新的超靈敏的基于細胞的傳感器及其應用的制作方法

專利名稱：新的超靈敏的基于細胞的傳感器及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的基于細胞的傳感器，其有效用于藥物發現，診斷和測定分析物，所述基于細胞的傳感器包括具有分泌顆粒的專職受控胞吐作用的細胞系，所述細胞系用作為報道分子多肽的存儲在具有專職受控胞吐作用的細胞系的受控分泌顆粒中的蛋白酶轉染，并具有作為受控分泌顆粒胞吐作用調節劑的內源或異源分子，所述顆粒存儲的蛋白酶報道分子至少具有:針對顆粒內已經存在的條件諸如低PH和其他蛋白酶的蛋白水解作用的高度抗性；胞吐作用后的酶活性；高度特異性切割序列；在無刺激或基礎條件下非常低的分泌水平；和在與細胞培養物生存力和顆粒胞吐作用相容的培養基中高信號與背景活性比，以獲得高通量的可靠且靈敏的檢測。當基于細胞的傳感器使用胞吐作用調節劑的特異性配體溫育時，報道分子多肽由顆粒釋放至胞外培養基中并且這些釋放的報道分子多肽的酶活性使用特異性底物來檢測。本發明還容許開發多重測定，其通過在同一反應器中混合至少兩種細胞系(各細胞系具有不同的成對的胞吐作用調節劑-顆粒存儲的蛋白酶報道分子)和使用各顆粒存儲的蛋白酶報道分子的高特異性底物來檢測胞吐作用來進行。這些靈敏的基于細胞的傳感器有效用于測試至少兩個分子之間的相互作用，一個分子擔當胞吐作用調節劑且另一個擔當胞吐作用調節劑的特異性配體。所述傳感器的應用的實例是:為了測試藥物發現中分子間相互作用，為了定量分子諸如蛋白從而診斷和檢測例如食品工業中、環境樣板中和制藥工業中數種樣品中的藥物或分子。
背景技術：
發現新的治療劑的方法傳統上涉及以下階段:在患者中或在合適的模型系統中，(I)鑒定藥物靶標，(2)驗證所述靶標，(3)篩選影響靶標活性的化合物，(4)測試前導化合物毒性，(5)測試前導化合物副作用，和(6)檢驗前導化合物的代謝和穩定性。高通量篩選(HTS)是藥物發現過程的最初階段之一。其容許測試數十萬化學化合物/日，從而選擇最卓越的候選者進行未來的檢驗。化合物針對治療靶標進行測試。近期現代大規模篩選的發展受到由基因組學鑒定的數量越來越多的靶標和利用組合化學方法合成的化合物文庫的擴大的高度影響。例如，質膜接納超過20種不同的受體家族，包括超過1000種不同的蛋白，其被稱為受體組(receptorome)。G-蛋白偶聯受體(GPCR)超家族代表受體組的單個最大部分,盡管受體組還包括toll樣受體、整聯蛋白受體、低密度脂蛋白受體、蛋白酪氨酸激酶受體和磷酸酶、細胞因子受體和甚至一些起受體作用的離子通道。胞外和細胞表面受體之間的相互作用的治療開發，其作為“藥物-受體”概念發起，被認為是20世紀生物醫學科學中的重大思想和見解之一。由于靶標鑒定的持續進步，篩選技術和靶標驗證，基于受體組的藥物發現努力可能在未來數十年中具有生產價值。毫不意外地，大多數專家斷定受體組占可藥用基因組的最大部分，其中GPCR始終引領該團體。最初的大規模篩選技術之一是競爭性放射性配體結合測定，其依賴于選擇性靶向目的受體的高度特異活性放射性配體的使用。競爭性放射性配體結合測定，在典型地進行時，提供關于特定分子靶標的藥物親和性的可靠評估，但是不提供關于功效(作為激動劑、拮抗劑或部分激動劑)的信息。傳統上，藥理學家已經依賴競爭性放射性配體結合測定來測量配體親和性和受體特異性，并將生理學相關性歸因于GPCR。競爭性放射性配體篩選經得起近-HTS(near-HTS)技術的檢驗，因為它們可以在96+孔板中進行，這已經被證實對于有效篩選針對受體陣列的受關注化學品文庫具有無法估計的價值。競爭性放射性配體結合測定還有助于使化學結構與藥物副作用相聯系。即使放射性配體篩選在不同細胞表達系統之間是一致的，它們具有數種缺點，這些缺點使得研究轉向另外的技術。例如，放射性配體測定不區分激動劑、部分激動劑、拮抗劑和反激動劑。但是更重要地，放射性配體測定不能檢測配體結合下游發生的響應，并且同樣不適合使孤獨受體脫孤(deorphanizing)，這是因為，通過定義，這些oGPCR具有未知的配體。另外，放射性配體結合測試，典型地，對于檢測與內源受體位點(正構位點，orthosteric site)結合的配體具有偏差并因此可能不能檢測在與內源位點不同的位點，即變構位點處發揮其作用的小分子調節劑。與放射性配體結合測試相反，功能性測定產生信息豐富的配體特征，其揭示配體如何調節例如GPCR中的信號轉導。這樣的功能性測定依賴于第二信使的檢測，其作為受體-特異性信號轉導途徑的結果產生。這樣的方法之一，使用利用鈣靈敏性熒光團作為信號測量的胞內鈣增加；而其他方法使用與報道分子如熒光素酶偶聯的鈣或cAMP靈敏性啟動子來測量受體活化或抑制。胞內鈣增加利用鈣靈敏性染料(其在胞內染料結合鈣時增加其熒光)和通過鈣傳感蛋白，稱為水母發光蛋白(aequorin，其在添加腸腔素(coelenterazine)衍生物時產生發光信號)來測量。但是這兩種鈣測定均具有以下缺陷:(1)它們不能用于篩選反激動劑；(2)配體添加和鈣增加之間的短時間間隔要求高度專門化設備進行同時的配體添加和鈣測量；和(3)不放大信號。存在許多測量基于細胞或膜的 cAMP 累積的技術，諸如 SPA (GE Healthcare (GE 衛生保健))、FlashPlate (PerkinElmer) >AScreen (Perkin Elmer)、HTRF cAMP(Cisbio)和 HitHunter (DiscoveRx)。基于報道基因的篩選技術是基于細胞的測定，其中第二信使的增加誘導報道分子，例如熒光素酶、β -內酰胺酶、SEAP和β -半乳糖苷酶的表達。理想的篩選技術應該是簡單、非放射性、具有高信噪比、均相、具有最少的試劑添加和可按照微量滴定板形式處理以促進自動裝置自動操作。另外的考慮因素是是否測量最近或最遠信號傳導步驟。最接近靶標活化處事件的測量將減少假陽性的發生率；然而信噪比可以隨信號轉動級聯向下移動而得到提高，這歸因于信號放大。使用與第二信使如鈣或cAMP靈敏性啟動子偶聯的報道分子的另一個缺點是那些方法依賴于誘導型啟動子，所述誘導型啟動子通常是具有高背景的弱啟動子，且報道分子需要在溶解產物中或作為分泌產物在轉錄和翻譯后進行測量。使用其中報道分子隨配體-蛋白相互作用迅速分泌至胞外培養基中的方法在藥物發現篩選中應該是理想的，因為其消除細胞溶解步驟，以釋放胞內報道分子。而且，使用方法，如使用特異性熒光團測量胞內鈣，消除了轉錄和新合成的需要，由此縮短了測定時間。這種測定時間的縮短在方法，如均相3456納米板篩選(homogeneous3456 nanoplate screening)中非常重要,其中反應體積非常低，因此使得試劑蒸發特別相關。而且，使用納米板來篩選要求非常靈敏的方法來定量非常小量的報道分子或第二信使，并且因此可以隨著信號放大級聯隨意偶聯的報道分子是理想的。但是，由于背景在信號放大級聯中也會被放大，特別是由于所述級聯中第一步引起的背景，所以存在對具有最低可能信號背景比的高度特異性報道分子的需要。最后，向納米板的各個孔中添加一種或兩種試劑的方法在藥物發現過程中是優選的。因此，理想的篩選技術應該是以下的混合:(I)基于報道分子的方法的高靈敏性；(2)第二信使方法的低假陽性率；(3)無轉錄的第二信使方法的短測定時間；(4)基于蛋白報道分子的方法的穩定信號；(5)均相法的最少試劑添加或測定產物分離；(6)具有高信噪比的可靠信號；(7)可放大的信號以減小測定體積同時保持高信噪比和(8)可以用于絕大多數人類可藥用基因組的通用讀數。具有預先形成的報道分子的受控胞吐作用的細胞可以達到數種上述條件，并且因此這樣的基于細胞的傳感器可以在藥物發現和化合物表征中具有高效用。內源性β_氨基己糖苷酶已經是最廣泛用于脫粒的溶酶體報道分子，但是該蛋白被認為是低靈敏性報道分子。例如，Tiberghien 等(Tiberghien 等.Journal of Immunological Methods (免疫學方法雜志)223_1999.63-75)開發了一種方法，其中早幼粒HL-60細胞分化并用于構建96孔微量板方法，其利用過濾而非離心法收集胞外流體以及β_氨基己糖苷酶，作為通過酶學測量的細胞釋放酶。該方法使用非專職細胞，所述非專職細胞需要分化以誘導分泌，β_氨基己糖苷酶報道分子和化學引誘物受體二者均是內源性的且由此低表達，并且以上因素的組合導致需要至少250.000個細胞/孔來進行篩選的方法。因此，作者主張他們的方法的主要優點是使用過濾而非離心法來收集胞外流體。在其他測定中，Naal RM等.Biosens Bioelectron(生物傳感器和生物電子學)2004年11月I日；20(4):791_6。Naal等已經開發了直接脫粒測定，從而容許在單一步驟中使用RBL-2H3肥大細胞作為生物傳感器來篩選用于藥物發現的化學品文庫，并基于內源性β_氨基己糖苷酶向胞外環境中的釋放進行環境毒性評價。該作者預期使用該方法檢測半抗原-1gE相互作用和篩選對于脫粒非常關鍵的syk酪氨酸激酶活性的藥理學抑制劑。那些作者還使用內源性β_氨基己糖苷酶作為報道分子，并僅使用該方法檢測半抗原-1gE相互作用和篩選參與脫粒的酪氨酸激酶的藥理學抑制劑。另外，在該方法中，僅使用貼壁細胞并且因此需要進行各孔的洗滌步驟以消除背景，所述背景由測定前16-24小時細胞培養過程中累積的基本氨基己糖苷酶活性和細胞培養基中使用的牛血清中正常存在的β_氨基己糖苷酶活性引起。這種各孔的洗滌步驟限制通量，增加成本，并且當在具有自動化移液自動裝置的HTS環境中進行時，測定中的信號背景比減小，這歸因于孔中殘留體積中包含氨基己糖苷酶活性。最后，由于氨基己糖苷酶通過大多數具有專職受控胞吐作用的造血細胞系來表達，所以該酶僅容許開發單重測定(monoplex assay)而非多重測定(multiplex assay)。在第三種方法中，Graminski,GF等(見Graminski GF 等 J.Biol.Chem.(生物化學雜志)(1993)，268，8，5957-5964)已經使用由受體介導的青蛙載黑素細胞(melanophore)中的色素分散，所述受體激活蛋白激酶A或蛋白激酶C，從而通過功能性測定迅速評估化學品對于激活PKA或PLC的受體的作用，所述功能性測定用于研究配體-受體相互作用和大規模藥物篩選。該方法的主要缺點是使用非哺乳動物來源的細胞進行受體-配體相互作用的功能性評估和比色法檢測在與熒光或化學發光方法相比時具有低靈敏度。已經開發了其他方法來研究胞內運輸和溶酶體靶向的配偶體和熒光蛋白，諸如GFP之間的融合蛋白分泌。在第一種方法中，EI Meskini, R等(見EI Meskini R等.Endocrinology (內分泌學)2001，142-2，864-873)已經使用具有GFP的前原神經肽(preproneuropeptide) Y融合體來探查AtT_20細胞、PC-12細胞和初級垂體細胞中嵌合蛋白在經歷受刺激釋放的LDCVs中產生GFP存儲的軌跡。在2002年，Rajotte (W02004/016212)聲稱他已經開發了通過使RMCP與GFP融合來檢測和定量脫粒的技術，但是該方法僅有效用于測量運輸而不能定量，這是由于細胞釋放GFP的低靈敏度。其他研究者已經將GPCR轉染至專職分泌細胞如RBL-2H3中，但是內源性β -氨基己糖苷酶始終是用于測量脫粒的報道分子，僅貼壁細胞被用于進行測定，并且因此需要另外的洗滌步驟來消除背景，因此損害通量，并且該酶僅容許單重測定的開發。而且，用于將表面受體如GPCR表達至造血細胞諸如RBL-2H3中的啟動子和條件需要仔細優化，以獲得一致的結果。例如，腺苷3受體被認為是這樣的GPCR，其本身不脫粒但是加強由未達最佳標準量的IgE-變應原誘導的脫粒。因此，目前的技術狀態未教導我們如何開發適合用于HTS中的基于脫粒的可靠且靈敏的傳感器。直至本發明，不存在關于使用高度特異性絲氨酸蛋白酶如粒酶Α、B，人胃促胰酶，蛋白酶3或嗜中性粒細胞彈性蛋白酶作為存儲在分泌溶酶體中的報道分子從而開發有效用于藥物發現或檢測用于診斷的分子的造血基于細胞的傳感器的報道。目前的技術狀態使用內源性β -氨基己糖苷酶作為報道分子，其通過測量來自至少50.000個細胞，即相對大量細胞的該酶活性進行(見Schwartz等.J.1mmunol.(免疫學雜志)123:1445-1450，1979 ；和 Dragonetti 等.J.Cell Sc1.(細胞科學雜志)113:3289_3298，2000)，或者與 GFP 融合從而追蹤分泌溶酶體運動的溶酶體酶受到實時監測。本發明描述了基于蛋白酶報道分子脫粒的高度靈敏的基于造血細胞的傳感器，其有效用于測試至少兩個分子之間的相互作用，具有高信號背景比從而進行可靠測量，快速的動力學，具有適用于高通量篩選的最少步驟，并使用報道分子酶的靈敏底物以檢測來自少量細胞的分泌酶從而減小成本。該基于細胞的傳感器可以用于單重或多重測定中。多重測定具有數種超越單重測定的優勢，例如:增加的通量、不損害數據質量條件下的成本降低，或甚至提高的數據質量，這是因為各測定具有作為內部對照的在同一孔中進行的另一個測定。發明目的定義轉導器定義為將信號由一種形式變換為另一種形式的任何裝置。例如，基于本發明生物傳感器的細胞將細胞表面處的配體與受體相互作用變換為預先存儲在細胞內部的報道分子多肽的分泌，因此該報道分子的酶活性測量與配體-受體相互作用相關。傳感器是一種類型的轉導器。轉換生物信號的傳感器稱作生物傳感器。所有活生物體包含生物傳感器，其具有與機械傳感器類似的功能。大多數生物傳感器是對以下敏感的特化細胞:光、運動、溫度、磁場、重力、濕度、振動、壓力、電場、聲音，和外部環境的其他物理方面；內部環境的物理方面，諸如伸展、生物體運動和附肢位置(本體感受)；環境分子，包括毒素、營養物和信息素的巨大陣列；許多內部代謝環境方面，諸如葡萄糖水平、氧水平或摩爾滲透壓濃度；和變化范圍的內部信號分子，諸如激素、神經遞質和細胞因子。通過使用生物靈敏性元件模擬生物傳感器的人工傳感器稱作生物傳感器。
受控胞吐作用，是這樣的過程，其中特化細胞分泌神經遞質、激素、酶、肽或低分子量物質(例如兒茶酚胺、谷氨酸鹽等)。在胞吐作用過程中，細胞活化產生一系列胞內事件，其導致包含貨物的小泡遞送至細胞表面膜(質膜)，其以這些小泡的子集與質膜特化區的融合而終結。雖然胞內Ca2+濃度上升經常觸發胞吐作用，但是其他胞內信號包括cAMP、二酰甘油(DAG)、磷脂和ATP也控制或調節Ca2+_觸發的胞吐作用。分泌顆粒或分泌小泡或分泌溶酶體是特化的胞內細胞器，其擔當選擇的分泌產物的存儲庫。分泌顆粒通過刺激劑或調節劑作用向細胞外周運動，它們的膜與細胞膜融合，并且它們的內容物負荷被釋放。盡管在大多數細胞類型中，分泌顆粒似乎代表完全新的細胞器，不同造血細胞和某些其他細胞類型中的顆粒與溶酶體共享數種性質。造血細胞，是源自骨髓干細胞并包含全部血細胞類型的細胞，其包括髓樣(單核細胞和巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、紅細胞、巨核細胞/血小板和一些樹突細胞)和淋巴樣譜系(T-細胞、B-細胞、NK-細胞、一些樹突細胞)。具有受控胞吐作用的細胞系:用于本文中時，術語“具有受控胞吐作用的細胞”、“專職分泌細胞系”和“具有專職受控胞吐作用的細胞系”可以互換使用。對于本發明方法重要的細胞系是具有專職受控胞吐作用的造血細胞系。所有這些術語還包括它們的后裔，即任意和所有后代。已知所有后裔可能不相同，其歸因于蓄意或無意的突變。有效用于基于細胞的傳感器的具有受控胞吐作用的細胞系是通常改造為表達顆粒存儲的報道分子的宿主細胞，所述報道分子通過胞吐作用調節劑如細胞表面受體，諸如GPCR的作用，在激動劑配體結合后釋放至培養基中。報道分子多肽或報道分子:是基因，研究者將該基因與細胞培養、動物或植物中的另一目的基因連接。某些基因被選作報道分子，因為它們賦予表達它們的生物體的特征是容易鑒定和測量的，或因為它們是可選擇性標記物。報道基因通常用于確定目的基因是否被細胞群或生物體群吸收或表達。本文中的報道基因是存儲在專職分泌細胞系如某些造血細胞的分泌顆粒內部的多肽，并且通過胞吐作用刺激劑或調節劑作用釋放至胞外培養基中。蛋白酶:蛋白由作為基本成分的氨基酸組成，其中酰胺鍵在一個氨基酸的COOH和下一個氨基酸的NH2之間形成，從而形成肽鍵。術語蛋白酶與肽酶同義，其意指肽鍵水解酶，并包括內肽酶和外肽酶。因此，催化在中性PH和環境溫度下肽鍵水解的能力表征蛋白酶，其中不同催化機制位于多種在除此之外的其他情況下為不相關的蛋白支架中。目前存在6類蛋白酶:絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶(例如，瘧原蟲天冬氨酸蛋白酶(plasmepsin))/金屬蛋白酶和谷氨酸蛋白酶。用于切割肽鍵的機制包括制備具有半胱氨酸和蘇氨酸(肽酶)或水分子(天冬氨酸、金屬和谷氨酸肽酶)親核性的氨基酸殘基，以使其攻擊肽羰基。一種制備親核物質的方法是通過催化三聯體，其中使用組氨酸殘基激活絲氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸作為親核物質。所有蛋白酶中的底物結合位點由相當大量氨基酸殘基組成，所述氨基酸殘基確保水解前底物的正確排列并有助于通過穩定過渡態促進催化。結合位點被分為許多亞位點，其各自多重相互作用固定底物的單個氨基酸殘基。除與特異性側鏈的相互作用以外，肽主鏈的結合也在催化作用中扮演重要角色。蛋白酶特異性經常在側鄰催化殘基的亞位點背景中研究，并提供對肽或蛋白底物具有特別偏愛的酶。為了分析蛋白酶特異性，使用Berger和Schechter的命名法(見SchechterI,Berger A.Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化學和生物物理研究通信)(1968) 32:898-902)。根據該命名法，蛋白酶反應位點中存在的氨基酸表示為S4，S3，S2，SI，SI,，S2,，S3'，且它們對應于具有序列P4，P3，P2，Pl，Pl'，P2'，P3'的底物中存在的氨基酸，其中切割Pl-PP肽鍵。例如，木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶家族具有明確的S3至SI'位點，其中一些個體蛋白酶具有更廣泛的特異性。例如，粒酶B肽IIe-Glu-PiO-Asp-氨基甲基香豆素具有IIE作為P4，Glu作為P3，Pro作為P2且Asp作為Pl。關于數種蛋白酶，切割肽鍵后的氨基酸殘基，即Pn'殘基，也對特異性有貢獻。例如，小鼠粒酶B在P2'位置處需要甘氨酸，從而有效切割底物。而且，人粒酶B的良好擴展底物是Ile-Glu-PiO-Asp-Ser-Gly-Met-Glu(P4-P3-P2-P1-P1; - 2' -P3/ -P4')。作為酶，蛋白酶可以通過它們的底物親和性、反應催化速率以及它們的底物特異性或催化效率來動力學表征。Michaelis和Menten方程式描述關于簡單的單位點反應的反應速率和特異性。Michaelis和Menten將底物S轉化為產物P的過程分成兩個步驟，如下
所示:·Km teatE + S <=> ES <=> E + P第一反應步驟描述底物與酶(催化劑)的結合，且常數Km對應于在這樣的條件下的平衡解離常數，在所述條件下產物形成與底物解離過程相比非常低。Km等于半最大反應速率Vmax/2時的底物濃度。在該情形中，Km是是解離常數的合適近似值，且因此描述底物對酶的特異性。對于更復雜的反應，該常數反映與酶結合的所有底物的解離平衡。第二反應步驟描述催化速率或產物形成速率，并表示為轉換數kMt。轉換數定義為產物P的最大數量/活性位點/單位時間。Michaelis-Menten動力學僅在飽和條件下，即當底物S濃度比酶濃度高得多時有效。蛋白酶的另一種重要特性是它們的底物特異性。比率kMt/KmS義成對酶-底物的催化效率的度量。它表示游離酶和游離底物的性質和反應。酶的特異性因此是酶對競爭性底物或競爭性酶對單一底物的特異性的度量。蛋白酶被分類為內肽酶，條件是它們的切割序列在靶底物內部，或外肽酶，條件是它們需要氨基末端或羧基末端基團來進行切割。外肽酶因此被分類為氨基肽酶和羧基肽酶。數種造血細胞的顆粒天然存儲蛋白酶如粒酶、肥大細胞蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶3、金屬蛋白酶如MMP-8和MMP-9、絲氨酸蛋白酶組織蛋白酶如組織蛋白酶(cathepsin)A和G和半胱氨酸組織蛋白酶。粒酶和肥大細胞蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶超家族，這是由于它們與詳盡記載的絲氨酸蛋白酶的高度氨基酸序列同一性；它們切割合成絲氨酸蛋白酶底物的能力和它們受到典型絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑制，(見例如Smith MJ等J.Leukoc.Biol.(白細胞生物學雜志)1996，60 =555-562)。粒酶和肥大細胞蛋白酶的酶活性已經被分類為類胰蛋白酶-樣(tryptase-like，在精·氨酸或賴氨酸后切割)，天冬裂酶-樣(Asp-ase-like,在天冬氨酸后切割)，胃促胰酶-樣(chymase_like,苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸后切割)和彈性蛋白酶-樣(elastase-like，在纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸后切割)。組織蛋白酶是一類球狀蛋白酶，最初描述為胞內肽水解酶，盡管一些組織蛋白酶也具有胞外功能。組織蛋白酶B，C，F，H，L，K，O, S，V，W，和X是木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶，且代表最大且最著名的組織蛋白酶類型。它們主要起胞內蛋白酶的作用，在溶酶體的酸性環境中介導末端非特異性大規模蛋白質水解(見例如Turk V，Turk B和TurkD.EMBO J(EMB0雜志)2001 ；20:4629-33)。組織蛋白酶A和G均是絲氨酸蛋白酶，但是組織蛋白酶G是內肽酶而組織蛋白酶A是羧肽酶。組織蛋白酶D和E是天冬氨酸蛋白酶。組織蛋白酶作為無活性酶原來合成并加工成為成熟的活性酶。粒酶:粒酶是結構相關的絲氨酸蛋白酶，其區別在于它們的底物特異性。它們天然表達在細胞毒性淋巴細胞諸如CD8陽性T淋巴細胞和天然殺傷細胞以及睪丸中。迄今為止，記述了人中的5種不同粒酶:粒酶A, B, H, K和M(見例如Grossman, WJ.等.Curr.0pinImmunol.(當前免疫學觀點)(2003) 15，544-552)。在小鼠中，可以發現這些粒酶中的四種(A，B, K和M)的確定的直向同源物，且粒酶C似乎是最有可能的粒酶H的鼠直向同源物。鼠基因組編碼數種另外的粒酶(D，E，F，G，L和N)，其中D，E，F和G由細胞毒性淋巴細胞表達山似乎是假基因且N在睪丸中表達。受控胞吐作用調節劑，指能夠改變下游參與受控胞吐作用過程的一種或多種信號轉導途徑的化合物、分子或組合物。該活性改變包括抑制(即，所述化合物、分子或組合物是胞吐作用“抑制劑”)以及刺激、誘導或增強(即，所述化合物、分子或組合物是胞吐作用“刺激劑”、“誘導劑”或“增強劑”)。這些調節劑利用體外和/或體內測定來鑒定。在這些測定中，使用對照，從而允許樣品之間的比較。藥物發現，一種過程，通過該過程發現和/或設計藥物。用于本文中時，藥物發現包括藥物鑒定和針對親和性、副作用、生物利用率的改進，還包括在投放市場前測試藥物在新的治療適應證中的作用，即也稱為重新分析(reprofiling)的過程。基因，是遺傳性的基本物理和功能單元。在生物化學術語中，基因是位于編碼特定功能性產物(即，蛋白或RNA分子)的特定染色體上特定位置中的核苷酸有序序列。用于本文中時，基因不僅由編碼序列組成，而且可以包括參與控制編碼序列轉錄的相鄰DNA區(例如，啟動子、增強子)和內含子。位于編碼區5’處并存在于mRNA上的序列稱為5’非翻譯序列。位于編碼區3’處或下游并存在于mRNA上的序列稱為3’非翻譯序列。術語“基因”包括基因的cDNA和基因組形式。基因的基因組形式或克隆包含編碼區，所述編碼區中插入有非編碼序列，稱為“內含子”或“間插區”或“間插序列”。內含子是轉錄為核內異質RNA(hnRNA)的基因區段；內含子可以包含調節元件諸如增強子。內含子從細胞核或初級轉錄物中去除或“切除”;因此內含子不存在于信使RNA(mRNA)轉錄物中。mRNA在翻譯過程中起作用，以指定新生多肽中的氨基酸序列或順序。“穩定引入的”或“穩定轉化的”或“穩定轉導的”或“穩定轉染的”或“穩定電穿孔的”，指結合到其基因組中的具有所需外源DNA的部分細胞。根據使用的表達載體和轉染技術，僅部分細胞可以將外源DNA整合到其基因組中。為了鑒定和選擇這些整合體，編碼可選擇標記物(例如，針對抗生素的抗性)的基因通常與目的基因一起引入至宿主細胞中。優選的可選擇標記物包括賦予藥物抗性的那些，諸如G418、潮霉素和嘌呤霉素。編碼可選擇標記物的核酸可以在與表達可檢測的翻譯產物的同一載體上引入至宿主細胞，或可以在單獨的載體上引入。使用引入的核酸穩定轉染的細胞可以通過藥物選擇鑒定(例如，已經結合了可選擇標記物基因的細胞將存活，而其他細胞死亡)。表面受體，指這樣的分子，其存在于細胞表面上，與胞外環境相互作用和以最終調節特定啟動子轉錄的方式胞內傳送或轉導關于該環境的信息，由此導致特定基因的轉錄。表面受體的實例是酪氨酸激酶受體、離子通道受體、細胞因子受體、趨化因子受體或G-蛋白偶聯受體(GPCRs)、諸如化學引誘物肽受體、神經肽受體、光受體、神經遞質受體、或多肽激素受體。G蛋白-偶聯受體(GPCRs)，也稱為七跨膜受體，7TM受體、七螺旋受體和G蛋白連接受體(GPLR)，是跨膜受體的大蛋白家族，其特征在于具有胞外N末端和胞質C末端的7個跨膜結構域。與GPCR結合的配體促進構象改變，從而導致小G-蛋白偶聯，信號轉導途徑的開始，和最終導致細胞響應。結合和激活這些受體的配體包括光敏化合物、氣味、信息素、激素和神經遞質，且尺寸在由小分子到肽到大蛋白的范圍內變化。G蛋白-偶聯受體僅存在于高等真核細胞，包括酵母、植物，和尤其，動物中。G蛋白-偶聯受體參與許多疾病，而且還是約一半的所有現代醫藥的靶標。GPCR通過類似的分子機制起作用。由胞外刺激物活化GPCR引起受體構象改變，這導致GTP-結合蛋白(G蛋白)的中間偶聯和活化。G蛋白在自然界中是異源三聚體，且由由不同基因編碼的α、β和Y亞基組成。α亞基負責⑶P和GTP的結合。配體與GPCR的結合導致α亞基由⑶P-結合形式轉變為GTP-結合形式并通過a-GTP與β Y 二聚體的解離引起異源三聚體的活化。a-GTP和β Y 二聚體均控制許多效應子的活性，所述效應子通過產生第二信使分子(例如，鈣、cAMP等)將信號傳送至細胞內部。存在至少17種Ga基因，且G蛋白可以分組為四個主要類型,稱為Ga丨人、G a q/11、G a s和Ga 12/13(見例如Preininger AM 和 Hamm HE.Sc1.STKE 2004 年，re3 和 Cabrera-Vera TM 等.Endocr Rev.(內分泌學綜述)2003年12月；24(6):765-81)。用于本文中時，GPCR包括與任意G a i/Q、G a q/11、G a s和G α 12/13偶聯的受體。具有固有的酶促酪氨酸激酶活性(RTKs)的受體，是關于許多多肽生長因子，細胞因子和激素的高親和性細胞表面受體。在人基因組中鑒定的90個獨特酪氨酸激酶基因中，58個編碼受體酪氨酸激酶蛋白。大多數RTKs是單一亞基受體，但是一些例如胰島素受體以多聚體復合物的形式存在。各單體具有單一跨膜結構域、胞外N-末端區和胞內C-末端區。胞外N-末端區由非常大的蛋白結構域組成，所述蛋白結構域與胞外配體(例如，特定生長因子)結合。胞內C-末端區包含控制結構域和負責這些受體激酶活性的結構域，其特異性磷酸化酪氨酸氨基酸。嵌合受體，基于這樣的人工受體，所述人工受體組合一個受體的部分與另一受體的部分，蛋白片段，標簽及其任意組合，包括這兩個完整結構域或其部分。通常，嵌合蛋白或"融合蛋白"是這樣的多肽，所述多肽包含所需蛋白產物的至少一部分，所述蛋白產物與至少另一肽序列或另一多肽融合。ITAM攜帶受體:基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)是免疫系統的某些細胞表面蛋白的胞質尾區中的四個氨基酸的保守序列，所述四個氨基酸重復兩次。所述基序包含與亮氨酸或異亮氨酸通過任意兩個其他氨基酸分隔開的酪氨酸，指定特征為YxxL。這些特征中的兩個典型地通過該分子尾區中的7-12個氨基酸分隔開(YxxLx(7_12)YxxL)。ITAM對于某些造血細胞如免疫細胞中的信號轉導很重要。因此，它們存在于重要的細胞信號傳導分子諸如T細胞受體復合物的⑶3和ζ -鏈、B細胞受體復合物的⑶79- α和-β鏈和某些Fe受體的尾區中。這些基序中的酪氨酸殘基在受體分子與其配體相互作用后被磷酸化，并形成與參與由胞內存儲釋放鈣的其他蛋白的相互作用的位點。可以開發某些嵌合受體，其包括一個受體的胞外配體結合結構域和ITAM攜帶受體的至少跨膜和胞內區。這樣的嵌合受體在交聯時，誘導由胞內存儲釋放鈣。拮抗劑或受體抑制劑，指下調蛋白的至少一種生物活性的試劑。最廣義使用的拮抗劑包括部分或完全阻斷、抑制、或中和特定標簽的生物學活性的任意分子。拮抗劑還可以是下調基因表達或減少表達蛋白存在量的化合物。它們可以競爭地、非競爭地、和/或變構地抑制蛋白的一種生物活性。激動劑或受體活化劑，指模擬、誘導或上調(例如加強或補充或提高)蛋白生物活性的試劑。激動劑可以是野生型蛋白或其具有該野生型蛋白的至少一種生物活性的衍生物。激動劑還可以是上調基因表達或增加蛋白的至少一種生物活性的化合物。激動劑還可以是增加多肽與另一分子，例如靶肽或靶核酸相互作用的化合物。胞外信號，包括通過與該信號直接或間接相互作用的細胞表面蛋白胞內轉導的分子和環境變化。胞外信號或效應分子包括以某些方式特異性改變細胞表面蛋白活性的任意化合物或物質。所述信號的實例，但不僅限于，結合細胞表面和/或胞內受體和離子通道并調節所述受體和通道活性的分子諸如乙酰膽堿，生長因子和激素。該術語還包括調節細胞受體活性并由此影響胞內功能的尚未確定物質。所述胞外信號是潛在的藥理學試劑，其可以用于通過調節特定細胞表面受體的活性來治療具體疾病。孤獨受體，是對未描述其特異性天然配體的受體的命名。信號轉導，是化學信號由細胞環境通過細胞膜的過程，且可以通過數種機制中的一種或多種，諸如磷酸化、離子通道的活化、通過鳥嘌呤核苷酸結合蛋白中間產物的效應酶活化、磷酸肌醇形成、腺嘌呤環化酶的活化、和/或轉錄因子的直接活化(或抑制)等發生。載體或質粒載體或質粒:術語"載體"用于指載體核酸分子，向其中可以插入核酸序列，從而引入細胞，在所述細胞中復制。核酸序列可以是“外源性的”，這意味著它對于向其中引入載體的細胞是外來的且該序列與細胞中的序列同源但處于其中通常不存在該序列的宿主細胞核酸內的適當位置處。載體包括質粒、粘粒、病毒(噬菌體、動物病毒和植物病毒)和人工染色體(例如，YACs)。本領域技術人員良好具備通過標準重組技術構建載體的能力(見例如，Maniatis,等,Molecular Cloning, A LaboratoryManual (分子克隆，實驗手冊)(Cold Spring Harbor (冷泉港)，1990)和 Ausubel,等，1994, Current ProtocolsIn Molecular Biology (當前分子生物學流程)(John Wiley&Sons, 1996), 二者均通過引用結合在本文中)。表達載體:術語"表達載體"指任何類型的遺傳構建體，其包括編碼能夠被轉錄的RNA的核酸。在一些情形中，RNA分子然后翻譯為蛋白、多肽或肽。在其他情形中，這些序列不翻譯，例如，在生成反義分子或核酶中。表達載體可以包含多種“控制序列”，其指特定宿主細胞中的可操作連接的編碼序列的轉錄和可能地，翻譯所需的核酸序列。除控制轉錄和翻譯的控制序列外，載體和表達載體還可以包含起其他作用的核苷酸序列并記述如下。啟動子:"啟動子"是控制序列，即核酸序列的一個區域，在該區域處控制轉錄起始和速度。它可以包含遺傳元件，調節蛋白和分子可以在所述遺傳元件處結合，諸如RNA聚合酶和其他轉錄因子，從而起始特異性轉錄核酸序列。短語“可操作定位”、“可操作連接”、“受控于”和“受轉錄控制”意指啟動子相對于核酸序列處于正確的功能性位置和/或方向，從而控制該序列的轉錄起始和/或表達。啟動子通常包括具有定位RNA合成起始位點作用的序列。其最著名的實例是TATA盒，但是在一些缺乏TATA盒的啟動子，諸如，例如用于哺乳動物末端脫氧核苷酸轉移酶基因的啟動子和用于SV40晚期基因的啟動子中，覆蓋起始位點本身的離散元件有助于固定起始位置。另外的啟動子元件控制轉錄起始的頻率。典型地，這些位于起始位點上游30IlObp區內，盡管許多啟動子已顯示出也包含起始位點下游的功能性元件。為了使編碼序列“受控于啟動子”，人們定位了所選啟動子“下游”(即3’)的轉錄閱讀框的轉錄起始位點的5’末端。“上游”啟動子刺激DNA的轉錄并促進編碼RNA的表達。啟動子元件之間的間隔經常是柔性的，因此當元件反轉或相對于彼此運動時，啟動子功能保持。在tk啟動子中，在活性開始下降前，啟動子元件之間的間隔可以增加至相隔50bp。根據啟動子，似乎各元件可以合作地或獨立地起激活轉錄的作用。啟動子可以與或可以不與“增強子”聯合使用，所述“增強子”指參與核酸序列轉錄活化的順式作用調節序列。啟動子可以與核酸分子天然相關聯，同樣可以通過分離位于編碼區段和/或外顯子上游的5'非編碼序列來獲得。這樣的啟動子可以稱為“內源性的”。類似地，增強子可以與核酸分子天然相關聯，位于該序列的下游或上游。備選地，通過在重組或異源啟動子控制下定位編碼核酸區段可以獲得某些優勢，所述異源啟動子指在其天然環境中通常不與核酸分子相關聯的啟動子。重組或異源啟動子也指在其天然環境中通常不與核酸分子相關聯的增強子。這樣的啟動子或增強子可以包括其他基因的啟動子或增強子、由任何其他表達、或原核細胞或真核細胞分離的啟動子或增強子、不“天然存在的”，即包含不同轉錄調節區的不同元件的啟動子或增強子、和/或改變表達的突變體。啟動子可以是異源或內源的。聚腺苷酸信號或終止信號:本發明的`載體或構建體通常包括至少一個終止信號。“終止信號”或“終止子”包括參與特異性終止由RNA聚合酶引起的RNA轉錄的DNA序列。因此，在某些實施方案中，預期結束RNA轉錄物生成的終止信號。終止子可以是在體內對獲得所需 目息水平所必需的。在真核細胞系統中，終止子區還可以包括允許新轉錄物位點特異性切割從而暴露聚腺苷酸化位點的特異性DNA序列。這向特化內源性聚合酶發出信號，使約200個腺苷殘基(聚腺苷酸)一段序列添加至轉錄物的3’末端。使用該聚腺苷酸尾部修飾的RNA分子似乎更穩定并更有效地翻譯。因此，在涉及真核細胞的其他實施方案中，優選地，終止子包括用于切割RNA的信號，且更優選地，終止子信號促進信息的聚腺苷酸化。終止子和/或聚腺苷酸化位點元件可以起提高信息水平和最小化由盒通讀為其他序列的作用。信號肽或信號序列:信號肽是短(3-60個氨基酸長的)肽鏈，其指導蛋白的翻譯后運輸。信號肽也可以稱為靶向信號、信號序列、轉運肽或定位信號。信號肽的氨基酸序列指導蛋白(其在細胞溶膠中合成)達到某些細胞器諸如細胞核，線粒體基質，內質網，葉綠體，非原質體和過氧物酶體。一些信號肽在運輸蛋白后，通過信號肽酶與蛋白切割開。酶原(zymogen)或酶原(proenzyme):酶原(zymogen)(或酶原(proenzyme))是無活性的酶前體。酶原需要生物化學變化(諸如暴露活性位點的水解反應，或改變構象以暴露活性位點)，以使其成為有活性的酶。所述生物活性變化通常發生在溶酶體中，其中前體酶的特定部分切割，從而使其活化。在活化時釋放的氨基酸鏈被稱為活化肽。
酶原性(zymogenicity):酶原性或酶原性指數(zymogenicity index)是針對任意給定底物，被處理的酶(例如通過蛋白酶)的活性與該酶原的活性的比率。它是如何有效限制酶原的測量值，其對應于酶原的無意義活性是一個很大的數字。例如，胱天蛋白酶-3具有酶原性指數約10.000而胱天蛋白酶-8具有100，胱天蛋白酶-9具有10且組織纖溶酶原激活物具有2-10(見例如Stennicke HR和Salvesen GS.Cell DeathandDifferentiation (死亡和分化)(1999) 6，1054-1059)。環狀排列變換(circularly permuted)蛋白:如果蛋白的N和C末端已經例如通過分子生物學技術人工移動至蛋白結構的另一位置，則該蛋白已經被環狀排列變換。如果蛋白序列由N末端向C末端閱讀并由ABCDEFGH表示，則環狀排列變換分子可以是Defghabc0因此，環狀排列變換代表大分子異構化形式，其中正常末端共價連接并通過在別處破壞蛋白主鏈引入新末端。有效用于本發明方法的環狀排列變換酶僅是這樣的酶，其中環狀排列變換形成具有高酶原性指數、缺乏酶活性的酶原(proenzyme)或酶原(zymogen),其可以通過蛋白酶切割轉變為有活性的酶。肽標簽:肽標簽是可以用于當蛋白的特異性抗體不可用時與抗體一起檢測蛋白或用于蛋白純化的短肽。可以用于細胞表面檢測和分離的已知肽標簽實例是c-myc標簽、HA標簽和FLAG sup.TM標簽。通常，存在特異性結合蛋白的任意肽標簽可以用于表面檢測和或分離，條件是這樣的特異性結合蛋白直接或間接標記有熒光團或例如用于表面分離的珠。放大級聯:偶聯酶放大級聯代表提高待定量初始信號量級的方法。這些級聯基于多酶系統的固有乘法性質，即反應之一的產物必然是隨后酶促反應的催化劑或輔因子。蛋白酶放大級聯的最佳實例是血液凝固級聯，其中第一蛋白酶激活酶原從而產生活性蛋白酶并且該第二蛋白酶也激活酶原從而產生第二活性蛋白酶，由此形成級聯，其中初始信號放大多至1000倍。酶基礎活性或酶原基礎活性:酶原基礎活性定義為在其中未添加酶原活化劑蛋白酶的確定培養基，例如細胞培養物上清或與無刺激條件下細胞培養相容的培養基中的酶活性與缺乏酶原的相同培養基中的酶活性的比。基礎分泌:基礎分泌指在缺乏細胞胞吐作用調節劑條件下由細胞分泌的蛋白相對量。在幾乎全部分泌細胞類型中，可以檢測基礎分泌水平。不知道基礎分泌是由存儲在顆粒中的蛋白釋放引起還是由與分泌顆粒分開分選的一部分新合成蛋白引起(見例如Burgoyne RD 和 Morgan A.PhysiolRev (生理學綜述)(2003)83:581-632)。例如，在大鼠腮腺泡細胞中，一些分泌蛋白在其生物起源過程中與分泌顆粒分開分選，以到達引起基礎釋放的組成型分泌小泡(見例如，Arvan P和Castle D.Biochem J (生物化學雜志)(1998),332 =593-610)。腮腺泡細胞通過真組成型分泌釋放一些淀粉酶，同時它們也將淀粉酶和其他分泌蛋白(諸如腮腺分泌蛋白，PSP)包裝到常規分泌顆粒中，所述分泌顆粒響應胞吐作用調節劑進行胞吐。組成型或基礎分泌相對胞吐作用受控現象之間關系的另一個實例通過哺乳動物上皮細胞證明(見 Burgoyne RD 和 Duncan JS.J Mamm Gland BiolNeoplasia (哺乳動物腺體生物學和瘤形成雜志)，(1998)3:275-286)。這些細胞主要通過明顯的組成型途徑分泌大量乳成分，包括乳蛋白、酪蛋白，但是大約1/3的合成酪蛋白保持在存儲的胞內庫中，并可以在完整細胞中響應Ca2+升高而釋放。重組DNA (rDNA)分子，指通過使核酸序列，諸如基因與DNA分子序列操作性連接生成的DNA分子。因此，重組DNA分子是雜合DNA分子，其包括至少兩個自然界中通常不共同存在的核苷酸序列。通常，引入至少包括自然界中通常不共同存在的啟動子和多肽的DNA編碼序列的重組DNA在引入至真核細胞中時被稱為“異源的”。通過這樣的異源或重組DNA產生的蛋白也稱為“異源的”。在表達異源核酸序列的背景中，“宿主細胞”指能夠復制載體和/或表達載體編碼的異源基因的原核或真核細胞。當宿主細胞使用核酸分子“轉染”或“轉化”時，它們稱為“改造”或“重組”細胞或宿主細胞，例如，已經向其中引入了外源核酸序列，諸如，例如，載體的細胞。因此，重組細胞可以與不包含重組引入的核酸的天然存在細胞相區分。宿主細胞的實例包括，但不僅限于，包含F或F sup./因子的大腸桿菌(E.coli)菌株(例如，DH5 a F或DH5 a F sup.')或缺乏F或F sup.'因子的大腸桿菌菌株(例如DH10B)。宿主如果容許復制載體或表達克隆到載體中的多肽，則被稱為是相容的。引物，用于本文中時，指寡核苷酸，不管天然存在于純化的限制酶切消化中的還是通過合成產生的，其能夠在被置于其中誘導與核酸鏈互補的引物延伸產物合成的條件下(即，在核苷酸和誘導劑諸如DNA聚合酶存在以及處于合適的溫度和pH的條件下)時擔當核酸合成起始點。PCR,指酶促擴增DNA區的聚合酶鏈反應方法。該指數擴增程序基于反復的變性循環、寡核苷酸引物退火和由DNA聚合劑諸如熱穩定性DNA聚合酶(例如分別由水生棲熱菌(Thermus aquaticus)或黃棲熱菌(Thermus f Iavus)分離的 Taq 或 Tfl DNA 聚合酶)引起的引物延伸。多聚接頭或多克隆位點(MCS)或多克隆，指核酸構建體上的一簇限制酶位點，其用于核酸序列的插入和/或切除。限制性內切核酸酶或限制酶或內切核酸酶，指這樣的酶(例如細菌的)，其各自在特定核苷酸序列處或附近切割雙鏈DNA。實例包括，但不僅限于，Avail、BamHI, EcoRI,Hindlll、HincI1、Ncol、SmaI 和 Rsal。選擇性生長培養基，指用于生長細胞的生長培養基，其已經增補了一種或多種選擇性試劑例如，抗生素。可選擇標記物或可選擇標記序列或可選擇標記基因，指這樣的基因或其他DNA片段，其編碼或提供賦予在在除此之外的其他情況下為有害環境中生長或存活能力的活性。例如，可選擇標記物可以將針對抗生素或藥物的抗性賦予其中表達該可選擇標記物的細胞。復制源(Ori)也可以用作允許質粒載體繁殖的可選擇標記物。可選擇標記區，對于載體序列而言，指載體元件的一部分，其包含特定載體元件上存在的全部可選擇標記序列。換言之，存在的可選擇標記序列的末端定義可選擇標記區。例如，如果特定載體元件僅具有一個可選擇標記序列，則可選擇標記區應該由可選擇標記序列的起點和可選擇標記序列終點來定義。如果特定載體元件具有，例如，2個可選擇標記序列，則可選擇標記區是第一個可選擇標記序列的起點和第二個可選擇標記序列的終點之間的核酸序列。克隆(To clone)或克隆(cloning),在關于插入序列和載體使用時,意指插入序列連接到能夠在宿主中復制的載體中。術語“克隆(to clone)”，在關于插入序列、載體和宿主細胞使用時，通常指生成給定插入序列的拷貝。在這點上，為了克隆一段DNA(例如，插入序列)，人們應該將其插入至載體(例如，質粒)中，所述載體(例如，質粒)隨后可以被置于宿主(通常細菌)中，由此質粒和插入物與宿主一起復制。各細菌在營養培養基上生長直至可見單菌落，挑取該菌落并使其在液體培養基中生長，并且將包含“克隆的"DNA的質粒由細菌中重新分離，這時將存在數百萬DNA拷貝。術語“克隆”還可以指攜帶克隆的DNA的細菌，或克隆的DNA本身。轉化或轉染，用于本文中時，指外源DNA引入至細胞(例如原核或真核細胞)中。轉化可以通過多種本領域已知的方式，包括磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導的轉染、聚凝胺-介導的轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂轉染、原生質體融合、逆轉錄病毒感染和生物射彈來實現。特別地，轉染進入真核細胞可以是瞬時的，此時細胞培養基中不包括合適的抗生素用于選擇攜帶穩定整合DNA進入染色體的細胞。用于穩定選擇的質粒載體必須具有可選擇標記物，所述可選擇標記物表達到待使用抗生素選擇的細胞中。盡管瞬時轉染可以用于本發明的方法，但是優選的細胞是通過抗生素選擇而變得穩定的那些。


圖1.本發明一般概念圖，其使用絲氨酸蛋白酶作為顆粒存儲的報道分子，IgE受體作為調節顆粒胞吐作用的細胞表面受體和由分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子切割的基于FRET的底物進行檢測。使用結合高親和性受體結合的IgE的多聚體抗原(例如，變應原)處理細胞誘導顆粒存儲的蛋白酶的釋放，且該蛋白酶切割底物產生熒光終產物。利用分泌報道酶的這種特異性底物，可以確定配體-與-受體-相互作用。圖2.本發明一般概念圖，其使用絲氨酸蛋白酶作為顆粒存儲的報道分子，GPCR作為調節顆粒胞吐作用的細胞表面受體和由分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子切割的基于FRET的底物進行檢測。使用GPCR的激動劑處理細胞誘導顆粒存儲的蛋白酶的釋放，且該蛋白酶切割底物產生熒光終產物，且該蛋白酶切割酶原產生活性酶。利用分泌報道酶的這種特異性底物，可以確定配體-與-受體-相互作用。圖3.本發明代表性質粒載體的一般結構。用于在嵌合hCMV-MoMLVS' -LTR強組成型啟動子(A)或四環素誘導型啟動子(B)控制下穩定表達粒酶B的具有潮霉素抗性的質粒載體圖譜。用于表達功能性表面受體，諸如GPCR的具有新霉素抗性的質粒載體圖譜，其使用小鼠免疫球蛋白K鏈的信號肽，用于通過抗-cmyc單克隆抗體表面檢測的c-myc標簽和用于在MoMLV5' LTR啟動子控制下(C)或在四環素誘導型啟動子控制下(D)過表達的病毒GPCR糖基化序列。圖4.測定實例，其中RBL-2H3細胞系在MoMLV5 ' LTR啟動子的控制下使用分泌顆粒中存儲的人粒酶B和N-末端c-myc標記的人II型毒蕈堿性受體(CHRM2) 二者穩定轉染，并包括信號肽和病毒糖基化序列，以用于有效的表面表達。(I)使用氨甲酰膽堿(CHRM2的激動劑)處理誘導胞內鈣濃度增加(2)，其誘導分泌粒酶B的顆粒釋放(3)，使用5' FAM-SGIEPDSGV-TAMRA,基于FRET的粒酶B底物(4)，利用485nm處的激發和535nm處的發射來檢測。535nm處的熒光增加與釋放的粒酶B量成比例。分泌報道分子可以直接檢測，或通過酶原如人胱天蛋白酶原_3進行信號放大，以便甚至更靈敏地檢測分泌的報道分子。圖5.使用本發明中所述方法進行的雙重測定圖。兩個不同的細胞系(A)和(B)在同一反應器中混合。細胞系A表達GPCRl (胞吐作用調節劑)-顆粒存儲的蛋白酶報道分子I的組合。GPCRl具有配體I作為激動劑而蛋白酶報道分子I切割在波長I處讀數的底物I (例如基于FRET的底物)。細胞系B表達GPCR2 (胞吐作用調節劑)-顆粒存儲的蛋白酶報道分子2的組合。GPCR2具有配體2作為激動劑而蛋白酶報道分子2切割在波長2處讀數的底物2 (例如基于FRET的底物)。使用GPCRl和GPCR2的配體I和配體2的混合物處理細胞A和B的混合物誘導顆粒存儲的蛋白酶I和2的釋放，并且可以確定波長I和2處的熒光增加。發明詳述A.發明簡述本發明涉及新的基于細胞的傳感器，其有效用于藥物發現，診斷和測定分析物，所述基于細胞的傳感器包括具有分泌顆粒的專職受控胞吐作用的細胞系，所述細胞系用作為報道分子多肽的存儲在具有專職受控胞吐作用的細胞系的受控分泌顆粒中的蛋白酶轉染，并具有作為受控分泌顆粒胞吐作用調節劑的內源或異源分子，所述顆粒存儲的蛋白酶報道分子至少具有:針對顆粒內已經存在的條件諸如低PH和其他蛋白酶引起的蛋白水解作用的高度抗性；胞吐作用后的酶活性；高度特異性切割序列；在無刺激或基礎條件下非常低的分泌水平；和在與細胞培養物生存力和顆粒胞吐作用相容的培養基中高信號與背景活性t匕，以獲得高通量的可靠且靈敏的檢測。當基于細胞的傳感器使用胞吐作用調節劑的特異性配體溫育時，報道分子多肽由顆粒釋放至胞外培養基中并且這些釋放的報道分子多肽的酶活性使用特異性底物來檢測。本發明還容許開發多重測定，其通過在同一反應器中混合至少兩種細胞系(各細胞系具有不同的成對的胞吐作用調節劑-顆粒存儲的蛋白酶報道分子)和使用各顆粒存儲的蛋白酶報道分子的高特異性底物來檢測胞吐作用來進行。本發明的基于細胞的傳感器因此包括:具有專職受控胞吐作用的造血細胞系；轉染至所述造血細胞系中的顆粒存儲的蛋白酶報道分子且所述顆粒存儲的報道分子受控于合適啟動子；受控于合適啟動子的胞吐作用調節劑例如表面受體如GPCR和用于檢測分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子的特定底物。這些靈敏的基于細胞的傳感器有效用于測試至少兩個分子之間的相互作用，一個分子擔當胞吐作用調節劑且另一個擔當胞吐作用調節劑的特異性配體。所述傳感器的應用的實例是:為了測試藥物發現中分子間相互作用，為了定量分子諸如蛋白，用于診斷和檢測例如食品工業中、環境樣板中和制藥工業中數種樣品中的藥物或分子。本發明的傳感器是靈敏的且由此使用比目前可用的傳感器更低量的細胞，響應比基于誘導型啟動子的傳感器更快，不需要溶胞作用來釋放報道分子，信號可以以終點模式或以動態模式測量，所有試劑可以混合然后讀數，不需要洗滌或終止步驟由此增加通量，獲得高信號背景比以用于可靠測定，和甚至，可能的信號放大步驟以用于甚至更靈敏檢測。本發明的傳感器還容許開發多重測定，其通過在同一反應器中混合至少兩種細胞系(各自具有不同的成對的胞吐作用調節劑-顆粒存儲的蛋白酶報道分子)和使用各顆粒存儲的蛋白酶報道分子的高度特異性底物檢測胞吐作用來實現。這樣的多重測定減小每次測定的成本并提高信號質量，這是因為各測定具有作為內部對照的在同一孔中進行的另一個測定。B.發明詳述本發明通過描述所述傳感器的各元件，即具有專職受控胞吐作用的細胞，顆粒存儲的蛋白酶報道分子、胞吐作用調節劑、用于表達顆粒存儲的蛋白酶報道分子和胞吐作用調節劑二者的啟動子和條件和檢測系統的相關性質來最好地理解。B.1.有效用于本發明方法的細胞本發明涉及新的基于細胞的傳感器，其有效用于藥物發現，診斷和測定分析物，所述基于細胞的傳感器包括具有分泌顆粒的專職受控胞吐作用的細胞系，所述細胞系用作為報道分子多肽的存儲在具有專職受控胞吐作用的細胞系的受控分泌顆粒中的蛋白酶轉染，并具有作為受控分泌顆粒胞吐作用調節劑的內源或異源分子，所述顆粒存儲的蛋白酶報道分子至少具有:針對顆粒內已經存在的條件諸如低PH和其他蛋白酶引起的蛋白水解作用的高度抗性；胞吐作用后的酶活性；高度特異性切割序列；在無刺激或基礎條件下非常低的分泌水平；和在與細胞培養物生存力和顆粒胞吐作用相容的培養基中高信號與背景活性t匕，以獲得高通量的可靠且靈敏的檢測。分泌顆粒及其受控胞吐作用是現有技術充分已知的，并已經在由于某些實驗優勢或由于其關鍵生理學或病理生理學目的被選作模型系統的一些細胞類型中進行了最廣泛地研究(見例如，Burgoyne, RD 和 Morgan, A.Physiological Reviews (生理學綜述),第 83卷，第2期，2003年4月，第581-632頁)。可能地，大多數研究的細胞類型是腎上腺嗜鉻細胞(及其腫瘤對應物PC12細胞系)，胰腺β -細胞和造血細胞如肥大細胞，血小板和嗜中性粒細胞，但是分泌顆粒胞吐作用也發生在用于分泌肽和其他激素的許多不同的神經內分泌和內分泌細胞類型中和在用于分泌消化酶的外分泌細胞中。而且，已經證明甚至在非專職分泌細胞系諸如成纖維細胞樣(fibroblastoid)細胞系(CH0細胞)中，存在胞吐作用的Ca2+受控途徑，且可能所有細胞類型具有受控胞吐途徑，即常規溶酶體可以由Ca2+觸發進行胞吐作用。但是分泌溶酶體是不同類型的受控分泌細胞器且該胞吐能力清楚地將它們與常規溶酶體區分開。盡管常規溶酶體也可以與質膜融合并在刺激后釋放其可溶性內容物(1)，但是Ca2+_觸發的由細胞諸如成纖維細胞和上皮細胞分泌溶酶體酶的程度僅趨于10-20%(2)。相對照地，至多80 %溶酶體標記物在生理學觸發時，由具有分泌溶酶體的細胞，本文中稱為具有專職受控胞吐作用的細胞釋放。因此，用于本發明方法的優選細胞選自包括具有專職受控胞吐作用的細胞的組。具有專職受控胞吐作用的細胞最多樣化的組之一是包括造血細胞如嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞；T-細胞諸如細胞毒性T淋巴細胞和天然殺傷細胞(NK細胞)的組。全部以上細胞的主要至正常功能是大量存儲的成分如蛋白酶諸如粒酶、肥大細胞蛋白酶、組織蛋白酶和其他水解酶如糖苷酶的受控胞吐作用。因此，具有專職受控胞吐作用的造血細胞是用于本發明方法的高度相關細胞。在本發明的一個實施方案中，所述細胞選自具有專職受控胞吐作用的造血細胞系的組，所述具有專職受控胞吐作用的造血細胞系選自細胞諸如使用其分泌溶酶體存儲特化成分諸如絲氨酸蛋白酶如粒酶、組織蛋白酶、肥大細胞蛋白酶、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3以及其通常的溶酶體成分(包括數種水解酶如糖苷酶和黑色素、組胺和5-羥色胺)的細胞毒性T淋巴細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞。在本發明的另一個實施方案中，優選的細胞選自RBL-2H3、大鼠嗜堿性粒細胞白血病細胞系、小鼠32D細胞系、小鼠骨髓造血細胞、人ΝΚ92細胞系、天然殺傷細胞系和人YT細胞系、天然殺傷細胞系和小鼠MC/9細胞系、小鼠肥大細胞。用于本發明方法的特別優選細胞系是RBL-2H3，因為該細胞系具有非常低的組成型分泌水平和本發明優選報道分子如粒酶的高度誘導分泌，所述粒酶賦予傳感器高信號背景比率。
B.2.胞吐作用調節劑本發明還包括胞吐作用調節劑。在本發明的一個實施方案中，胞吐作用調節劑選自誘導胞內鈣水平變化的化合物或多肽。在本發明的另一個實施方案中，胞吐作用調節劑選自誘導cAMP、二酰甘油DAG)、磷脂或ATP水平變化的化合物或多肽，其轉而控制或調節鈣觸發的胞吐作用。—個重要的胞吐作用調節劑類型是表面受體，其包括G-蛋白偶聯受體(GPCR)、具有固有酪氨酸激酶活性的受體，具有相關酪氨酸激酶活性的受體和攜帶ITAM基序的受體如內源或異源Fcy和ε受體或攜帶正常參與許多造血細胞受體中的抗原識別和呈遞的ITIM基序的受體。因此，在本發明的一個實施方案中，胞吐作用調節劑可以是表面受體，所述表面受體在配體結合時激起存儲在具有受控胞吐作用的細胞顆粒內的報道分子的胞吐作用。這樣的胞吐作用調節劑可以是內源胞吐作用調節劑如高度親和性IgE受體，也稱為Fe受體ε I或轉染的同源或異源胞吐作用調節劑如GPCRs或Fe Y受體或Fce I受體。在本發明的另一個實施方案中，胞吐作用調節劑可以是表面受體，所述表面受體在配體結合時抑制由與另一受體結合的配體誘導的報道分子胞吐作用。在再一個實施方案中，胞吐作用調節劑可以包括具有用于配體結合的胞外區和用于信號轉導的跨膜和胞內區的嵌合受體，例如，包括IL-2結合區的白介素_2受體胞外區和包括ITAM序列和信號轉導所需的其他序列的至少大鼠Fce受體I跨膜和胞內區的嵌合受體。在一個實施方案中，細胞表面受體選自G-蛋白偶聯受體(GPCRs)、具有固有或相關酪氨酸激酶活性的受體和包含在特異性配體結合時激起顆粒存儲的報道分子胞吐作用的受體的I ΤΑΜ。GPCR根據它們轉導的信號分成四個主要類型:G a -1/Q、G a -q/n、G α -s和G α -12/13偶聯受體。a-S偶聯GPCR增加細胞內部的環-AMP而α-1/o偶聯GPCR阻斷細胞內部的環-AMP的增加。a -q偶聯GPCR增加胞內鈣且α -12/13產生細胞溶膠小GTP酶Rho的活化。但是本領域中公知地是，造血細胞具有混雜的α-15/16鏈，所述鏈與a-s、a-12/13和a-1/o偶聯GPCR偶聯從而增加胞內鈣，且本發明受益于此。在本發明的一個實施方案中，可以用于使報道分子由顆粒胞吐的GPCR可以選自α-q/ll、或a-12/13或a-1/o或a -s偶聯的GPCR。選作本發明方法中的胞吐作用調節劑的GPCR可以是全長受體或其中已經部分或完全缺失C-末端尾部的受體。已知在配體結合時，一些GPCR誘導β -氨基己糖苷酶釋放，但是根據技術發展水平，這似乎僅是某些GPCR的性質。例如，腺苷3受體已經被報道自身不誘導脫粒，但是加強由未達最佳標準劑量的IgE和抗原誘導的脫粒。脫粒已經主要在趨化因子受體和內源性表達在肥大細胞和嗜堿性粒細胞諸如RBL-2H3細胞中的某些a -1偶聯GPCR中證明。而且，顆粒胞吐作用已經在I型和III型毒蕈堿性乙酰膽堿受體中證明，其二者均是a_q偶聯GPCR，在RBL-2H3細胞中過表達。但是關于導致脫粒的途徑存在爭議。例如，Barlic等報告缺乏C-末端的IL8RA(CXClR) a -1偶聯GPCR不能在RBL-2H3中脫粒且甚至將這種脫粒的失去歸因于絲氨酸殘基，所述絲氨酸殘基在白介素_8相互作用時磷酸化并結合抑制蛋白。其他研究者質疑該結果，他們提供這樣的證據:C-末端截斷的IL8RA(CXClR)比天然受體甚至更有效地脫粒，這可能是因為配體結合后更低的內在化速度。全部以上結果使用作為報道分子的β -氨基己糖苷酶和CMV啟動子，即用于細胞如RBL-2H3中對大多數GPCR極弱并在造血細胞如RBL-2H3中部分沉默的啟動子。在實驗過程中，我們已經發現人腺苷3受體(AD0RA3)在克隆到合適載體諸如本發明達到中描述那些載體中時，是非常有效的胞吐作用調節劑。質疑以前的技術發展水平主要基于在hCMV啟動子控制下表達的GPCR，所述hCMV啟動子關于大多數GPCR在細胞如RBL2H3中非常低且關于在hCMV啟動子控制下表達的某些GPCR在那些細胞中隨時間而沉默。而且，以前的載體不使用任何序列來幫助GPCR表面表達。所有以上區別使我們的傳感器高度靈敏并因此有效用于藥物發現。關于有效的基于細胞的傳感器的另一個重要考慮是受配體調節的靶標的表達水平。靶標如表面受體，例如，以小于1000分子/細胞至大于500.000分子/細胞的量表達在細胞表面上，并因此存在多至1000倍的靶分子表達水平變化。GPCR，即主要表面受體類型，通常以低水平表達且僅約10% GPCR在N末端具有信號肽，而大部分使用第一跨膜結構域作為信號來易位至膜，這可能受到某些用于表面表達的分子伴侶的幫助。通常，靶標的較高表達水平將導致傳感器的較高靈敏度并因此，需要研究過表達蛋白靶標，特別是表面受體的條件。本發明還包括有效用于對本發明方法有效的細胞表面上的G-蛋白偶聯受體表達的啟動子和序列。在一個實施方案中，關于組成型GPCR表達的合適啟動子可以選自包括人或小鼠延伸因子l-α啟動子(SEQ ID NO:1)，人磷酸甘油酸激酶(SEQ ID Ν0:6)，勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子(SEQID NO:2)和來自莫洛尼鼠白血病病毒啟動子的5' LTR即MoMLV-5/ LTR(SEQ ID NO:3)的組。這樣的啟動子在用于本發明方法的造血細胞中不隨時間沉默。在本發明的一個實施方案中，關于GPCR表面表達的合適啟動子是誘導型啟動子。在另一個實施方案中，用于細胞表面GPCR表達的誘導型啟動子可以選自包括四環素誘導型啟動子、蛻皮激素誘導型啟動子、cumate誘導型啟動子和孕酮誘導型啟動子的組。在另一個實施方案中，GPCR可以包括用于表面過表達的信號肽和用于例如通過流式細胞計數或通過磁珠的陽性細胞表面檢測和/或分離的標簽。例如，Andersson, H等(見 Andersson 等 Mol Pharmacol (分子藥理學)(2003) 64:570_577)已經證明了在 CBl 的N末端添加信號肽或縮短長N-尾部在不影響與大麻素配體的受體結合的條件下，很大地提高受體的穩定性和細胞表面表達。在另一個實施方案中，有效用于GPCR表達的載體可以包括用于表面過表達的糖基化序列。這樣的糖基化序列應該插入標簽和天然GPCR序列的第一個氨基酸之間。在進一步優選的實施方案中，糖基化序列是選自包含序列SEQ ID NO:4的病毒GPCR的天然糖基化序列。關于組成型GPCR表達的有效載體的一個實例是P-MoMLV-5' LTR-SP-cmyc-標簽-VGS-MCS-聚腺苷酸(SEQ ID NO:5)，其包含在造血細胞中不沉默的啟動子、用于幫助跨膜易位的信號肽、用于使用表面上的GPCR選擇細胞的標簽、用于提高膜表達的糖基化信號和用于穩定信使RNA的聚腺苷酸序列。如果序列SEQ ID NO:5的載體中的P_MoMLV5' LTR啟動子序列被四環素誘導型啟動子替換，則獲得適合于誘導型GPCR表達的載體。本發明首次證明了在GPCR的N末端添加糖基化信號，特別是源自病毒GPCR的糖基化信號提高細胞表面受體表達。B.3.顆粒存儲的報道分子
關于顆粒分泌最廣泛使用的報道分子是內源性β_氨基己糖苷酶，但是該蛋白傳統上已經被認為是具有低信號背景比的低靈敏度報道分子。另外，該糖苷酶不能如例如蛋白酶一樣與信號放大級聯偶聯，蛋白酶可以偶聯到用于初始信號放大的蛋白水解級聯中，類似于導致血液凝固的血液凝固級聯，其中信號由使用酶原作為底物的酶級聯放大數倍。而且，由于β_氨基己糖苷酶正常存在于大多數具有專職受控胞吐作用的造血細胞的顆粒，該蛋白不容許開發多重測定。因此需要用于開發脫粒的靈敏測量法的其他顆粒存儲的報道分子的探索。在組成型和受控途徑之間分選可溶性蛋白明顯很復雜，且存在關于可溶性蛋白到達存儲顆粒與表達水平無關途徑中的細胞類型特異性的重要證據。例如，淀粉酶是外分泌胰腺細胞中的正常顆粒成分，且在轉染至外分泌胰腺細胞系中時被運輸到顆粒，但在轉染的內分泌細胞系中組成型分泌(見例如，EI Meskini, R等.Endocrinology (內分泌學)(2001)第142卷，第2期864-873)。細胞類型特異性可以解釋使用POMC分子的氨基端蛋白研究不同內分泌和神經細胞系途徑的一些矛盾結果(見例如，TarnffffH等.Eur J CellBiol (歐洲細胞生物學雜志)(1993)，62:294-306 ;RoyP 等.Mol Cell Endocrinol (分子細胞內分泌學)(1991)，82:237-250 和 CoolDR 等.J Biol Chem(生物化學雜志)(1995)270:8723-8729)。蛋白分選的細胞特異性超越細胞系擴展到原始培養物，因為相同的構建體在原代內分泌和神經細胞中可以以非常不同方式處理。因此，對于本領域中技術人員而言，不同于具有受控胞吐作用的造血細胞的其他細胞可以用于本發明的方法中，但是其他細胞類型的選擇需要與以高濃度存儲在所選細胞系的分泌顆粒中的特定報道分子以及與低水平基礎分泌平行進行。有效用于本發明方法的、存儲在分泌顆粒，尤其在造血源細胞分泌顆粒中的報道分子的一個重要性質是針對該報道分子在顆粒內部主要抵抗的嚴苛環境的抗性。造血細胞的分泌顆粒與溶酶體，即內部在極酸pH條件下存儲水解酶諸如組織蛋白酶、類胰蛋白酶和胃促胰酶的大型庫的細胞器相關，且該環境對于天然不存儲在該細胞器中的蛋白不理想，因此蛋白酶或PH不穩定性報道分子將可能在分泌顆粒內部降解，由此降低該不穩定性報道分子蛋白的靈敏度。例如，蛋白酶是由活化肥大細胞胞吐的主要蛋白成分(見例如Huang等，J Clin Immunol.(臨床免疫學雜志)18:169_183，1998)。類胰蛋白酶、胃促胰酶和羧肽酶是存儲在肥大細胞的分泌顆粒中的蛋白酶的三個主要家族。因此，本發明的優選報道分子是針對本發明造血細胞的顆粒內部的蛋白水解和低PH具有高度抗性的多肽。盡管分泌溶酶體內溶酶體酶和造血絲氨酸蛋白酶與數種抗生素蛋白的共存顯示在不降解條件下的共存儲是可能的，但是并非人工引導至分泌顆粒的每一個多肽都將抵抗該嚴苛環境。例如，Kaur J 和 Cutler DF (見 Kaur, J 和 Cutler DF.J.Biol.Chem.(生物化學雜志)，(2002)第277卷，第12刊，10498-10505)發現了嵌合HRP-Pselectin可以靶向分泌和常規溶酶體，但是多至70%的靶向蛋白通過蛋白水解降解。用于本發明方法的造血細胞的分泌顆粒與溶酶體共享性質，所述溶酶體是內部在極酸PH環境下存儲水解酶諸如組織蛋白酶、類胰蛋白酶和胃促胰酶的大型庫的細胞器，并且對于本發明方法的有效報道分子必須是針對合適造血細胞的顆粒內部環境具有抗性的多肽。在本發明的一個實施方案中，有效報道分子選自針對造血細胞的顆粒內部環境，諸如蛋白水解和低pH具有抗性的多肽。在本發明的另一個實施方案中，顆粒存儲的蛋白酶報道分子選自天然存儲在造血細胞的顆粒中的一組絲氨酸蛋白酶，其包括具有天冬裂酶樣活性的酶(在天冬氨酸后切割)，具有胃促胰酶-樣活性的酶(在苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸后切割)，具有類胰蛋白酶-樣活性的酶(在賴氨酸或精氨酸后切割)和具有彈性蛋白酶-樣活性的酶(在纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸或半胱氨酸后切割)。在又一個實施方案中，優選的絲氨酸蛋白酶具有內肽酶活性的酶，其選自包括粒酶、組織蛋白酶G、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3和肥大細胞蛋白酶如胃促胰酶的組。造血細胞的顆粒還存儲屬于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶家族的組織蛋白酶。組織蛋白酶是一類球狀蛋白酶，最初描述為胞內肽水解酶，盡管一些組織蛋白酶也具有胞外功能。組織蛋白酶B，C，F，H，L，K，O, S，V，W，和X是木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶，且代表最大且最著名的組織蛋白酶類型。它們主要起胞內蛋白酶的作用，在溶酶體的酸性環境中介導末端非特異性大規模蛋白質水解(見例如Turk V7Turk B和Turk D.EMBO J(EMB0雜志)2001 ；20:4629-33)。組織蛋白酶A和G均是絲氨酸蛋白酶，但是組織蛋白酶G是內肽酶而組織蛋白酶A是羧肽酶。組織蛋白酶D和E是天冬氨酸蛋白酶。組織蛋白酶作為無活性酶原來合成并加工成為成熟的活性酶。由于在溶酶體的酸性環境中半胱氨酸組織蛋白酶作為胞內蛋白酶的功能，它們的最優PH是約5-5，5且在本發明方法中細胞培養存活性和胞吐作用所需的生理PH下，它們的催化效率不是最優的。由于該原因，絲氨酸蛋白酶在與半胱氨酸組織蛋白酶比較時，通常是對于本發明方法中的顆粒存儲優選的報道分子。現有技術發展水平中還已知其他降解蛋白酶包括金屬蛋白酶存儲在顆粒中，并由造血細胞諸如嗜中性粒細胞，例如MMP-8 (嗜中性粒細胞膠原酶)和MMP-9 (92kDa明膠酶)釋放(見例如，Owen CA 和 Campbell EJ.J.Leukoc.Biol.(白細胞學生物學雜志)(1999)65，137-150)，但是造血細胞的絲氨酸蛋白酶對由本發明方法的優選細胞釋放的蛋白水解活性具有最大貢獻，且因此絲氨酸蛋白酶比金屬蛋白酶和半胱氨酸組織蛋白酶更優選。這種對于蛋白水解活性的較大貢獻是與也存儲在顆粒中的其他蛋白酶相比絲氨酸蛋白酶的更大顆粒濃度和絲氨酸蛋白酶在中性PH的更大催化活性的結果。在本發明的一個實施方案中，編碼報道分子的DNA可以被轉染以生成酶原蛋白或或生成活性酶。作為酶原合成的顆粒報道分子靶向分泌顆粒，在那里它們被活化，而活性酶靶向分泌顆粒且它們不需要活化。例如，粒酶是通過顆粒內部組織蛋白酶C，通過在N-末端活化二肽處切割生成活性酶而變為具有活性的酶原。即使組成型活性粒酶B被正確靶向并存儲在顆粒內部且因此有效用于本發明的方法，這樣的組成型活性粒酶B具有比作為酶原合成的粒酶B更高的基礎活性，由此降低傳感器的信號背景比。其他研究者證明了(見Isaaz等.Eur J Immunol (歐洲免疫學雜志)1995 ；25(4): 1071-9)在活性合成過程中的CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)克隆中，大量粒酶是組成型分泌的且多至1/3的粒酶A和B可以通過組成型分泌途徑由CTL直接分泌，其如通過粒酶A酶活性和分泌的粒酶B的免疫印跡所示，其中1/3的蛋白未能獲得顆粒靶向信號。切割蛋白的組成型分泌可以被CHX和布雷菲德菌素A(BFA) 二者阻斷。雖然BFA不影響被識別的靶標的定向殺傷，它消除旁觀者殺傷，這說明旁觀者殺傷由通過非顆粒途徑遞送的新合成切割蛋白引起。因此，使用需要在顆粒內部活化的酶原代替組成型活性報道分子減小基礎活性，并且產生具有較高信號背景比的細胞系，以用于有效用于本發明方法的更可靠傳感器。
在本發明的另一個實施方案中，對于本發明方法的有效報道分子可以是天然存在的序列或密碼子優化報道分子以便在有效細胞系中高度表達。例如馬粒酶B的密碼子優化序列如SEQ ID NO:9所示。B.4.用于報道分子表達的啟動子本發明還包括對于表達報道分子的合適啟動子。關于表達本發明的顆粒存儲的報道分子的有效啟動子是適合于造血細胞中蛋白表達的啟動子，特別是適合于中度至高度蛋白表達的啟動子。當通過特異性ELISA(酶聯免疫吸附測定)定量時，具有中度蛋白表達的啟動子生成大于IOng顆粒存儲的粒酶B/百萬RBL-2H3細胞，而強啟動子生成大于IOOng顆粒存儲的粒酶B/百萬RBL-2H3細胞。合適啟動子的另一相關特性是蛋白表達在培養過程中必須是穩定的。某些異源啟動子在培養過程中，特別是在造血細胞中被下調，且該過程稱為“啟動子沉默”。對于本發明方法的優選啟動子因此是不可沉默啟動子。在本發明的一個實施方案中，用于報道分子表達的啟動子選自包括以下各項的組:hCMV和MoMLV-5^ -LTR啟動子的嵌合啟動子(SEQ ID NO:10) ;MoMLV-5, LTR啟動子(SEQ ID NO:3);延伸因子 l-α 啟動子(SEQ IDNO:1) ;RSV 啟動子(SEQ ID NO:2)和胸苷激酶啟動子(SEQ ID N0:7)。其他啟動子諸如人巨細胞病毒啟動子，即一種廣泛用于真核細胞轉染的最強啟動子，也是合適的，但是在本發明的造血細胞中，它與具有在MoMLV的嵌合hCMV-5^ LTR的控制下的粒酶B的載體相比產生至少125倍更少的粒酶B，由此降低傳感器靈敏度。因此，使用粒酶B作為報道分子的載體有效用于啟動子評估，從而選擇對本發明方法的報道分子表達合適的啟動子。通常，對本發明方法中報道分子表達的優選啟動子是這樣的啟動子，即由其生成更多的報道分子，較強的啟動子比較弱的啟動子更優選。在本發明的另一個實施方案中，優選的啟動子是在傳代培養過程中不被細胞沉默的那些。啟動子沉默限制啟動子的有效性，且我們發現了人CMV(hCMV)啟動子在本發明的至少一個優選細胞系中，即在RBL-2H3中部分沉默。但是也由hCMV與MoMLV的5' -LTR融合組成的嵌合啟動子在超過6個月的連續培養中不沉默。啟動子沉默必須通過實驗確定，且對于本領域技術人 員而言，其中例如人粒酶B在待測啟動子控制下表達并具有抗生素抗性以便用于哺乳動物細胞系中的穩定選擇的載體有效用于克隆新型啟動子并用于選擇可以被培養數月的穩定細胞系，從而選擇不沉默的強啟動子，并由此有效用于本發明的方法。在本發明的一個實施方案中，用于表達顆粒存儲的蛋白酶報道分子的啟動子是誘導型啟動子。在另一個實施方案中，用于表達顆粒存儲的蛋白酶報道分子的誘導型啟動子可以選自包括四環素誘導型啟動子、蛻皮激素誘導型啟動子、cumate誘導型啟動子和孕酮誘導型啟動子的組。B.5.檢測技術和底物除有效用于本發明方法的報道分子的針對分泌顆粒內部環境的抗性外、高水平表達、低基礎分泌和高誘導分泌以外，用于本發明靈敏檢測方法的受控胞吐作用的報道分子的其他重要性質是用于測量分泌的報道分子的檢測技術類型和該報道分子對用于檢測的特定底物的催化效率。高靈敏度檢測技術和對特定底物具有高催化效率的報道分子有益于本發明的方法。關于本發明方法的有效報道分子是具有蛋白水解活性的酶并且因此，蛋白水解活性檢測技術對于本發明特別重要。在本發明的一個實施方案中，用于測量分泌顆粒存儲的報道分子的酶活性的方法選自比色法、熒光法、FRET法、時間分辨-FRET法或發光法。這些方法是現有技術水平中公知的。例如，人粒酶B活性可以通過使用C-末端與P-硝基苯胺(pNA)偶聯的肽IEPD，通過比色法檢測，在405nm處檢測，C-末端與7-氨基-4-甲基香豆素偶聯的相同肽可以通過具有380nm處的激發和460nm的發射波長的熒光來檢測，且C-末端與7-氨基-三氟甲基香豆素偶聯的相同肽可以通過具有400nm處的激發和505nm處的發射的熒光來檢測。與本發明方法特別相關的是高度靈敏的熒光或發光蛋白酶底物，例如，基于FRET的蛋白酶底物、基于發光的蛋白酶底物和基于羅丹明-110的熒光底物。在本發明的另一個實施方案中，用于測量有效報道分子如粒酶A，B,胃促胰酶，蛋白酶3或嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的酶活性的方法選自Forste「共振能量轉移(fret)或時間分辨-FRET法。Ffirster共振能量轉移或fret是檢測能夠作為成對的fret兩個熒光團之間接近度的技術。例如，如果一個稱為“供體”的熒光團的熒光發射譜與另一個稱為“接受體”的熒光團重疊，則這兩個分子可以起FRET對作用。當彼此接近時，典型地在100埃以下范圍內時，供體熒光團的激發導致非輻射的能量轉移至接受體熒光團，由此導致來自接受體的熒光發射增加和來自供體的熒光發射減少。當分離FRET配偶體時，除去FRET。EDANS/DABCYL熒光團-猝滅劑對是最常用于FRET應用的一種，這歸因于EDANS的發射譜(激發波長341nm，發射波長471nm)和DABCYL的吸收譜(最大吸收波長453nm)之間良好的譜重疊。由DABCYL引起的EDANS熒光的猝滅因此很高效，在DABCYL/EDANS標記肽蛋白水解時觀察到多至40-倍的熒光增強。例如，具有序列SGIETOSGV的肽可以在N-末端使用EDANS作為"供體"熒光團和C-末端使用DABCYL作為"接受體"或猝滅劑來標記。當該完整的肽底物用于測量酶活性時，EDANS的熒光被DABCYL猝滅。當FRET肽被例如人粒酶B切割時，EDANS的熒光重新獲得，并可以在激發/發射=340nm/470nm處連續監測。EDANS熒光的增加與粒酶B活性相關聯。5'-FAM/TAMRA FRET對也廣泛用于標記蛋白酶底物，比基于DABCYL/EDANS的肽更靈敏，且基于5-FAM/TAMRA的FRET底物更少地受測試化合物的自發熒光干擾，這歸因于其較長的發射波長。還存在許多可以有效用于本發明方法的FRET對。例如，Biosearch Technologies (生物探索技術)已經開發了高效粹滅劑，以商標BHQsup.TM或Blackhole粹滅劑銷售，而Anaspec已經開發了 QXLsup.TM粹滅劑和Perkin ElmerQSYsup.⑧猝滅劑。為了使猝滅劑-熒光團對有效，熒光團的發射熒光譜必須與猝滅劑的吸收譜重疊。有效用于本發明方法的FRET對的另一相關特性是用于檢測的激發和發射波長。具有長的激發和發射波長的FRET對較少地傾向于來自細胞成分和來自用于藥物發現的化合物的干擾，并因此優選用于本發明的方法。有效用于基于FRET的蛋白酶測定的所謂的NIR染料是本領域技術中公知的(見例如，Pham W等.Bioconj.Chem.(生物綴合化學)
(2004);151403-1407)，且本發明受益于為了靈敏且特異性檢測蛋白酶活性所開發的新技術，包括新型 NIR 染料(見例如 Peng X等.A nonf luorescent, broad-range quencher dyefor Forsterresonance energy transfer assays(用于共振能量轉移測定的非突光廣譜粹滅劑).Analytical Biochemistry (分析生物化學)電子公開于2月25日，(2009)),所述新型NIR染料在被特定蛋白酶切割時具有更好的信號與背景熒光比。例如，對于使用FRET的粒酶 B 檢測合適的底物是 5' -FAM-Ser-1le-Glu-Pro-Asp-Ser-Gly-Ser-TAMRA。時間分辨FRET或TR-FRET是FRET的變體，其中鑭系螯合物諸如鋱螯合物用作供體物種。因為鋱螯合物具有比標準有機熒光團長許多數量級的熒光壽命，所以TR-FRET可以在該干擾完全衰減后測量。這一點再加上接受體強度與供體強度的比值讀數(ratiometric readout),為HTS測定提供有效的讀數。在本發明的一個實施方案中，由顆粒分泌的蛋白酶引起的肽切割使用時間分辨熒光計來檢測。例如，肽可以在一末端與熒光鑭系螯合物且在另一末端與鑭系螯合物的猝滅劑偶聯。在由蛋白酶引起切割時，鑭系螯合物和猝滅劑將隨底物切割而被分離。用于本發明方法的時間分辨FRET技術的一個相關特性是熒光發射可以由激發延遲并且因此避免用于藥物發現過程的化合物自發熒光。例如，對于檢測分泌的粒酶B的有效底物是Lanthan-1EPDSG-Quench,其中Lanthan是鑭系螯合物,例如銪螯合物且Quench是鑭系突光的合適猝滅劑，例如QSYsup. 7。在一個優選實施方案中，用于靈敏檢測分泌的蛋白酶的方法選自具有來自用于藥物發現的細胞和化合物二者的最小干擾的高效FRET對，諸如例如，5' -FAM和TAMRA FRET對，近紅外FRET對和基于鑭系螯合物的時間分辨FRET法。在本發明的再一個實施方案中，顆粒分泌的蛋白酶使用肽-修飾的熒光素底物(見例如，Geiger R和Miska WjUSPTO 5035999)，在包含ATP和熒光素酶二者的合適緩沖液中測量。例如，對于確定泌的粒酶B的合適肽是Ile-Glu-Pro-Asp-氨基熒光素(IEPD-氨基熒光素)，其中天冬氨酸的羧酸與6-氨基熒光素綴合生成不被熒光素酶切割的酰胺熒光素，除非IEPD-氨基熒光素先被分泌的人粒酶B切割。利用該粒酶B底物，顆粒存儲的胞吐作用與發光偶聯并且因此用于藥物發現的細胞和化合物二者的自發熒光不產生與測定讀數的干擾。基于羅丹明110的蛋白酶底物是熒光團的雙酰胺衍生物，是與羅丹明IlO(RllO)各氨基基團共價連接的肽(見例如，Mangel W等USPT04557862)，由此抑制染料的可視吸收和熒光二者。當酶切割時，非熒光雙酰胺底物以兩步驟過程轉變，首先轉變為熒光單酰胺并然后轉變為甚至更多熒光R110。RllO切割產物具有與熒光素類似的光譜特性和大消光系數，由此提供在標準熒光素濾器設置下的使用容易度和良好信號背景比。在本發明的一個實施方案中，用于蛋白水解檢測的蛋白酶底物是羅丹明110修飾的肽。在另一個實施方案中，用于報道分子檢測有效優選底物是處于包含細胞的混合物中的適合用于報道分子檢測的細胞不能透過的底物。在本發明的另一個實施方案中，分泌的蛋白酶的優選檢測包括用于信號放大的酶促級聯。容許信號放大的蛋白酶級聯是本領域技術中公知的(見例如，Harris, C.USPTO4，463，090)。蛋白酶放大級聯的最佳實例是血液凝固級聯，其中第一蛋白酶激活酶原產生活性蛋白酶且該第二蛋白酶還激活酶原產生第二活性蛋白酶，由此形成級聯，其中初始信號放大多至1000倍。具有非常低基礎活性的酶原需要使用高信號背景比進行信號放大。例如，天然胱天蛋白酶8酶原具有完全加工的酶的1%活性，其是與大多數蛋白酶原相比非常大的活性(見Muzio M.等J.Biol.Chem.(生物化學雜志)(1998) 273 =2926-2930)，并且因此天然胱天蛋白酶-8對于靈敏檢測分泌的報道分子如粒酶B具有高背景。相反，人胱天蛋白酶原-3可以被人、大鼠、馬或黑猩猩粒酶B高效切割并活化，從而生成成熟胱天蛋白酶_3，其具有比未切割酶原約10.000倍更高的活性并因此高度有效用于顆粒分泌的蛋白酶的檢測。高酶原性指數是對本發明方法中有效用于檢測分泌的報道分子的蛋白酶特別優選的性質。除高酶原性指數外，對于本發明方法的優選酶原選自在活化后具有高催化效率和具有低的酶基礎活性的酶。需要選擇具有這些性質的酶原用于本發明中顆粒胞吐作用的靈敏檢測。酶原的基礎活性與酶原性指數有關，但在此是與本發明方法相關的區別。第一，具有相同酶原性指數的兩種酶可以具有不同的基礎活性，但是具有較高基礎活性的酶也是具有較高催化效率的酶。優選用于本發明方法的是具有最高可能的酶原性指數和最低可能的基礎酶活性的酶。第二，基礎活性不僅與酶原性有關，因為某些酶如胱天蛋白酶原_3在以高濃度存在時，可以容易地自體活化。例如，胱天蛋白酶原_3的酶原性指數是約10.000且因此非常高，但是如果該酶以高濃度存儲，則該酶自體活化并且基礎活性可以非常高。第三，與本發明方法有關的基礎活性是在缺乏受控胞吐作用調節劑條件下細胞的細胞培養物上清中存在的基礎活性，而不僅僅是由轉染的顆粒存儲的報道分子產生的基礎活性。例如，粒酶A是屬于蛋白酶的類胰蛋白酶-家族的絲氨酸蛋白酶。該類胰蛋白酶家族的特征在于精氨酸或賴氨酸氨基酸后的切割序列。盡管人粒酶A在P4-P3-P2-P1具有包括IGDR或VANR的最佳切割序列(見例如,Mahrus S和Craik CS.Chemistry&Biology (化學與生物)
(2005)，12,567-577)并由此潛在地有效用于本發明的方法，但是在非轉染RBL-2H3細胞的未刺激細胞培養物上清中已經出現的類胰蛋白酶的活性如此高以致于在使用人粒酶A穩定轉染、使用分泌調節劑如離子霉素刺激的RBL-2H3細胞和使用或不使用離子霉素刺激的未轉染細胞之間不存在差異。但是如果除去細胞培養物上清并使用無血清緩沖液，例如改性的HBSS清洗細胞，則基礎類胰蛋白酶活性降低至這樣的水平，其中人粒酶A成為對本發明方法有效的報道分子。Verheiien等已經開發了有效用于蛋白酶定量的人工放大級聯(見Verheiien JH等.Biochem.J.(生物化學雜志)(1997) 323，603-609 和 Verheiien JH,USPT0,8, 115,252)，其中尿激酶原被修飾為包含可由待定量蛋白酶切割的識別位點。其他人已經使用在不同切割位點修飾的不同蛋白酶如胱天蛋白酶原-3作為蛋白酶活性的測量。例如，Li Y等(見LiY.等 Molecular Biotechnology (分子生物技術)，(2001)第 18 卷,第 I 期，1-10)已經開發了包含β -分泌酶切割位點的修飾的胱天蛋白酶原_3，其誘導293Τ細胞中的凋亡，即活性胱天蛋白酶-3的公知作用，且他們證明了修飾的胱天蛋白酶_3誘導的凋亡與β-分泌酶識別序列對β -分泌酶的易感性相關，并且甚至證明了蛋白酶競爭劑防止修飾的胱天蛋白酶-3誘導的細胞死亡。在另一個實例中，Vocero-Akbani AM等(見Vocero-Akbani AM等Nat Med.(自然醫學)(1999)，第5卷，第I期:29_33)改造了胱天蛋白酶原_3，其用人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白水解切割位點替代內源性蛋白水解切割位點。一旦在細胞內部，這種改造的胱天蛋白酶原_3在未感染細胞中保持無活性，但是在HIV-感染的細胞中，該胱天蛋白酶原_3由HIV蛋白酶加工成活性形式，由此導致感染細胞的凋亡。全部以上蛋白酶級聯實例都與本發明的方法相關，盡管對本發明方法優選的酶原基于以天然胱天蛋白酶原-3為基礎的天然放大級聯。數種胱天蛋白酶如胱天蛋白酶_3和胱天蛋白酶-8是粒酶B的天然底物，且我們已經使用胱天蛋白酶-3的這種性質來開發用于定量分泌的粒酶B的快速靈敏方法。在本發明的一個特定實施方案中，用于人、大鼠、黑猩猩或馬粒酶B的優選酶原是未修飾的人胱天蛋白酶原-3,其包括根據GenbankNM_032991的由第29位的絲氨酸至第277位的組氨酸的氨基酸。在另一個實施方案中，有效用于檢測分泌的人粒酶B、大鼠粒酶B、黑猩猩粒酶B或馬粒酶B的人胱天蛋白酶原-3是突變變體，其第174位蘇氨酸突變為脯氨酸，以實現人、大鼠、黑猩猩或馬粒酶B更有效切割。在另一個實施方案中，人胱天蛋白酶原_3通過至少將第176位絲氨酸改變為纈氨酸或亮氨酸來進一步修飾，以減小白體活化。在一個實施方案中，具有由人粒酶B引起的改進切割的人胱天蛋白酶原-3在第174位具有脯氨酸而非蘇氨酸且第176位絲氨酸突變為纈氨酸，第177位甘氨酸突變為亮氨酸，第178位纈氨酸突變為甲硫氨酸和第179位天冬氨酸突變為谷氨酸。具有包括氨基酸Ρ4-Ρ3-Ρ2-Ρ1-ΡΓ -P2, -P3 ^ -Pf的序列IETOVLME的這種胱天蛋白酶原-3對于人粒酶B切割最佳并且在缺乏粒酶B時具有非常低的自體活化，但被人粒酶B切割時具有完整活性。這樣的具有高度減小的自體活化的突變人胱天蛋白酶原3如SEQ ID N0:11所示。已知鼠粒酶B的四肽特異性與人粒酶B顯著不同。人和小鼠粒酶B比關于各粒酶B的異源胱天蛋白酶原_3更有效地切割物種-特異性胱天蛋白酶原_3。人胱天蛋白酶原-3通過小鼠粒酶B在包含P4-P3-P2-P1序列的IETD處(第175位的異亮氨酸-谷氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸)的切割與通過人蛋白酶的切割相比約6倍更低效，即使兩種胱天蛋白酶都具有相同的IETD切割序列，因此物種-特異性胱天蛋白酶原-3的使用對于本發明方法中的分泌粒酶B的檢測是優選的。在本發明的一個實施方案中，用于測量有效的活化酶原的酶活性的方法選自比色法、熒光法、FRET、時間分辨-FRET或發光法。有效用于檢測活性胱天蛋白酶3的底物的實例是:5' -FAM-Ser-Asp-Glu-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-TAMRA,其是 FRET 底物；Lanthan-CDEVDK-Quench,其中 Lanthan 是鑭系螯合物，例如，銪螯合物且Quench是鑭系熒光的合適猝滅劑，例如用于時間分辨熒光計的QSYsup._ 7 ;用于熒光檢測的DEVD-AMC和DEVD-AFC，和用于發光檢測的DEVD-氨基熒光
素。
在另一個優選實施方案中，活化酶原如胱天蛋白酶_3的底物是細胞不能透過的底物，從而減小由胞內底物水解的背景。在另一個優選實施方案中，活性胱天蛋白酶_3的優選細胞不能透過的底物是序列DEVD的肽，所述序列DEVD在C-末端與7-氨基-4-甲基香豆素或羅丹明110或氨基熒光素偶聯，或在一末端與用于FRET或時間分辨-FRET的熒光團偶聯且另一末端與特定熒光團的熒光的合適猝滅劑偶聯。在本發明的另一個實施方案中，分泌的蛋白酶的活性可以通過被該分泌的蛋白酶活化的酶原來檢查，其中所述酶原是環狀排列變換酶，其缺乏酶活性，除非被特定蛋白酶活化。環狀排列變換是這樣的過程，其中酶的氨基和羧基端相連接并且在該分子的任何位置形成新氨基和羧基端。用于本發明方法的有效環狀排列變換酶是這樣的酶，其通過環狀排列變換而轉變為具有低基礎活性的酶原且活性通過蛋白酶切割恢復。環狀排列變換酶原是本領域技術公知的。Plainkum P等(見Plainkum P等Nat Struct Biol.(自然結構生物學)2003年2月；10(2): 115-9.)首次證明通過連接核糖核酸酶A的N和C端，活性位點被痕原蟲天冬氨酸蛋白酶II (即來自惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)的高度特異性蛋白酶)識別的氨基酸序列阻斷。它們通過環狀排列變換產生新N和C端，并且在存在瘧原蟲天冬氨酸蛋白酶II的條件下，核糖核酸酶原獲得約1000倍催化活性并保持高度構象穩定性。其他研究者已經將N和C端的環狀排列變換應用于形成可以被蛋白酶活化的新型酶原(見例如，Johnson RJ 等 FEBSJournal (FEBS 雜志)第 273 卷，第 23 刊，第 5457-5465頁，2006 和 Jucovic M 等 Protein Engineering Design and Selection (蛋白工程設計和選擇)2008 21(10):631-638)。在本發明的另一個實施方案中，用于定量分泌的蛋白酶的合適酶原選自具有對于高信號背景比而言低基礎活性并因此獲得更可靠測定的酶，和在被分泌的蛋白酶活化后具有高催化效率的酶。例如，修飾的腸激酶原具有非常高的基礎活性，即低酶原性指數，這妨礙其用于靈敏檢測人粒酶B。在本發明的另一個實施方案中，用于定量分泌的蛋白酶的優選酶原選自這樣的酶，其反應緩沖液可以制成與用于胞吐作用的培養基相容。關于基于任何檢測技術的靈敏報道分子檢測，需要非常高效切割的特定蛋白酶底物。關于任何具體底物切割序列周圍的氨基酸殘基是蛋白酶報道分子催化效率的主要決定因素。在一個實施方案中，具有類胰蛋白酶-樣活性的有效的顆粒存儲的報道分子選自包括粒酶A和粒酶K的組。在另一個實施方案中，具有天冬裂酶樣活性的有效的顆粒存儲的報道分子是粒酶B。在另一個實施方案中，具有胃促胰酶-樣活性的有效的顆粒存儲的報道分子選自包括粒酶H、胃促胰酶和組織蛋白酶G的組。在再一個實施方案中，具有彈性蛋白酶-樣活性的有效的顆粒存儲的報道分子選自包括粒酶M、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的組。在一個實施方案中，有效的顆粒存儲的報道分子選自包括人、小鼠，大鼠、馬、牛、短尾負鼠、綿羊和山羊組的物種的絲氨酸內肽酶。在本發明的一個特定實施方案中，異源報道分子選自一組絲氨酸蛋白酶，其包括來自人、大鼠、黑猩猩和馬物種的粒酶B，因為粒酶B蛋白酶是唯一已知的絕對需要在天冬氨酸后切割的絲氨酸蛋白酶。在本發明的一個實施方案中，用作傳感器報道分子的人、大鼠、黑猩猩和馬物種粒酶B的優選底物包括P4處的選自異亮氨酸或纈氨酸的氨基酸；P3處的選自谷氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸的氨基酸；P2處的選自脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、谷氨酸、甘氨酸或組氨酸的氨基酸；和在Pl處的天冬氨酸。在本發明的另一個實施方案中，來自人、大鼠、黑猩猩或馬物種的那些粒酶B的進一步優選擴展的底物包括Pl'處的選自纈氨酸、絲氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的不帶電氨基酸和P2'處的選自絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酸的氨基酸。在本發明方法的另一個優選實施方案中，人、大鼠、黑猩猩或馬物種的粒酶B的進一步優選底物包括這樣的序列:P4處的異亮氨酸，P3處的谷氨酸，P2處的脯氨酸或蘇氨酸和Pl處的天冬氨酸。進一步優選的底物還包括Pl'處的絲氨酸和P2'處的甘氨酸或亮氨酸。在本發明的一個實施方案中，用作傳感器報道分子的人、大鼠和小鼠物種的粒酶A的底物包括P4處的選自異亮氨酸、纈氨酸，或甘氨酸的氨基酸；P3處的選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的氨基酸；P2處的選自天冬酰胺或苯丙氨酸的氨基酸和Pl處的精氨酸或賴氨酸。在本發明的另一個實施方案中，人、鼠或小鼠粒酶A的進一步優選擴展的底物包括Pl'處的長線性疏水性氨基酸諸如脂肪族側鏈的賴氨酸和甲硫氨酸，或無支鏈疏水性氨基酸如丙氨酸或極性殘基如絲氨酸4ΡΡ2^處的選自纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸。在本發明方法的另一個優選實施方案中，人粒酶A的進一步優選底物包括P4處的纈氨酸或異亮氨酸，P3處的丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸，P2處的天冬酰胺或天冬氨酸和Pl處的精氨酸。進一步優選的底物還包括Pl'處的絲氨酸或甲硫氨酸和P2'處的纈氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。在本發明方法的另一個優選實施方案中，小鼠粒酶A的進一步優選底物包括P4處的甘氨酸或纈氨酸，P3處的酪氨酸或苯丙氨酸，P2處的苯丙氨酸或天冬酰胺和Pl精氨酸。小鼠粒酶A的進一步優選底物還包括Pl'處的絲氨酸或甲硫氨酸和P2處的纈氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。在本發明的一個實施方案中，用作傳感器報道分子的人胃促胰酶的底物包括P4處的選自甘氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸的氨基酸；P3處的選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或谷氨酸的氨基酸；P2處的選自天冬酰胺、絲氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸或纈氨酸的氨基酸和Pl處的酪氨酸或苯丙氨酸。在本發明的另一個實施方案中，人胃促胰酶的進一步優選擴展的底物包括Pl'處的絲氨酸或甘氨酸；P2,處的選自天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸或甘氨酸的氨基酸和P3'處的選自纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸或甘氨酸的氨基酸。在本發明方法的 另一個優選實施方案中，人胃促胰酶的進一步優選底物包括P3處的組氨酸、谷氨酸或蘇氨酸；P2處的脯氨酸或蘇氨酸；和Pl處的苯丙氨酸或酪氨酸。進一步優選底物還包括Pl'處的絲氨酸和P2'處的天冬氨酸、谷氨酸或丙氨酸。在本發明的一個實施方案中，用作傳感器報道分子的人、大鼠和小鼠物種蛋白酶3的底物包括P4處的具有小脂肪族殘基的氨基酸如纈氨酸和丙氨酸；P3處的具有小脂肪族殘基的氨基酸如丙氨酸和纈氨酸；P2處的選自天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和賴氨酸的帶電氨基酸和Pl處的選自半胱氨酸、正纈氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸。在本發明的另一個實施方案中，人、大鼠或小鼠蛋白酶3的進一步優選擴展的底物包括Pl'處的選自精氨酸和賴氨酸的帶正電氨基酸或具有小脂肪族殘基的氨基酸如丙氨酸或纈氨酸4ΡΡ2^處的選自天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺的氨基酸。在本發明方法的另一個優選實施方案中，人蛋白酶3的進一步優選底物包括P4處的纈氨酸或丙氨酸；P3處的纈氨酸或丙氨酸；P2處的天冬氨酸和Pl處的半胱氨酸、纈氨酸或正纈氨酸。進一步優選底物還包括Pl'處的丙氨酸或賴氨酸，P2^處的天冬氨酸和P3'處的精氨酸。在本發明的一個實施方案中，用作傳感器報道分子的人、大鼠和小鼠物種嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的底物包括P4處的脯氨酸或具有小脂肪族殘基的氨基酸如纈氨酸和丙氨酸；P3處的具有小脂肪族殘基的氨基酸如丙氨酸和纈氨酸或選自天冬氨酸和谷氨酸的帶負電氨基酸；P2處的具有小脂肪族殘基的氨基酸如丙氨酸和纈氨酸或選自天冬氨酸和谷氨酸的帶負電氨基酸和Pl處的選自異亮氨酸、正纈氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的疏水性或極性氨基酸。在本發明的另一個實施方案中，人、大鼠或小鼠嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的進一步優選擴展的底物包括Pl'處的疏水性或極性或帶負電氨基酸和P2,處的疏水性或帶負
電氨基酸。在本發明方法的另一個優選實施方案中，人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的進一步優選底物包括P4處的脯氨酸或纈氨酸或丙氨酸；P3處的谷氨酸或纈氨酸或丙氨酸；P2處的谷氨酸和Pl處的異亮氨酸、纈氨酸或正纈氨酸。進一步優選底物還包括Pl'處的甲硫氨酸，P2;處的精氨酸或天冬氨酸和P3^處的精氨酸。本發明傳感器的一個相關特性是不同的基于細胞的傳感器可以在同一反應器中組合，從而在各反應器中產生多重測定。為了在同一反應器中組合，各基于細胞的傳感器必須產生特定胞吐作用調節劑和特定顆粒存儲的報道分子的獨特組合。另外，當釋放時，這樣的顆粒存儲的報道分子必須使用特定底物來檢測，所述特定底物具有與其他底物或其他釋放報道分子的最小或優選無干擾作用。在本發明的一個實施方案中，至少兩個基于細胞的傳感器，其各產生一種胞吐作用調節劑和一種顆粒存儲的報道分子的獨特特定組合，可以在同一反應器中混合，產生多
重反應。在另一個實施方案中，2或3或4或5或6個不同的基于細胞的傳感器在與細胞存活性、顆粒胞吐作用和所有顆 粒存儲的報道分子的酶活性相容的培養基中，在同一反應中混合。在一個特定實施方案中，與細胞存活性、顆粒胞吐作用和酶活性相容的培養基是25mM Hepes pH = 7，4 ；130mM NaCl 5，65mM KCl ；1, 2mM KH2P04 ；0, 6mM MgCl2 ；1, 8mMCaC12 ；0，I %葡萄糖和0，I %牛血清清蛋白。在一個優選的實施方案中，用于檢測混合的報道分子的酶活性的方法選自FRET或時間分辨FRET。例如,Biosearch Technologies (生物探索技術)已經開發了高效粹滅劑，以商標BHQsup.TM或Blackhole粹滅劑銷售，而Anaspec已經開發了 QXLsup.TM粹滅劑和PerkinElmer QSYsup._粹滅劑。為了使成對的猝滅劑_熒光團有效，熒光團的發射熒光譜必須與猝滅劑的吸收譜重疊。數種成對熒光團-猝滅劑可以混合，以通過組合熒光團形成多重反應，所述熒光團的熒光發射譜不重疊或最小重疊。在另一個實施方案中，不同報道分子酶的活性通過熒光和發光法的組合來檢測。C.本發明基于細胞的傳感器的應用本發明的基于細胞的傳感器通常有效用于測試至少兩種分子之間的相互作用，其中一種擔當胞吐作用調節劑且另一種作為胞吐作用調節劑的特異性配體。例如，在藥物發現中，針對靶標測試數千或甚至數百萬小分子，從而發現改變該靶標活性的小分子。在特定實施方案中，篩選化合物，以獲得G-蛋白偶聯受體(即一種高度可藥用受體類型)的激動齊喊拮抗齊U。但是相同傳感器在檢測和定量調節顆粒胞吐作用的化合物，例如，在例如食品工業、環境樣品和用于診斷的數種樣品中的藥物濫用中具有應用。該傳感器的應用不局限于細胞表面受體或表面受體的小調節劑。例如，使用結合待測蛋白的成對的兩個分子，通過利用本發明的傳感器可以進行快速、特異性且靈敏檢測，條件是結合待測蛋白的分子中的一個是特異性免疫球蛋白E且另一個結合待測蛋白的分子誘導待測蛋白的寡聚化。以上傳感器的其他應用是用于測試抗變應性化合物和用于檢測變應原。D.用于測試化合物是否調節胞吐作用的試劑盒本發明還包括用于測試化合物是否調節胞吐作用的試劑盒。該試劑盒至少包括:具有專職受控胞吐作用的造血細胞系，其使用在合適啟動子的控制下的異源蛋白酶報道分子來轉染，和用于檢測分泌的異源蛋白酶報道分子的特異性底物。另外，具有專職受控胞吐作用的造血細胞系可以使用在合適啟動子，如GPCR、異源Fe Y I受體或異源Fe ε I受體的控制下的異源性胞吐作用調節劑來轉染，或可以使用內源性胞吐作用調節劑如內源性Fce受體I (IgE受體)。使用IgE受體作為胞吐作用調節劑的試劑盒可以包括特異于待測分析物的IgE和用于誘導與IgE結合的分析物的寡聚化的第二分子。
實施例現在參考下述實施例描述本發明。這些實施例僅是為舉例說明的目的提供，并且本發明絕不應該解釋為限于這些實施例，相反應該解釋為包括因本文提供的教導而變得顯而易見的任意的和所有的變化。盡管出于描述的目的已經在本文中描述了具體的實施方案，但是本領域技術人員應該理解可以在不背離如在附上的權利要求中所述的發明的前提下進行各種細節變化。下述表格描述實施例中所用的顆粒存儲的蛋白酶報道基因的總結。表1-.用于本發明的方法的顆粒存儲的報道分子的實例
權利要求
1.基于細胞的傳感器，其包括: a具有分泌顆粒的專職受控胞吐作用的造血細胞系， b蛋白酶報道分子，其轉染到(a)所述細胞系中，存儲在所述細胞系的分泌顆粒中， c (a)所述細胞系的分泌顆粒的受控胞吐作用的內源性調節劑或轉染的異源性調節劑， d用于檢測所述分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子的特異性底物。
2.權利要求1的基于細胞的傳感器，其中所述具有分泌顆粒的專職受控胞吐作用的細胞系是造血細胞系和/或它們的后代，其選自由髓樣細胞系組成的組，或選自由淋巴樣細胞系組成的組，所述髓樣細胞系包括單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、紅細胞、巨核細胞、血小板和樹突細胞，所述淋巴樣細胞系包括T-細胞、B-細胞和NK-細胞。
3.權利要求1-2的基于細胞的傳感器，其中所述細胞選自由以下各項組成的組:大鼠嗜堿性白血病細胞系RBL-2H3、小鼠骨髓造血細胞系32D、天然殺傷細胞系人NK92細胞系、天然殺傷細胞系人YT細胞系和小鼠肥大細胞小鼠MC/9細胞系。
4.權利要求1-3的基于細胞的傳感器，其中所述胞吐作用調節劑是多肽，所述多肽在被活化或抑制時誘導胞內鈣、cAMP、二酰甘油(DAG)磷脂或ATP水平變化，其轉而控制或調節鈣觸發的胞吐作用。
5.權利要求1-4的基于細胞的傳感器，其中所述受控分泌顆粒胞吐作用調節劑是內源性表面受體或轉染的異源性表面受體。
6.權利要求5的基于細胞的傳感器，其中所述表面受體選自由以下各項組成的組:G-蛋白偶聯受體(GPCR)、攜帶ITAM基序的受體、攜帶ITIM基序的受體和蛋白酪氨酸激酶受體。
7.權利要求1-6的基于細胞的傳感器，其中所述受控分泌顆粒胞吐作用調節劑是嵌合受體，其包括:(a)具有配體結合結構域的胞外區和(b)包含ITAM序列的Fe受體的至少跨膜和胞內區，用于在胞外區配體結合誘導受體寡聚化之后增加胞內鈣。
8.權利要求1-7的基于細胞的傳感器，其中穩定轉染至所述細胞系中并存儲在所述分泌顆粒中的蛋白酶報道分子是多肽，所述多肽對造血細胞顆粒內部的蛋白質水解和低pH環境具有抗性。
9.權利要求8的基于細胞的傳感器，其中穩定轉染至所述細胞系中的、由分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子是絲氨酸蛋白酶。
10.權利要求9的基于細胞的傳感器，其中絲氨酸蛋白酶選自由天然存儲在造血細胞顆粒中的絲氨酸蛋白酶組成的組，包括具有在天冬氨酸后切割的天冬裂酶樣活性的酶；具有在苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸后切割的胃促胰酶-樣活性的酶；具有在賴氨酸或精氨酸后切割的類胰蛋白酶-樣活性的酶或具有在纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸或半胱氨酸后切割的彈性蛋白酶-樣活性的酶。
11.權利要求8-10的基于細胞的傳感器，其中所述絲氨酸蛋白酶是選自由以下各項組成的組的粒酶:人粒酶A、B、H、K和M、鼠粒酶A、B、C、D、E、F、G、K、M、L和N ;牛粒酶B、黑猩猩粒酶B、短尾負鼠粒酶B和馬粒酶B。
12.權利要求8-10的基于細胞的傳感器，其中所述絲氨酸蛋白酶選自人胃促胰酶、人組織蛋白酶G、人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和人蛋白酶3。
13.權利要求1-12的基于細胞的傳感器，其中所述顆粒存儲的蛋白酶報道分子是來自人、大鼠、黑猩猩和/或馬物種的粒酶B，且用于檢測報道分子胞吐作用的底物包括處于P4的選自異亮氨酸或纈氨酸的氨基酸；處于P3的選自谷氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸的氨基酸；處于P2的選自脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、谷氨酸、甘氨酸或組氨酸的氨基酸，和處于Pl的天冬氨酸。
14.權利要求13的基于細胞的傳感器，其中所述底物還包括處于Pl'的選自纈氨酸、絲氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的不帶電氨基酸和處于P2'的選自絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酸的氨基酸。
15.權利要求13-14的基于細胞的傳感器，其中所述底物包括以下序列:處于P4的異亮氨酸、處于P3的谷氨酸、處于P2的脯氨酸或蘇氨酸；處于Pl的天冬氨酸；處于Pl'的絲氨酸和處于P2的甘氨酸或亮氨酸。
16.權利要求1-12的基于細胞的傳感器，其中所述顆粒存儲的蛋白酶報道分子是人、大鼠和/或小鼠物種的粒酶A，且用于檢測報道分子胞吐作用的底物包括處于P4的選自異亮氨酸、纈氨酸或甘氨酸的氨基酸；處于P3的選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的氨基酸；處于P2的選自天冬酰胺或苯丙氨酸的氨基酸；處于Pl的精氨酸或賴氨酸；處于Pl'的長線性疏水性氨基酸諸如脂肪族側鏈的賴氨酸和甲硫氨酸，或無支鏈疏水性氨基酸如丙氨酸或極性殘基如絲氨 酸；和處于P2的選自纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸。
17.權利要求1-12的基于細胞的傳感器，其中所述顆粒存儲的蛋白酶報道分子是人胃促胰酶，且用于檢測報道分子胞吐作用的底物包括處于P4的選自甘氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸的氨基酸；處于P3的選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或谷氨酸的氨基酸；處于P2的選自天冬酰胺、絲氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸或纈氨酸的氨基酸；處于Pl的酪氨酸或苯丙氨酸；處于Pl'的絲氨酸或甘氨酸；處于P2的選自天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸或甘氨酸的氨基酸和處于P3的選自纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸或甘氨酸的氨基酸。
18.權利要求1-12的基于細胞的傳感器，其中所述顆粒存儲的蛋白酶報道分子是人、大鼠和小鼠物種的蛋白酶3，且用于檢測報道分子胞吐作用的底物包括處于P4的具有小脂肪族殘基的氨基酸如纈氨酸和丙氨酸；處于P3的具有小脂肪族殘基的氨基酸如丙氨酸和纈氨酸；處于P2的選自天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和賴氨酸的帶電氨基酸；處于Pl的選自半胱氨酸、正纈氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸；處于Pl'的選自精氨酸和賴氨酸的帶正電氨基酸或具有小脂肪族殘基的氨基酸如丙氨酸或纈氨酸；和處于P2'的選自天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺的氨基酸。
19.權利要求1-12的基于細胞的傳感器，其中所述顆粒存儲的蛋白酶報道分子是人、大鼠和小鼠物種的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶，且用于檢測報道分子胞吐作用的底物包括處于P4的脯氨酸或具有小脂肪族殘基的氨基酸如纈氨酸和丙氨酸；處于P3的具有小脂肪族殘基的氨基酸如丙氨酸和纈氨酸或選自天冬氨酸和谷氨酸的帶負電氨基酸；處于P2的具有小脂肪族殘基的氨基酸如丙氨酸和纈氨酸或選自天冬氨酸和谷氨酸的帶負電氨基酸；處于Pl的選自異亮氨酸、正纈氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的疏水性或極性氨基酸；處于Pl'的疏水性或極性或帶負電氨基酸和處于Ρ2的疏水性或帶負電氨基酸。
20.獲得權利要求1-19的生物傳感器的方法，其包括使用載體轉化權利要求2-3中的造血細胞系，所述造血細胞系攜帶權利要求4-6中的受控分泌顆粒胞吐作用的內源性調節齊U，所述載體在合適啟動子控制下編碼權利要求8-19中的分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子。
21.獲得權利要求1-19的生物傳感器的方法，其包括使用在合適啟動子控制下表達權利要求4-7中的受控分泌顆粒胞吐作用調節劑的載體和在合適啟動子控制下編碼權利要求8-19中的分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子的載體轉化權利要求2-3中的造血細胞系。
22.權利要求21的方法，其中編碼權利要求4-7中的受控分泌顆粒胞吐作用調節劑的載體也包含用于細胞表面受體表達的信號肽，和/或用于陽性細胞的表面檢測和/或分離的標簽。
23.權利要求21的方法，其中用于受控分泌顆粒胞吐作用調節劑的組成型表達的啟動子選自由以下各項組成的組:人或小鼠延伸因子l-α啟動子(hEFla)(SEQ ID ΝΟ:1)、來自人(hPGK)、小鼠和大鼠物種的磷酸甘油酸激酶啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子(SEQID NO:2)和來自莫洛尼鼠白血病病毒啟動子的5^ LTR即MoMLV-5' LTR(SEQ ID NO:3)。
24.權利要求21的方法，其中用于表達受控分泌顆粒胞吐作用調節劑的啟動子是誘導型啟動子。
25.權利要求24的方法，其中所述誘導型啟動子選自由以下各項組成的組:四環素誘導型啟動子、蛻皮素誘導型啟動子、cumate誘導型啟動子和孕酮誘導型啟動子。
26.權利要求21-25的方法，其中用于表達受控分泌顆粒胞吐作用調節劑的載體包含用于表面過表達的糖基化序列。
27.權利要求26的方法，其中所述糖基化序列包含SEQID NO:4。
28.權利要求21-27的方法，其中用于受控分泌顆粒胞吐作用調節劑組成型表達的載體是 P-MoMLV-5' LTR-SP-cmyc-標簽-VGS-MCS-polyA (SEQ ID NO:5)。
29.權利要求20-21的方法，其中編碼分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子的載體包含天然存在的序列或密碼子優化序列以用于在造血細胞系中高表達。
30.權利要求20-29的方法，其中表達顆粒存儲的蛋白酶報道分子的啟動子選自由中等至強蛋白表達啟動子組成的組。
31.權利要求30的方 法，其中所述啟動子選自由以下各項組成的組:hCMV和MoMLV-5' -LTR啟動子的嵌合啟動子(SEQ ID NO:10) ；MoMLV-5; LTR啟動子(SEQ ID NO:3);延伸因子l-α啟動子(SEQ ID NO: I) ;RSV啟動子(SEQ ID NO:2);人巨細胞病毒啟動子和胸苷激酶啟動子。
32.權利要求20-29的方法，其中所述顆粒存儲的報道分子在誘導型啟動子控制下表達。
33.權利要求32的方法，其中所述誘導型啟動子選自由以下各項組成的組:四環素誘導型啟動子、蛻皮素誘導型啟動子、cumate誘導型啟動子和孕酮誘導型啟動子。
34.測試至少兩個分子之間相互作用的方法，一個分子擔當胞吐作用調節劑且另一個分子擔當所述胞吐作用調節劑的特異性配體，所述方法包括以下步驟: a)在與細胞存活、胞吐作用和分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子的酶活性相容的培養基中溫育權利要求1-19的基于細胞的傳感器， b)添加胞吐作用調節劑的特異性配體， c)添加顆粒存儲的蛋白酶報道分子的特異性底物，和 d)使用被釋放報道分子的特異性底物檢測被釋放報道分子多肽(由顆粒釋放至胞外培養基中)的酶活性。
35.權利要求34的方法，其中測試所述相互作用在單重或多重測定中進行。
36.權利要求34-35的方法，其中分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子的酶活性利用細胞不能透過的底物來測量，所述細胞不能透過的底物選自由以下各項組成的組:比色底物、熒光底物、FRET底物、時間分辨-FRET底物或發光底物。
37.權利要求36的方法，其中檢測顆粒分泌的蛋白酶通過發光測量法，使用肽-修飾的熒光素底物來進行。
38.權利要求37的方法，其中熒光底物是基于羅丹明110的蛋白酶底物，其由與羅丹明IlO(RllO)的各氨基共價連接的特定肽組成，在酶切割時，非熒光雙酰胺底物以兩步過程進行轉化，首先轉化成熒光單酰胺和然后轉化成甚至更多的熒光Rl 10。
39.權利要求38的方法，其中檢測顆粒分泌的蛋白酶通過405nm處的比色法檢測，利用C-末端偶聯P-硝基苯胺(pNA)的蛋白酶特異性肽底物進行；或通過具有380nm處激發和460nm發射波長的熒光，利用C-末端偶聯7-氨基-4-甲基香豆素的蛋白酶特異性肽底物進行；或通過具有400nm處激發和505nm處發射的熒光，利用C-末端偶聯7-氨基-三氟甲基香豆素的蛋白酶特異性肽底物進行。
40.權利要求34-35的方法，其中檢測分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子的活性包括產生用于信號放大的酶促級 聯，其中報道分子分泌的蛋白酶的活性通過由所述分泌的蛋白酶激活的酶原來檢測。
41.權利要求40的方法，其中用于人、大鼠、黑猩猩或馬粒酶B檢測的酶原是突變的人胱天蛋白酶原3 JBSEQ ID ΝΟ:11所示。
42.權利要求40-41的方法，其中由分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子激活的酶原的酶活性利用細胞不能透過的底物來測量，所述細胞不能透過的底物選自由以下各項組成的組:比色底物、熒光底物、FRET底物、時間分辨-FRET底物或發光底物。
43.權利要求40的方法，其中所述酶原是環狀排列變換的酶，其缺乏酶活性，除非被分泌顆粒存儲的蛋白酶報道分子激活。
44.權利要求1-19的基于細胞的傳感器用于確定與成對的兩個分子結合的蛋白的應用，其中與待確定的蛋白結合的分子中的一個是特異性免疫球蛋白G、或特異性免疫球蛋白E、或特異性免疫球蛋白A，且與待確定的蛋白結合的第二個分子在結合時誘導待確定蛋白的寡聚化。
45.權利要求1-1944的基于細胞的傳感器的應用，其用于測試藥物發現中分子間相互作用或用于定量分子諸如蛋白以用于診斷或檢測食品工業樣品中、環境樣品中和制藥工業中的藥物或分子或用于測試IgE-變應原相互作用，用于測試抗變應性化合物和/或用于檢測變應原。
46.權利要求1-19的基于細胞的傳感器在單重測定中的應用，其中僅一個基于細胞的傳感器包含在單一反應器中，并且其中在特異性配體與胞吐作用調節劑反應后僅檢測一種顆粒存儲的蛋白酶報道分子。
47.權利要求1-19的基于細胞的傳感器在多重測定中的應用，其中至少兩個不同的基于細胞的傳感器包含在單一反應器中，每個具有不同的成對的胞吐作用調節劑-顆粒存儲蛋白酶報道分子，并且其中在至少兩種不同的特異性配體分別與不同的胞吐作用調節劑反應后檢測至少兩種不同的顆粒存儲的蛋白酶報道分子。
48.用于測試化合物是否調節胞吐作用的試劑盒，其包括權利要求1-19的基于細胞的傳感器。
49.根據權利要求48的試劑盒，其包括至少一種用于檢測分泌的異源性蛋白酶報道分子的特異性底物。
50.根據權利要求48-49的試劑盒，其中所述基于細胞的傳感器包括IgE、IgG或IgA受體，作為待確定的分析物的胞吐作用調節劑，和第二分子，其用于誘導與IgE、IgG或IgA結合的分析物的寡聚化 。
全文摘要
本發明涉及在藥物發現中有用的新的基于細胞的傳感器，所述基于細胞的傳感器包括具有分泌顆粒的專職受控胞吐作用的細胞系，所述細胞系用作為報道分子多肽的存儲在具有專職受控胞吐作用的細胞系的受控分泌顆粒中的蛋白酶轉染，并具有作為受控分泌顆粒胞吐作用調節劑的內源或異源分子，所述顆粒存儲的蛋白酶報道分子至少具有針對顆粒內已經存在的條件諸如低pH和其他蛋白酶的蛋白水解作用的高度抗性；胞吐作用后的酶活性；高度特異性切割序列；在無刺激或基礎條件下非常低的分泌水平；和在與細胞培養物生存力和顆粒胞吐作用相容的培養基中高信號與背景活性比，以獲得高通量的可靠且靈敏的檢測。
文檔編號G01N33/50GK103154731SQ201080068285
公開日2013年6月12日 申請日期2010年7月28日 優先權日2010年7月28日
發明者埃利耶·帕斯-羅哈斯, 瑪麗亞·德·格拉西亞·蒙特羅-佩尼亞爾沃, 韋羅妮卡·馬庫拉達·盧納-格雷羅, 費·伊莎貝爾·加西亞·馬塞拉, 何塞·安德列斯·莫拉萊斯-馬丁內斯, 塔尼亞·加西亞·馬塞拉, 安娜·貝倫·阿拉貢-戈麥斯, 安娜·克薩達-莫利納, 奧羅拉·瑪麗亞·馬克斯-莫拉萊斯 申請人:坎瓦克斯生物技術公司