專利名稱：在非競爭性免疫測定中減少白細胞干擾的制作方法
技術領域：
本發明涉及在用于利用非競爭性免疫測定法測定分析物在血液樣品中的存在或濃度的裝置和方法中減少或消除來自血沉棕黃層(buffy coat)組分、特別是白細胞的干擾。具體地，本發明涉及通過用受調理素作用的消耗珠(sacrificial bead)和類似地受調理素作用的組件修正(amend)血液樣品來減少或消除白細胞免疫傳感器干擾。
背景技術：
為了診斷、篩選、疾病分期、法醫分析、妊娠測試、藥物檢測以及其它原因，會對生物樣品進行許多目標分析物的實驗室免疫測定測試。雖然少數定量測試例如妊娠測試已被簡化成用于患者在家中使用的簡單試劑盒，但大部分定量測試仍然需要經訓練的專業技術人員在實驗室環境中使用復雜儀器進行。實驗室測試增加了分析成本并且延遲了結果。在許多情況下，延遲可能對患者的病況或預后(例如表示心肌梗塞和心力衰竭的標志物的分析)有害。在此類和類似危急情況下，有利地是在及時現場護理(point-of-care)時準確、便宜地并且以最短延遲進行此類分析。許多類型的免疫測定裝置和方法已進行了描述。一種用于成功地測量血液樣品中的分析物的一次性傳感設備由Lauks在美國專利No. 5，096, 669中公開。其它設備由Davis等人在關于凝血時間的美國專利No. 5，628，961和5，447，440中公開。這些設備使用讀數裝置和適合讀數裝置的筒(cartridge)以測量作為時間函數的血液樣品中分析物的濃度和粘度的改變。將美國專利Nos. 5，096，669,5, 628，961和5，447，440通過引用整體并入本文。US 20060160164描述了利用免疫參考電極的免疫測定設備，US 20050054078描述了利用改進的樣品封閉(sampleclosure)的免疫測定設備，US 20040018577描述了多重雜交免疫測定(multiple hybrid immunoassay), US 20030170881 (授權為 US 7，419，821)描述了用于分析物測量和免疫測定的裝置和方法，全部所述專利是共同擁有的并且通過引用并入本文。非競爭性兩位點免疫測定法(Non-competitivetwo-site immunoassay)(也稱為夾心型免疫測定法)通常用于測定生物測試樣品中的分析物濃度，用于例如由AbbottPoint of Care Inc.開發為i-Stat 系統的及時現場分析物檢測系統。在典型的兩位點酶聯免疫吸附測定(ELISA)中，將一種抗體結合至固體載體上以形成固定或捕捉抗體，并且將第二種抗體綴合至或結合至信號產生性試劑例如酶以形成信號或標記抗體。在與包含待測量的分析物的樣品反應后，分析物被“夾”在固定抗體與信號抗體之間。在清洗掉樣品和任何非特異性結合的試劑后，測量保留在固體載體上的信號抗體的量，該量應當與樣品中的分析物的量成比例。電化學檢測也已被用于免疫測定，在所述電化學檢測中分析物的結合直接或間接引起與電極相鄰的電活性物質種類的活性改變。關于電化學免疫測定的綜述，參見Laurell等人，Methods in Enzymology,第 73 卷，〃Electroimmunoassay〃，Academic Press, NewYork, 339，340, 346-348(1981)。在電化學免疫傳感器中，分析物與其同源抗體的結合產生了電極上的電活性物質種類的活性改變，所述電極處于適當的電化學電勢下以引起電活性物質種類的氧化或還源。存在許多用于滿足這些條件的設置。例如，可將電活性物質種類直接附著至分析物，或可將抗體共價地連接至從無電活性底物產生電活性物質種類或破壞電活性底物的酶。參見，M. J. Green(1987)Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 316 :135-142。差分安培測量(differentialamperometrie measurement)的概念在電化學領域是公知的。參見，例如，共同擁有的Cozzette美國專利No. 5，112，455，通過引用整體并入本文。此外，差分安培傳感器組合的形式公開于共同擁有的Cozzette美國專利No. 5，063，081。該專利還公開了選擇性滲透層用于電化學傳感器的用途以及成膜乳膠用于固定生物活性分子的用途，通過引用并入本文。聚(乙烯醇)(PVA)在傳感器制造中的用途描述于美國專利No. 6，030，827 (通過引用并入本文)。Vikholm (U. S. 2003/0059954A1)教 導了直接連接至具有生物分子排斥涂層例如PVA的表面、抗體之間空隙中的表面的抗體，Johansson (美國專利No. 5，656，504)教導了具有固定在其上的抗體的固相例如PVA。美國專利No. 6，030, 827和6，379，883教導了用于形成聚(乙烯醇)層的方法，所述專利通過引用整體并入本文。如在本領域內是公知的，免疫測定易遭受各種形式的干擾。例如共同擁有的在審的美國申請12/411，325闡述了通過將IgM包括在IgG試劑混合物中來減小嗜異性抗體的干擾。將‘325申請通過引用整體并入本文。隨著免疫測定技術不斷地被改造以適合進入及時現場護理測試市場，將全血用作測試介質相對于血漿和血清已得到增加，血漿和血清通常用于中心實驗室測試。這顯然意味著紅細胞和血沉棕黃層成分(例如白細胞和血小板)存在于測定介質中。已發現在某些測定中，可針對白細胞有效地對不同的測定組分例如珠子和電極表面進行調理作用。注意，對于電極表面，為了基于超氧離子的電化學檢測而觀察人嗜中性粒細胞的呼吸爆發，Hill 等人(FEBS 191，257-263，1985)利用人 IgG 對微伏安電極(microvoltammetricelectrode)進行調理作用。先前提及的US 20060160164( ‘ 164申請)論述了電化學免疫傳感器和全血與血漿之間的偏差(bias);以及，標志物例如肌鈣蛋白等的免疫測定通常被測量和報告為血漿或血清值。其提及當將這些免疫傳感器用于分析全血時，需要使用用于消除偏差的校正因子或方法。其說明該偏差的某些方面可被消除，包括與血沉棕黃層(其由白細胞和血小板組成)的組分相關的全血電化學免疫測定中的偏差，以及還有與樣品之間的血細胞比容(hematocrit)差異相關的偏差。本領域技術人員公認血沉棕黃層是當將血液離心時在紅細胞上方形成的一層白細胞和血小板。在‘164申請中，還觀察到在具有涂覆了分析物抗體例如肌鈣蛋白抗體的珠子的免疫傳感器上發生白細胞干擾。對照實驗顯示該正偏差不存在于血漿樣品和其中已除去血沉棕黃層的血液樣品中。因此，白細胞似乎能夠粘附至免疫傳感器并且促進酶標記的抗體的非特異性結合，所述抗體甚至在洗滌步驟后仍然保持結合。在該公開內容中顯示該偏差可通過在珠子制備過程中將少量抗體添加至人血清白蛋白來部分消除。因此，當樣品與修飾的珠子接觸時，來自樣品的白蛋白快速包被珠子，并且一旦它們被一層天然白蛋白包被，白細胞就不應當將珠子識別為受調理作用的表面。‘164申請還描述了對白細胞干擾問題的另一個解決方法，其中通過使血液樣品的鹽濃度從約140mM的正常鈉離子濃度增加至高于約200mM，優選增加至約230mM來消除該偏差。人們相信，解釋減少的干擾的機制可能是鹽引起白細胞的滲透皺縮。該解釋與白細胞受損的與顯露的免疫傳感器相互作用的能力一致。然而，很明顯在至少下列領域仍然需要用于減少白細胞活性在免疫測定中的額外的微小效應的改進的方法(i)免疫傳感器干擾，最明顯地在及時現場護理測試的情景中，
(ii)電化學免疫測定，(iii)與免疫-參考傳感器結合的免疫傳感器的使用，(iv)全血免疫測定，(V)基于一次性使用的筒的免疫測定，(Vi)僅使用單一洗滌步驟的非相繼免疫測 定,和(vii)干試劑涂層。發明概述本發明涉及用于減少或消除白細胞干擾、尤其是非競爭性免疫測定中的白細胞干擾的試劑盒、筒(cartridge)和方法。根據本發明的不同實施方案，可以通過使用針對白細胞進行了調理作用的消耗珠子來減少或消除白細胞干擾。白細胞優先吞噬所述消耗珠子，從而減少白細胞干擾。例如，在一個實施方案中，本發明是用于對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行夾心式免疫測定的試劑盒，包括針對白細胞進行了調理作用的消耗珠子、針對分析物的固定的第一抗體和針對分析物的標記的第二抗體。在另一個實施方案中，本發明是用于對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行夾心式免疫測定的筒，所述筒包括(a)接收血液樣品的樣品入口 ；(b)用于計量血液樣品以形成計量樣品的計量室；(C) 一個或多個包含針對白細胞進行了調理作用的消耗珠子和針對分析物的標記的抗體的干試劑涂層；(d)包含針對分析物的固定抗體的電極；和(e)用于將計量樣品、流態化的消耗珠子和標記的抗體移至電極的一個或多個泵件。 在另一個實施方案中，本發明是對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行夾心式免疫測定的方法，包括(a)將懷疑含有分析物的血液樣品暴露于針對白細胞進行了調理作用的消耗珠子、針對分析物的固定的第一抗體；和標記的第二抗體以形成包含所述第一抗體、所述分析物和所述第二抗體的復合物；和(b)測定復合的標記物的量。在一個方面，(i)將血液樣品與消耗珠子混合，隨后與固定的第一抗體混合，隨后與標記的第二抗體混合。在另一個方面，在大體上相同的時間將血液樣品與消耗珠子、固定的第一抗體和標記的第二抗體混合。在另一個方面，在大體上相同的時間將血液樣品與固定的第一抗體和標記的第二抗體混合。在另一方面，在將血液樣品與固定的第一抗體混合之前，在大體上相同的時間將血液樣品與消耗珠子和標記的第二抗體混合。在另一個實施方案中，本發明是顯著減少白細胞在分析物免疫傳感器(所述傳感器包含固定在電極上的針對分析物的抗體涂覆的珠子)上積累的方法，所述方法包括步驟(a)將懷疑包含分析物的樣品與消耗珠子接觸以形成修正的樣品，其中樣品中的白細胞優先吞噬消耗珠子，和(b)將修正的樣品與免疫傳感器接觸。在另一個實施方案中，本發明涉及對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行免疫測定的方法，包括(a)將懷疑包含分析物的血液樣品與過量消耗珠子混合以形成修正的樣品，其中樣品中的白細胞優先吞噬消耗珠子；(b)將修正的樣品與包含固定在電極上的針對分析物的抗體涂覆的珠子的免疫傳感器接觸，在所述抗體-涂覆的珠子、所述分析物和第二標記抗體之間形成夾心；(C)從所述免疫傳感器洗滌所述血液樣品；和(d)使用所述免疫傳感器測定所述夾心式標記物的量和使所述標記物的量與樣品中的分析物的濃度相關聯。在另一個實施方式中，本發明是用于對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行夾心式免疫測定的方法，包括(a)將懷疑包含分析物的血液樣品與過量的進行了調理作用的消耗珠子混合以形成修正的樣品，其中樣品中的白細胞優先吞噬消耗珠子；(b)將修正的樣品與針對分析物的抗體涂覆的珠子在有效地在所述抗體涂覆的珠子、所述分析物和第二標記抗體之間形成夾心的條件下接觸；(C)從所述抗體涂覆的珠子洗滌所述血液樣品；和
(d)測定所述夾心式標記物的量并使所述標記物的量與樣品中的分析物的濃度相關聯。對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行免疫測定的測試筒，所述測試筒在導管中包含免疫傳感器，所述免疫傳感器具有針對分析物的固定的第一抗體，所述導管具有布置在其中的干試劑涂層，所述干試劑涂層包含消耗珠子和針對所述標記物的第二標記的抗體并且被構造為溶解于所述血液樣品中。在上述實施方案中，血液樣品優選是全血樣品，任選地利用抗凝劑修正。分析物優選選自 BNP、proBNP、NTproBNP, cTnl、TnT、HCG, TSH、PSA、D- 二聚體、CRP、肌紅蛋白、NGAL,CKMB和髓過氧化物酶。例如，消耗珠子可包含利用非人IgG或其片段涂覆的基底珠子。所述基底珠子可以由選自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成。在一些其它方面，消耗珠子包括利用選自蛋白質、細菌、病毒和異型生物質(xenobiotic)的材料或其片段涂覆的基底珠子。在另一個實施方式中，消耗珠子是經穩定的細菌或細菌孢子。消耗珠子優選具有0. 01 ii m至20 ii m例如0. I U m至5 U m的平均粒度,理想地，以足以提供每微升樣品至少104個珠子的溶解的消耗珠子濃度的量存在。消耗珠子和第二標記抗體可以存在于一個或多個可溶解的干試劑涂層中，所述涂層可以例如布置于計量室內。所使用的固定的第一抗體優選附著至傳感器，所述傳感器選自安培計電極(amp erome trie electrode)、電位測定電極(potentiometric electrode)、電導測定電極(conductimetric electrode)、光波導(optical wave guide)、表面等離子體共振傳感器(surface plasmon resonance sensor)、聲波傳感器和壓電式傳感器。例如，固定的第一抗體可以連接至測定珠子，然后測定珠子可以連接至安培計電極。任選地，所述標記的第二抗體用選自放射性標記物、酶、生色團、熒光團和化學發光物質種類的標記物標記分析物。標記的第二抗體用酶標記，所述酶優選選自堿性磷酸酶、葡萄糖苷酶、黃遞酶、辣根過氧化物酶和葡萄糖氧化酶。附圖概述本發明的這些和其它目的、特征和有利方面描述于下列特定實施方案的詳細說明中并且在下列圖中進行了顯示，其中圖I是免疫傳感器筒蓋的等軸俯視圖；圖2是免疫傳感器筒蓋的等軸仰視圖3是免疫傳感器筒的帶墊圈(tape gasket)的布局的俯視圖；圖4是免疫傳感器筒底座的等軸俯視圖；圖5是免疫傳感器筒的布局的圖解視圖；圖6是免疫傳感器筒內的流體和空氣路徑的圖解視圖，包括用干試劑修正流體的位置； 圖7顯示包括IgM的電化學免疫傳感器的操作原理；圖8是未按比例繪制的具有抗體標記的顆粒的電化學免疫傳感器的構造的側視圖；圖9是免疫傳感器筒的電導測定電極和免疫傳感器電極的掩模(mask)設計的俯視圖；
圖10顯示包括針對白細胞進行了調理作用的消耗珠子的電化學免疫傳感器的操作原理；圖11 (a)顯示具有正斜率輸出信號的BNP筒的意外波形，圖11 (b)顯示具有負斜率輸出信號的BNP筒的意外波形。圖11(c)顯示對于低分析物濃度具有接近零斜率的正常反應，圖11(d)顯示僅在高分析物濃度時預期負斜率，其中測量可變成基底限制的而非酶限制的。圖12顯示在(a)正常樣品和(b)異常血沉棕黃樣品上進行的洗滌步驟中氧化電極脈沖的效應；圖13是電活性物質種類的酶促再生的示意圖；圖 14 顯不區段形成法(segment forming means)；圖15是免疫傳感器筒的優選實施方案的俯視圖；圖16是免疫傳感器筒的優選實施方案的流控技術(fIuidics)的圖解視圖；圖17(a)和(b)顯示在消耗珠子在樣品中(a)不存在和(b)存在的情況下在高棕黃(high buffy)樣品中的BNP的測定后免疫傳感器的顯微照片；圖18顯不具有用于關閉關閉位直(closed position)中的樣品進入端口的可滑動密封組件的筒設備；圖19顯示具有用于關閉開口位置中的樣品進入端口的滑動密封組件的筒設備；圖20顯示在分析過程中發生的信號產生反應(a)利用堿性磷酸酶切割底物以產生電活性對-氨基苯酚和(b)對-氨基苯酚的氧化；圖21顯示在高棕黃(左圖框)和正常全血(右圖框)樣品中對于免疫傳感器斜率的影響的圖形數據試劑中摻入了(亞批2和3)和未摻入(亞批I)消耗微粒；圖22(a)和(b)顯示圖17(a)和(b)中的相關免疫傳感器的顯微照片的分析儀波形；和圖23顯示不充分的洗漆(poor washing)(不能用分析流體替換傳感器結構內的樣品流體)對安培計波形的影響。發明詳述本發明涉及減少或消除因白細胞的存在而引起的干擾的增強的方式。在優選實施方案中，本發明可用于下列領域的一個或多個領域(i)免疫傳感器，最明顯地在及時現場護理測試的情景中，(ii)電化學免疫測定，(iii)與免疫-參考傳感器結合的免疫傳感器的用途，(iv)全血免疫測定，(V)基于一次性使用的筒的免疫測定，(Vi)僅具有單一洗滌步驟的非相繼免疫測定和(Vii)干試劑涂層。值得注意地，雖然上述的US20060160164基于在免疫傳感器上添加抗人血清白蛋白抗體涂層和向測定介質添加鹽解決了與白細胞相關的某些干擾，但本說明書公開了與白細胞相關的偏差的其它來源，提供了用于減少所述干擾的新型解決方法。如將被本領域技術人員理解的一樣，此處公開的一般概念適用于許多免疫測定法和平臺。本發明允許使用筒快速原位測定分析物，所述筒具有分析物傳感器的陣列和用于將修正的樣品相繼呈遞至免疫傳感器或分析物陣列的裝置。在優選實施方案中，本發明用于經設計利用讀數設備來進行操作的筒，例如1992年3月17日授予Lauks等人的美國專利No. 5，096，669或2008年9月2日授予的美國專利No. 7，419，821 (將所述兩個專利通過引用整體并入本文)中公開的。本發明在該情景中得到最佳理解。因此，首先描述用于及時現場護理免疫測定系統的適當設備和操作方法，然后描述可使所述系統最好地適合在全血免疫測定中進一步減少或消除白細胞干擾的方法。用于本發明的消耗珠子可用于基于異質或勻質珠子的測定，以及用于非競爭性(夾心)免疫測定或競爭性免疫測定。在優選實施方式中，本發明用于異質的電化學免疫測 定，其是基于在電極表面或附近形成夾心。在另一個實施方式中，本發明用于勻質夾心免疫測定，其在流體介質內。因此，在該情景中，術語“異質的”和“勻質的”是指捕捉步驟。因此，對于勻質測定，捕捉步驟在流體介質中發生，然而在異質測定中，捕捉步驟在宏觀表面例如傳感器表面(以競爭性或非競爭性方式)上發生。在這類實例的每一個實例中，當在血液樣品中進行測定時，固定的測定珠子易受白細胞攻擊。在競爭性和非競爭性測定中，該效應可通過添加針對白細胞進行了調理作用的消耗珠子(優選地過量)來減小。在一個實施方案中，本發明涉及用于處理液體樣品以測定分析物在樣品中的存在或量的筒和方法。所述筒優選包含計量裝置(metering means)，其允許導入未計量體積的樣品，筒和其連接的讀數裝置通過該計量裝置處理計量的量。因此，使醫生或操作者在測量之前免除了手工測量樣品的體積，從而節省了時間、人工投入以及增加了準確性和重現性。在一個實施方案中，計量裝置包括連接有毛細管栓并且沿著其長度具有空氣進入點的延長的樣品室。在空氣進入點上施加的空氣壓力驅動計量體積的樣品通過毛細管栓。通過空氣進入點與毛細管栓之間的樣品室的體積預定計量的體積。筒可具有用于以氣密方式封閉樣品端口的關閉設備。該關閉設備優選相對于筒的主體是可滑動的并且提供了移除位于端口區域的任何過量樣品的剪切作用，從而可靠地封閉進入端口與毛細管栓之間的保持室(holding chambe)中的樣品的一部分。參見,例如，公布的美國專利申請US2005/0054078A1，將其完整內容通過弓I用并入本文。筒可以這樣密封例如，以將過量流體樣品從樣品口移除的方式將密封組件滑動地移動至筒的表面上，將一定體積的流體樣品封閉在內部流體樣品保持室內，并且抑制流體樣品過早地沖破內部毛細管栓。通過該滑動關閉設備獲得的密封優選是不可逆的并且防止過量血液被捕捉在筒中，因為關閉設備在口(血液通過其進入筒)的平面上移動并且提供將血液封閉在進入端口的平面下的剪切作用，從而將過量血液即口的平面上方的血液從進入端口移除以及任選地將其轉移至廢料室。一個示例性關閉設備示于圖I中并且包括罩子I的集成組件2、3、4和9。在該實施方案中，關閉設備2圍繞鉸鏈旋轉直至鉤3咬住閉鎖(shut)，從而封閉樣品進入端口 4。包括圖I中的罩子I的集成組件2、3、4和9的關閉設備的另一選擇顯示為圖18和19中的獨立滑動組件200。圖18和19顯示了包括圖I的罩子的改進形式的筒設備，其附著于與圖4中的底座相似的底座(所述底座具有圖3中顯示的插入粘附層(intervening adhesivelayer)和獨立的滑動關閉組件200)。圖19顯示了開口位置中的關閉設備200，其中樣品進入端口 4可接收樣品，例如血液。圖18顯示了關閉位置中的關閉設備200，其中其以氣密方式封閉樣品進入端口。在操作中，在已將樣品例如血液添加至進入端口并且其進入保持室34后，手工將組件200從打開位置推至關閉位置。在顯示的實施方案中，將進入端口的區域中的任何過量血液被移入溢流室201或相鄰的保留區域或腔。該室或區域可包括保留過量樣品例如血液的流體吸收墊或材料。樣品進入端口 4可以是環狀(如圖19中顯示的)或橢圓形的口，并且口的直徑通常在0. 2-5_，優選1-2_的范圍內，或具有1-15_(對于橢圓形)的周長。圍繞口的區域可選擇為疏水性或親水性的以控制施用的樣品的滴形，從而促進向進入端口內的進入。圖18和19中顯示的關閉設備的一個有利方面是其防止樣品被推送超出保持室34末端上的毛細管栓組件之外。少量樣品例如血液在毛細管栓之外的存在對于測量分析物的主要濃度的測試并不重要，因此其不依賴于樣品體積。然而，對于免疫測定應用(其中樣品的計量通常為有利的)，密封組件提高設備的計量準確性并且確保當分析儀在筒導管內推動樣品時，樣品的測定區段相對于免疫傳感器被適當地定位。在操作中，當將樣品例如血液添加至筒中時，其移動至毛細管栓。因此，當毛細管栓至樣品進入端口的區域即保持室34包含樣品時，存在用于測試的充足樣品。在填充保持室的過程中，一些樣品可保留在進入端口的口的平面上方。當將密封組件從打開移動至關閉位置時，進入端口上方的任何樣品被剪切掉而不在關閉行動中捕捉額外的樣品，從而確保樣品不移動至毛細管栓25之外。在優選實施方案中，密封組件200位于圖3的帶墊圈21的表面上方數千分之一英寸內。通過隨后使200的表面下降至粘性帶墊圈來封閉進入端 口，此時所述表面哨合鎖閉部件(locking feature) 212和213。由于所述帶是基本上不可壓縮的并且所述口的直徑小，因此被用戶施加至密封組件的任何不經意的壓力將不會使樣品移動至毛細管栓之外。在某些使用幾滴樣品的筒的實施方案中，不希望在保持室中形成氣泡，因為這可影響測定。因此，已開發了用于將超過一滴樣品例如血液導入保持室34而不產生氣泡的可靠方法。樣品進入端口可以被設計為接收多滴樣品，由于首先用電暈(Corona)和/或試劑混合物處理保持室，因此連續液滴不會在保持室34中引起捕獲的氣泡形成。對一次性醫療設備使用電暈處理在本領域是公知的，并且是增加實際上任何材料例如金屬化表面、箔、紙、紙板原料(paperboard stock)或塑料例如聚乙烯、聚丙烯、尼龍、乙烯樹脂(vinyl)、PVC和PET的表面活性的有效方法。該處理使得它們更易接收墨水、涂層和粘合劑。在實踐中，將待處理的材料暴露于放電或“電暈”。放電區域中的氧分子斷裂成原子并且結合至待處理的材料中的分子，從而導致化學活化的表面。用于電暈處理的適當設備是商購可得的(例如Corotec Corp.，Farmington, Conn.)。過程變量包括處理材料所需的功率的量、材料速度、待處理的面的寬度、數目以及具體材料對電暈處理的反應性，所述變量可由操作者確定。安裝電暈處理的常見位置與打印、涂覆或成層(laminating)過程成直線。另一種常見安裝是直接在吹塑薄膜(blown film)或鑄制薄膜(cast film)擠壓機上，因為新鮮材料更易接收電暈處理。如上所述，非競爭性(夾心)免疫測定形式是最廣泛使用的免疫測定法，并且其也是本文中論述的分析設備例如筒的優選形式。在該實施方案中，將一種抗體(固定的抗體)結合至固體載體或免疫傳感器上，將第二抗體(信號抗體)綴合/結合至信號產生性試劑例如酶，例如堿性磷酸酶。簡而言之，圖20顯示了在分析過程中發生的信號產生反應，圖20(a)顯示底物被堿性磷酸酶切割以產生電活性對-氨基苯酚，圖20(b)顯示對-氨基苯酚的氧化。圖20(a)中的反應在傳感器結構的上層發生而圖20(b)中的反應在金電極表面發生。圖20(a)中的插圖顯示堿性磷酸酶催化的水解的PH-依賴性。中間的圖描述了暴露于樣品之前的免疫傳感器結構的總體特征。
信號產生性試劑(例如，信號抗體)可以是分析設備中的干試劑涂層的一部分(如下文中描述的)，并且優選在樣品到達免疫傳感器之前溶解在生物樣品中。在洗掉樣品和非特異性結合的試劑后，保留在固體載體上的信號產生性試劑(例如，信號抗體)的量原則上應當與樣品中的分析物的量成正比。然而，此類測定構型的一個限制是對于由存在于血液樣品中的白細胞引起的干擾的易感性。雖然白細胞干擾可通過共同擁有的US 20060160164中公開的方法來緩解，但現已發現對于某些血液樣品，令人驚訝是，可通過添加與樣品均勻混合的消耗珠子(其中已針對白細胞特別地對所述珠子進行了調理作用)來顯著地減小或消除所述效應。優選利用從動物種類分離的非人IgG(IgG種類的免疫球蛋白)或其片段涂覆消耗珠子。如本文中所用，術語“片段”是指來源于指定分子的任何攜帶表位的片段。因此，IgG片段可包含例如攜帶表位的F(ab’)2或Fab片段或Fe片段。此外，關于“IgG或其片段”，其是指單獨的IgG、單獨的IgG片段(即，IgG的F(ab’)2片段、Fab片段和/或Fe片段中的一個或多個)或IgG和IgG片段的組合。可利用多個表面涂層達到期望的效果，只要對表面涂層進行了調理作用，或當與待測定的樣品接觸后所述表面涂層可經歷調理作用。在優選實施方案中，將消耗珠子摻入干試劑涂層，所述干試劑涂層在一些實施方案中可以是相同的干試劑涂層，其包含信號產生性試劑(例如，信號抗體)。因此，在一個實施方案中，分析設備包括干試劑涂層，所述涂層包含如下組分之任一或兩者(a)適合于緩解白細胞的效應的組分，例如用IgG或其片段涂覆的珠子，和/或(b)信號抗體。干試劑涂層可從試劑混合物形成，其優選還包含如下組分之任一和兩者(a)適合于緩解白細胞的效應的組分，例如用IgG或其片段涂覆的珠子，和/或(b)信號抗體。在一個方面，試劑涂層和/或混合物還包含IgM或其片段以緩解由嗜異性抗體引起的干擾，如共同在審的美國申請12/411，325中所公開的。優選首先對待將試劑混合物沉積于其上的表面進行電暈處理以提供帶電荷的表面基團，所述基團將促進打印的混合物擴散。一般來說，用于形成干試劑涂層的試劑混合物還可包含水溶性蛋白質、氨基酸、聚醚、含有羥基的聚合物、糖或碳水化合物、鹽和任選地染料分子。可使用一種或多種各組分。在一個實施方案中，混合物包含牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、鹽、甲氧基聚乙二醇、蔗糖和任選地溴酚藍以提供幫助使打印過程可視的顏色。在一個實施方案中，將I至20 y L混合物打印至分析設備的期望的表面上(例如保持室或其它導管內)并且使其風干(加熱或不加熱)，然后將其與其罩子裝配在一起。在優選方面，所述試劑混合物和從其形成的干試劑涂層包含拉克替醇、DEAE-葡聚糖、鹽例如氯化鎂和氯化鈉、IgG/IgM、肝素、表面活性劑和羅丹明。優選將試劑混合物配制為包含消耗珠子和任選地其它干擾減少性試劑的可打印的水溶液。在導入生物樣品例如血液后，優選在測定的第一步驟中將樣品與試劑混合。試劑還可包括無機鹽和表面活性劑以使測定性能在化學和流體性屬性方面得到最優化。其它任選添加劑可包括肝素以確保足夠的抗凝；和染料以使打印后試劑的定位可見。任選地還存在穩定劑例如疊氮化鈉(以抑制微生物生長)和拉克替醇與二乙氨乙基-葡聚糖的混合物(Applied Enzyme Technologies Ltd. , Monmouth House, MamhiladPark, Pontypool, NP40HZ UK)(以穩定蛋白質)。一旦沉積在設備中，可將沉積的試劑在暖和氣流中例如干燥30至60分鐘。在一個實施方案中，使用自動打印儀器將試劑打印在設備的樣品入口中并且干燥以形成包含消耗珠子的試劑涂層。除了包含消耗珠子外，還可將其它任選的添加劑包含在筒中或與測定結合使用。如上文所論述的，可添加抗凝劑肝素以便在未將樣品收集在肝素化的管或未將樣品在肝素化的管中正確混合的情況下提高性能。添加足夠的肝素以便新鮮未肝素化的血液在筒的測 試循環過程中(通常在2至20分鐘的范圍內)保持不凝固。可添加山羊和小鼠IgG以抵抗免疫測定領域中公知的嗜異性抗體問題。可添加Proclin、DEAE葡聚糖、Tris緩沖液和拉克替醇作為試劑穩定劑。可添加Tween 20以減少蛋白質與塑料(其是用于筒的優選材料)的結合。其還允許試劑更均勻地涂覆塑料表面并且用作使糖例如拉克替醇的結晶減少至最低程度的雜質，以便它們保持為玻璃。可添加疊氮化鈉以抑制細菌生長。在優選實施方案中，如下制備I升(L)批次的基本打印混合物(base printcocktail):將蛋白質穩定溶液(PSS, AET Ltd.，50%固體，100. Og)添加至200_250mL的氯化鈉(8. OOg)和疊氮化鈉(0. 500g)的水溶液中，將所得的溶液轉移至IL容量瓶中。通過將鼠IgG (0. 9g)添加至75mL去離子水并且攪拌15-60分鐘直至完全溶解來制備鼠IgG的溶液。以相同的方式制備同樣地濃縮的羊IgG溶液，將兩個溶液都通過I. 2 PM濾器過濾。從提供商(例如，Sigma-Aldrich)獲得以液體形式存在的鼠IgM。在280nm處通過分光光度計測量3種免疫球蛋白(Ig)原液的每一種的蛋白質濃度。計算提供鼠IgG(0.75g)、羊IgG(0. 75g)和鼠IgM(25mg)所需的這些Ig溶液的質量，將這些量添加至打印溶液中。通過將DEAE-葡聚糖(2. 5g)添加至50-100mL的去離子水中并且攪拌30分鐘來制備二乙氨乙基-葡聚糖(DEAE-葡聚糖)的溶液。將DEAE-葡聚糖溶液添加至打印溶液。向該溶液中添加肝素鈉(10，000IU/mL, 3. OOmL) ,Tween-20 (3. 00g)和 5%(w/v)的羅丹明水溶液(200 u L)。用去離子水將所得的溶液稀釋至I. 000L，然后貯存在冷凍室或冰箱直至使用。當被包含時，可在該最終稀釋之前添加用于白細胞干擾緩解的IgG-涂覆的微粒。優選使打印此類和相似的流體以在筒組分上形成干試劑涂層自動化并使其基于微分配系統(microdispensing system),包括照相機和計算系統，以對齊組分,如美國專利No. 5，554，339 (通過引用將其整體并入本文)中所公開的。在該專利中，利用軌道(track)替代娃片夾(wafer chuck)以將塑料筒底座輸送至分配頭(dispensing head)。軌道以預定方向將底座呈遞至分配頭以確保一致的位置分配。在另一個實施方案中，測試筒可包含多個干試劑涂層(在該情況下所述涂層可分別稱為第一試劑涂層、第二試劑涂層等以區分它們)。例如，可將消耗珠子包含在第一試劑涂層中，該涂層例如可與包含信號產生性成分例如信號抗體的第二試劑涂層相鄰。在該方面，第二試劑涂層可位于第一試劑涂層的上游或下游，盡管優選地包含信號抗體的試劑涂層位于包含消耗珠子的試劑涂層的下游。在優選實施方案中，用包含消耗珠子和任選地緩解不同干擾形式的其它試劑的第一試劑涂層涂覆保持室。在該方面，包含信號抗體的第二試劑涂層優選位于保持室的下游，例如緊靠在免疫傳感器的的上游。在其它實施方案中，消耗珠子可以不是分析設備例如筒的一部分。例如，可將消耗珠子集成在樣品收集設備例如毛細管、Vacutainer 或注射器中。例如，可在收集設備的內壁上形成消耗珠子涂層。因此，在一個實施方案中，本發明是用于進行免疫測定的試劑盒，其包括首先用于修正第一容器或位置中的血液樣品的消耗珠子，隨后將樣品通過具有捕捉和信號抗體的第二容器或位置。·在另一個實施方案中，可將用于緩解白細胞干擾的組分包含在溶液中并與生物樣品例如血液混合，將所得的修正的樣品導入分析設備例如筒中。在一個實施方案中，例如，可將血液樣品與消耗珠子混合以形成修正的樣品，隨后將該樣品導入分析設備例如筒。在另一個方面，所述設備在其中包括小袋(pouch)，所述小袋包含含有消耗珠子的液體，其與血液樣在設備中混合，隨后大體上如本文中所述進行處理以形成測定，例如夾心測定，以進行分析物檢測。在另一個實施方案中，電潤濕法(electrowetting)用于將包含消耗珠子的第一液體與液體生物樣品例如血液混合。在該實施方案中，可提供用于操作微滴的裝置。所述裝置例如可具有單面電極設計，其中將所有導電組件包含在于其上操作微滴的表面上。為了包含待操作的微滴，可與第一表面平行地提供另外的表面。通過進行基于電潤濕法的技術(其中以受控的方式相繼激勵和去激勵包含在第一表面上或植入其中的電極)操作微滴。所述裝置可使得能夠進行多個微滴操作過程，包括將兩個微滴融合和混合在一起，將微滴分成兩個或更多個微滴，通過從液流形成單個可控微滴而從連續液流取樣，以及迭代二元(iterative binary)混合或數字混合微滴以獲得期望的混合比率。如此，可將包含消耗珠子和其它試劑的第一液體的微滴與液體生物樣品例如血液小心和可控地融合和混合。參見，例如，美國專利No. 6，911，132，將其整體通過引用并本文。雖然本發明可廣泛地應用于免疫測定系統，但其在i-STAT 免疫測定系統(Abbott Point of Care Inc.，Princeton, N. J.)的情景中獲得最好的理解,如上文中弓丨述的共同擁有的在審的和授權的專利中所描述的。在一些實施方案中，所述系統使用免疫-參考傳感器(參見US2006/0160164A1，通過引用整體并入本文)以評估在測定過程中發生的非特異性結合(NSB)的程度。NSB可因不充分的洗滌或因干擾的存在而產生。來自測定的凈信號由從分析物免疫傳感器產生的特異性信號(通過扣除從免疫-參考傳感器產生的非特異性信號而修正)組成。免疫-參考傳感器上的信號的量受制于通過質量控制算法確定的限制。在一個實施方案中，本發明改善了 i-STAT免疫測定形式對于由白細胞引起的干擾的抗性；然而，其同樣地適用于標準ELISA形式，其中這類細胞存在于分析介質中。具體地，本發明包括使用涂覆的消耗珠子，發現所述涂覆的消耗珠子顯著減少由存在于某些測試樣本中的白細胞引起的干擾。
如上文中指出的，現已發現用優選與其它試劑(如例如在‘164和‘325申請中公開的)組合的消耗珠子修正樣品可導致減少的或消除的白細胞干擾。在實驗中，將非人IgG-標記的微粒珠子添加至i-STAT 免疫測定形式中使用的樣品條件化干試劑打印混合物。隨后測試先前因來自白細胞的干擾而不能被可靠分析的已知樣品。值得注意的是，雖然常規夾心測定在這些情況下產生錯誤結果，但先前的i-STAT系統測定先前未報道這些樣品的不準確的結果，因為所述系統包括檢測假信號的算法，以錯誤代碼警示用戶，并禁止結果被顯示。這是進行可靠及時現場護理測試所需的質量體系的一個部分的實例。通過該方式，分析系統的質量和完整性得到了維持。令人驚訝地，當測試包含消耗珠子的改進的筒并將結果與不存在消耗珠子的常規筒相比較時，結果顯示當應用消耗珠子，在常規筒中展示白細胞干擾的血液樣品可被精確地分析。就本發明的主題而言，發現某些免疫測定測試筒，特別是BNP筒，展示因先前未知的干擾機制而產生的意外的正和負傾斜的波形。分別參見，例如，圖11(a)和(b)。這導致 關于干擾機制的假說，所述假說是基于，在洗滌步驟中將電極脈沖至正電位的效應的實驗。注意，基于理論基礎預期的的正常免疫傳感器反應在低分析物濃度下具有接近0的斜率，并且僅在高分析物濃度下預期負斜率，其中測量可變成底物限制性的而非酶限制性的。這兩種情況分別示于圖11(c)和(d)中。存在幾個引起動態(非穩態)安培計信號的潛在機制。動態電極活性(變化的有效電極區域)是不可能的，因為電極從形成的組件分離(因為聚乙烯醇(PVA)層上存在固定的測定珠子(微粒))，兩者在血漿樣品中都未顯示該效應。取決于流體接觸，動態層厚度例如上述組分的膨脹或收縮是不可能的，因為對于這樣的現象不存在引起正斜率和負斜率的驅動力。酶的動態覆蓋(例如，ALP，變化的酶表面濃度)被排除，因為在薄層形式中，在測量的時間標度上，酶(例如，ALP)從傳感器的擴散是不可能的。鑒于相對小的分子尺寸并且相對容易擴散(D 5X10_6cm2/s)，酶底物(例如對-氨基苯酚磷酸(P-APP))至電極表面的動態運輸是不可能的。因此，通過消除的方法，動態ALP活性被認為是動態傳感器信號的最可能誘因。此外，進行研究以評估所述機制。值得注意的是，ALP對于對-氨基酸苯酚磷酸的水解是PH依賴性的，最佳pH接近pH 10。在筒中，使用9. 2的工作pH，因為這種略低的PH確保免疫復合物的穩定性。此外，電極上對-氨基苯酚(p-AP)的氧化是pH依賴性的并且預期PH每減小十倍程，電位偏移約+59mV，即在較低的pH下，反應一定更難驅動，即需要增加的應用電位。如果微粒打印層因與干擾組分相互作用至傳感器結構內的樣品流體(pH 7.4)在洗滌步驟中不能完全被分析流體(pH 9.2)完全替代的程度而變得不太可滲透，則這將導致亞最適的檢測步驟PH，特別是對于在離分析流體的進入點最遠的區域上發生的電極反應而言。更重要地，該受損的流體替代將一定會產生隨時間而緩和的PH梯度。隨著酶和電極反應的相對速率改變，觀察到信號也如此。該技術評估具有重要的有利方面其為正向和負向傾斜的信號提供了解釋。參見，例如，圖11(a)和(b)。通過在洗滌步驟中，將脈沖應用至極端電位，例如將脈沖應用至氧化電位，進一步評估觀察到的干擾與不完全洗滌步驟(因微粒層的“堵塞(Plugging) ”或“污染(fouling) ”而產生)相關的概念。預期正傾斜波形可能由失活阻斷的傳感器引起，可應用脈沖在分析步驟之前清潔電極。觀察到，在正常樣品的洗滌步驟期間應用氧化脈沖對觀察到的信號和在隨后的分析中沒有影響。參見圖12(a)。然而，在異常高棕黃樣品的情況下，脈沖的效應是大且動態的信號，此外，鑒于分析物的濃度，這些信號比預期的要大。參見圖12(b)。在這兩種情況下對氧化電位脈沖的反應的差異證明傳感器結構內的流體確實不同。如所預期，正確反應因期望的分析流體在傳感器上的存在而引起，而異常反應產生是因為傳感器結構上的流體是血漿，或血漿與分析流體的組合。可如下理解反應的差異根據H2O — l/202+2H++2e_，氧化脈沖導致氧氣的進展和pH的減小。在包含緩沖至pH 9. 2的分析流體的傳感器結構的情況下，在電極上產生的質子在緩沖液(IOOmM的碳酸鹽，在分析流體中)存在的情況下被快速消耗。然而，在由分析流體提供的緩沖不存在的情況下，質子維持在電極的區域中，導致酸性流體的羽流(plume)。 該酸性羽流導致PAPP至pAP的酸催化水解，產生比預期的更大的信號。具體地，異常波形產生自pAP，所述pAP通過酶例如ALP對pAPP的酶促作用以及還有非酶促的酸催化的水解產生。值得注意的是，對于對-氨基苯酚磷酸，除非氨基如在低pH時那樣被質子化，否則不會大量發生酸催化的水解反應不會大量發生。這是因為反應在對位上需要強吸電子取代基(Barnard et al. J. Chem. Soc. (1966)，227-235)。如在本領域是已知的，-NH2 取代基主要提供電子，然而在質子化后，-NH3+取代基變得高度吸電子(甚至比-NO2更強；例如，對于-NH2, Hammet para-rho 值為-0. 66,對于-NH3+ 為 I. 70)。這些實驗使觀察到的干擾與“高棕黃”樣品發生關聯并且可有意地通過運行具有富集的血沉棕黃層的全血樣品來引發。注意，該術語是指當將全血離心時在血漿-紅細胞邊界形成的一層白細胞和血小板。表明白細胞和潛在地血小板作為污染試劑的其它證據示于顯微照片圖17(a)(不使用消耗珠子的測定)和17(b)(使用消耗珠子后的測定)。為了進行比較，圖20中顯示了與全血接觸之前的原始免疫傳感器。圖17(a)顯示與高棕黃樣品ClO5個白細胞/yL)接觸的傳感器，使用標準測量循環和10分鐘的傳感器溫育時間。不將樣品與進行了調理作用的消耗珠子接觸。很明顯，一部分測定珠子涂覆的傳感器表面被不容易通過洗滌步驟被去除的細胞的粘著層覆蓋。相比之下，圖17(b)顯示了與高棕黃樣品ClO5個白細胞/yL)接觸的傳感器，使用標準測量循環和10分鐘的傳感器溫育時間。然而，與圖17(a)中顯示的測定相反，將圖17(b)中顯示的樣品與根據本發明的一個實施方案進行了調理作用的(IgG涂覆)消耗珠子接觸。很明顯，在洗滌步驟后，測定珠子-涂覆的傳感器表面的部分與圖17(a)相比較具有顯著較少的粘著的細胞。IgG用作調理素，其是能夠標記例如被白細胞吞噬的病原體的物質。通常將IgG添加至免疫測定以對付嗜異性抗體干擾，如共同在審的美國申請2/411，325中所描述的，所述IgG存在于本文中描述的BNP筒中的測定珠子上。因此，很可能，該來源的IgG (當存在于免疫測定設備中時)或天然存在于血液樣品中的IgG可用于不希望地對傳感器表面進行針對白細胞的調理作用。此外，由于測定珠子在尺寸上與作為吞噬作用的天然靶標的生物細胞(細菌)相似，所以IgG在測定珠子上的積累可能不期望地促進白細胞在這些珠子上積累。這與在具有高白細胞計數和可能地具有激活的免疫狀態的細胞的樣品中觀察到的干擾是一致的。本發明提供了對這種白細胞干擾的解決方法，其中將消耗性IgG-涂覆的微粒包含在樣品中，這為白細胞活性提供了誘餌靶，從而使它們繞開傳感器上的主要免疫試劑。使用與用于制備測定珠子的方法類似的方法進行IgG-涂覆的微粒的制備。該方法包括將IgG吸附至MES緩沖液(2- (N-嗎啉代)乙磺酸)中的羧化聚苯乙烯微粒上，然后在EDACd-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)存在的情況下進行交聯。現性描述用于形成消耗珠子的一個非限定方法。在優選程序中，通過以18，000RCF(相對離心力)離心20分鐘而從它們的基質(10%的微粒在，在水中，Seradyn)沉淀出粗制微粒，將其重懸浮于25mMMES緩沖液至100-200mg/mL的濃度。隨后以等于約I至5%的重量的微粒的量添加溶解在25mM MES緩沖液中的IgG。在于冰箱中進行15-20分鐘回轉(nutation)后，通過以1300RCF離心20分鐘沉淀出微粒，將其重懸浮于新鮮MES緩沖液至75mg/mL的濃度。通過測量280nm處的吸光度(I. 4AU/mg/mL蛋白質的有效消光系數)測定來自離心的上清液的蛋白質含量，以確認IgG已被吸附至微粒上。將新鮮制備的EDAC交聯劑(10mM，在MES緩沖液中)添加至重懸浮的微粒至約2_4mM的終濃度。隨后通、過在冰箱中回轉120±15分鐘而攪拌混合物。隨后可通過以1300RCF離心20分鐘再次沉淀出微粒，將其重懸浮于1/5PPS (磷酸緩沖鹽溶液)中并且在凍箱中回轉15-30分鐘。在最終的離心后，可將微粒重懸浮于PBS+0. 05%疊氮化鈉中或1:11/5PPB:PSS(1/5PPB為用4份水稀釋的 PBS,PSS=蛋白質穩定溶液,Applied Enzyme Technologies, Pontypool, UK)中至10%的固體濃度。可將所得的制劑等份冷凍貯存(優選在-60° C)。將通過該方法形成的懸浮于PBS中的微粒用于本文中描述的實驗，以及直接施用至血液樣品中。富集的或高棕黃全血樣品的制備(如對于用于本文中描述的實驗所描述的)如下。從供體抽取新鮮全血放入2個6mL EDTA-抗凝Vacutainers ，將其以2000RCF (標準轉子)離心10分鐘。當需要BNP “陽性”樣品時，在離心之前將BNP抗原摻入管。除了最后高出血漿/血沉棕黃層/紅細胞界面的I毫米外，取出所有血漿并置于一旁。隨后使用移液管取出界面區域(注意盡可能多地取出血沉棕黃層)并置于一旁。隨后取出紅細胞并置于一旁。通過將棕黃材料與更少部分的血漿和紅細胞級分組合，可以產生高棕黃血液樣品，同時保留正常樣品血細胞比容，例如，35-55wt. %。類似地，可產生存在低水平或基本上不存在棕黃材料(白細胞和血小板)的樣品。在實驗中，利用如下樣品測試BNP測試筒⑴高棕黃樣品，(ii)在臨運行之前用10%體積的10%重量的用PBS中的IgG涂覆的微粒(y P-IgG)的懸浮液處理的高棕黃樣品，
(iii)高血細胞比容的不含白細胞的樣品，和Qv)低血細胞比容的不含白細胞的樣品。圖21包括顯示白細胞干擾對電化學免疫傳感器的信號斜率的影響和消耗微粒處理對所述斜率的影響的圖形數據。右圖框和左圖框中顯示的是作為正常全血樣品(右圖框)和高棕黃血液樣品(富含白細胞，高棕黃，左圖框)的凈信號(X-軸)的函數繪制的傳感器斜率(y_軸)。左圖框顯示在消耗微粒不存在的情況下(亞批I)，在高棕黃樣品中觀察到的信號斜率的相當大的變化性。該變化性在消耗微粒存在的情況下(亞批2和3)被顯著緩解。注意，在具有和不具有消耗微粒的正常全血樣品(右圖框)中觀察到極小的信號斜率變化性。測定后傳感器的顯微檢查顯示在高棕黃(HB)中運行的芯片上存在厚的沉積；在HB/^P-IgG運行的樣品上不存在沉積。免疫傳感器的顯微照片示于圖17(a)和17(b)中，并且它們的相關分析儀波形分別顯示于圖22(a)和(b)中。從與血液樣品接觸之前的原始免疫傳感器(如圖20中顯示的)與在利用消耗珠子的優選制劑處理的血液接觸之后的免疫傳感器(圖17(b))的比較清楚地看到，在視覺上存在顯著的改善，即與圖17(a)相比較附著的白細胞減少。基于許多觀察，該視覺改善與免疫傳感器性能的實際改善直接相關。其它實驗顯示干擾現象在單獨的血漿或在含血小板但不含白細胞的樣品中不發生，但僅在含高棕黃水平的樣品中發生。此外，利用IgG涂覆的更小的微粒，例如具有小于0.2um的平均粒度的微粒，不具有與較大顆粒相同的對傳感器斜率的干擾緩解效應。優選地，IgG-涂覆的微粒(消耗珠子)的平均粒度為0.01至20 iim，例如，0.1至20 iim，I至10iim，0. I至5iim或2至5iim。消耗微粒的粒度分布優選是單型的，雖然多型分布也是可能的。原理上，可使用具有正確尺寸和能夠進行調理作用的的任何顆粒；然而，聚苯乙烯珠子是優選的。在優選方面，使用山羊或綿羊IgG涂覆的顆粒，雖然可使用其它IgG來源例如小鼠或兔IgG。一般而言，發現微粒的尺寸是非常重要的但其組成或IgG的來源是不重要的。關于消耗珠子，它們優選包含由選自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成的基底珠子，并且可具有約0. 01 ii m至約20 ii m的范圍內的平均粒度,更優選在0. Iiim至5iim或約 2 y m至約5 y m的范圍內的平均粒度。注意，雖然球狀珠子的使用是優選的，但其它珠子結構例如橢圓形和其它不規則形狀的顆粒在此處所用的術語珠子和微粒的含義之內。在該情況下，平均粒度是指顆粒的平均最長尺度，例如球狀顆粒的直徑，如通過本領域內公知的方法測定的。總之，實驗數據支持這樣的結論白細胞是其中傳感器在洗滌循環中變得不太可滲透的現象的主要原因，并且該免疫測定干擾可通過添加消耗IgG涂覆的顆粒至測定介質來緩解。免疫傳感器的優選實施方案的晶片級(Wafer-level)微制造如下。基礎電極(圖9的94)在15 ii m中心上包含7 ii m金盤(gold disk)的方陣列。所述陣列覆蓋直徑約600 ii m的圓形區域，并且這樣實現在由一系列包含Si/Si02/TiW/Au的層制造的基底上光圖案化一薄層厚度0. 35 y m的聚酰亞胺。7 u m微電極的陣列提供電活性物質種類的高收集效率，具有減小的來自任何電化學本底電流(與暴露的金屬的電容相關)的貢獻。在金屬上包含PVA層顯著地增強了本底電流的減小。通過在晶片上的微電極上旋轉涂覆PVA+有機卩比唳鹽(stilbizonium)光敏交聯試劑的含水混合物來制備多孔PVA層。旋轉涂覆混合物任選地包括牛血清白蛋白(BSA)。隨后對其進行光圖案化以僅覆蓋陣列上方和圍繞陣列的區域，并且優選具有約0. 6 y m的厚度。差分測量(differential measurement)的一般概念在電化學和傳感領域是已知的。現在描述用于減少電化學免疫傳感系統中的干擾信號的新型方法。然而，雖然描述了成對安培計電化學傳感器的差分測量，但其在其它電化學傳感系統包括電位測定傳感器、場效應晶體管傳感器和電導測定傳感器中具有等同的效用。其還適用于光學傳感器，例如消逝波傳感器和光波導，以及還有其它類型的傳感，包括聲波和溫度傳感等。因此，可將固定的抗體附著至選自安培計電極、電位測定電極、電導測定電極、光波導、表面等離子體共振傳感器、聲波傳感器和壓電式傳感器的傳感器。理想地，在非競爭性測定實施方案中，來自免疫傳感器(IS)的信號僅來源于包含固定的抗體(Abl)、分析物和被標記的信號抗體(Ab2)的夾心的形成，其中標記物(例如，酶)與底物(S)反應以形成可檢測的產物(P)，如下面方案(I)中顯示的。表面-Abl-分析物-Ab2-酶；酶+S—P (I)已知一些信號抗體(Ab2)可非特異性結合至表面，如下面方案(2)和(3)中顯示的，并且在洗滌步驟中可能不從免疫傳感器的區域被完全洗掉(達到約100微米遠)，從而產生與表面-Abl-分析物-Ab2-酶免疫測定夾心結構無關的總的檢測產物的一部分，從而產生干擾信號。表面-Ab2-酶；酶+S — P (2)表面-分析物-Ab2_酶；酶+S — P (3) 如上文顯示的，可以任選地將第二免疫傳感器置于筒中，其可用作免疫-參考傳感器(IRS)并且產生與在第一免疫傳感器上發生的相同的(或可預測地相關的)程度的NSB。干擾可通過從第一免疫傳感器的信號扣除該免疫-參考傳感器的信號而被減少，即，除去信號的NSB組分，從而提高測定的性能，如下面方案(4)中顯示的。該修正可任選地包括額外的補償值的扣除或添加。修正的信號=IS-IRS(4)優選地，除用于分析物(例如，cTnl)的捕捉抗體被針對血漿蛋白(以高濃度天然存在于樣品(正常和病理性的)中)的抗體替代外，免疫-參考傳感器在所有重要方面(例如，尺度、多孔篩選層、乳膠顆粒涂層和金屬電極組成)與第一免疫傳感器是相同的。可將免疫傳感器和參考免疫傳感器在硅芯片上分別制造為相鄰結構94和96 (如圖9顯示的)。雖然描述了肌鈣蛋白I和BNP測定的優選實施方案，但該結構對于其它心臟標志物測定包括例如肌鈣蛋白T、肌酸激酶MB、原降鈣素、proBNP、NTproBNP、肌紅蛋白等加上臨床診斷中使用的其它夾心測定例如PSA、D- 二聚體、CRP、HCG、NGAL、髓過氧化物酶和TSH也是有用的。結合血漿蛋白的適當的抗體的實例包括針對人血清白蛋白、血纖蛋白原和IgGfc區域的抗體，白蛋白是優選的。然而，如果適當的抗體是可獲得的，則可使用以大于約lOOng/mL的濃度存在的任何天然蛋白質或血衆組分。然而，所述蛋白質應當以充足的量存在，以快速地涂覆傳感器(與進行分析物測定所需的時間相比)。在優選實施方案中，所述蛋白質以足以在接觸血液樣品的約100秒內結合參考免疫傳感器上超過50%的可用抗體的濃度存在于血液樣品中。一般地，第二固定的抗體具有約lxl0_7至約1x10_15M的親和常數。例如，歸因于血液樣品中白蛋白的約IxKT4M的高摩爾濃度，具有約lxlO,M的親和常數的針對白蛋白的抗體是優選的。已發現提供被來源于樣品的天然白蛋白覆蓋的表面可顯著地減少可存在的其它蛋白質和細胞材料的結合。該方法通常優于使用常規封閉試劑以使NSB減少至最低限度的 常規免疫測定，因為此類試劑通常必須被徹底干燥并且在使用前保持穩定數月或數年，在該時間過程中它們可降解，產生比期望的更粘的表面，導致隨年代增長而產生的NSB。相反地，此處描述的方法在使用時提供了新鮮表面。接下來描述用于心臟腦利鈉肽(BNP)的免疫傳感器和用于進行差分測量以減少NSB的效應的參考-免疫傳感器。通過相同的方法制備利用抗-BNP和抗-HAS涂覆的羧化物-修飾的乳膠微粒(由 Bangs Laboratories Inc.或 Seradyn Microparticles Inc.提供)。首先通過離心對顆粒進行緩沖液交換，隨后加入抗體，所述抗體被允許被動吸附在顆粒上。隨后用pH 6. 2的MES緩沖液中的EDAC活化顆粒上的羧基，以與抗體形成酰胺鍵。通過離心除去任何珠子聚集，將完成的珠子冷凍貯存。發現，對于抗-人血清白蛋白(HSA)抗體，乳膠珠子的飽和覆蓋導致珠子質量增加約7%。使用共價連接從包含7mg的抗-HAS和IOOmg的珠子的混合物制備涂覆的珠子。通過使用該制劑，將約0. 4nL的微滴(包含約1%的固體，在去離子水中)微分散(使用美國專利No. 5，554，339的方法和裝置，將所述專利通過引用整體并入本文)至覆蓋傳感器96的光圖案化的多孔聚乙烯醇選擇性滲透層上，然后使其干燥。干燥顆粒附著至多孔層并且顯著阻止它們在血液樣品或洗滌流體中的溶解。對于BNP抗體，乳膠珠子表面的飽和覆蓋導致約10%的珠子的質量增加。因此通過將IOmg抗-BNP連同偶聯試劑一起添加至IOOmg珠子，實現飽和覆蓋。隨后將這些珠子微分散至傳感器94上。在另一個實施方案中，用具有血漿蛋白抗體例如抗-HAS和分析物抗體例如抗-BNP的珠子涂覆免疫傳感器94。利用約2mg或更少的抗-HAS/100mg珠子制備的并且隨后用抗-BNP飽和涂覆的乳膠顆粒在免疫傳感器上提供了優良的NSB性質。已發現肌鈣蛋 白測定的斜率(信號對分析物濃度)未受實質影響，因為在珠子上存在充足的抗-BNP來捕捉可用的分析物(抗原)。通過測定不同抗體的珠子飽和濃度和免疫傳感器(具有只有針對靶分析物的抗體的珠子)的斜率，可測定具有針對給定的分析物和血漿蛋白的抗體的珠子的抗體組合的適當比率。具有參考免疫傳感器的免疫傳感器的重要方面是由一層血漿蛋白優選HSA/抗-HAS組合產生的表面的“人源化”。這似乎使得珠子不易于被抗體-酶綴合物的NSB影響。其也似乎減少了珠子差異性。不受理論束縛，似乎隨著傳感器被樣品覆蓋，它們因抗-HAS表面而迅速被天然白蛋白涂覆。這與常規封閉材料相比較提供了優良結果，所述常規封閉材料在制造中被徹底干燥并且通常在長期貯存之后復水化。“人源化”傳感器表面的另一個有利方面是其提供了對人抗-小鼠抗體(HAMA)和其它嗜異性抗體干擾的抗性的額外模式。HAMA對免疫測定的影響是公知的。可用于本發明的設備和方法中的免疫-參考傳感器的另一個用途是監測分析循環中獲得的洗滌效率。如上所述，本底噪聲的一個來源是少量酶綴合物仍然存在于溶液中，或非特異性吸附在傳感器上并且未被洗滌步驟除去。本發明的該方面涉及通過導入實施例2中提及的空氣段，使用小體積的洗滌液進行高效洗滌步驟。在安培計電化學系統的優選實施方案的操作中，通過分析儀記錄因ALP的活性而產生的與免疫傳感器94和免疫-參考傳感器96上的對-氨基苯酚的氧化相關的電流。對于銀-氯化銀參考電極，將免疫傳感器和免疫-參考傳感器的電位設置在相同的值上。為了除去干擾效應，根據上述公式(4)，分析儀從免疫傳感器的信號扣除免疫-參考傳感器的信號。當在兩個傳感器之間存在特征性常值偏移時，該偏移也被扣除。應認識到免疫-參考傳感器不必具有所有與免疫傳感器相同的非特異性性質，僅需在測定的洗滌和NSB部分一致成比例。植入分析儀中的算法可解釋兩種傳感器之間的任何其它基本恒定的差異。免疫傳感器與免疫-參考傳感器的差異組合而非單獨的免疫傳感器的使用，給測定提供了下列改善。在優選實施方案中，筒設計提供了干試劑，所述干試劑產生約40-50億個溶解至約10 UL血液樣品中的酶綴合物分子。在結合和洗滌步驟結束時，傳感器上的酶分子的數目為約70，000個。在利用優選實施方案的實驗中，在免疫傳感器和參考免疫傳感器上存在平均約200，OOO (土約150,000)個酶分子，作為非特異性結合的本底。通過使用免疫-參考傳感器的差異測量，消除了約65%的不確定度，顯著提高了測定的性能。雖然其它實施方案可具有其它程度的提高，但關于測定性能的總體提高的基礎仍然保持。任選的免疫-參考傳感器的另一個用途是檢測異常樣品狀況，例如不恰當地抗凝固的樣品，其將材料沉積在整個導管中并且在免疫傳感器和免疫-參考傳感器上都引起增加的待測量的電流。該效應與在測量步驟中非特異性吸附的酶和保留在傳感器上的洗滌流體的薄層中的酶相關。任選的免疫-參考傳感器的另一個用途是修正洗滌效率的信號。在某些實施方案中，免疫傳感器上的信號水平取決于洗滌的程度。例如，利用更多流體/空氣段轉換的更長洗滌可因一部分特異性結合的綴合物被洗掉而產生更低的信號水平。然而這可能是相對小的影響，例如小于5%，修正可提高測定的總體性能。可基于傳感器上的相對信號，或與位于與傳感器相鄰的導管中的電導傳感器(用作用于檢測和計數空氣段/流體轉換的數目的傳感器)結合來實現修正。這為嵌入分析儀的算法修正工具提供了輸入。在利用內源蛋白質例如HSA的參考免疫傳感器的另一個實施方案中，可通過利用以針對外源蛋白質例如牛血清白蛋白(BSA)的抗體涂覆的免疫-參考傳感器來實現相同的目的。在該情況下，在與傳感器接觸前需要將一部分BSA溶解在樣品中(作為額外的試劑提供)。可在筒的樣品保持室中或在外部收集設備例如BSA涂覆的注射器中以BSA作為干試劑進行該溶解步驟。該方法提供了某些有利方面，例如，可就表面電荷、特定表面基團、糖基化程度等選擇蛋白質。這些性質可以不必存在于內源蛋白質的可獲得的選擇中。除了鹽以外，其它試劑也可提高免疫測定的全血精確度。應當以促進快速溶解的方式將此類試劑呈遞給全血。涂覆在血液保持室(或另一種導管)的壁上的支持基質(包括纖維素、聚乙烯醇和明膠(或其混合物))促進快速溶解，例如在15秒內完成超過90%。本發明的筒具有下列優點樣品和第二流體可在測定順序中在不同的時間接觸傳感器陣列。還可利用最初作為干涂層存在于各導管內的其它試劑或化合物獨立地修正樣品 和第二流體。筒內液體的受控運動還允許超過一種物質被修正進入每一種液體，而無論樣品或流體何時移動至導管的新區域。這樣，給每一種流體提供了多個修正，從而極大地擴大了可進行的自動化測定的復雜性，從而增強了本發明的效用。在一次性筒中，優選使包含的液體的量保持少量以使成本和尺寸降至最低程度。因此，在本發明中，導管內的區段還可用于通過使區段的空氣-液體界面通過待漂洗的傳感器陣列或其它區域至少一次來幫助清潔和漂洗導管。已發現，與利用更大體積的液體的連續漂洗相比較，利用該方法使用更少的流體實現了更高效的漂洗。導管內的限制在本發明中適用于幾個目的。位于樣品保持室與第一導管之間的毛細管栓被用于通過阻止保持室中的樣品轉移(直至施加足夠的壓力來克服毛細管栓的阻抗)來促進樣品計量。第二導管內的限制用于使洗滌流體沿著替代途徑轉向朝向廢料室(當流體到達縊縮時)。墊圈中的小孔與疏水涂層一起被提供來阻止從第一導管至第二導管的流動直至施加足夠的壓力。將液體流動控制在本發明的導管內和導管之間的部件在本文中統稱為閥門。因此，本發明的一個實施方案提供了一次性使用的筒，其具有連接至第一導管(其包含分析物傳感器或分析物傳感器的陣列)的樣品保持室。將部分地包含流體的第二導連接至第一導管并且可在第二導管的流體中導入空氣段以分割它。提供泵裝置以替代第一導管內的樣品，并且這將流體從第二導管移入第一導管。因此，可將傳感器首先與樣品接觸，隨后與第二流體接觸。在另一個實施方案中，筒包括位于第一導管與廢料室之間的可關閉閥門。該實施方案允許只使用單個連接至第一導管的泵裝置將流體從第二導管移入第一導管。該實施方案還允許高效地洗滌本發明的筒的導管，這是小型一次性使用的筒的重要特征。在操作中，樣品被排出以接觸傳感器，隨后被排出通過可關閉閥門而進入廢料室。在濕潤后，可關閉閥門密封對廢料室的開口，從而提供了氣密密封，其允許只使用連接至第一導管的泵裝置抽取第二導管中的流體使其與傳感器接觸。在該實施方案中，可關閉閥門允許以該方式排出流體并且阻止空氣從廢料室進入第一導管。在另一個實施方案中，提供了可關閉閥門和用于將區段導入導管的裝置。該實施方案可具有許多有利方面，所述有利方面之一是在傳感器或傳感器的陣列上互換分段的流體的能力。因此將第一區段或區段組用于漂洗傳感器，隨后新鮮區段替代其以進行測量。只需要一個泵裝置(連接至第一導管)。在另一個實施方案中，在覆蓋分析傳感器的液體的薄膜中進行分析物測量。優選利用安培計量法進行此類薄膜測定。該筒與前述實施方案相異在于具有可關閉的閥門和導管內的排氣口，當將樣品排出通過閥門時所述可關閉的閥門被密封，所述排氣口允許至少一個空氣段隨后被導入測量流體，從而增加從傳感器漂洗樣品的效率，并且還允許在測量之前從傳感器除去幾乎全部液體，并且還允許新鮮液體區段被帶動穿過傳感器以允許就提高的精確度進行連續的重復測量以及重現性的內部檢查。在非競爭性測定實施方案中，如上所描述的，用于檢測低濃度免疫活性分析物的分析方案依賴于酶標記的抗體/分析物/表面結合的抗體的“夾心”復合物的形成，如上文中所論述的。將樣品中分析物的濃度轉化為成比例的酶表面濃度。所述酶能夠通過將底物轉化成可檢測的產物來放大分析物的化學信號。例如，當所述酶是堿性磷酸酶時，單個酶分子每分鐘可產生約9000個可檢測的分子，從而與其中將電活性物質種類附著至抗體(替代堿性磷酸酶)的方案相比較，在分析物的可檢測性上提供了幾個數量級的提高。在免疫傳感器實施方案中，有利的是將傳感器首先與樣品，然后與洗滌流體接觸，隨后記錄來自傳感器的反應。在具體的實施方案中，除了利用IgG-涂覆的微粒修正以減少白細胞干擾外，還在修正的樣品與傳感器接觸之前，利用結合樣品中的目標分析物的抗體-酶綴合物(信號抗體)修正樣品。樣品中的結合反應產生分析物/抗體-酶復合物。傳感器包括靠近電極表面附著的針對分析物的固定的抗體。在與傳感器接觸后，分析物/抗體-酶復合物結合電極表面附近的固定的抗體。有利地在該點盡可能多地從電極附近除去未結合的抗體-酶綴合物以使來自傳感器的本底信號減小至最小。抗體-酶復合物的酶有利地能夠轉化流體中提供的底物以產生電化學活性物質種類。使該活性物質種類靠近電極產生，并且當施加適當的電位(安培計操作)時，其從電極上的氧化還原反應提供電流。或者，如果電活性物質種類是離子，可電壓計量地測量它。在安培計測量中，可在測量過程中固定電位或按照預定的波形改變電位。例如，三角波可用于掃描限度之間的電位，如循環 伏安法的公知技術中所使用。或者，可將數字技術例如方波用于改善與電極鄰近的電活性物質種類的檢測靈敏度。根據電流或電壓測量，計算樣品中分析物的量或存在。這些和其它分析電化學法在本領域是公知的。在其中筒包括免疫傳感器的實施方案中，有利地從惰性金屬例如金、鉬或銥的基本傳感器和 覆蓋有連接至微粒例如乳膠顆粒的生物活性層的多孔選擇性滲透層微制造免疫傳感器。將微粒分配在覆蓋電極表面的多孔層上，形成粘著的多孔生物活性層。生物活性層具有特異性結合目標分析物的性質，或當分析物存在時表現出可檢測的變化的性質，最優選為針對分析物的固定的抗體。參考附圖，本發明的筒包括罩子(圖I和2)、底座(圖4)和置于底座與罩子之間的薄膜粘著墊圈(圖3)。現參考圖1，罩子I由堅硬材料(優選塑料)制造，并且能夠在柔性鉸鏈區5、9、10上反復變形而不破裂。罩子包括蓋子2，其通過柔性鉸鏈9連接至罩子的主體。在操作中，在將樣品導入樣品保持室34后，可確保蓋子在樣品進入端口 4的入口上方，阻止樣品滲漏，通過鉤3將蓋子保持在原位。罩子還包括兩個槳(paddle) 6、7，其相對于罩子的主體可移動，并且通過柔性鉸鏈區5、10連接至罩子。在操作中，當利用泵裝置操作時，槳6對由被薄膜墊圈21覆蓋的腔43組成的氣囊施加壓力，以排出筒的導管內的流體。當通過第二泵裝置操作時，槳7對墊圈21施加壓力，所述墊圈由于在其中切割的裂縫22而變型。筒經改造適合于插入讀數裝置，從而具有多個用于該目的的機械和電氣連接。還應當明顯的是筒的手工操作是可能的。因此，在將筒插入讀數裝置后，墊圈將壓力傳遞至位于腔42中的包含流體的箔袋(裝有約130 u L的分析/洗滌溶液(“流體”)，從而刺破尖狀物38上的包裝，將流體排入導管39，所述導管通過底座中的短橫向導管連接至傳感器導管。分析流體填充分析導管的前端，首先將流體推至帶墊圈中用作毛細管栓的小開口。施加至筒的分析儀器械的其它運動用于將一個或多個區段在分析導管內受控的位置處注射入分析流體。這些區段用于幫助以最少的流體洗滌傳感器表面和周圍的導管。罩子還包括被柔性薄膜8覆蓋的孔。在操作中，對薄膜施加的壓力將一個或多個空氣區段通過墊圈上的小孔28排入導管20。參考圖2，底座的下表面還包括第二導管11，和第一導管15。第二導管11包括縊縮12，其通過提供對流體流動的阻抗來控制流體流動。任選的涂層13，14提供了疏水表面，其與墊圈孔31、32—起控制第二與第一導管11，15之間的流體流動。底座中的凹陷17提供了用于導管34中的空氣經墊圈中的孔27通過導管34的路徑。參考圖3，薄膜墊圈21包括多個孔和裂縫來幫助底座與罩子內的導管之間的流體轉移并且在必要時允許墊圈在壓力下變形。因此，孔24允許流體從導管11流入廢料室44 ；孔25包括導管34與15之間的毛細管栓；孔26允許空氣在凹陷18與導管40之間流動；孔27提供了凹陷17與導管34之間的空氣流動；孔28允許流體從導管19經任選的可關閉閥門41流至廢料室44。孔30和33允許分別安放在切除物(cutaway) 35和37內的多個電極與導管15內的流體接觸。在具體的實施方案中，切除物37安放接地電極和/或對-參考電極，切除物35安放至少一個分析物傳感器和任選地電導測定傳感器。在圖3中，膠帶21在22上切開，以允許被3個切口 22圍繞的膠帶在儀器向下施力以在尖狀物38上破裂組件42內的校準物小袋時變形。還在23上切割膠帶，這允許當儀器提供向下的力時膠帶向下彎曲至組件43中，從而將空氣從室43排出，并且使樣品流體通過導管15朝向傳感器移動。圖3中的組件29用作連接罩子圖2與底座圖4中的區域的膠帶中的開口。參考圖4，導管34是連接樣品進入端口 4至裝配的筒中的第一導管11的樣品保持室。切除物35安放分析物傳感器或分析物反應表面以及任選的電導測定傳感器。切除物37安放接地電極(需要時)作為電化學傳感器的返回電路，并且還可安放任選的電導測定傳感器。切除物36在墊圈孔31與32之間提供了流體路徑，以便流體可通過第一與第二導管之間。凹陷42在裝配的筒中安放包含流體的包裝，例如可破裂的小袋，所述包裝由于在插入讀數裝置后施加在槳7上的壓力而被尖狀物38刺破。來自刺破的包裝的流體流入39上的第二導管。氣囊由凹陷43 (在其上表面上被墊圈21密封)組成。氣囊是泵裝置的一個實施方案，并且由施加至槳6的壓力驅動，其將空氣排入導管40中，從而樣品從樣品室34的排至第一導管15中。 空氣從氣囊進入樣品保持室(墊圈孔27)的位置以及毛細管栓25的位置一起確定了樣品保持室的預定體積。當槳6被壓下時，相應于該體積的樣品的量被排入第一導管。因此該排列是用于遞送計量的量的未計量的樣品至筒的導管內的一個可能的實施方案。在本發明的筒中，在底座塑料部件中提供用于計量樣品區段的裝置。區段尺寸受到底座中的區室的尺寸和毛細管栓以及帶墊圈中的通氣管孔的位置控制。該體積可容易地從2至200 y L變化。樣品尺寸的該范圍的擴大在本發明的情景中是可能的。將流體被推著通過分析前導管11，所述導管可用于在樣品出現在傳感器導管19中之前將試劑(例如，顆粒、可溶性分子或IgM或其片段)加入樣品以進行修正。或者，修正試劑可位于部分15中，部分16之外。推動樣品通過分析前導管也用于將張力導入膈膜泵槳7，這促進其對流體排出的驅動的反應性。在一些測定中，如果需要定量分析物，則計量是有利的。為從導管排出的樣品和/或流體提供了廢料室44，以防止對筒的外表面的污染。還提供了連接廢料室與外部大氣的排氣口 45。筒的一個期望的特征是一旦加載了樣品，可完成分析，并且可棄去筒而操作者或其他人不接觸樣品。現參考圖5，提供了筒和組件的特征的示意圖，其中51-57是可任選地用干試劑涂覆以修正樣品或流體的導管和樣品室的部分。將樣品或流體在干試劑上方通過至少一次以溶解它。用于修正樣品的試劑可包括如下的一種或多種抗體-酶綴合物(信號抗體)、IgM和/或其片段、IgG和/或其片段以及阻止測試化合物間的特異性或非特異性結合反應的其它封閉試劑，和/或用于減少白細胞干擾的上述IgG涂覆的微粒。還可提供不溶性的但幫助阻止測定組分對筒的內表面的非特異性吸附的表面涂層。在具體的實施方案中，在第一導管與廢料室之間提供了可關閉的閥門。在一個實施方案中，該閥門58由用不能滲透的物質涂覆的干燥海綿材料組成。在操作中，將海綿材料與樣品或流體接觸導致海綿的膨脹以充滿腔41 (圖4)，從而實質上阻斷液體至廢料室44的進一步流動。此外，濕潤的閥門也阻斷第一導管與廢料室之間的空氣流動，這允許連接至樣品室的第一泵裝置排出第二導管內的流體，以及以下列方式將流體從第二導管排出至第一導管中。現參考圖6，該圖顯示了免疫傳感器筒的示意性布局，其中提供了 3個泵61-63。雖然這些泵已根據具體的實施方案進行了描述，但可容易地理解，能夠進行泵61-63的各自功能的任何泵設備可用于本發明中。因此，泵1，61，應當能夠將樣品從樣品保持室排出至第一導管中；泵2，62應當能夠排出第二導管內的液體；泵3，63應當能夠將至少一個區段插入第二導管。本申請中所設想的其它類型的泵包括但不限于與氣動裝置(通過該氣動裝置可對氣囊施加壓力)接觸的氣囊、柔性膈膜、活塞和氣缸(cylinder)、電動力學泵以及振動泵(sonic pump)。參考泵3，63，術語“泵”包括通過其可將一個或多個區段插入第二導管的所有設備和方法，例如用于將空氣從氣囊排出的氣動裝置、當溶解時產生氣體的干化學藥品或多個可操作地連接至電源的電解電極。在具體的實施方案中，使用可具有超過一個氣囊或小室的機械區段產生性膈膜產生區段。如所顯示的，孔8具有單個開口，所述開口連接內部膈膜泵與流體充滿的導管(將向所述導管內注射區段)20。可分割膈膜以產生多個區段，每一個區段被注射在流體充滿的導管內的指定位置中。在圖6中，組件64表示這樣的區域其中免疫傳感器進行捕捉反應以形成包含固定的抗體、分析物和信號抗體的夾心。在替代性實施方案中，使用被動部件注射區段。通過帶墊圈密封筒的底座中的孔。覆蓋孔的帶墊圈在任一末端上具有兩個小孔。一個孔是開口，而另一個被過濾材料覆蓋，所述過濾材料當與液體接觸后變濕。用疏松親水材料例如纖維素纖維濾器、濾紙或玻璃纖維濾器充滿孔。該親水材料通過毛細管作用將液體吸入底座中的孔內，將先前存在于孔中的、空氣排出。空氣通過帶墊圈中的開口排出，從而產生了其體積通過孔的體積和疏松親水材料的空體積(void volume)確定的區段。可選擇用于覆蓋至底座中的孔的進口之一的濾器以計量流體填充孔的速率，從而控制區段被注射入罩子中的導管的速率。該被動裝置允許任意數目的受控區段被注射在流體路徑中的指定位置并且需要最小的間隔。基于本公開內容，很明顯本發明的方法提供了在分析物免疫測定中減少或消除來自白細胞的干擾的方法，其中首先收集樣品例如全血樣品，隨后通過將包含消耗珠子的干試劑溶解在樣品中來修正樣品。優選地，所述試劑盒或方法包括充足的消耗珠子以提供相對于血液樣品中的白細胞過量的珠子。這產生了具有至少5微克/微升樣品、例如至少10微克/微升樣品、或至少15微克/微升樣品的溶解的消耗珠子濃度的樣品，所述濃度足以實質上嚙合樣品中的任何白細胞。就范圍而言，干試劑優選溶解于樣品中以產生約5微克至約40微克珠子/微升樣品、優選約10至約20微克珠子/微升樣品的消耗珠子濃度。取決于珠子的尺寸，這相應于至少約IO4個珠子/微升樣品、至少約IO5個珠子/微升樣品、或約IO5至約IO6個珠子/微升樣品。因此，在一些優選實施方案中，消耗珠子以足以提供至少IO4個珠子/微升樣品、例如至少約IO5個珠子/微升樣品或約IO5至約IO6個珠子/微升樣品的溶解的消耗珠子濃度的量存在。一旦該步驟完成，可能對修正的樣品進行免疫測定例如電化學免疫測定以測定分析物的濃度。注意，干試劑的溶解和夾心形成步驟可同時發生或以逐步的方式發生。所述方法主要針對作為心血管標志物的分析物，例如Tnl、TnT、CKMB、肌紅蛋白、BNP、NT-proBNP和proBNP，但也可用于其它標志物例如P -HCG, TSH、髓過氧化物酶、珠蛋白、D- 二聚體、CRP、NGAL和PSA。為了確保大部分白細胞在檢測步驟之前已被隔離，優選將使品修正步驟進行約I分鐘至約30分鐘的范圍內的選擇的預定時間。優選在包括免疫傳感器、導管、樣品進入端口和樣品保持室的筒中進行所述方法，其中用干試劑涂覆這些組件的至少一個的至少一部分。注意，干試劑可包括如下的一種或多種用于減少白細胞干擾的消耗珠子、緩沖劑、鹽、表面活性劑、穩定劑、簡單碳水化合物、復雜碳水化合物及各種組合。此外，干試劑還可包括針對分析物的酶標記的抗體(信號抗體)。
如上文中所建議的，除了使用完整IgG分子涂覆消耗珠子外或并非使用完整IgG分子涂覆消耗珠子(其中從連接至F(ab’)2區域的Fe區域形成單個單層，這繼而包含兩個Fab區域)，還可以使用IgG的片段。IgG片段化可使用二硫鍵還原(-S-S-至-SH HS-)與酶促胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的組合以產生F(ab’) 2片段、Fab片段和/或Fe片段的一些組合來不同地實現。可通過層析分離這些片段以單獨使用，或組合使用這些片段。例如，當封閉位點位于Fe片段上時，可使用片段而不使用完整IgG分子。這同樣也適用于Fab片段和F(ab’)2片段。在實際測定步驟中，優選地一旦在固定的抗體與信號抗體之間形成夾心，隨后就將樣品介質洗滌至廢料室，然后將夾心暴露于能夠與酶反應以形成能夠電化學檢測的產物的底物。優選形式是電化學酶偶聯免疫吸附測定。優選地，所述設備是對樣品例如血液樣品中的分析物進行免疫測定的設備，其中具有減少的來自白細胞的干擾。設備安放有電化學免疫傳感器、導管和樣品進入端口，其中導管允許樣品以受控的方式通過進入端口至免疫傳感器。在一個方面，至少一部分安裝組 件利用可包含非人IgG-涂覆的消耗珠子的干試劑進行涂覆。重要特征是干試劑能夠溶解于樣品中并且在結合和優選吞噬中嚙合白細胞。這通常足以隔離樣品中的潛在干擾性白細胞。在優選實施方案中，所述設備還包括免疫-參考傳感器。所述免疫傳感器優選用于檢測心血管標志物例如，分析物例如1'111、1'111\0(]\^、肌紅蛋白、8冊、見'- 1'08冊和proBNP。設備在其中運轉的系統通常允許樣品與試劑保持接觸持續預定時間例如I至30分鐘。優選地，所述裝置是一次性使用的筒(例如充滿單個樣品)，用于測試一次，隨后棄去。通常，設備包括能夠將樣品洗至廢料室的洗滌流體，和能夠與免疫傳感器上的酶夾心反應以形成適用于電化學檢測的底物。更廣泛地，本發明涉及在用于任何生物樣品(其中通常存在白細胞)的分析物免疫測定中減少來自白細胞的干擾。此外，對修正的樣品進行免疫測定以測定選擇的分析物的濃度可基于多種技術，包括電化學技術，例如安培計技術和電位測定技術，以及還有光學技術，例如吸光度、熒光和發光。雖然已在BNP測試筒的情景下描述了本發明，但其同樣地適用于其中白細胞存在并且可以是干擾的原因的任何免疫測定。例如，其可以以用于對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行免疫測定的試劑盒的形式存在，其中所述試劑盒包括針對白細胞進行了調理作用的消耗珠子、針對分析物的固定的第一抗體和針對分析的第二標記的抗體。此外，可對本領域已知的現有免疫測定形式進行修飾以包括消耗珠子，例如通過在樣品預處理步驟中添加珠子。該預處理可通過將消耗珠子整合在血液收集設備中、獨立容器中來實現，或可通過將消耗珠子整合在設備的測試循環中而在分析(免疫測定)設備本身中發生。方法或試劑盒不限于BNP，但可經改造適用于任何免疫測定，包括但不限于proBNP、NTproBNP、cTnl、TnT、HCG, TSH、PSA、D- 二聚體、CRP、肌紅蛋白、NGAL, CKMB 和髓過氧化物酶。此外，所述方法和試劑盒適用于這樣的測定其中用任何非人(包括鼠、羊、牛和狼)IgG或其片段涂覆消耗珠子，以及或者用活化的人IgG或其片段涂覆消耗珠子。消耗珠子可包含用選自蛋白質、細菌、病毒和異型生物質的材料或其片段涂覆的基底珠子，或可由靜止或穩定的細菌細胞、孢子或其片段例如大腸桿菌提供，任選地不具有基底珠子。雖然上述優選測定使用附著至測定珠子(所述珠子繼而附著至具有底層電極(underlying electrode)的多孔層)的固定的第一抗體，但可將第一抗體直接固定在電極或任何其它表面上，或固定在可溶性珠子上。所述試劑盒或方法可包括以可溶解的干試劑(包括進行了調理作用的消耗珠子作為可溶解的干試劑的一部分)的形式存在的第二標記的抗體，或其中兩者存在于單獨的干試劑位置中。注意，固定的和標記的抗體都可以是單克隆抗體、多克隆抗體、其片段及其組合。此外，第二抗體可用各種標記物包括放射性標記物、酶、生色團、熒光團、化學發光物質種類和免疫測定領域已知的其它標記物來進行標記。當用酶來標記第二抗體時，其優選為ALP、辣根過氧化物酶或葡糖氧化酶。所述試劑盒或方法適用于包含白細胞的任何樣品，例如全血，并且所述樣品可以是利用抗凝劑例如EDTA、肝素、氟化物、檸檬酸鹽等修正的血液樣品。當所述方法或試劑盒用于進行非-競爭性免疫測定時，存在依次的混合步驟，包括(i)將懷疑包含分析物的血液樣品與進行了調理作用的消耗珠子混合；(ii)將血液樣品與針對分析物的固定的第一抗體混合并且在固定的抗體與所述分析物之間形成復合物；和(iii)將血液樣品與標記的第二抗體混合以形成具有所述分析物和所述固定的抗體的復合物。注意，這些混合步驟可同時進行或按有序順序進行。例如，步驟(ii)和(iii)可同時進行，或可在步驟(ii)之前進行步驟(i)和(iii)。在最后的步驟中，測定在固定的第一抗體、分析物與標記的第二抗體之間形成的復合物的量。本發明的方法特別地涉及顯著緩解白細胞在分析物免疫傳感器上的積累，所述傳感器由針對固定在電極上的分析物的抗體涂覆的測定珠子制造。在將懷疑包含分析物的樣品與進行了調理作用的消耗珠子混合以形成修正的樣品(其中樣品中的白細胞優先吞噬消耗珠子)后，隨后將修正的樣品與免疫傳感器接觸。作為結果，白細胞在測定珠子上的積累最小化并存在測定珠子的吞噬，并且可實現可靠的測定。本發明的方法涉及對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行免疫測定，包括將懷疑包含分析物的血液樣品與過量的進行了調理作用的消耗珠子混合以形成修正的樣品，其中樣品中的白細胞優先吞噬消耗珠子；將修正的樣品與包含針對固定在電極上的分析物的抗體涂覆的珠子的免疫傳感器接觸；在所述抗體涂覆的珠子、所述分析物與第二標記的抗體之間形成夾心；從所述免疫傳感器洗滌所述血液樣品；以及利用所述免疫傳感器測定所述夾心標記物的量和使所述標志的量與樣品中分析物的濃度相關聯。本發明的方法還涉及對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行免疫測定，包括將懷疑包含分析物的血液樣品與過量的進行了調理作用的消耗珠子混合以形成修正的樣品，其中樣品中的白細胞優先吞噬消耗珠子；將修正的樣品與針對分析物的抗體涂覆的珠子接觸；在所述抗體涂覆的珠子、所述分析物與第二標記的抗體之間形成夾心；從所述抗體涂覆的珠子洗滌所述血液樣品；和測定所述夾心標記物的量和使所述標記物的量與樣品中的分析物的濃度相關聯。本發明還涉及用于對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行免疫測定的測試筒，包括導管中的免疫傳感器，其中所述免疫傳感器具有針對分析物的固定的第一抗體。在該實施方案中，導管優選具有干試劑涂層或包含針對白細胞進行了調理作用的消耗珠子和針對所述分析物的第二標記的抗體的單獨涂層。在操作中，干試劑溶解于所述血液樣品中。根據下列非限定性實施例，本發明將變得更好理解。、
實施例I圖7顯示了根據相關在審美國申請12/411，325的特定實施方案的安培計免疫測定(用于測定肌鈣蛋白I (TnI)，一種心臟壞死標志物的存在和量)的原理。將血液樣品導入筒的樣品保持室，通過將涂覆的干試劑溶解在樣品保持室中來修正血液樣品。干試劑包括IgM 77，其在溶解入樣品后，選擇性結合可包含在樣品中的互補嗜異性抗體78。如所顯示的，干試劑還包含IgG 79，其也在溶解于樣品中后選擇性結合互補抗體78。圖10顯示根據本發明的特定實施方案的用于測定心臟功能的標志物例如BNP和TnI的存在和量的安培計免疫測定的原理。將血液樣品導入筒的樣品保持室，通過將涂覆的干試劑溶解于樣品保持室中來修正血液樣品。干試劑包括消耗珠子102，其在溶解于樣品中后選擇性結合可包含在樣品中的白細胞103。注意，干試劑還可以包含，并優選包含IgM和 IgG，如對于圖7所描述的。此外，圖7和10顯示包含共價附著至信號抗體71例如多克隆抗-肌鈣蛋白I抗體的堿性磷酸酶的綴合分子，也將其溶解于樣品中。該綴合物特異性結合血液樣品中的分析物70例如TnI或BNP，從而產生由結合至AP綴合物的分析物組成的復合物。在捕獲步驟中，該復合物結合至附著在免疫傳感器上或接近免疫傳感器的捕獲抗體72 (固定的抗體)。傳感器芯片具有電導傳感器，其用于監測樣品到達傳感器芯片的時間。流體的到達時間可用于檢測筒內的滲漏到達的延遲發出滲漏的信號。可使用流體的邊緣作為定位標志來主動控制傳感器導管內樣品區段的位置。由于樣品/空氣干擾穿過電導傳感器，因此產生精確的信號，所述信號可用作流體標志物，從該流體標志物可執行受控的流體排出。優選在傳感器上方對流體區段進行邊靠邊(edge-to-edge)的振蕩，以將完整樣品呈遞至免疫傳感器表面。可在傳感器芯片之外的傳感器導管中導入第二試劑，所述試劑在流體振蕩過程中均勻分布。傳感器芯片包括捕捉區和用針對目標分析物的抗體涂覆的區域。這些捕捉區由聚酰亞胺的疏水環或另一種光刻產生的層界定。將以一些形式(例如結合至乳膠微球體)包含抗體的一個或幾個微滴(大小約5至40納升)分配在傳感器的表面上或傳感器上的選擇性滲透層上。光限定的環包含該含水微滴，從而允許抗體涂覆的區域定位至數個微粒的精確度。可產生大小為0.03至約2平方毫米的捕捉區。該大小的上限受到本實施方案中的導管和傳感器的大小的限制，并且不是本發明的限制。因此，用與Tnl/AP-aTnl復合物結合的生物層73 (例如共價連接的抗-肌鈣蛋白I抗體)涂覆金電極74。從而AP被固定至緊靠電極，與最初存在于樣品中的分析物的量成正比。除了特異性結合外，酶-抗體綴合物可非特異性結合傳感器。非特異性結合提供了來自傳感器的本底，所述本底是不期望的并且優選將其減小至最小。如上所述，漂洗方案，特別是將分段流體用于漂洗傳感器，提供了使該本底信號減小至最小的高效方法。在緊接漂洗步驟的第二步驟中，將被例如堿性磷酸酶水解以產生電活性產物76的底物75呈遞給傳感器。在具體的實施方案中，底物由磷酸化二茂鐵或對-氨基苯酚組成。將安培計電極設置在足以氧化或還原水解底物的底物(但非直接氧化或還原所述底物)的固定電化學電位上，或將電位在適當的范圍內掃描一次或多次。任選地，可以用這樣的層涂覆第二電極在制造過程中制造分析物/AP抗-分析物的復合物例如Tnl/AP-aTnl，以用作用于測量的參考傳感器或校準工具。
在本實施例中，傳感器包括兩個安培計電極，其用于檢測從4-氨基苯基磷酸鹽與酶標記堿性磷酸酶的反應酶促產生的4-氨基苯酚。優選從用聚酰亞胺的光限定的層涂覆的金表面產生電極。絕緣聚酰亞胺層中的規則間隔的開口界定了在其上以2個電子/分子反應氧化的4-氨基苯酚的小金電極的網格。傳感器電極還包括生物層，而參考電極可以例如從不存在生物層的金電極或從銀電極或其它適當的材料構建。不同的生物層可提供具有感知不同分析物的能力的各種電極。可選擇底物例如對-氨基苯酚以便底物和產物的E (1/2)顯著不同。優選地，底物的伏安半波電位E(l/2)比產物的顯著更高(更加正)。當條件滿足時，可在底物存在的情況下選擇性電化學測量產物。電極的大小和間距在測定靈敏度和本底信號中起著重要作用。格子中的重要參數 是暴露的金屬的百分比和活性電極之間的間距。電極的位置可以直接在抗體捕捉區之下或偏離捕捉區受控的距離。電極的實際安培計信號取決于傳感器相對于捕捉抗體位置的定位和在分析過程中流體的運動。記錄電極上的電流，所述電流取決于傳感器附近的電活性產物的量。本實施例中堿性磷酸酶活性的檢測依賴于4-氨基苯酚氧化電流的測量。這可在約+60mV相對于Ag/AgCl接地芯片的電位實現。所用的檢測的確切形式取決于傳感器構型。在傳感器的一個形式中，金微電極的陣列直接位于抗體捕獲區之下。當分析流體被拉在該傳感器上方時，位于捕獲位點上的酶在酶限制的反應中將4-氨基苯酚磷酸轉化成4-氨基苯酚。選擇4-氨基苯基磷酸的濃度以使之過剩，例如10倍于Km值。分析溶液是0. IM(在二乙醇胺中)，I. OM NaCl (被緩沖至pH 9. 8)。此外，分析溶液包含0. 5mM MgCl2，其為酶的輔因子。或者，碳酸鹽緩沖液具有期望的性質。在另一個電極幾何學實施方案中，電極位于離捕捉區域數百微米的地方。當將分析流體的新鮮區段拉至捕捉區上方時，酶產物建立而不存在因電極反應的丟失。在一段時間后，溶液被緩慢地從捕捉區拉至檢測器電極上方，從而導致產生電流峰，從所述電流峰可測定酶活性。堿性磷酸酶活性的靈敏檢測的重要考慮是與在金傳感器上發生的本底氧化和還原相關的非-4-氨基苯酚電流。金傳感器傾向于在這些電位上在堿性緩沖液中提供顯著的氧化電流。本底電流在很大程度上取決于緩沖液濃度、金電極的面積(暴露的面積)、表面預處理和所用緩沖液的性質。二乙醇胺是特別好的用于堿性磷酸酶的激活緩沖液。在摩爾濃度上，酶促速率增加為非激活緩沖液例如碳酸鹽的約3倍。在替代實施方案中，綴合至抗體或其它分析物-結合分子的酶是尿素酶，并且底物是尿素。通過使用銨靈敏電極在本實施方案中檢測到了通過尿素的水解產生的銨離子。銨特異性電極對于本領域技術人員來說是公知的。適當的微制造的銨離子選擇性電極公開于美國專利No. 5，200，051 (通過引用并入本文)中。與底物反應以產生離子的其它酶在本領域是已知的，對于與其一起使用的其它離子傳感器在本領域也是已知的。例如，可在磷酸根離子選擇性電極上檢測到從堿性磷酸酶的底物產生的磷酸根。現參考圖8，其中顯示了微制備免疫傳感器的實施方案的構建。優選地，提供平面非導電基底80，通過本領域技術人員已知的常規方法或微制造在所述非導電基底上沉積導電層81。導電材料優選是貴金屬例如金或鉬，雖然也可使用其它惰性金屬例如銥，也可能使用石墨、導電聚合物或其它材料的非金屬電極。還提供了電氣連接82。將生物層83沉積在至少一部分電極上。在本公開內容中，生物層意指在其表面上包含充足量的分子84(所述分子可結合目標分析物或通過產生能夠測量的變化來對這樣的分析物的存在作出反應)的多孔層。任選地，可在電極與生物層之間插入選擇性滲透篩選層以篩選電化學干擾，如美國專利No. 5，200，051中所描述的。在具體的實施方案中，從具有約0. 001至50微米的范圍內的特定直徑的乳膠珠子構建生物層。通過共價連接與上述生物層的定義一致的任何適當的分子來修飾珠子。本領域存在許多連接方法，包括提供胺反應性N-羥基琥珀酰亞胺酯基團以容易地偶聯蛋白質的賴氨酸或N-末端氨基。在具體的實施方案中，生物分子選自離子載體、輔因子、多肽、蛋白質、糖肽、酶、免疫球蛋白、抗體、抗原、外源凝集素、神經化學物質受體、寡核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA或適當的混合物。在最具體的實施方案中，生物分子是經選擇以結合人絨毛膜促性腺素、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白復合物、肌酸激酶、肌酸激酶亞基M、肌酸激酶亞基B、肌紅蛋白、肌球蛋白輕鏈或這些蛋白的經修飾的片段的一個或多個的抗體。此類修飾的片段是通過至少一個氨基酸的氧化、還原、缺失、添加或修飾(包括利用天然部分或利用合成部分的化學修飾)產生的。優選地，生物分子特異性結合分析物并且具 有約10_7至10_15M的結合分析物配體的親和常數。在一個實施方案中，通過下列方法將包含具有通過適當分子共價修飾的珠子的生物層附著至傳感器。將微分散針用于將一小微滴(優選約20nL)經修飾的珠子的懸浮液沉積在傳感器表面上。允許微滴干燥，這導致在表面上形成在使用過程中抵抗排出的珠子的涂層。除了其中生物層相對于安培計傳感器存在于固定位置中的免疫傳感器外，本發明還設想了其中將生物層涂覆在可移動的顆粒例如測定珠子上的實施方案。筒可包含能夠與分析物相互作用的可移動微粒，例如在捕獲步驟之后定位至安培計電極的磁性顆粒，其中磁力被用于將顆粒濃縮在電極上以進行測定。本發明的可移動的微粒的一個有利方面是它們在樣品或流體中的運動會加速結合反應，從而使得測定的捕捉步驟更快。對于使用非磁性可移動的微粒的實施方案，將多孔濾器用于在電極捕捉珠子。注意，關于本發明的消耗珠子，當測定珠子具有磁性時，消耗珠子優選是非磁性的并且被單獨隔離。此外，當測定珠子不具有磁性時，消耗珠子優選是有磁性的并且被單獨隔離。現參考圖9，其中顯示了用于單個基底上的幾個電極的掩模設計。關于掩蔽和蝕刻技術，可沉積獨立的電極和導線。因此，以低成本在緊湊的面積上提供多個免疫傳感器94和96以及電導測定傳感器90和92連同它們各自的連接墊91、93、95和97，以實現至讀數裝置的電氣連接。原理上，可以以這樣的方式裝配非常大的傳感器陣列，每一個傳感器對不同的分析物靈敏或用作對照傳感器或參考免疫傳感器。具體地，可如下制備免疫傳感器。加熱氧化硅晶片以形成約I微米絕緣氧化物層。將鈦/鎢層濺射在氧化層上達到100至1000埃的優選厚度，然后濺射一層最優選800埃厚的金。隨后，將光致抗蝕劑旋制在晶片上，并干燥和適當地烘焙。隨后使用接觸掩模例如相應于圖9中顯示的接觸掩模使表面曝光。對潛像(latent image)顯影,將晶片與金-蝕刻劑接觸。用光可限定的聚酰亞胺涂覆圖案化的金層，適當地烘焙，使用接觸掩模進行曝光，顯影，在O2漿(plasma)中進行清潔，優選在350° C碘化5小時。可對晶片背側進行任選的金屬化以用作電阻加熱元件(resistive heating element),其中免疫傳感器將被用于恒溫器形式中。隨后用抗體涂覆的顆粒打印表面。將優選具有約20nL的體積并且包含1%固體內容物(在去離子水中)的微滴沉積在傳感器區域并且通過風干原位干燥。任選地，將抗體穩定化劑(由SurModica Corp. or AET Ltd提供的)涂覆在傳感器上。干燥顆粒以使它們以阻止在樣品或包含底物的流體中溶解的方式粘附至表面。該方法提供了可靠且可重現的適用于制造高容量的傳感器芯片的固定方法。實施例2關于筒的使用方法，未計量的流體樣品通過樣品進入端口 4被導入筒的樣品保持室34。毛細管栓25阻止樣品在該階段進入導管15，并且使保持室34充滿樣品。關閉蓋子2或組件200以阻止樣品從筒滲漏。隨后將筒插入讀數裝置，例如屬于Zelin的美國專利No. 5，821，399 (將其通過引用并入本文)中公開的讀數裝置。將筒插入讀數裝置激活了機 械裝置，當包裝被壓靠在尖狀物38上時，所述機械裝置刺穿位于42上的包含流體的包裝。從而流體被排入第二導管，以39、20、12和11的順序到達。12上的縊縮阻止液體的進一步運動，因為殘余靜水壓被經第二導管部分11進入廢料室44的流體流動所消散。在第二步驟中，泵裝置的操作對氣囊43施加壓力，迫使空氣通過導管40，通過切除物17和18，在預定的位置27進入導管34。毛細管栓25和位置27界定了原始樣品的計量部分。當樣品在樣品保持室34內時，其被室的內表面上的包含消耗珠子和其它材料的干試劑涂層修正。隨后通過在氣囊43內產生的氣壓將樣品的計量部分排出通過毛細管栓。樣品通過導管15并且與位于切除物35內的分析物傳感器接觸。在使用位于切除物35內的免疫傳感器的實施方案中，在樣品到達傳感器之前，利用例如酶-抗體綴合物(信號抗體)修正所述樣品。為了促進分析物與傳感器的高效結合，任選地將包含分析物的樣品以振蕩運動在傳感器上方反復通過。優選，使用約0. 2至2Hz，最優選0. 7Hz的振蕩頻率。因此，使與信號抗體結合的信號酶緊鄰安培計電極表面，與存在于樣品中的分析物的量成正比。一旦已提供分析物/酶-抗體綴合物復合物結合免疫傳感器的機會，就通過對氣囊43進一步施加壓力來射出樣品，樣品進入廢料室44。洗滌步驟接著從傳感器室除去非特異性結合的酶-綴合物和消耗珠子。通過泵裝置43將第二導管中的流體移動至與傳感器接觸。分析流體被緩慢地拉動直至在電導傳感器上檢測到第一空氣段。可通過任何適當的方法在導管內產生空氣段，包括但不限于(I)被動方法，如圖14中顯示和下文中描述的；(2)主動方法，包括使用泵短暫地降低導管內的壓力，其中空氣通過瓣或閥門被抽入導管；或(3)通過溶解預置于導管內的化合物，所述化合物在與導管內的流體接觸后釋放氣體，其中這樣的化合物可包括碳酸鹽、碳酸氫鹽等。該區段在從導管15清除樣品污染的流體上是極有效的。漂洗傳感器區域的效率可通過如所描述的將一個或多個空氣段導入第二導管來極大地增加。使空氣段的前沿和/或后緣在傳感器上通過一次或多次以漂洗和重懸浮可能已從樣品沉積的外來物質。外來物質包括除特異性結合的分析物或分析物/抗體-酶綴合物復合物外的任何材料。然而，本發明的目的是使漂洗不要達到足以促進特異性結合的分析物或分析物/抗體-酶綴合物復合物從傳感器分離的延長時間或劇烈程度。將空氣段導入流體的第二有利方面是分割流體。例如，在流體的第一個區段用于漂洗傳感器后，隨后將第二區段置于傳感器上方，兩個區段以最低限度混合。該特征通過更有效率地除去未結合的抗體-酶綴合物而進一步減小來自傳感器的本底信號。在前沿洗滌后，分析流體被緩慢地拉動直至在電導傳感器中檢測到第一空氣段。該區段在清除與第一分析流體樣品混合的樣品污染的流體上是極有效的。為了進行測量，將新的流體部分置于傳感器上方，并且將電流或電位記錄為時間的函數(在對操作模式適宜的情況下)。實施例3現參考圖15，其 中顯示了免疫傳感器筒的俯視圖。筒150包括底座和頂部，優選由塑料構成。兩個部分通過細的粘著性墊圈或細的柔性薄膜連接。如在先前的實施方案中一樣，裝配的筒包括樣品保持室151(通過樣品入口 167將包含目標分析物的樣品導入其中)。如之前一樣通過毛細管栓152 (優選由連接筒的兩個部分的墊圈或薄膜中的0. 012英寸(0.3mm)的激光掏槽孔(laser cut hole)形成)和位于樣品保持室內的預定的點上的進入點155 (通過泵裝置例如漿的作用壓迫樣品膈膜156將空氣由此處導入)的組合作用經樣品導管154(第一導管)將樣品的計量部分遞送至傳感器芯片153。在接觸傳感器以允許結合發生之后，樣品被移動至排氣口 157，該排氣口包括吸收樣品的芯吸材料，從而使關閉的排氣孔密封以防止液體或空氣的進一步通過。芯吸材料優選是棉花纖維材料、纖維素材料或具有孔的其它親水材料。在本申請中重要的是所述材料具有充足的吸收力(即，具有足夠的芯吸速度)，閥門在與下文中描述的樣品膈膜驅動裝置的隨后縮回相當的時期內關閉，這樣樣品隨后不被抽回傳感器芯片的區域。如在特定的實施方案中顯示的，提供了洗滌導管(第二導管)158，其在一端連接至排氣口 159并且在另一端連接至位于排氣口 157與傳感器芯片153之間的樣品導管的點160上的樣品導管。在將筒插入讀數裝置后，流體被導入導管158。優選地，流體最初存在于箔袋161內，當驅動裝置對小袋施壓時所述箔袋被刺破。還提供了通過墊圈163中的小開口將流體連接至導管154的短導管162。第二毛細管栓最初防止流體到達毛細管栓160，以便流體保留在導管158內。在已關閉排氣口 157后，開動泵，從而在導管154內產生降低的壓力。排氣口164(優選在墊圈中包括小瓣切(flap cut)或振動以提供間斷氣流的膜)提供了用于空氣經第二排氣口 165進入導管158的裝置。第二排氣口 165優選還包括當被濕潤時能夠關閉排氣口的芯吸材料，需要時，所述芯吸材料允許樣品膈膜156隨后凹陷以封閉排氣口 165。與樣品膈膜156的驅動同時，流體經毛細管栓160從導管158被抽入導管154。因為流體的流動被空氣進入口 164打斷，所以至少一個空氣段(區段或區段流)被導入。樣品膈膜156的進一步縮回將包含至少一個空氣段的液體抽回穿過傳感器芯片153的傳感表面。液體內空氣-液體邊界的存在增強了傳感器芯片表面的漂洗以除去剩余樣品。優選地，樣品膈膜156的運動受到安裝在與分析傳感器相鄰的傳感器芯片內的電導電極接收的信號的控制。這樣，液體在芯片上的存在可被檢測到，并且可通過在分開的步驟中通過流體的運動來進行多個讀取。當只有流體薄膜覆蓋芯片、接地芯片(ground chip) 165和傳感器與接地電極之間的導管154的壁的連續部分時，有利地在本實施方案中進行分析物測量。通過操作樣品膈膜156抽出流體來獲得適當的薄膜，直至緊鄰傳感器的電導測定傳感器顯示大體積液體不再存在于導管154的區域中。已發現可在極低(nA)電流下進行測量，因接地芯片與傳感器芯片之間的薄膜的增加的阻抗(與大體積流體相比較)而產生的電位下降不明顯。接地芯片165優選是銀/氯化銀。為了避免在相對疏水的氯化銀表面上容易形成的空氣段，有利地將接地芯片圖案化為散布有更親水的區域例如二氧化硅的表面的銀/氯化銀的小區域。因此，優選接地電極構型包括密集排列的并且散布有二氧化硅的銀/氯化銀方塊的陣列。如果銀/氯化銀的區域有些凹陷，對于避免非有意的區段是更有利的。現參考圖16，其中顯示了免疫傳感器筒的優選實施方案的流控技術的圖解視圖。區域R1-R7表示與特定操作功能相關的導管的特定區域。因此Rl表示樣品保持室；R2是籍以將樣品的計量部分排出至捕捉區域的樣品導管，并且在所述導管中任選地用涂覆在導管壁上的物質修正樣品；R3表示捕捉區域，其安放有電導測定傳感器和分析物傳感器；R4和R5表示任選地用于進一步利用涂覆在導管壁上的物質修正流體的第一導管的部分，通過其實現更復雜的測定方案；R6表示在將筒插入讀數裝置后，向其中導入流體的第二導管的部分；R7包括位于毛細管栓160與166之間的導管的一部分，在所述部分中可進行進一步修正；R8代表位于點160與排氣口 157之間的導管154的部分，其還可被用于修正包含在其中的液體。實施例4關于流控技術和分析物測量的協作，在分析順序中，用戶將樣品置于筒中，將筒置于分析儀中，并且在I至20分鐘內，進行一種或多種分析物的定量測量。此處是在分析過程中發生的事件的順序的非限定性實例(I)將25至50 ii L樣品導入樣品入口 167，然后填充至毛細管栓151，該毛細管栓由在將罩子和底座組件保持在一起的膠帶中的0.012英寸(0. 3mm)的激光掏槽孔形成。將 一種或多種包含消耗珠子+任選地用于緩解干擾的其它材料和優選地信號抗體的干試劑涂層溶解在樣品中。用戶旋轉安裝在按鈕瓣(snap flap)上的乳膠橡膠盤以關閉樣品入口167和將筒置于分析儀中。(2)分析儀與筒接觸，然后馬達驅動的活塞壓在箔袋161上迫使洗滌/分析流體流出進入中央導管158。(3)獨立的馬達驅動的活塞接觸樣品膈膜156，沿著樣品導管推動樣品的測量區段(從試劑區域Rl至R2)。通過電導傳感器在傳感器芯片153上檢測樣品。傳感器芯片位于捕獲區域R3。(4)以預定和受控的方式利用R2與R5之間的樣品膈膜156振蕩樣品，持續受控的時間，以促進與傳感器的結合。(5)將樣品推向筒的廢液區(R8)并且與以纖維素或類似的吸收芯形式存在的被動泵157接觸。濕潤該芯的作用使芯對氣流產生密封，從而消除其排泄由樣品膈膜156產生的多余壓力的能力。主動排氣口(active vent)成為圖16的“受控排氣口 ” (6)樣品導管的快速排空(通過從樣品膈膜156縮回馬達驅動的活塞來實現)迫使空氣(來自排氣口)和洗滌/分析流體的混合物從第二導管移動進入位于圖16中的R5與R4之間的進口。通過重復樣品導管的快速排空，產生一系列空氣分隔的流體區段，所述區段被拉動穿過傳感器芯片朝向樣品入口(從R4至R3至R2和R1)。這洗滌不含過量試劑的傳感器并且利用適用于分析的試劑濕潤傳感器。源自箔袋的洗滌/分析流體還可通過在中央洗滌/分析流體導管內的R7與R6中添加試劑來修正。
(7)洗滌/分析流體區段以更慢的速度被抽向樣品入口以產生只包含一薄層分析流體的傳感器芯片。在該點上進行電化學分析。優選分析方法是電流測定法但也可使用電位測定法或阻抗檢測。(8)機械裝置收回，從而使筒從分析儀取出。實施例5在一些實施方案中，為了評估在測定過程中發生的非特異性結合的程度，設備利用免疫-參考傳感器。除免疫試劑是抗-HSA(人血清白蛋白)抗體而非抗-分析物抗體夕卜，以與分析物免疫傳感器同樣的方式制造免疫-參考傳感器。在與人全血或血漿樣品接觸后，參考電極被特異性結合的HAS涂覆，HAS是存在于所有人血液樣品中的豐富的內源蛋白質，從而為所有使用本發明的免疫測定形式的單個測試運行提供共同參照。因不充分的洗滌而產生的或因干擾存在而產生的NSB可通過該第二傳感器來監測。來自測定的凈信號由從分析物免疫傳感器產生的特異性信號(通過扣除從參考 傳感器產生的非特異性信號而修正)組成，例如凈信號=分析物傳感器信號-參考傳感器信號-偏移，如上述公式4中顯示的。“偏移”是解釋待經歷NSB的兩個傳感器的趨勢的差異的系數。實際上，其解釋每一個傳感器在它們非特異性結合綴合物的能力方面的相對“粘度”，并且是基于不含分析物和不含干擾的樣品的反應建立的。這可通過獨立實驗來進行。在參考傳感器上耐受的信號的量受制于由質量控制算法確定的限制，所述算法尋求在低分析物濃度上保證結果的完整性，其中NSB的效應最可能以可在臨床環境中改變決策制定的方式影響測定結果。基本原理是過量信號在參考傳感器上的存在用作NSB存在(因不充分的洗滌步驟或干擾而產生的)的標識。雖然上述的本發明通常涉及在利用全血樣品的分析物免疫測定中減少或消除來自白細胞的干擾，但其也適用于在其它類型的生物樣品(在所述生物樣品中可能存在白細胞，例如腦脊髓液)中進行的免疫測定。此外，其適用于其中可存在殘留白細胞(雖然有意地通過離心或過濾除去它們)的樣品，例如血漿。其也適用于可以例如利用緩沖液稀釋的樣品。此外，雖然本發明通常涉及通過將干試劑溶解在樣品中來修正樣品，但其也實際上在其它實施方案中用于在分析過程中或在樣品收集過程中將試劑以液體形式添加至樣品。也明顯地，在本文中已在電化學檢測方法例如安培計法和電位測定法方面描述了本發明，雖然其同樣地適用于其它檢測模式，特別是光傳感法例如基于發光、熒光和吸光度的方法。雖然已根據多個優選實施方案描述了本發明，但本領域技術人員承認可進行各種修飾、置換、省略和改變而不背離本發明的精神。例如，雖然說明書的部分涉及非競爭性夾心免疫測定法，但本發明的設備和方法類似地可用于競爭性免疫測定。此外，其目的是，本發明的范圍僅受下列權利要求的范圍限制。
權利要求
1.一種用于對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行夾心式免疫測定的試劑盒，包括針對白細胞進行了調理作用的消耗珠子，針對分析物的固定的第一抗體和針對分析物的標記的第二抗體。
2.權利要求I的試劑盒，其中所述分析物選自BNP、proBNP、NTproBNP、cTnI、TnT、HCG、TSH、PSA、D- 二聚體、CRP、肌紅蛋白、NGAL, CKMB和髓過氧化物酶。
3.權利要求I的試劑盒，其中所述消耗珠子包括用非人IgG或其片段涂覆的基底珠子。
4.權利要求3的試劑盒，其中所述基底珠子由選自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成。
5.權利要求I的試劑盒，其中所述消耗珠子包括利用選自蛋白質、細菌、病毒和異型生物質的材料或其片段涂覆的基底珠子。
6.權利要求I的試劑盒，其中所述消耗珠子是經穩定的細菌或細菌孢子。
7.權利要求I的試劑盒，其中所述消耗珠子具有O.01 μ m至20 μ m的平均粒度。
8.權利要求I的試劑盒，其中所述消耗珠子具有O.I μ m至5 μ m的平均粒度。
9.權利要求I的試劑盒，其中所述消耗珠子以足以提供每微升樣品至少IO4個珠子的溶解的消耗珠子濃度的量存在。
10.權利要求I的試劑盒，其中所述固定的第一抗體附著至傳感器，所述傳感器選自安培計電極、電位測定電極、電導測定電極、光波導、表面等離子體共振傳感器、聲波傳感器和壓電式傳感器。
11.權利要求I的試劑盒，其中固定的第一抗體附著至測定珠子，并且測定珠子附著至安培計電極。
12.權利要求I的試劑盒，其中所述消耗珠子和第二標記的抗體在一種或多種可溶解的干試劑涂層中。
13.權利要求I的試劑盒，其中所述標記的第二抗體用選自放射性標記物、酶、生色團、熒光團和化學發光物質種類的標記物進行標記。
14.權利要求I的試劑盒，其中所述標記的第二抗體用選自堿性磷酸酶、葡萄糖苷酶、黃遞酶、辣根過氧化物酶和葡萄糖氧化酶的酶標記。
15.一種用于對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行夾心式免疫測定的筒，所述筒包括 (a)接收血液樣品的樣品入口； (b)用于計量血液樣品以形成計量樣品的計量室； (C) 一個或多個包含針對白細胞進行了調理作用的消耗珠子和針對分析物的標記的抗體的干試劑涂層； (d)包含針對分析物的固定抗體的電極；和 (e)用于將計量樣品、流態化的消耗珠子和標記的抗體移至電極的一個或多個泵件。
16.權利要求15的筒，其中所述分析物選自BNP、proBNP、NTproBNP,cTnl、TnT, HCG,TSH、PSA、D- 二聚體、CRP、肌紅蛋白、NGAL, CKMB和髓過氧化物酶。
17.權利要求15的筒，其中所述消耗珠子包括用非人IgG或其片段涂覆的基底珠子。
18.權利要求17的筒，其中所述基底珠子由選自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成。
19.權利要求15的筒，其中所述消耗珠子有O.Ol μ m至20 μ m的平均粒度。
20.權利要求15的筒，其中所述消耗珠子以足以提供每微升樣品至少IO4個珠子的溶解的消耗珠子濃度的量存在。
21.權利要求15的筒，其中一個或多個干試劑涂層沉積在計量室內。
22.—種對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行夾心式免疫測定的方法，包括 (a)將懷疑含有分析物的血液樣品暴露于針對白細胞進行了調理作用的消耗珠子、針對分析物的固定的第一抗體、和標記的第二抗體以形成包含所述第一抗體、所述分析物和所述第二抗體的復合物；和 (b)測定復合的標記物的量。
23.權利要求22的方法，其中所述消耗珠子在有效地使樣品中的白細胞優先吞噬消耗珠 子的條件下接觸血液樣品。
24.權利要求22的方法，其中所述分析物選自BNP、proBNP、NTproBNP、cTnI、TnT、HCG、TSH、PSA、D- 二聚體、CRP、肌紅蛋白、NGAL, CKMB和髓過氧化物酶。
25.權利要求22的方法，其中所述消耗珠子包括用非人IgG或其片段涂覆的基底珠子。
26.權利要求25的方法，其中所述基底珠子由選自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成。
27.權利要求22的方法，其中所述消耗珠子具有O.01 μ m至20 μ m的平均粒度。
28.權利要求22的方法，其中所述消耗珠子具有O.I μ m至20 μ m的平均粒度。
29.權利要求22的方法，其中所述消耗珠子以足以提供每微升樣品至少IO4個珠子的溶解的消耗珠子濃度的量存在。
30.權利要求22的方法，其中所述血液樣品是以抗凝劑修正的全血。
31.權利要求22的方法，其中所述血液樣品與消耗珠子混合，然后與固定的第一抗體混合，然后與標記的第二抗體混合。
32.權利要求22的方法，其中在大體上相同的時間所述血液樣品與消耗珠子、固定的第一抗體和標記的第二抗體混合。
33.權利要求22的方法，其中在大體上相同的時間所述血液樣品與固定的第一抗體和標記的第二抗體混合。
34.權利要求22的方法，其中在血液樣品與固定的第一抗體混合之前，在大體上相同的時間血液樣品與消耗珠子和標記的第二抗體混合。
35.一種實質性減少白細胞在分析物免疫傳感器上積累的方法，所述免疫傳感器包含固定在電極上的針對分析物的抗體涂覆的珠子，所述方法包括步驟 a)將懷疑包含分析物的樣品與消耗珠子混合以形成修正的樣品，其中樣品中的白細胞優先吞噬消耗珠子，和 (b)將修正的樣品與免疫傳感器接觸。
36.權利要求35的方法，其中所述消耗珠子以足以提供每微升樣品至少IO4個珠子的溶解的消耗珠子濃度的量存在。
37.一種對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行免疫測定的方法，包括 (a)將懷疑包含分析物的血液樣品與過量的消耗珠子混合以形成修正的樣品，其中樣品中的白細胞優先吞噬消耗珠子；(b)將修正的樣品與包含固定在電極上的針對分析物的抗體涂覆的珠子的免疫傳感器接觸，以在所述抗體-涂覆的珠子、所述分析物和第二標記抗體之間形成夾心； (C)從所述免疫傳感器洗滌所述血液樣品；和 (d)使用所述免疫傳感器測定所述夾心式標記物的量和使所述標記物的量與樣品中的分析物的濃度相關聯。
38.一種用于對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行夾心式免疫測定的方法，所述方法包括 (a)將懷疑包含分析物的血液樣品與過量的進行了調理作用的消耗珠子混合以形成修正的樣品，其中樣品中的白細胞優先吞噬消耗珠子； (b)將修正的樣品與針對分析物的抗體涂覆的珠子在有效地在所述抗體涂覆的珠子、所述分析物和第二標記抗體之間形成夾心的條件下接觸； (C)從所述抗體涂覆的珠子洗滌所述血液樣品；和 (d)測定所述夾心式標記物的量和使所述標記物的量與樣品中的分析物的濃度相關聯。
39.一種用于對懷疑存在于血液樣品中的分析物進行免疫測定的測試筒，所述測試筒在導管中包含免疫傳感器，所述免疫傳感器具有針對分析物的固定的第一抗體，所述導管具有沉積在其中的干試劑涂層，所述干試劑涂層包含消耗珠子和針對所述分析物的第二標記的抗體并且被配置為溶解于所述血液樣品中。
全文摘要
本發明涉及用于在分析物免疫測定、尤其是非競爭性免疫測定中減少來自白細胞的干擾的方法和設備。在一個實施方案中，本發明是包括如下步驟的方法(a)用消耗珠子修正生物樣品例如全血樣品；和(b)對修正的樣品進行競爭性免疫測定以測定所述分析物在所述樣品中的濃度。優選，用IgG-涂覆的消耗珠子修正樣品。
文檔編號G01N33/543GK102713627SQ201080061356
公開日2012年10月3日 申請日期2010年11月17日 優先權日2009年11月17日
發明者A·R·摩絲, G·戴維斯, J·L·E·坎貝爾 申請人:雅培醫護站股份有限公司