表征微生物中抗生素抗性的方法和設備的制作方法

專利名稱：表征微生物中抗生素抗性的方法和設備的制作方法
技術領域：
本發明涉及細菌診斷學領域，特別涉及一種表征微生物的抗生素抗性的方法、實施本發明方法的試劑盒以及用于表征微生物的抗生素抗性的系統，其包括用于實施本發明的方法的質譜分析裝置以及樣品制備材料。
背景技術：
抗生素抗性是微生物抵御抗生素作用的能力。這種抗性通過基因突變和微生物間的質粒交換而發生。抗生素抗性已對醫學產生主要影響，而這種影響在未來數年只會增長。因表現出抗生素抗性而重新獲得興趣的一組機會微生物是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)。這些菌種(包括，例如，克雷伯菌(Klebsiella spp)和大腸桿菌(Escherichia coli))包括機會病原體,這些機會病原體已與尿路感染、敗血癥、呼吸道感染以及腹瀉尤其相關。早在三十年前，人們便了解這些菌種對第三代頭孢菌素(例如氧亞氨基β_內酰胺)具有抗性，但是從那時才開始記錄抗性的指數增長。菌株通過生成分子A類β-內酰胺酶的稱為超廣譜內酰胺酶(ESBL)獲得其抗性，所述酶能夠滅活第三代頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢泊肟)和單環內酰胺(氨曲南)。ESBL是常見β-內酰胺酶(例如TEM和SHVi1-內酰胺酶)的衍生物，這種衍生物在酶的活性部位附近進行一次或多次氨基酸置換，從而增加其對第三代頭孢菌素和單環內酰胺的親和力以及水解活性。新一代頭孢菌素的廣泛使用促使進化出了更多種類的ESBL。ESBL由可轉移的接合質粒編碼，這些接合質粒負責將抗性傳播給其他的革蘭氏陰性菌。根據其物理特性，ESBL被區分為450多種，克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦對ESBL有不同程度的抑制，這一特性可用于在實驗室中檢測ESBL。目前，在臨床微生物學實驗室中僅采用表型ESBL檢測試驗。分子(基因型)試`驗正處于開發階段。然而，分子試驗存在的問題在于基因型和表型之間缺少100%的相關性。因此，包括ESBL生成細菌在內的任何細菌表型的分子試驗的預測值均受到限制。一般情況下，目前的實驗室表型試驗較之ESBL基因型確證試驗更具有靈敏性和針對性。所有的表型ESBL檢測試驗依據同樣的原理:試驗評估在β -內酰胺類抗生素存在時或β_內酰胺類抗生素與β_內酰胺酶抑制劑組合存在時，對細菌生長的抑制作用的變化情況。還有一些從商業渠道獲得的各種人工試驗和自動化平臺，可用于實施這些表型試驗。人工試驗采用浸有β-內酰胺類抗生素或β-內酰胺類抗生素與β-內酰胺酶抑制劑組合的圓盤或試片。浸透的材料放置在固體培養基中，培養基事先接種了已知密度的細菌懸浮液。之后進行過夜培養，通過觀察確定生長抑制的情況，并根據抑菌圈的直徑對生長抑制的情況進行定量分析。自動化系統建立在細菌生長測量的基礎之上，測量細菌在不同濃度的β-內酰胺類抗生素存在時或β-內酰胺類抗生素與β-內酰胺酶抑制劑組合存在時的細菌生長情況。在4到18小時之后，獲得此類系統的結果。目前，需要能夠更為迅速地診斷ESBL生成細菌的設備和方法。同時，也需要可以用于臨床微生物學實驗室的ESBL檢測試驗以便在酶動力學方面表征ESBL，從而可以跟蹤進化趨勢，并評估和預測抗生素治療中的有效劑量。一般來說，這些設備廣泛地應用于表征微生物的抗生素抗性。發明概述本發明現提供用于快速診斷產生抗生素修飾酶的微生物、尤其是(在優選實施方式中)生成ESBL的微生物的設備和方法。本發明還提供了可表征抗生素修飾酶本身的設備和方法。此類表征可提早檢測出新型抗性。第一方面，本發明提供了一種用于表征微生物的抗生素抗性的方法，所述方法包括以下步驟:a)提供抗微生物化合物或其酶修飾產物、其分子靶標或者其修飾酶底物化合物的參考質譜；b)使微生物、其細胞裂解物或其生長培養基上清液暴露于水成液中的所述抗微生物化合物或所述底物化合物，從而提供被暴露的樣品；c)獲取被暴露 樣品的質譜；d)比較在c)步驟中獲取的質譜和在a)步驟中的參考質譜，以及e)從所述比較中確定在所述暴露后是否出現所述抗微生物化合物、其修飾產物或所述底物的修飾，或者其分子靶標是否過量生成，并確立在觀察到所述修飾時所述微生物對所述抗微生物化合物潛在地存在抗性。在所述方法的優選實施方案中，修飾包括所述抗微生物化合物的酶鈍化或酶降解和/或其分子靶標的甲基化或過量生成。更優選地，酶降解是由內酰胺酶的降解導致。在這種情況下，抗微生物化合物可以是β-內酰胺類抗生素或任何其他β-內酰胺酶底物。因此，在所述方法的另一個優選實施方案中，修飾抗微生物化合物的酶的底物化合物可以替代抗微生物化合物。在其他優選實施方案中，抗微生物化合物是β_內酰胺類抗生素，優選地選自青霉素、頭孢菌素、頭霉素類和碳青霉烯類，更優選地選自頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢泊廂和氨曲南。清楚的是，根據抗生素抗性的機制，可能也會過量生成抗微生物化合物的分子靶標(例如葉酸)，這會導致對葉酸拮抗劑產生抗性。可以通過使用內標物并觀察目標物/內標物的比例增大來檢測過量生成靶標。核酸(例如DNA)可以作為適用的內標物。此外，再次根據抗生素抗性的機制，也可以檢測出抗微生物化合物的分子靶標(例如，如核酸)甲基化。在本發明方法的另一個優選實施方案中，可通過將所述微生物同時暴露于多種抗微生物化合物中來實施本方法，從而表征所述微生物對多種抗生素化合物的抗性。在本發明方法的另一個優選實施方案中，所述抗微生物化合物的酶鈍化或酶降解是由內酰胺酶導致。在特別優選的實施方案中，所述內酰胺酶可以選自頭孢菌素酶(包括超廣譜頭孢菌素酶)、青霉素酶、羧芐西林酶、氯唑西林酶和碳青霉烯酶。在本發明方法的另一個進一步優選實施方案中，β -內酰胺酶是超廣譜β -內酰胺酶(ESBL)。在所述方法的另一個進一步優選實施方案中，微生物是可能會生成ESBL的微生物，優選是選自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)和奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)的革蘭氏陰性菌。本發明的各方面中使用的樣品包括微生物或其裂解產物。微生物樣品可以是微生物培養物樣品。此類培養物不必為純培養物。或者，培養基的部分或直接臨床材料也可以作為樣品來源。在所述方法的另一個優選實施方案中，該方法也是用于表征微生物的抗微生物修飾酶的方法的一部分，優選地所述抗微生物修飾酶最好是超廣譜β_內酰胺酶(ESBL)。在特別優選的實施方案中，本發明方法是用于表征超廣譜β_內酰胺酶(ESBL)的方法的一部分。優選地，根據本發明的用于表征所述酶的方法包括確定在存在或不存在特定酶抑制劑的情況下，所述抗微生物化合物或所述底物化合物的修飾(優選降解)速率和/或所述化合物或底物的酶修飾產物的生成速率，或者所述化合物分子祀標的過量生成速率，從而確定所述酶的米-曼(Km)常數和最大反應速率。在所述方法的另一個優選實施方案中，使用MALDI三重四極質譜分析獲取質譜。在所述方法的另一個優選實施方案中，被暴露樣品是被暴露的所述微生物的粗細胞裂解物。在所述方法的另一個優選實施方案中，所述方法還包括定量分析所述微生物的步驟。優選地，通過定量分析所述樣品中的從微生物衍生的一種或多種結構生物分子或代謝物來對微生物進行定量分析。在優選實施方案中，所述結構生物分子或代謝物選自核酸，優選(基因組)DNA。DNA作為單分子存在于細胞內，可通過使用例如PCR和/或DNA探測介導技術對其進行定量分析。另一方 面，本發明提供用于表征微生物的內酰胺類抗生素抗性的試劑盒，其包含:a)用于裂解微生物的裂解緩沖液；b)至少一種抗微生物化合物或抗微生物化合物修飾酶的底物，以及c) MALDI 基質，優選地所述試劑盒進一步包含:d)攜帶至少一種抗微生物化合物或底物的載體，其中所述載體任選地是一次性質譜分析樣品載板的形式。另一方面，本發明提供了適用于通過上述本發明的方法表征微生物的β_內酰胺類抗生素抗性的系統，所述系統包含以下一種或多種組成部分:-至少一種抗微生物化合物或抗微生物化合物修飾酶的底物；-容器，用于使微生物、其細胞裂解物或其生長培養基上清液暴露于所述水成液中的至少一種抗微生物化合物中，優選地所述至少一種底物化合物在所述容器中提供；-用于裂解所述微生物種的裂解緩沖液；-MALDI 基質；-質譜分析裝置；-抗微生物化合物、其酶修飾產物、其分子靶標或者其修飾酶底物化合物的參考質譜，以及-質譜分析樣品載板，
任選地進一步包含-用于液體處理的自動移液器；-包含計算機程序代碼工具的計算機程序，當所述程序在計算機上運行時，實施如上所述的本發明方法的所有步驟，程序包括例如結果轉譯算法、界面軟件和/或專家系統軟件。本發明在另一方面提供了包含計算機程序代碼工具的計算機程序，當所述程序在計算機上運行時，實施如上所述的本發明方法的所有步驟。在另一方面，本發明提供了計算機程序產品，它包含存儲在計算機可讀介質上的計算機程序代碼工具，當所述程序產品在計算機上運行時，實施所述的本發明方法。發明詳述定義術語“抗生素”和“抗微生物化合物”在本文可互換使用，在本文用于描述降低微生物生存能力或抑制微生物生長或繁殖的化合物或組合物。“抑制生長或繁殖”意味著世代周期時間增加至少2倍、優選至少10倍、更優選至少100倍、且最優選無限地，也就是全部細胞均死亡。正如本公開中所使用的，抗生素還意于包括抗菌劑、抑菌劑或殺菌劑。本發明中可用的抗生素的非限制性實例包括青霉素、頭孢菌素、氨基糖苷類、磺胺類、大環內酯類、四環素、林可酰胺類、喹諾酮類、氯霉素、糖肽類、甲硝唑、利福平、異煙肼、壯觀霉素、葉酸抑制劑、磺胺甲惡唑等等。術語“ β -內酰胺類抗生素”用于指具有包括β -內酰胺類功效在內的抗生素特性的化合物。β -內酰胺環(β -內酰胺類)是含有雜環結構的環酰胺，由三個碳原子和一個氮原子組成。本發明中涉及的有效β_內酰胺類抗生素的非限制性實例包括青霉素、頭孢菌素、頭霉素類、青霉烯類、碳青霉烯類和單環內酰胺。β -內酰胺類抗生素對多種細菌感染均有效(不存在抗藥性的情況下)。本文中使用的術語內酰胺類抗生素”是指包括任何經抗生素抗性微生物滅活而發生質量或結構變化的抗生素，如果所述的質量或結構變化可通過質譜分析檢測。術語“第三代頭孢菌素”是指這樣一類化合物，包括但不限于頭孢克肟、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢卡品、頭孢達肟、頭孢地尼、頭孢妥侖、頭孢他美、頭孢甲肟、頭孢地嗪、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢咪唑、頭孢匹胺、頭孢泊肟、頭孢磺啶、頭孢特侖、頭孢布烯、頭孢噻林、頭孢唑肟和氧頭孢烯類。
術語“ β -內酰胺酶”是指由微生物(優選細菌)生成的酶(EC3.5.2.6)，這種酶能夠水解β-內酰胺類抗生素的β_內酰胺環。根據所謂的Ambler分類法，這一類酶通常被分為4大類(A、B、C和D類)，這種分類法主要依據蛋白質同源性。β-內酰胺酶的示例包括頭孢菌素酶、青霉素酶、卡羧芐西林酶、氯唑西林酶、碳青霉烯酶和頭孢他啶酶。這表示該術語包括“普通的”β -內酰胺酶、超廣譜β -內酰胺酶(ESBL)和AmpCP -內酰胺酶。根據Ambler分類法，本發明中優選的內酰胺酶為A和D類的β-內酰胺酶，或者根據Bush分類，屬于 2 類的 β -內酸胺酶(Bush 等人 1995.Antimicrob Agents Chemother.39:1211-33)。Ambler分類法中A類抗生素為典型的活性部位絲氨酸β -內酰胺酶，而Ambler分類法中D類抗生素是一組特定的絲氨酸β-內酰胺酶，和A類的β-內酰胺酶幾乎沒有序列相似性，D類抗生素俗稱為OXA (苯唑西林酶)類。還優選是金屬碳青霉烯酶。
本文中使用的術語“超廣譜β_內酰胺酶”(縮寫ESBL)最初被稱為“擴展廣譜β-內酰胺酶”，首次發明用于TEM和SHV酶的衍生物，這兩種酶能夠水解氧亞氨基頭孢菌素。這些均屬于β_內酰胺酶官能團2be。此后，該術語的含義得到了擴展，包括:(1)與TEM和SHV突變體的譜相似、但是從其他來源衍生的酶，例如CTX-M和VEB類型；(2)具有臨界ESBL活性的TEM和SHV突變體，例如TEM-12 ；以及(3)多種比其親本型提供更寬的抗性、但不符合官能團2be定義的β -內酰胺酶，例如對頭孢吡肟具有增強活性的OXA衍生物和突變體AMpC類型。本文中使用的術語“抗性的”和“抗性”是指微生物暴露在通過正常人體治療劑量方案能夠達到的抗微生物劑的濃度下，微生物的生存能力沒有降低并且生長或繁殖也未得到抑制的現象。這意味著無法使用這種抗微生物劑成功治療由這種微生物引起的感染。本文中使用的術語“微生物”尤其指病原微生物，例如細菌、酵母、真菌和細胞內外的寄生蟲。在本發明的優選方面中，該術語指病原細菌或機會細菌。這些包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏陰性菌可能是以下屬中的細菌:假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、摩根氏菌屬(Morganella)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、布拉漢菌屬(Branhame I la)、奈瑟氏菌屬(Neisse ria)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、朽1檬酸桿菌屬(Citrobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、愛德華菌屬(Edwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、巴斯德菌屬(PasteureI la)、普羅威登斯菌屬(Provideneia)、放線桿菌屬(Actinobaci I Ius )、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、包特氏菌屬(Bordetella)、西地西菌屬(Cedecea)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、黃單抱菌屬(Xanthomonas)和軍團菌屬(Legionella)。革蘭氏陽性菌可能是以下屬中的細菌:腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿`菌屬(Bacillus)、李斯特菌屬(Listeria)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、加德納菌屬(Gardnerella)、考克氏菌屬(Kocuria)、乳酸球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Micrococcus)、微球菌屬(Leuconostoc)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)和棒狀桿菌屬(Corynebacteria)。酵母和真菌可能是以下屬中的酵母:念珠菌屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、酵母屬(Saccharomyces)和絲抱酵母屬(Trichosporon)。本文中使用的術語“質譜”是指一種圖譜，以分子質量或其函數(例如質荷比(m/ζ)、離子質量等)作為自變量。因變量通常為定量測量，例如豐度、相對豐度、強度、濃度、離子數量、分子數量、原子數量、計數/毫伏、計數等等。例如，在離子環境內，質譜通常以質荷比(m/z)作為自變量，其中m是離子質量，ζ是離子電荷，而因變量最常見的是各分子離子和/或其碎片離子的豐度。術語“離子”是指通過得到或失去一個或多個電子或質子而獲得凈電荷的一個原子或原子團。可以多種方式形成離子，其中包括在電流、紫外線和某些其他射線和/或高溫作用下分解氣體分子。本文中使用的術語“參考質譜”是指用于比較分析的對照質譜。
本文中使用的術語“修飾酶的底物化合物”是指任何可被抗生素修飾酶水解的化合物(無論是否為抗生素)。所述底物的酶修飾會使產生與原始底物化合物具有不同質荷比(或質譜)的反應產物。如果酶轉化是酶降解，那么本文中使用的“反應產物”是指“降解產物”。本文中使用的術語“修飾酶”泛指抗微生物化合物修飾酶，例如β -內酰胺酶。本文中使用的“修飾”是指抗微生物化合物的化學或物理變化(優選是化學變化)，這種變化會滅活化合物的抗微生物活性。修飾可包括降解，降解是指化合物分子的化學基團缺失，導致分子質量降低，有時還會伴隨質荷比的變化。或者，修飾是指化合物分子的化學基團被置換或添加，從而滅活化合物的抗微生物活性，這種修飾模式會改變分子的質量，有時還會伴隨質荷比的變化。本文中使用的術語“細胞裂解物”是指通過破碎或裂解細胞而得到的細胞懸浮液或細胞碎片。粗細胞裂解物包含所有的蛋白質、糖蛋白、多糖、脂質和核酸。本發明中的細胞裂解物可以包括全細胞，但是基本上由裂解步驟之后獲取的細胞成分或任何碎片或其混合物組成。然而，細胞裂解物溶液可以包括但不限于是裂解細胞溶液，可將這種溶液處理為清除或滅活了所選分子的溶液。這樣，與最純化的細胞成分相比，該溶液依然基本上是“原液”。例如，細胞裂解 物可以是一種經制劑處理過的裂解細胞溶液，這種制劑可以滅活或清除聚合酶抑制劑。此外，細胞裂解物還可以是一種經抗凝劑處理過的裂解細胞溶液。任何方法均可用于裂解細胞樣品中的細胞。例如，滲透休克法、超聲裂解法、加熱法、物理破碎法、微波處理和酶和/或堿裂解法均為可用于裂解細胞的方法。本文中使用的術語“生長培養基”是指包含微生物基因表達和/或微生物種生長所需的所有元素的培養基。生長培養基可以是固體培養基、半固體培養基或液體培養基。生長培養基可以含有一種或多種元素，例如氨基酸、胨、碳水化合物、核苷酸、礦物質、維生素、活性分子例如抗生素、酶、表面活性劑、緩沖液、磷酸鹽、銨鹽、鈉鹽、金屬鹽、一種或多種可以檢測酶的活性的底物等等。本文中使用的術語“上清液”是指通過離心、過濾、沉淀或其他技術中的已知方法清除液體培養基(例如液體肉湯培養基)中培養的細胞時剩余的液體懸浮液，懸浮液中還包含溶解物質和懸浮物質。本文中使用的術語“基質”和“MALDI基質”可互換使用，它是指一種液態或固態的化合物，可用來形成基質用于MALDI質譜分析。為了進行MALDI，分析物必須嵌入大量對激光器發射的波長具有良好吸收特性的分子中。這些基質分子通常為小分子有機化合物，主要是酸類。在現有技術中，每種用于MALDI的激光的合適基質材料是公知的，本領域技術人員也會清楚地理解“MALDI基質”這一術語。不限制本發明，常用基質材料包括芥子酸(SA)、α -氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、2，5_ 二羥基苯甲酸(DHB)、7_羥基_4_(三氟甲基)香豆素(HFMC)、3-羥基吡啶甲酸(3-ΗΡΑ)、5-(三氟甲基)尿嘧啶、咖啡酸、琥珀酸、鄰氨基苯甲酸、3-氨基吡嗪-2-羧酸、四(五氟苯基)卟啉和阿魏酸。基質適宜地溶于乙腈/水/甲酸(500:500:1 ;ν/ν/ν),或其他適用比例取決于所用基質。本文中使用的術語“樣品”是指含有或疑似含有分析物的物質，例如要表征的微生物或內酰胺酶，或者內酰胺酶底物或其內酰胺酶降解產物。本發明方法中使用的樣品可以為液態或是固態，可溶于或懸浮于液體、乳液或凝膠中，也可與某種物質結合或被其吸附。樣品可以是生物樣品、環境樣品、實驗樣品、診斷樣品或任何含有或疑似含有目標分析物的其他類型樣品。同樣，樣品可以是或者可包含生物體、器官、組織、細胞、體液、活檢樣品或其碎片。本發明方法中使用的樣品可以是任何疑似含有分析物的物質，例如β -內酰胺酶和ESBL的底物。在生物環境中，樣品可以包含生物流體、整個生物體、器官、組織、細胞、微生物、培養基上清液、亞細胞器、蛋白質復合物、單體蛋白、重組蛋白、融合蛋白、病毒、病毒粒子、肽和氨基酸。本文中使用的術語“樣品載板”是指可適用于接受MALDI分析樣品的所有載板。常用載板為 10x10 不銹鋼祀板(Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA),如果適用，可在靶板上涂一層疏水涂層。本文中使用的術語“米-曼常數” ΒΓΚπι”是指酶反應速率為最大值的一半時的底物濃度。本文中使用的術語“最大反應速率”即“Vmax”是指飽和底物濃度下的最大酶反應速率。米-曼動力學描述了酶化學反應生成分子的生成速率。為了確定酶反應的最大速率，應不斷增加底物濃度直至產物形成速率恒定。這是酶的“最大速率”(Vmax)。在這種情況下，酶的活性部位充滿底物。由于Vmax時無法準確測量底物濃度，因此可以通過最大速率達到一半時的底物濃度來表征酶。這個底物濃度就是米-曼常數(KM)。對于展示簡單米-曼動力學的酶反應，這代表酶-底物(ES)復合物的解離常數(底物的親和力)。值越低，親和力越高。本文中使用的術語“MALDI三重四極MS”是指一種基質輔助激光解析/電離方法，其中質譜儀具有三個與進入離子平行的四極子。第一個四極子充當濾質器。第二個四極子充當碰撞池，其中所選離子碎裂成碎片。第三個四極子對所產生的離子碎片進行掃描。四極桿質量分析器利用振蕩電場有選擇地穩定或擾動通過射頻(RF)四極場的離子的路徑。僅有一種質荷比可以在任何時間穿過系統，而改變磁透鏡上的電勢可以讓多種m/z值快速擺動，以持續的方式或連續的離散跳躍方式。四極桿質譜分析器充當質量選擇濾質器。本文中使用的術語“定量分析”是指用于獲取定量測量的任何方法。例如，對微生物進行定量分析 包括確定微生物的豐度、相對豐度、強度、濃度和/或計數等等。本文中使用的術語“結構生物分子”是指數量在微生物培養基的各個細胞間基本上恒定的任何細胞蛋白質、糖蛋白、多糖、脂質、核酸等，這一數量可用于定量分析那些微生物。例如，如果采用DNA，那么可通過DNA擴增或利用(可鑒定質譜的)核酸探針進行定量分析。此類定量分析方法可采用諸如標準校正曲線，其中可繪制DNA含量與細胞數量或其他生物量參數(例如培養基光密度或碳總質量)關系的圖表。 本文中使用的術語“代謝物”是指在細胞或生物體內進行生物化學反應而生成的化合物，化合物的數量在微生物培養基的各個細胞間基本上恒定，這一數量可用于定量分析那些微生物。優選實施方案本發明提供用于表征微生物的抗生素抗性的方法。本方法的第一步是提供待表征對其抗性的抗生素化合物、其合適的模擬底物、抗生素化合物的分子靶標的一個或多個參考質譜表征。可通過使用任何用于樣品分析的質譜分析(MS)技術來制作參考光譜。優選MS 技術為 MALD1-MS。適用的內酰胺酶底物可以是任何內酰胺類抗生素。或者，可以使用誘導β-內酰胺酶在微生物中表達和/或能夠被β-內酰胺酶的酶活性水解的β-內酰胺類衍生物或模擬物。本發明中使用的模擬底物本身可以但不是必須顯示任何抗生素活性。β -內酰胺酶底物優選是一種β -內酰胺酶降解產物能夠易于被MS識別的化合物，最好是底物及其降解產物具有不同的質荷比。用于表征微生物的β -內酰胺類抗生素抗性的優選方法的另一步驟涉及使微生物、其細胞裂解物或其生長培養基上清液暴露于水成液中的底物化合物，從而提供被暴露樣品。適用的被暴露樣品可以是疑似攜帶要表征β -內酰胺類抗生素抗性的微生物的受試者(即人或動物受 試者)的體液或體組織樣品。適用的體液樣品可以是血液、糞便、尿液樣品。可以在體內或體外使微生物暴露于底物化合物。在某些實施方案中，暴露可以包含培養步驟，其中在短時間內培養微生物，例如在含有目標抗微生物劑的溶液中培養1-5分鐘到1-3小時。此外，也可以使用微生物的裂解物和微生物培養基的上清液。有特定的酶存在時，抗微生物劑或其模擬底物被修飾或被滅活，從而導致與活性藥物形式相比在元素組成上有所不同。這會導致可通過質譜分析檢測的抗微生物劑的質量發生變化。本發明的一項優勢在于粗細胞裂解物也可用于提供被暴露樣品。因此，將要表征的微生物不需要存活，并且也無需在檢測其中的β_內酰胺酶活性之前提純被暴露樣品。當微生物含有β -內酰胺酶基因卻在通行的生長條件下沒有生成所述酶時，可通過在β-內酰胺類抗生素或β-內酰胺酶誘導化合物存在的情況下培養微生物來誘導微生物在生物體中生成內酰胺酶。優選地，在細菌細胞裂解之前，可選擇性地進行誘導或刺激β -內酰胺酶的生成。一般來說，被暴露樣品對抗生素化合物的修飾能力可以通過檢測抗生素底物化合物的減少量來檢測，或者通過檢測修飾酶和底物化合物之間的水解反應的反應產物增加量來檢測。因此，被暴露樣品中β_內酰胺酶的活性可以通過檢測β_內酰胺酶底物化合物的減少量來檢測，或者通過檢測β_內酰胺酶和底物化合物之間的水解反應的反應產物增加量來檢測。或者，被暴露樣品對抗生素化合物的修飾能力還可以通過檢測對抗生素化合物的分子靶標的修飾作用來檢測。例如，對紅霉素、環丙沙星、萬古霉素、甲氧西林和四環素的抗性基于靶標修飾，例如RNA甲基化。同樣，這些靶標修飾可以通過本文中所述的質譜分析來檢測。因此，本發明不限于檢測作為修飾酶的內酰胺酶，也可以表征對內酰胺類的抗性。同樣，也可以使用本發明表征不基于藥物修飾的對抗生素的其他抗性。盡管內酰胺類通常通過水解作用滅活抗生素藥物，也可使用本發明中的設備和方法檢測和表征其他類型的酶修飾。例如，可通過添加磷酸基團修飾氨基糖苷類抗生素。也可通過本發明中的方法檢測這類修飾酶底物的修飾。可通過質譜分析非常精確地測量(定量)反應或靶標化合物的變化，這是本發明人的一項重要發現。因此，在培養步驟之后，可使用通用質譜分析樣品制備方法，例如通過有機溶劑沉淀蛋白質、固相萃取(SPE)或液液萃取(LLE)，來制備用于質譜分析的被暴露樣品。大約使用IuL的制備溶液用于質譜分析。在本發明的優選實施方案中，可采用MALDIMS，更優選采用MALDI四極MS。使用MALDI MS，可精確測量反應化合物，暴露時間(培養時段)可以非常短。通過大約5分鐘的培養時間即可成功表征。MALDI MS涉及將暴露樣品連同基質涂布到質譜分析樣品載板并在樣品載板上干燥樣品以制備質譜分析樣品。適用的基質在上文中已詳細說明，而基質的性質沒有特殊的限制。可通過質譜分析領域的本領域技術人員的已知方法來從被暴露樣品制備質譜樣品。樣品置于質譜儀上之后，可通過標準程序獲取樣品的質譜，標準程序取決于所用設備和MS方法的類型。在本發明的方法中，采用MS、優選串聯質譜分析(MS-MS)或基質輔助激光解析/電離(MALDI)實施檢測底物或靶標修飾(例如內酰胺酶底物降解或RNA甲基化)步驟。質譜分析提供一種有效的方法，用于確定復雜有機分子(包括蛋白質和肽)的結構和種類。在MS中，樣品化合物被高能電子轟擊，使其成為具有一定特性的碎片。這些重量和電荷各異的碎片隨后經過一個磁場，并根據其質荷比進行分離。樣品化合物的最終特有碎片特征樣式(質譜)可用于鑒定和定量分析此化合物。典型的MS程序包括以下步驟:1.通過將樣品任選地(在稱之為MALDI的特殊形式的MS的情況下)連同基質涂布到質譜分析樣品載板上將樣品裝載到MS儀器，并通過蒸發溶劑在載板上干燥樣品或混合物。2.通過多種方法(例如通過電子束沖擊樣品)之一電離樣品成分，從而形成帶電荷的粒子(離子)3.通過電場加速正離子4.根據離子在電磁場中的運動的詳細信息計算粒子的質荷比(m/z)，并且5.檢測在步驟4中根據m/`z排列的離子。在MALDI MS中，基質由結晶分子組成，其中三種適合的結晶分子示例分別是3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(芥子酸)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-氰基或α -基質)和2，5-二羥基苯甲酸(DHB)。基質溶液與被暴露樣品混合在一起。有機溶劑使疏水分子溶于溶液之中，而水則使可溶于水(親水)的分子溶于溶液之中。在MALDI板或載板上(通常是特制的金屬板)點涂此溶液。將溶劑蒸發掉，僅剩下重結晶的基質和分散在基質晶體上的樣品分子。可用于本發明的適用MS應用包括MALD1-TOF MS質譜分析、MALD1-FT質譜分析、MALD1-FT-1CR質譜分析、MALDI三重四極質譜分析。采用MALD1-T0F質譜分析，通量估計為每個樣品I分鐘。采用MALDI三重四極質譜分析，試驗持續時間減少為每個樣品大約5秒，不會喪失靈敏度或針對性。采集質譜后，以定性、半定量或定量分析的方式比較衍生樣品質譜與抗微生物化合物、其酶修飾產物、其分子靶標的參考質譜，也可與其修飾酶的底物化合物的參考質譜進行比較。通過此類比較，可以定性、半定量或定量分析的方式確定底物或靶標的修飾和/或修飾產物的生成。質譜分析可以同時測量失活或修飾的抗生素(例如降解產物)和未受損的抗生素底物(或模擬底物)以及分子靶標，而產物與底物的比例可測量微生物滅活或修飾被測底物的能力。或者或此外，樣品中的底物水平減少或產物水平增加的任意一個均可作為微生物的抗生素滅活或抗生素修飾能力的量度。或者，分子靶標水平增加或修飾(抗性)靶標水平增加可以指示微生物的抗性。在表征對藥物的抗生素抗性(涉及靶標修飾作為抗性機制)的情況下，使微生物、其細胞裂解物或其生長培養基上清液暴露于水成液中的抗微生物化合物的步驟相當于提供微生物、細胞裂解物或生長培養基上清液的樣品并在其中檢測被修飾靶標。因此，在本發明的其中一個實施方案中，抗微生物底物化合物的修飾作為微生物生成諸如β_內酰胺酶的證據，并表明該微生物可能對例如通過降解、所提供的抗微生物底物化合物或適用的模擬底物的特定β-內酰胺酶滅活的β-內酰胺類抗生素化合物具有抗性。例如,通過這種方法,可表征所述微生物種對內酰胺類抗生素的抗性。或者，在本發明的另一個實施方案中，微生物細胞中的抗微生物化合物分子靶標的修飾(相對數量或化學成分的修飾)表明微生物可能對目標抗生素化合物具有抗性。例如,通過這種方法,可表征微生物種對紅霉素、環丙沙星、萬古霉素、甲氧西林和四環素的抗性。如上所述，本發明在某些實施方案中提供一種快速診斷微生物的方法，微生物生成滅活或在結構上修飾抗微生物劑的酶。該方法可用于快速檢測ESBL活性。特別是在醫院中，極為需要這種方法，因為第三代頭孢菌素廣泛用于針對感染的重癥患者的經驗療法。快速檢測患者樣品中的ESBL活性對于盡早開始為患者提供最適用的抗生素藥物療法極為重要。本發明中的方法可用于快速檢測ESBL活性。此外，本發明中的方法同樣適用于微生物培養基上清液或直接從諸 如經尿液樣品離心后的患者樣品分離出的微生物。通過這種方法，甚至在檢測出(培養的)細菌之前，應當有可能檢測出ESBL活性。質譜分析尚未用于通過監測底物強度的降低和/或產物強度的增加來檢測抗生素的酶失活或化學修飾。此外，質譜分析也尚未用于研究復雜樣品(例如裂解微生物)的酶活性。更為具體地是，以前從未發表使用MS的ESBL酶檢測和表征。快速檢測ESBL活性的診斷方法還需要適當地通過使用裂解試劑裂解樣品從微生物中釋放出抑制抗微生物劑的β_內酰胺酶。隨后，可轉移這些裂解物，最好使用自動移液器移液到多孔試片，例如ΑΤΒ 或Rapidec 試片，這些試片包含一些帶有試劑的孔，可根據不同的抗微生物化合物進行不同的試驗反應。例如，一些孔包含一定數量的一種或多種β -內酰胺酶底物，以干燥或固定(膠合)的形式存在。一些孔還可包含一種或多種內標物，便于進行定量分析。一些孔還可作為對照而未裝有底物，用于抗微生物化合物的自降解。轉移到孔中、并如本文所述培養一小段時間后，每個孔的被暴露樣品適于放置在MALDI板或其他MS載板上。在MALDI的情況下，將適用的基質添加到載板上。之后，即可獲取質譜。使用專用的分析算法進行適當的質譜分析。隨后，使用計算機軟件比較從被暴露樣品獲得的質譜和參考質譜，以便確定每個孔的底物是否降解。如果出現降解，那么專用軟件可能會以報告的形式提供試驗結果，報告可能包含諸如如下內容:(I)微生物的種類(種名)(微生物種的鑒定可以通過參考試驗進行，也可在相同或平行的試片中進行)，(2)多孔試片中提供的被測抗微生物劑清單，(3)被微生物種抑制或降解的抗微生物劑清單，(4)假設負責抗微生物抑制的抗性機制，(5)關于結果的專用解釋備注。或者，可以在質譜載板上進行使微生物、其細胞裂解物或其生長培養基上清液暴露于水成液中的底物化合物(從而提供被暴露樣品)的步驟。在允許任選地存在的β_內酰胺酶在樣品載板上降解β -內酰胺酶底物化合物時，可將MALDI基質直接添加到被暴露樣品O可使用復雜樣品(其中包括粗細胞裂解物或患者樣品)實施本發明中的方法。該方法允許精確評估抗微生物劑大小范圍(通常200到1000道爾頓)內的分子，并且可適用于使用例如作為底物的抗微生物藥物確定抗生素滅活或抗生素修飾酶的活性。本發明中的方v法 還可作為ESBL確證試驗使用。在大多數臨床微生物學實驗室中，首先要為ESBL表型篩選細菌，隨后可采用獨立的ESBL表型確證試驗確定ESBL表型。本發明可用于確定細菌中的ESBL表型。較之目前的表型試驗，本發明中的方法的優勢在于本文中建議使用的方法不僅可以處理細菌懸浮液還可處理細菌裂解物。采用細菌裂解物能夠抵消因基于其他機制的抗性而導致的潛在偏差，特別是藥物的進入減少，排出增加。細菌裂解物與目前的表型ESBL確證試驗不能配套使用，因為這些試驗均依靠細菌的生長。本發明中的方法還可作為高通量篩選方法使用，用于醫藥行業的新型β_內酰胺酶抑制劑。目前，內酰胺酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦分別與氨基青霉素和哌拉西林配合使用，用于克服生成β_內酰胺酶的細菌帶來的問題。克拉維酸或他唑巴坦抑制β_內酰胺酶的活性，而氨基青霉素或哌拉西林殺滅細菌。考慮到日益增長的ESBL問題，醫藥行業急需篩選抑制ESBL的新型化合物的工具。本發明極為適用于此目的。
實施例我們通過使用作為底物的芐青霉素檢測出生成CTX-M-1和CTX-M-9的大腸桿菌的粗裂解物以及生成SHV-2的肺炎克雷伯菌中的β -內酰胺酶的活性。以芐青霉素為底物，我們能夠監測純青霉素酶(源于蠟樣芽胞桿菌(B.Cereus))的酶動力學。
權利要求
1.一種用于表征微生物的抗生素抗性的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供抗微生物化合物、其酶修飾產物、其分子靶標或者其修飾酶底物化合物的參考質譜； b)使微生物、其細胞裂解物或其生長培養基上清液暴露于水成液中的所述抗微生物化合物或所述底物化合物，從而提供被暴露樣品； c)獲取被暴露樣品的質譜； d)比較在c)步驟中獲取的質譜和在a)步驟中的參考質譜，以及 e)從所述比較中確定在所述暴露后是否出現所述抗微生物化合物、其修飾產物、其分子靶標或所述底物的修飾，并確立在觀察到所述修飾時所述微生物潛在地對所述抗微生物化合物存在抗性。
2.根據權利要求1的方法，其中所述修飾包括所述抗微生物化合物或所述底物的酶鈍化或酶降解和/或其分子靶標的甲基化或過量生成。
3.根據權利要求2的方法，其中所述的酶降解是由β-內酰胺酶降解導致。
4.根據權利要求3的方法，其中所述的β-內酰胺酶選自根據Ambler分類法的A和D類的β -內酰胺酶，或者屬于根據Bush分類的2類的β -內酰胺酶。
5.根據權利要求4的方法，其中所述的β-內酰胺酶是超廣譜β -內酰胺酶(ESBL)。
6.根據上述權利要求任一項的方法，其中所述的微生物是疑似生成ESBL的微生物，優選地選自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia coli )、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)和奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)。
7.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述的抗微生物化合物是內酰胺類抗生素，優選地選自青霉素、頭孢菌素、頭霉素類和碳青霉烯類，更優選選自頭孢他啶、頭孢噻月虧、頭孢曲松、頭孢泊廂和氨曲南。
8.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述的方法也是用于表征微生物的抗微生物修飾酶的方法的一部分，優選地所述抗微生物修飾酶是超廣譜內酰胺酶(ESBL)。
9.根據權利要求8的方法，其中所述的用于表征所述酶的方法包括確定所述抗微生物化合物或所述底物化合物的修飾速率、優選降解速率和/或所述化合物或底物的酶修飾產物的生成速率，或者所述化合物分子靶標的生成速率，從而確定所述酶的米-曼(Km)常數和最大反應速率(Vmax)。
10.根據前述權利要求任一項的方法，其中在步驟b)之后，所述被暴露樣品和基質一同涂布在質譜分析樣品載板上，其中所述樣品在樣品載板上干燥以制備質譜樣品用于基質輔助激光解析電離質譜分析(MALD1-MS)。
11.根據權利要求10的方法，其中所述質譜是通過使用MALDI三重四極MS獲得的。
12.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述的被暴露樣品為所述微生物的被暴露于抗微生物化合物的粗細胞裂解物。
13.根據前述權利要求任一項的方法，其中在步驟(b)中，通過在所述樣品中定量分析由所述微生物衍生的一種或多種結構生物分子或代謝物來定量分析所述微生物，優選地其中所述結構生物分子或代謝物為DNA分子。
14.用于表征微生物的抗生素抗性的試劑盒，其包含: a)用于裂解微生物的裂解緩沖液；b)至少一種抗微生物化合物或抗微生物化合物修飾酶的底物，以及c)MALDI 基質， 優選地所述試劑盒進一步包含: d)攜帶所述至少一種抗微生物化合物或底物的載體，其中所述載體任選地是一次性質譜分析樣品載板。
15.用于表征微生物的抗生素抗性的系統，其包含: -至少一種抗微生物化合物或抗微生物化合物修飾酶的底物； -容器，用于使微生物、其細胞裂解物、或其生長培養基上清液暴露于水成液中的所述至少一種抗微生物化合物，優選地其中至少一種底物化合物在所述容器中提供； -用于裂解所述微生物的裂解緩沖液； -MALDI 基質； -質譜分析裝置； -抗微生物化合物、其酶修飾產物、其分子靶標或者其修飾酶底物化合物的參考質譜，以及 -質譜分析樣品載板， 任選地進一步包含 -用于液體處理的自動移液器； -計算機程序，其包含計算機程序代碼工具，當所述程序在計算機上運行時或者其中所述的計算機程序在計算機可讀介質上實現，可執行權利要求1-13任一項的所有步驟。
16.計算機程序，其包含計算機程序代碼工具，當所述程序在計算機上運行時，可執行權利要求1-13任一項的所有步驟。
17.計算機程序產品，其包含存儲在計算機可讀介質上的計算機程序代碼工具，當所述程序產品在計算機上運行時，可執行權利要求1-13任一項的方法。
全文摘要
本發明涉及一種表征微生物中抗生素抗性的方法，所述方法包括步驟(a)提供抗微生物化合物、其酶修飾產物、其分子靶標或者其修飾酶底物化合物的參考質譜；(b)使微生物、其細胞裂解物、其生長培養基上清液暴露于水成液中的所述抗微生物化合物或所述底物化合物，從而提供被暴露樣品；(c)獲取被暴露樣品的質譜；(d)比較在c)步驟中獲取的質譜和在a)步驟中的參考質譜，以及(e)從所述比較中確定在所述暴露后是否出現所述抗微生物化合物、其修飾產物、其分子靶標或所述底物的修飾，并確立在觀察到所述修飾時所述微生物對所述抗微生物化合物潛在地存在抗性。
文檔編號G01N33/569GK103108958SQ201080068659
公開日2013年5月15日 申請日期2010年8月19日 優先權日2010年8月19日
發明者T·M·魯威德, J·J·A·范坎朋, A·F·范貝爾庫姆, W·H·F·格森斯, G·P·胡弗 申請人:伊拉斯謨大學鹿特丹醫藥中心