片組織完全失綠并變得透明，可見明顯藍色色斑時停止加熱。取出葉片，用純 水沖洗干凈，濾紙吸水，用掃描儀掃描成像，應用圖像處理軟件Image-Pro plus軟件對藍色 色斑進行光密度統計分析。圖1是暴露于鉛污染土壤的蠶豆幼苗葉片O2 -原位顯色的示意圖；圖2是暴露于 鉛污染土壤的蠶豆幼苗葉片02__的比色檢測結果。實驗結果表明，蠶豆種子播種一個月后， 葉片ο廠的灰質度顯著性增加，而將鉛處理組的葉片應用SOD酶預處理后再進行原位顯色， 0廠灰質度明顯減少。實驗結果證明，鉛污染土壤能夠誘導蠶豆幼苗葉片組織0廠的積累， 而且02__在葉片中的分布是非均勻的(見圖1)。實驗同步采用比色法對葉片中02__含量進 行了分析，發現軟件統計結果與比色法檢測結果基本一致(圖2)。實施例2鎘污染土壤誘導水稻幼苗葉片組織02__的積累和分布
選擇水稻幼苗作為受試生物，應用NBT原位顯色方法，研究了暴露于鎘污染土壤一個 月后的水稻幼苗葉片組織02__的積累水平和分布狀況，土壤鎘含量采用原子吸收光譜法測 定。暴露一個月后，收集不同處理組和對照組水稻的葉片，每一組均設置自由基顯色對照， 處理如下將葉片置于真空抽濾裝置內，加入含20 U/mL SOD酶和10 mM MnCl2的pH值為7. 0的磷酸緩沖溶液(PBS)，抽真空3次，每次5 min，真空度大小以能使葉片表面冒出微小 氣泡為宜；將各組葉片連同自由基顯色對照組葉片一起，置于含1 mg/mL氮藍四唑(NBT)的 PH值為7. 0的PBS溶液中，繼續抽真空3次，每次約10 min,之后將葉片連同溶液置于暗處， 靜置8 h，使其充分顯色；顯色反應結束后，用鑷子將葉片從溶液中小心取出，洗去表面殘余 溶液，置于煮沸的80%的乙醇溶液(ν/ν)中，至水稻葉片組織完全失綠并變得透明，可見明 顯藍色色斑時停止加熱。取出葉片，用純水沖洗干凈，濾紙吸水，用掃描儀掃描成像，應用圖 像處理軟件Image-Pro plus軟件對藍色色斑進行光密度統計分析。圖3 (A)是暴露于鎘污染土壤的水稻幼苗葉片0廠原位顯色的示意圖；圖3 (B) 是暴露于鎘污染土壤的水稻幼苗葉片02__的光密度軟件分析結果。實驗結果表明，暴露一 個月后，鎘污染土壤顯著誘導了水稻0廠的積累，而且其光密度值隨著外源鎘濃度的增加而 呈現增大趨勢。實施例3鉛污染土壤誘導蠶豆幼苗葉片組織H2A的積累和分布
選擇蠶豆幼苗作為受試生物，應用DAB原位顯色方法，研究了暴露于外源添加0，25， 125，250，500，1000, 2000 mg/kg鉛污染土壤中的蠶豆幼苗葉片組織H2A的積累水平和分布 狀況。蠶豆種子播種一個月后，收集不同處理組和對照組植株的葉片，每一組均設置自由基 顯色對照，處理如下將葉片置于真空抽濾裝置內，加入含10 mM抗壞血酸和1 mM過氧化 氫酶的PH值為7. 5的磷酸緩沖溶液(PBS)，抽真空3次，每次5 min，真空度大小以能使葉片 表面冒出微小氣泡為宜；將各組葉片連同自由基顯色對照組葉片一起，置于含1 mg/mL 二 氨基聯苯胺(DAB)的pH值為7. 5的PBS溶液中，繼續抽真空3次，每次約8 min，之后將葉 片連同溶液置于暗處，靜置12 h，使其充分顯色；顯色反應結束后，用鑷子將葉片從溶液中 小心取出，洗去表面殘余溶液，置于煮沸的80%的乙醇溶液(ν/ν)中，溶液加入沸石注意防 止暴沸，至蠶豆葉片組織完全失綠并變得透明，可見明顯棕褐色色素沉淀時停止加熱。取出 葉片，用純水沖洗干凈，濾紙吸水，用掃描儀掃描成像，應用圖像處理軟件Image-Pro plus 軟件對藍色色斑進行光密度統計分析。實驗還同步采用比色法對葉片中H2O2含量進行了檢 測。圖4A是暴露于鉛污染土壤的蠶豆幼苗葉片H2A原位顯色的示意圖；圖4B是暴露 于鉛污染土壤的蠶豆幼苗葉片H2A的比色檢測結果。實驗結果表明，蠶豆種子播種一個月 后，鉛污染土壤能夠誘導蠶豆幼苗葉片組織H2A的積累，而且其分布是非均勻性的，其光密 度的變化與分光光度法檢測結果基本一致。
權利要求
1.一種葉片組織自由基測定的原位顯色和定量的方法，其步驟為第一步采集植物新鮮葉片，快速漂洗干凈；第二步葉片自由基顯色反應；第三步脫除葉片葉綠素，清洗葉片并掃描成像用于軟件分析定量。
2.根據權利要求1所述的一種葉片組織自由基測定的原位顯色和定量的方法，其特征 在于同步設置對照組，根據所測自由基種類不同，在第二步前對對照組葉片前處理方法分 別為1)超氧陰離子自由基將葉片置于真空抽濾裝置內，加入含1(T20 U/mL SOD酶和10 mM MnCl2W溶液，抽真空3次，每次;Γ5 min，效果以葉片表面冒出明顯氣泡為宜；2)過氧化 氫自由基將葉片置于真空抽濾裝置內，加入含10 mM抗壞血酸和廣2 mM過氧化氫酶的溶 液，抽真空3次，每次3 5min，效果以葉片表面冒出明顯氣泡為宜。
3.根據權利要求1或2所述的一種葉片組織自由基測定的原位顯色和定量的方法， 其特征在于第二步具體為將預處理過的對照組葉片和未處理待測葉片置于真空抽濾裝置 內，根據所測自由基種類不同，按如下處理1)超氧陰離子自由基應用0. 5^1. 0 mg/mL氮藍 四唑NBT溶液抽真空3次，每次5 10 min ；2)過氧化氫取自由基立即應用廣2 mg/mL 二氨 基聯苯胺DAB溶液抽真空3次，每次5 10 min ；抽濾結束后，將葉片連同溶液置于暗處，靜 置5 12 h，使其充分顯色。
4.根據權利要求3中任一項所述的一種葉片組織超氧陰離子和過氧化氫自由基測定 的原位顯色和定量的方法，其特征在于第三步具體為顯色反應結束后，用鑷子將葉片從溶 液中小心取出，洗去表面殘余溶液，置于煮沸的80%的乙醇溶液(ν/ν)中，溶液加入沸石注 意防止暴沸，并注意在整個過程中補充因揮發損失的乙醇溶液；以葉片組織完全失綠并變 得透明，可見自由基反應色斑時停止加熱；葉片超氧陰離子自由基與NBT反應呈藍色斑點， 過氧化氫自由基與DAB反應呈棕褐色斑點；用純水沖洗葉片后，掃描成像，應用圖像處理軟 件Image-Pro plus軟件對自由基著色區域進行光密度統計分析；葉片可置于10%的甘油 (ν/ν)中，4°C下長期保存備用。
5.根據權利要求3中任一項所述的一種葉片組織自由基測定的原位顯色和定量的方 法，其特征在于對照組預處理所用的溶液以及顯色反應所用的NBT和DAB溶液均用10 mM 磷酸緩沖溶液PBS配制，pH值保持在6. 5^7. 5。
全文摘要
本發明公開了一種葉片組織自由基測定的原位顯色和定量的方法，屬于葉片自由基測定領域。其步驟為第一步采集植物新鮮葉片，快速漂洗干凈；第二步葉片自由基顯色反應，1)超氧陰離子自由基將葉片置于真空抽濾裝置內，加入含SOD酶和MnCl2的溶液，抽真空，效果以葉片表面冒出明顯氣泡為宜；2)過氧化氫自由基將葉片置于真空抽濾裝置內，加入含抗壞血酸和mm過氧化氫酶的溶液，抽真空，效果以葉片表面冒出明顯氣泡為宜。第三步脫除葉片葉綠素，清洗葉片并掃描成像用于軟件分析定量。本發明能夠直觀地顯示葉片組織中O2.-和H2O2的非均勻分布狀況，可實現較為準確的半定量，成本低，操作簡單，易推廣。
文檔編號G01N21/27GK102147359SQ20111000024
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月4日 優先權日2011年1月4日
發明者姜錦林, 汪承潤, 王曉蓉, 田園, 耿金菊, 顧雪元 申請人:南京大學