專利名稱：用于檢測pnh ii型白細胞的試劑和方法及其作為血栓形成病癥的風險因子的鑒定的制作方法
技術領域：
本發明的領域是醫學、免疫學、分子生物學和蛋白質化學。直量
陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是罕見的衰弱性疾病，其特征尤其為血細胞生成異常、補體介導的血管內溶血和血栓形成傾向。參見例如Rosse和Nishimura (2003) IntJ Hematon] (2、: 121-124 和 fcodsky (2008) Blood Rev22(2) : 65-74。PNH 由 X 連鎖磷脂酸肌醇聚糖互補型 A 類(phosphatidylinositol glycan complementation class A,PIGA)基因中的體細胞突變引起，該基因編碼糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨生物合成最初步驟所必需的酶。參見 Miyata 等(I"3) ^^/7^259:1318-1320 和 Bessler 等(1994) EMBOゾ益:110-117。GPI錨(GPI anchor)將許多蛋白質與造血細胞表面連接。這些所謂的GPI錨定蛋白(GPI-anchored protein)尤其包括補體調節蛋白，例如CD55 (DAF)和CD59。根據發生在PIGA基因上的突變的類型，可導致GPI錨生物合成的部分喪失或完全喪失，其相當于細胞表面上GPI錨定蛋白(例如GPI錨定的CD55和CD59)存在的部分喪失或完全喪失。參見Rosse (1997)63-93。紅細胞(RBC)表面上補體調節蛋白的部分或
完全缺乏導致這些細胞對補體介導的裂解的敏感性升高和受累患者中PNH的相關癥狀。參見 Nicholson-Weller 等(1983) Proc Natl AcacI Sci [/SA80:5066-5070 和 Yamashina 等(1990) N Eml λ ifeJ323:1184-1189。傳統上，PNH的診斷和PNH患者的監測包括采用流式細胞術，對RBC和粒細胞表面上的 CD55 和 CD59 表達進行分析。Sutherland 等(2009) Am J Clin / 從132:564-572。最近研發的PNH診斷方法采用了重組的非裂解形式的細菌蛋白質氣單胞菌溶素，其與造血細胞表面上的GPI錨結合。參見授予Buckley和Brodsky的美國專利號6，593，095。傳統的和新的方法兩者皆可供醫學從業人員將PNH患者的RBC或白細胞分成以下三類之ー 1型細胞，其具有正常或幾乎正常的細胞表面表達的GPI錨定蛋白；PNH III型細胞，其沒有或完全缺乏細胞表面表達的GPI錨定蛋白；和PNH II型細胞，其具有中等水平的細胞表面表達的GPI錨定蛋白。Brodsky等(2000) Am J Clin / 從114:459-466。由于白細胞譜系中的II型細胞難以與正常I型白細胞相區別開來，因此未對這些細胞進行表征。本公開內容至少部分基于本發明人的以下發現與不具有PNH II型細胞群或具有白細胞和紅細胞分別少于I. 2%或0. 02%的PNH II型細胞群的患者相比，具有至少I. 2%的PNH II型白細胞群或至少0. 02%的PNH II型紅細胞群的患者更可能患血小板減少癥。患有因血小板破壞所致血小板減少癥的患者極更可能發生血栓形成，而在PNH患者中，血栓形成是死亡的主要原因。因此，本公開內容提供用于根據患者中相對的PNH II型細胞群確定患者是否處于血小板減少癥和/或血栓形成風險增加的狀態的方法。部分通過開發檢測PNH II型細胞的改進方法，輔助鑒定PNH II型細胞和血小板減少癥之間的關系。因此，本公開內容還提供可用于在例如患者的生物樣品中檢測PNH II型細胞(例如II型白細胞和/或II型紅細胞)的試劑和方法。本公開內容還提供用于根據患者中PNH II型細胞的存在情況或量診斷和治療患者的方法。例如，本公開內容的特征在于根據在疑患PNH的患者的生物樣品中檢測的PNH II型白細胞的百分比而確定患者的血小板減少癥的風險的方法。本文所述診斷方法具有優于現有技術方法的許多優勢。例如，本文所述 方法可更有效地將PNH II型白細胞與I型細胞分離，這可供更準確和精密地測量生物樣品中II型細胞的百分比，以及更準確地評價包含II型和III型細胞兩者的PNH克隆的整體大小。另外，因為紅細胞的高度更新(因對補體介導的裂解的敏感性升高所引起的PNH III型RBC固有的較短壽命)和PNH患者接受頻繁的RBC輸入，因此依賴于II型RBC上GPI表達的PNH診斷方法可能不可靠。因此，本文所述診斷方法不僅可供從業人員準確精密地量化生物樣品中II型白細胞的百分比，從而量化樣品中的異常克隆整體大小，而且該方法還比依賴于檢測相對不穩定的PNH II型RBC群的現有方法更可靠。在一個方面，本公開內容的特征在于用于預測患者是否處于血栓形成風險增加的狀態的方法。所述方法包括根據表明患者處于血栓形成風險增加的狀態的患者的生物樣品中相同組織學類型(相同譜系)的細胞總數的PNH II型細胞的百分比，確定患者是否處于血栓形成風險增加的狀態。在另一個方面，本公開內容的特征在于用于預測患者是否可能是血小板減少性的方法。所述方法包括根據表明患者可能是血小板減少性的患者的生物樣品中相同組織學類型(相同譜系)的細胞總數的PNH II型細胞(例如II型紅細胞和/或II型白細胞)的百分比，確定患者是否可能是血小板減少性的。在另一個方面，本公開內容的特征在于用于確定患者是否處于血栓形成風險增加的狀態的方法。所述方法包括提供(或接收)有關患者的生物樣品中相同組織學類型(相同譜系)的總細胞的PNH II型細胞的百分比的信息；和確定患者是否處于血栓形成風險增加的狀態，其中生物樣品中相同組織學類型的細胞總數的PNH II型細胞的百分比表明患者處于血栓形成風險增加的狀態。在另一個方面，本公開內容的特征在于用于預測患者是否處于發生血栓形成風險的狀態的方法，所述方法包括測定患者的生物樣品中PNH II型細胞的百分比；和提供患者是否處于血栓形成風險增加的狀態的預測，其中生物樣品中相同組織學類型的細胞總數的PNH II型細胞的百分比表明患者處于血栓形成風險增加的狀態。在一些實施方案中，PNH II型細胞是白細胞(例如粒細胞或單核細胞)。在一些實施方案中，PNH II型細胞是紅細胞。在本文所述任何方法的一些實施方案中，大于或等于I. 2%的PNH II型白細胞的百分比與大于或等于0. 02%的PNH II型紅細胞的百分比的組合表明患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態或可能是血小板減少性的。在本文所述任何方法的一些實施方案中，當PNH II型白細胞的百分比為至少I. 2%(例如至少 I. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9,2,2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9、
3.3.1.3.2.3.3.3.4.3.5.3.6.3.7.3.8,3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65. 3%或70%以上)時，患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態(和/或可能是血小板減少性的)。在本文所述任何方法的一些實施方案中，當PNH II型紅細胞的百分比為至少0. 02% (例如至少0. 02,0. 03,0. 04,0. 05,0. 06,0. 07、
0.08、0. 09、0. U0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、I、I. I、I. 2、I. 3、I. 4、I. 5、I. 6、I. 7、
1.8、1. 9、2、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、 3.8,3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71. 3%或75%以上)時，患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態(和/或可能是血小板減少性的)。在本文所述任何方法的一些實施方案中，介于I. 2%_65%之間、包括I. 2%和65%的PNH II型白細胞群表明患者處于血栓形成風險增加的狀態(和/或可能是血小板減少性的)。在一些實施方案中，大于或等于5%的PNH II型白細胞群表明患者處于血栓形成風險增加的狀態(和/或可能是血小板減少性的)。在一些實施方案中，大于或等于10%、20%或甚至50%的PNH II型白細胞群表明患者處于血栓形成風險增加的狀態(和/或可能是血小板減少性的)。在一些實施方案中，本文所述任何方法還可包括從患者中獲取生物樣品。生物樣品可以是例如全血樣品。在另一個方面，本公開內容的特征在于用于預測患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態(和/或可能是血小板減少性)的方法。所述方法包括測定患者的生物樣品中相同組織學類型的全部白細胞的II型白細胞的百分比；和預測患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態，其中如果II型白細胞的百分比大于或等于I. 2% (例如大于或等于 I. 3、I. 4、I. 5、I. 6、I. 7、I. 8、I. 9,2,2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9,3,3. I、
3.2.3.3.3.4.3.5.3.6,3. 7,3. 8,3. 9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65. 3%或70%以上)，則患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態(和/或可能是血小板減少性的)。在另一個方面，本公開內容的特征在于用于預測患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態(和/或可能是血小板減少性)的方法。所述方法包括測定患者的生物樣品中相同組織學類型的全部紅細胞的II型紅細胞的百分比；和預測患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態(和/或可能是血小板減少性的)，其中如果II型紅細胞的百分比大于或等于 0. 02% (例如大于或等于 0. 02,0. 03,0. 04,0. 05,0. 06,0. 07,0. 08,0. 09,0. I、
0.2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1、1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5、1. 6、1. 7、1. 8、1. 9、2、2. I、
2.2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、3. 8、3. 9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71. 3%或75%以上)，則患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態(和/或可能是血小板減少性的)。
在又一個方面，本公開內容的特征在于用于為患者選擇療法的方法，所述方法包括為確定具有以下細胞群的患者選擇抗血栓療法和抗血小板減少療法的一種或兩種大于或等于 I. 2% (例如大于或等于 I. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9,2,2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、3. 8、3. 9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65. 3% 或 70% 以上)的 PNH II型白細胞群和/或大于或等于0. 02% (例如大于或等于0. 02,0. 03,0. 04,0. 05,0. 06,0. 07、
0.08、0. 09、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、I、I. I、I. 2、I. 3、I. 4、I. 5、I. 6、I. 7、
1.8、1. 9、2、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、
3.8,3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71. 3%或75%以上)的PNH II型紅細胞群。在另一個方面，本公開內容的特征在于用于治療患者的方法。如果患者被確定為具有以下細胞群，則所述方法包括給予有需要的患者抗血栓療法和抗血小板減少療法的一種或兩種大于或等于1.2% (例如大于或等于I. 3、1. 4、1. 5、1. 6、1. 7、1. 8、1. 9、2、2. I、
2.2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、3. 8、3. 9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65. 3% 或 70%以上)的PNH II型白細胞群和/或大于或等于0.02% (例如大于或等于0. 02、0. 03、0. 04、
0.05、0. 06、0. 07、0. 08、0. 09、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1、1. 1、1. 2、1. 3、
1.4、I. 5、I. 6、I. 7、I. 8、1. 9、2、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3、3. 1、3. 2、3. 3、
3.4.3.5.3.6.3.7,3. 8,3. 9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71.3%或75%以上)的 PNH II 型紅細胞群。在本文所述任何方法的一些實施方案中，抗血小板減少療法可以是例如血小板輸注。在又一個方面，本公開內容的特征在于用于確定患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態的基于計算機的方法，所述方法包括接收包括PNH患者的醫學概況的數據，所述概況包括有關患者生物樣品中相同組織學類型(相同譜系)的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比的信息；和對至少包括所述信息的數據部分進行處理以確定患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態，其中如果II型白細胞的百分比大于或等于I. 2% (例如大于或等于 I. 3、I. 4、I. 5、I. 6、I. 7、I. 8、I. 9,2,2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9、
3.3.1.3.2.3.3.3.4.3.5,3. 6,3. 7,3. 8,3. 9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65. 3%或70%以上)，則患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態。在又一個方面，本公開內容的特征在于用于確定患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態的基于計算機的方法，所述方法包括接收包括PNH患者的醫學概況的數據，所述概況包括有關患者生物樣品中相同組織學類型(相同譜系)的全部紅細胞的PNH II 型紅細胞的百分比的信息；和對至少包括所述信息的數據部分進行處理以確定患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態，其中如果II型紅細胞的百分比大于或等于0. 02% (例如大于或等于 0. 02,0. 03,0. 04,0. 05,0. 06,0. 07,0. 08,0. 09,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6、
0.7、0. 8、0. 9、1、1. 1、1. 2、I. 3、I. 4、I. 5、I. 6、I. 7、I. 8、I. 9、2、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、
2.1,2. 8、2. 9、3、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、3. 8、3. 9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71. 3% 或 75% 以上)，則患者處
于發生血栓形成的風險增加的狀態。在另一個方面，本公開內容的特征在于用于確定患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態的基于計算機的方法，所述方法包括提供有關患者生物樣品中相同組織學類型(相同譜系)的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比的信息；將信息輸入計算機；和應用計算機和輸入信息計算表明患者是否處于血栓形成的風險增加的狀態的參數，其中如果II型白細胞的百分比大于或等于1.2% (例如大于或等于1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、
I.9、2、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6 、2. 7、2. 8、2. 9、3、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、3. 8、
3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65. 3%或70%以上)，則患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態。在另一個方面，本公開內容的特征在于用于確定患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態的基于計算機的方法，所述方法包括提供有關患者生物樣品中相同組織學類型的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比的信息；將信息輸入計算機；和應用計算機和輸入信息計算表明患者是否處于血栓形成的風險增加的狀態的參數，其中如果II型白細胞的百分比大于或等于0. 02% (例如大于或等于0. 02,0. 03,0. 04,0. 05,0. 06,0. 07,0. 08、
0.09、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1、1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5、1. 6、1. 7、1. 8、
1.9、2、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7,3. 8、
3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70,71,71. 3%或75%以上)，則患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態。在一些實施方案中，本文所述任何基于計算機的方法還可包括在計算機可讀介質上存儲參數和/或輸出參數。在一些實施方案中，如果患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態，則本文所述任何方法可包括針對出現至少一種血栓形成癥狀監測患者的步驟。在一些實施方案中，如果患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態，則本文所述任何方法可包括為患者選擇抗血栓療法。在一些實施方案中，如果患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態，則本文所述任何方法可包括給予患者抗血栓療法。抗血栓療法可以是例如抗凝血藥或溶血栓藥。抗凝血藥可以是例如香豆定、肝素或其衍生物。溶血栓藥可以是例如組織纖溶酶原激活物、鏈激酶或尿激酶型纖溶酶原激活物。在本文所述任何方法的一些實施方案中，氣單胞菌溶素蛋白的非裂解變體形式可用來測定生物樣品中PNH II型白細胞的百分比。在一些實施方案中，本文所述任何方法可包括記錄所測定的生物樣品中PNH II型細胞的百分比。在一些實施方案中，本文所述任何方法可包括記錄患者是處于發生血栓形成的風險增加的狀態還是患者不處于發生血栓形成的風險增加的狀態的預測。記錄可載于計算機可讀介質。記錄還可載于例如有形介質(例如患者的實際記錄或圖表)。在又一個方面,本公開內容的特征在于用于白細胞分類的方法。該方法使大量的白細胞與結合(i) GPI或(ii) GPI錨定蛋白的試劑接觸；和根據與細胞結合的試劑的量將一種或多種白細胞歸類為PNH II型細胞。在另一個方面，本公開內容的特征在于用于白細胞分類的方法，所述方法包括使大量白細胞與結合(i) GPI或(ii) GPI錨定蛋白的試劑接觸；根據與細胞結合的試劑的量，檢查(interrogate)至少一部分與試劑接觸的白細胞；和將所檢查的一種或多種細胞歸類為PNH II型細胞。在另一個方面，本公開內容的特征在于用于區分不同白細胞群的方法。所述方法包括使大量白細胞與結合(i) GPI或(ii) GPI錨定蛋白的試劑接觸；和根據結合細胞的試劑的量，將至少一部分白細胞與所述大量的其它白細胞區分開來，其中足以將PNH II型白細胞(如存在的話)與相同組織學類型(相同譜系)的I型白細胞和PNH III型細胞區分開來，以供測定所述大量中相同組織學類型的全部白細胞的PNH II型白細胞的百 分比。該方法還可包括測定PNH II型白細胞的百分比。在又一個方面，本公開內容的特征在于用于測定樣品中PNH II型白細胞的百分比的方法，所述方法包括根據與細胞結合的試劑的量，檢查與試劑接觸的大量白細胞，其中試劑與(i) GPI或(ii) GPI錨定蛋白結合，其中檢查足以將PNH II型白細胞(如存在的話)與相同組織學類型的I型白細胞和PNH III型細胞區分開來，以供測定所述大量中相同組織學類型的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比；并測定PNH II型白細胞的百分比。在本文所述任何方法的一些實施方案中，使大量白細胞與結合GPI的試劑和結合GPI連接的蛋白質的試劑接觸。在本文所述任何方法的一些實施方案中，白細胞的區分或檢查(和/或PNH II型白細胞的百分比的測定)包括流式細胞術。在本文所述任何方法的一些實施方案中，待檢查的大量白細胞獲自患有、疑似患有PNH或有發生PNH的風險的患者。在一些實施方案中，患者是這樣的患者，之前已測定其PNH II型紅細胞的百分比，但是可疑和/或非決定性的。在一些實施方案中，本文所述任何方法還可包括記錄PNH II型白細胞的百分比。記錄可載于計算機可讀介質或有形介質(例如患者圖表或記錄)。在本文所述任何方法的一些實施方案中，試劑可與人GPI部分結合。試劑可以是例如抗體或其抗原結合片段，或氣單胞菌溶素蛋白。氣單胞菌溶素蛋白可以是例如與蛋白質的野生型形式相比，是非裂解的或基本上非裂解的氣單胞菌溶素蛋白的變體形式。非裂解的或基本上非裂解的氣單胞菌溶素蛋白可包含SEQ ID N0:2或7中所述氨基酸序列，其中253位的蘇氨酸被半胱氨酸取代，且300位上的丙氨酸用半胱氨酸取代。在本文所述任何方法的一些實施方案中，試劑可與GPI錨定蛋白結合。例如，試劑可以是例如與GPI錨定蛋白結合的抗體或其抗原結合片段。GPI錨定蛋白可以是例如堿性磷酸酶、5’核苷酸酶、乙酰膽堿酯酶、二肽酶、LFA-3、NCAM、PH-20、⑶55、CD59、Thy-I、Qa_2、CD14、CD33、CD16 (Fcy 受體 III)、癌胚抗原(CEA)、CD24、CD66b、CD87、CD48、CD52 或本領域已知的和/或本文給出的任何其它GPI錨定蛋白。在一些實施方案中，所測定的具有大于或等于I. 2%的PNH II型白細胞群或者大于或等于0. 02%的PNH II型紅細胞群的患者可診斷為患有PNH。在一些實施方案中，所測定的具有大于或等于I. 2%的PNH II型白細胞群或者大于或等于0.02%的PNH II型紅細胞群的被診斷為患有PNH的患者或以前診斷的PNH患者可開給補體抑制劑的處方和/或用補體抑制劑治療，例如但不限于依庫珠單抗。在又一個方面，本公開內容的特征在于與人GPI部分結合的抗體或其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段可以是例如重組抗體、雙鏈抗體、嵌合化抗體或嵌合抗體、去免疫化人抗體(deimmunized human antibody)、完全人抗體、單鏈抗體、Fv片段、Fd片段、Fab片段、Fab’片段和F(ab’)2片段。除非另有定義，否則本文所用所有技術和科學術語具有與本公開內容所屬領域普通技術人員通常理解的相同含義。萬一有抵觸，則以本文件(包括定義)為準。下面描述了優選的方法與材料，但是與本文所述方法與材料類似或等同的方法與材料也可用于本公開方法和組合物的實踐或測試中。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻均通過引用以其整體結合到本文中。本公開內容的其它特征和優勢，例如用于測定受試者的血小板減少癥或血栓形成的風險的方法，根據下列描述、實施例和權利要求將是清楚明了的。附圖
簡沭
圖I是雙色點圖，其描述了與含有與Alexa Fluor 488綴合的氣單胞菌溶素的非裂解變體和結合與藻紅蛋白(phyocoerythrin) (PE)綴合的CD24的抗體兩者的溶液一起孵育 的人外周血粒細胞群。非裂解氣單胞菌溶素與GPI錨特異性結合，因此表達任何GPI錨定蛋白的細胞被這種熒光蛋白標記。CD24是在粒細胞上表達的GPI連接的蛋白質，因此表達CD24的細胞將被抗CD24抗體和非裂解氣單胞菌溶素兩者結合。X軸表示由與細胞結合的氣單胞菌溶素綴合物產生的可檢測信號的log強度，Y軸表示由與細胞結合的抗CD24抗體綴合物產生的可檢測信號的log強度。通過該分析揭示了 3個粒細胞群111型細胞，其沒有GPI連接的蛋白質，因此似乎未被抗CD24抗體和非裂解氣單胞菌溶素的任一種標記；1型粒細胞，其相對于缺乏GPI錨的細胞，表達高水平的GPI連接的蛋白質；11型粒細胞，其表達中等水平的GPI連接的蛋白質，因此以低于正常(I型)粒細胞中觀察到的水平的水平被抗CD24和非裂解氣單胞菌溶素兩者標記。圖2是描述絕對血小板計數相對于PNH患者血液中PNH II型粒細胞的百分比的散點圖。Y軸表示I UL患者血液的血小板計數(X 10_3)，X軸表示總粒細胞群內PNH II型粒細胞的百分比。圖的左半邊是在無可檢測的PNH II型粒細胞群的PNH患者(N= 141)中觀察到的血小板計數的分布。圖的右半邊是在有可檢測的PNH II型粒細胞群的PNH患者(N=19)中觀察到的血小板計數的分布。發明詳述
本公開內容的特征在于尤其可用于確定患者是否具有PNH II型細胞群和/或是否處于發生血小板減少癥和/或血栓形成的風險增加的狀態的各種診斷和治療應用。本公開內容的特征還在于可用于所述方法的試劑。雖然絕無意限制，但下面對使用前述任一個的示例性試劑、綴合物和方法進行詳細說明，并在工作實施例中舉例說明。
本公開內容的特征在于可用于本文所述診斷和治療方法的多種試劑。在一些實施方案中，試劑與糖基磷脂酰肌醇(GPI)部分結合，該部分將許多細胞表面蛋白錨定于細胞膜上。GPI 部分一般含有乙醇胺-HP04_6Man a l_2Man a l_6Man a l-4GlcNH2l_6ffl_FO-肌醇-IHPO4-二酰甘油(或烷基酰基甘油或神經酰胺)核心。參見例如Paulick和Bertozzi(2008) BiochemistrvM (27) : 6991-7000。然而,已報道了該核心結構上的多種變異。例如，聚糖核心可用側鏈修飾，例如但不限于磷酸乙醇胺、甘露糖、半乳糖、唾液酸或其它糖。出處同上。
在一些實施方案中，試劑可以是氣單胞菌溶素蛋白，例如非裂解氣單胞菌溶素蛋白。氣單胞菌溶素是由有毒的氣單胞菌(MroMmBs')菌種(例如但不限于嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和殺鮭氣單胞菌iA<3romorms salmonicida))表達的形成通道的細胞溶解蛋白。氣單胞菌溶素作為52 kDa前體由細菌細胞分泌，所述前體通過蛋白水解除去C端肽而轉化成活性形式(活化)。氣單胞菌溶素前體可被宿主蛋白酶以及由氣單胞菌溶素表達細菌分泌的蛋白酶激活。一旦與細胞結合，氣單胞菌溶素便在細胞中寡聚化產生通道，并最終裂解細胞(Howard 和 Buckley (1985) J163:336-340)。由氣單胞菌科各不同成員產生的氣單胞菌溶素多肽的氨基酸序列是高度保守的。因此，本文所用氣單胞菌溶素多肽可來自氣單胞菌的任何菌種，例如但不限于嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌認cariae)、維氏氣單胞菌(/I. veronii)(生物型soAria)、維氏氣單胞菌(生物型reroflii)、簡氏氣單胞菌(/1.、殺鮭氣單胞菌和舒氏氣單胞菌Clschubertii)。在一些實施方案中,氣單胞菌溶素多肽來自嗜水氣單胞菌或殺鮭氣單胞菌。在一 些實施方案中，氣單胞菌溶素多肽是含有24個氨基酸信號肽的前體形式(proform)。在一些實施方案中，前體形式氣單胞菌溶素多肽可具有帶有SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:6中所述氨基酸序列的多肽，或者由帶有SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:6中所述氨基酸序列的多肽組成。在一些實施方案中，氣單胞菌溶素多肽是其中已除去信號序列的蛋白質形式。例如，氣單胞菌溶素多肽可具有帶有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7中所述氨基酸序列的多肽，或者由帶有SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:7中所述氨基酸序列的多肽組成。在一些實施方案中，氣單胞菌溶素多肽是蛋白質的活性形式。例如，氣單胞菌溶素多肽可具有帶有SEQ ID NO:3中所述氨基酸序列的多肽，或者由帶有SEQ ID N0:3中所述氨基酸序列的多肽組成。本文所用“多肽”、“肽”和“蛋白質”可互換使用，意指不論長度或翻譯后修飾的氨基酸的任何肽連接鏈。本文所述氣單胞菌溶素多肽可含有或可以是野生型蛋白質或者可以是具有至多 50 個(例如至多 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40 或 50 個)
保守氨基酸取代的野生型多肽的變體。保守取代通常包括下列組別內的取代甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸、組氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。本文所述氣單胞菌溶素多肽還包括多肽的“GPI結合片段”，其比全長的前體形式多肽短，但仍保持與GPI部分結合的活性多肽的能力的至少10% (例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99. 5%或100%以上)。氣單胞菌溶素多肽的GPI結合片段包括蛋白質的末端及內部缺失變體。缺失變體可缺少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(兩個或更多個氨基酸的)氨基酸區段或非連續的單個氨基酸。GPI結合片段的長度可為至少40個(例如至少41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300個或325個以上)氨基酸殘基(例如SEQ ID No:l_3的至少40個連續氨基酸殘基)。在一些實施方案中，氣單胞菌溶素多肽的GPI結合片段的長度小于400個(例如小于 350、325、300、275、250、225、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41 或 40 個)氨基酸殘基(例如小于SEQ ID No:1-3的400個連續氨基酸殘基)。在一些實施方案中，氣單胞菌溶素多肽的GPI結合片段長為至少40個氨基酸殘基，但小于400個氨基酸殘基。在一些實施方案中，氣單胞菌溶素多肽的GPI結合片段可包含具有下列氨基酸序列的多肽或由具有下列氨基酸序列的多肽組成LDPDSFKHGDVTQSDRQLVKTVVGWAVNDSDTPQSGYDVTLRYDTATNWSKTNTYGLSEKVTTKNKFKWPLVGETELSIEIAANQSWASQNGGSTTTSLSQSVRPTVPARSKIPVKIELYKADISYPY (SEQ ID NO:4)。在一些實施方案中，氣單胞菌溶素多肽的GPI結合片段可包含具有下列氨基酸序列的多肽或由具有下列氨基酸序列的多肽組成LDPDSFKHGDVTQSDRQLVKTVVGWAVNDSDTPQSGYDVTLRYDTATNWSKTNTYGLSEKVTTKNKFKWPLVGECELSIEIAANQSWASQNGGSTTT SLSQSVRPTVPARSKIPVKIELY KC DISYPY (SEQ ID NO:5)。在一些實施方案中，氣單胞菌溶素多肽可具有與帶有SEQ ID No:l_3、6或7 (見下文)中任一個所描述的氨基酸序列的氣單胞菌溶素序列有以下同一性或大于以下同一性的氨基酸序列70% (例如 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%)。百分比(%)氨基酸序列同一性定義為在比對序列并引入空位(必要時)以達到最大百分比序列同一性后，候選序列中與參比序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。用于測定百分比序列同一性的目的的比對可以本領域技術人員所掌握的各種方式實現，例如，應用公眾可獲取的計算機軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。可通過已知方法確定用于測量比對的合適參數，包括在比較的序列的全長范圍內實現最大比對所需的任何算法。在一些實施方案中，根據既定應用，可優選使用缺乏裂解細胞能力的變體氣單胞菌溶素多肽。氣單胞菌溶素多肽的這種變體形式是本領域已知的，并描述于例如Brodsky等(2000) Am J Clin / 從o71M:459-466。在一些實施方案中，氣單胞菌溶素的非裂解變體形式含有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7中所述的氨基酸序列，或者由之組成，其中具有以下的一個或多個變化132位上的組氨酸取代了天冬酰胺(Hisl32Asn) ;202位上的甘氨酸為半胱氨酸；253位上的蘇氨酸為半胱氨酸，且300位上的丙氨酸為半胱氨酸；和225位上的蘇氨酸為甘氨酸。氣單胞菌溶素的一個示例性非裂解變體包含SEQ ID No :2或7所述氨基酸序列，其中253位上的蘇氨酸為半胱氨酸，且300位上的丙氨酸為半胱氨酸。如上所述，變體形式可保持與GPI部分結合的能力。在一些實施方案中，變體氣單胞菌溶素多肽具有小于10% (例如小于9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)的非變體對應物氣單胞菌溶素多肽裂解靶細胞的能力。在一些實施方案中，變體氣單胞菌溶素多肽沒有可檢測的細胞溶解活性。用于測定變體氣單胞菌溶素多肽是否與GPI部分結合的方法是本領域已知的，并以工作實施例為例說明。例如，用于檢測的基于細胞的方法，可采用流式細胞術技術和可檢測標記的(例如熒光團標記的)變體氣單胞菌溶素多肽，測定變體氣單胞菌溶素多肽與細胞表面上的GPI部分之間的結合。參見例如Hong等(2002) EMBO /21 (19) :5047-5056。同樣地，用于檢測和/或定量測定氣單胞菌溶素多肽或其變體的細胞溶解活性的方法也是本領域已知的。例如，可通過使變體多肽與正常的人紅細胞接觸，并測定自紅細胞釋放的血紅蛋白的量，來測定變體氣單胞菌溶素多肽的溶血活性。參見例如Howard和 Buckley (1982) Biochemistrv2\(7):1662-1667 ；Avigad 和 Bernheimer (1976)Infection and Immunity 13(5):1378-1381GarIand 和 Buckley (1988) Infectionand Immunity 56(5) : 1249-1253 以及 Bernheimer 和 Avigard (1974) Infection andImmunity 9:1016-1021。與非變體對應物多肽具有的細胞溶解活性的量相比，因變體引起細胞溶解活性的量的降低或缺乏表明變體多肽的細胞溶解活性降低或缺乏。用于獲得氣單胞菌溶素多肽或產生本文所述多肽的變體的方法是分子生物學領域已知的，并以工作實施例為例說明。參見例如Sambrook等(1989) “MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, ” Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y.和 Ausubel 等(1992) “Current Protocols in Molecular Biology,” Greene Publishing Associates。可米用標準技術(參見例如 Sambrook 等(1989)，同上)，自本文所述的任何氣單胞菌菌種獲得編碼氣單胞菌溶素多肽的模板DNA。例如，Howard等人描述了編碼嗜水氣單胞菌的氣單胞菌溶素多肽的核酸序列的分離和表征(Howard 等(1987) T Bacterioll^9 (6):2869-2871)。 Buckley (1990) Biochem. CellBiol. 221-224 和 Wong 等(1989)171:2523-2527 描沭了從殺鮭氣單朐菌分離的氣單胞菌溶素多肽。在一些實施方案中，氣單胞菌溶素多肽可含有內部或末端(羧基端或氨基端)無關的或異源的氨基酸序列(例如來源于不相當于任何天然存在的蛋白質的其它蛋白質或合成序列的序列)。所述序列可以是例如抗原標簽(例如FLAG、聚組氨酸、血凝素(HA)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或麥芽糖結合蛋白(MBP))。異源序列還可包括可用作診斷或可檢測標記的蛋白質，例如螢光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)。示例性的氣單胞菌溶素多肽以及用于制備和純化多肽的方法描述于美國臨時專利申請順序號61/200，655，其公開內容通過引用以其整體結合到本文中。在一些實施方案中，試劑可以是與GPI部分結合的抗體。已鑒定和分離出與非人GPI 部分結合的抗體。參見例如 Naik等(2006) Infection and Immunity 74 (2) : 1412 (與惡性痕原蟲{Plasmodium falciparum)的GPI部分結合的天然存在抗體的分離)。正如本文詳細描述的一樣，與人GPI部分結合的抗體的產生盡在本領域普通技術人員的能力范圍內。本文所用術語“抗體”是指整個或完整抗體分子(例如IgM、IgG (包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA、IgD或IgE)或任何其抗原結合片段。術語抗體包括例如嵌合化抗體或嵌合抗體、人源化抗體、去免疫化抗體和完全人抗體。抗體的抗原結合片段包括例如單鏈抗體、單鏈Fv片段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。scFv片段是單條多肽鏈，其包含scFv得自其中的抗體的重鏈和輕鏈可變區兩者。另外，胞內抗體、微型抗體(minibodies)、三鏈抗體(triabodies)和雙鏈抗體(參見例如Todorovska等(2001) J Immunol Methods 248 (I):47-66 ;Hudson 和 Kortt (1999) J Immunol Methods231 (1):177-189 ；Poljak (1994) Structure!(12) :1121-1123 Rondon 和 Marasco (1997)Annual Review of Microbioloffv^1:257-283,其每個的公開內容均通過引用以其整體結合到本文中)也包括在抗體的定義中，并可適用于本文所述方法。雙特異性抗體也包括在術語“抗體”中。雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同抗原的結合特異性的單克隆抗體，優選人或人源化抗體。本文論述了用于產生抗體或其片段的方法。在一些實施方案中，試劑可與GPI錨定蛋白結合。例如，試劑可以是與GPI錨定蛋白結合的抗體。在一些實施方案中，試劑可以是GPI錨定蛋白的配體。GPI錨定蛋白眾多，包括而不限于堿性磷酸酶、5’核苷酸酶乙酰膽堿酯酶、二肽酶、LFA-3、NCAM、PH-20、⑶55、CD59、Thy-U Qa_2、CD14、CD33、CD16 (Fcy 受體 III)、癌胚抗原(CEA)和 CD52。與 GPI 錨定蛋白結合的抗體是本領域公知的，描述于例如Hall和Rosse (1996),同上，Richards等(2008) Cytometry B Clin Cvtoml(I) :47-55 Richards 和 Barnett (2007) Clin LabMedTJ (3) :577-590 ；Luzzatto 等(2006) Int J Hemato 1M(2) :104-112 ；以及 Thomason等(2004) Am J Clin / 從o7122 (I) : 128-134。這類抗體可經商業途徑獲自例如SantaCruz Biotechology, Inc. (Santa Cruz, California), Novus Biologicals (Littleton,Colorado)和 R& D Systems (Minneapolis, MN)。
用于產生與GPI錨定蛋白或GPI部分結合的用于所述診斷和/或治療方法的抗體的合適方法是本領域已知的，并在下面的部分中進行了描述。用于產生抗體的方法
本領域已知且本文描述了用于產生本公開內容的抗體(例如與GPI部分或GPI錨定蛋白結合的抗體)或其抗原結合片段的合適方法。例如，單克隆抗CD55抗體可如下產生采用人CD55表達細胞、CD55多肽或CD55多肽的抗原片段作為免疫原，然后在產抗體細胞來自其中的動物中產生免疫應答，進而可分離出單克隆抗體。可測定該抗體的序列，并通過重組技術產生抗體或其變體。可根據單克隆抗體的序列以及能夠與GPI錨定蛋白或GPI部分結合的多肽，采用重組技術來產生嵌合抗體、⑶R移植抗體、人源化抗體和完全人抗體。此外，可根據靶標特異性，采用例如表達GPI部分或GPI錨定蛋白、重組GPI連接的蛋白質或游離GPI部分的細胞作為誘餌分離抗體或多肽，來選擇來源于重組文庫(“噬菌體抗體”)的抗體。非人抗體和嵌合抗體的產生和分離盡在技術人員的能力范圍之內。可采用重組DNA技術以改進在非人細胞中產生的抗體的一種或多種性質。因此，可構建嵌合抗體，以降低其在診斷或治療應用中的免疫原性。此外，可通過CDR移植和任選構架修飾使抗體人源化，使免疫原性最小化。參見美國專利號5，225，539和7，393，648，其每個的內容均通過引用結合到本文中。抗體可獲自動物血清，或者在單克隆抗體或其片段的情況下在細胞培養物中產生。可根據已確立的方法，包括在細菌或優選哺乳動物細胞培養中的方法，利用重組DNA技術產生抗體。所選擇的細胞培養系統優選分泌抗體產物。在另一個實施方案中，用于產生本文公開的抗體的方法包括培養已用雜交載體轉化的宿主，例如大腸桿菌W. coli)或哺乳動物細胞。載體包含一個或多個含有啟動子的表達盒，所述啟動子在合適讀框中與編碼抗體蛋白的第二 DNA序列連接的編碼信號肽的第一 DNA序列有效連接。然后收集抗體蛋白并進行分離。任選表達盒可包含與編碼抗體蛋白的多順反子(例如雙順反子)DNA序列有效連接的啟動子，所述序列在合適的讀框中與信號肽各自獨立地有效連接。
在合適的培養基中進行雜交瘤細胞或哺乳動物宿主細胞的體外增殖，所述培養基包括常規標準培養基(例如Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)或RPMI 1640培養基)，任選補充了哺乳動物血清(例如胎牛血清)或痕量元素和生長維持補充劑(例如飼養細胞，例如正常小鼠腹膜滲出物細胞、脾細胞、骨髓巨噬細胞、2-氨基乙醇、胰島素、運鐵蛋白、低密度脂蛋白、油酸等)。作為細菌細胞或酵母細胞的宿主細胞的增殖同樣在本領域已知的合適培養基中進行。例如，對于細菌，合適的培養基包括培養基LE、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific Broth、SOB、S0C、2 xYT或M9基本培養基。對于酵母，合適的培養基包括培養基YPD、YEF1D、基本培養基或完全極限省卻培養基(Complete Minimal Dropout Medium)。體外生產提供相對純的抗體制備物和可供擴大生產以得到大量所需抗體。用于細菌細胞、酵母、植物或哺乳動物細胞培養的技術是本領域已知的，包括均質懸浮培養(例如在氣升式反應器中或在連續攪拌反應器中)和固定化或截留細胞培養(例如在中空纖維、微囊中、在瓊脂糖微珠或陶瓷柱體上)。還可通過使哺乳動物細胞在體內繁殖來得到大量所需抗體。為此，將產生所需抗 體的雜交瘤細胞注射入組織相容性哺乳動物中以引起產抗體腫瘤的生長。任選動物在注射前用烴、尤其是礦物油例如姥鮫烷(四甲基-十五烷)初免。1-3周后，自這些哺乳動物的體液中分離抗體。例如，將通過把合適的骨髓瘤細胞與Balb/c小鼠的產抗體脾細胞融合獲得的雜交瘤細胞或由產生所需抗體的雜交瘤細胞系Sp2/0獲得的轉化細胞腹膜內注射給任選用姥鮫烷預治療的Balb/c小鼠。1-2周后，從動物中取出腹水。例如，在Kohler 和 Milstein，(1975) #atorg256:495-497 ；美國專利號4，376， 110 ;Harlow 和 Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold SpringHarbor (其公開內容均通過引用結合到本文中)中論述了前述技術和其它技術。用于制備重組抗體分子的技術描述于上述參考文獻和例如W097/08320 ;美國專利號5, 427, 908 ；美國專利號 5，508，717 ;Smith (1985) 5bie/ ce225:1315-1317 Parmley和 Smith (1988) Gene73:305-318 ；De La Cruz 等(1988) Journal of BiologicalChemistry!^: 4318-4322 ;美國專利號 5, 403, 484 ;美國專利號 5，223,409 ；W088/06630 ；W092/15679 ;美國專利號5，780，279 ;美國專利號5，571,698 ;美國專利號6，040，136 ；Davis 等(1999) Cancer Metastasis Rev. 18 (4) : 421-5 :以及 Taylor 等(1992) NucleicAcids Research 20 :6287-6295 ;Tomizuka等(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA97(2)722-727，其每個的內容均通過引用以其整體結合到本文中。優選通過GPI或GPI錨定蛋白表達細胞的免疫熒光染色法、通過免疫印跡法、通過酶免疫測定法(例如夾心測定法或斑點測定法或放射免疫測定法)，針對所需抗體對細胞培養上清液進行篩選。對于抗體的分離，可通過例如用硫酸銨沉淀、針對吸濕性材料(例如聚乙二醇)透析、通過選擇性膜過濾等，濃縮培養上清液中或腹水中的免疫球蛋白。必要和/或需要時，抗體通過常規層析方法純化，例如凝膠過濾、離子交換層析法、經DEAE-纖維素層析法和/或(免疫)親和層析法，例如用GPI部分、在其表面表達GPI錨的細胞、GPI錨定的多肽、在其表面表達GPI錨定蛋白的細胞或者用A蛋白或G蛋白的親和層析法。另一個實施方案提供用于制備在合適的哺乳動物中分泌針對GPI部分或GPI錨定蛋白的抗體的細菌細胞系的方法。例如，兔用GPI部分、在其表面表達GPI錨的細胞、GPI錨定的多肽、在其表面表達GPI錨定蛋白的細胞或其片段免疫。按照本領域眾所周知的方法(例如通過引用結合到本文的各參考文獻所公開的方法)，構建自經免疫的兔產生的噬菌體展示文庫，并淘選所需抗體。還公開了分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞。優選的雜交瘤細胞是遺傳上穩定的，分泌本文所述的具有所需特異性的單克隆抗體，并可通過體外融化和繁殖由深度冷凍培養物或作為體內腹水擴繁。在另一個實施方案中，提供用于制備分泌抗GPI部分或GPI錨定蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞系的方法。在該方法中，合適的哺乳動物(例如Balb/c小鼠)用一種或多種多肽或其抗原片段(例如CD55或CD14)或用一種或多種得自CD55表達細胞的多肽或抗原片段、CD55表達細胞本身或含有上述純化的多肽的抗原載體免疫。類似地，哺乳動物可用人GPI部分、其片段或表達人GPI部分的細胞免疫(或許以高的量)。使經免疫的哺乳動物的產抗體細胞短暫生長在培養物中，或與合適骨髓瘤細胞系的細胞融合。將在融合中獲得的雜交細胞克隆，選擇分泌所需抗體的細胞克隆。例如，使用用例如GPI錨定蛋白或GPI部分免疫的Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞系PAI或骨髓瘤細胞系Sp2/0-Ag 14的細 胞融合。然后針對所需抗體的分泌篩選所得雜交細胞，將陽性雜交瘤細胞克隆。用于制備雜交瘤細胞系的方法包括通過在幾個月內(例如介于2和4個月之間)皮下和/或腹膜內注射目標抗原幾次(例如4-6次)來免疫Balb/c小鼠。最后一次注射后2-4天取出經免疫小鼠的脾細胞，并在融合啟動子、優選聚乙二醇存在下，與骨髓瘤細胞系PAI的細胞融合。優選在含有約30%-約50%分子量約4000的聚乙二醇的溶液中，將骨髓瘤細胞與3-20倍過量的經免疫小鼠的脾細胞融合。融合后，在補充了選擇培養基的如上所述的合適培養基(例如HAT培養基)中，每隔一定間隔使細胞擴繁，以防止正常骨髓瘤細胞生長超過所需要的雜交瘤細胞。抗體和其片段可以是“嵌合的”。嵌合抗體和其抗原結合片段包含來自兩個或更多個不同物種(例如小鼠和人)的部分。可用剪接至人恒定結構域基因區段的具有所需特異性的小鼠可變區產生嵌合抗體(例如美國專利號4，816，567)。如此，可對非人抗體進行修飾以使之更適于人的臨床應用(例如用于檢測II型PNH細胞的方法)。本公開內容的單克隆抗體包括非人(例如小鼠)抗體的“人源化”形式。人源化或CDR移植mAb特別用作人用治療藥物，因為它們不會像小鼠抗體一樣快速從循環中清除，通常不引起不良免疫反應。一般而言，人源化抗體具有自非人來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常稱為“輸入”殘基，其通常取自“輸入”可變結構域。制備人源化抗體的方法一般是本領域眾所周知的。例如，可基本按照Winter和同事的方法(參見例如 Jones 等(1986)似卿321:522-525 ;Riechmann等(1988) #atorg332:323-327 ;以及Verhoeyen等(1988) Science^. 1534-1536)，通過用嚙齒動物CDR或CDR序列取代相應的人抗體序列，來進行人源化。另參見例如Staelens等(2006) Mol Immunol A2>: 1243-1257。在一些實施方案中，非人(例如小鼠)抗體的人源化形式是這樣的人抗體(接受者抗體)，其中接受者抗體的超變(CDR)區殘基被非人物種(供體抗體)的超變區殘基置換，所述非人物種例如具有所需特異性、親和力和結合能力的小鼠、大鼠、兔或非人靈長類。在一些情況下，人免疫球蛋白的構架區殘基還被相應的非人殘基置換(所謂的“回復突變”)。另外，可利用噬菌體展示文庫改變在抗體序列內的選定位置上的氨基酸。人源化抗體的性質還受人構架的選擇的影響。此外，可對人源化和嵌合化抗體進行修飾以包含不存在于接受者抗體或供體抗體中的殘基，以進一步改進抗體性質，例如親和力或效應子功能。本公開內容中還提供完全人抗體。術語“人抗體”包括具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區(如存在的話)的抗體。人抗體可包括不是人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機誘變或位點專一誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)。然而，術語“人 抗體”不包括這樣的抗體，其中來源于另一種哺乳動物物種(例如小鼠)種系的CDR序列移植入人構架序列(即人源化抗體)。完全人抗體或人抗體可來源于攜帶人抗體基因(攜帶可變(V)、多樣性(D)、連接(J)和恒定(C)外顯子)的轉基因小鼠或來源于人細胞。例如，目前可產生這樣轉基因動物(例如小鼠)，其能夠在缺乏內源免疫球蛋白產生的情況下在免疫時產生完整的人抗體庫。(參見例如 Jakobovits 等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:2551 .Takobovits 等(1993)Nature )&2:255-258 Bruggemann 等(1993) Year in Immunol. 1:33 ;以及 Duchosal 等(1992) fetorg355:258) 0可對轉基因小鼠品系進行改造以含有來自未重排人免疫球蛋白基因的基因序列。人序列可編碼人抗體的重鏈和輕鏈兩者，并可在小鼠中正確起作用，經歷重排以提供類似于人的抗體庫的大范圍抗體庫。轉基因小鼠可用靶蛋白(例如GPI部分或GPI錨定蛋白，例如CD55或CD14)免疫以產生一系列各種各樣的特異性抗體及其編碼RNA。然后，可將編碼這類抗體的抗體鏈組分的核酸自動物克隆至展示載體中。通常，克隆編碼重鏈和輕鏈序列的各個核酸群，然后將各個群在插入載體時重組，使得任何指定的載體拷貝接收重鏈和輕鏈的隨機組合。設計載體表達抗體鏈，使得它們可在含有載體的展示包(display package)外表面上裝配并展示。例如,抗體鏈可與來自曬菌體外表面的卩遼菌體外殼蛋白一起作為融合蛋白表達。此后，可針對與靶標結合的抗體的展示來篩選展示包。另外，人抗體可來源于曬菌體展示文庫(Hoogenboom等(1991) J. MoL BioL227:381 ；Marks 等(1991) J. Mol. Biol. ,222:581-597 :以及 Vaughan 等(1996) NatureBiotecAjA:309 (1996))。可產生使用隨機化組合的合成人抗體V區的合成曬菌體文庫。通過在抗原上選擇，可制備其中V區在性質上非常類似人的完全人抗體。參見例如美國專利號 6，794，132,6, 680，209,4, 634，666，以及 Ostberg等(1983) ,Hybridoma 2:361-367，其每個的內容均通過引用以其整體結合到本文中。對于人抗體的產生，另參見Mendez等(1998)Nature GeneticsltQ-. 146-156,Green和Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495,其公開內容通過引用以其整體結合到本文中。以下文獻中進一步論述和描述了人抗體美國專利號5，939，598、6，673，986、6，114，598,6, 075，181,6, 162，963,6, 150，584,6, 713，610 和 6，657，103 以及美國專利公布號 20030229905 AU20040010810 AU US 20040093622 AU20060040363 AU20050054055AU20050076395 AU20050287630 Al。另參見國際公布號 WO 94/02602,WO 96/34096 和 WO98/24893以及歐洲專利號EP 0 463 151 BI。上文引述的專利、申請和參考文獻各自的公開內容通過引用以其整體結合到本文中。在一備選方法中，他人，包括GenPharm International, Inc ,利用“小基因座(minilocus)”方法。在小基因座方法中，通過包含來自Ig基因座的各片段(各個基因)來模擬外源Ig基因座。因此，將一個或多AVh基因、一個或多個Dh基因、一個或多個Jh基因、U恒定區和第二恒定區(優選Y恒定區)構成用于插入動物的構建體。該方法描述于例如美國專利號5, 545，807,5, 545，806,5, 625，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016、5，770，429,5, 789，650 和 5，814，318,5, 591，669,5, 612，205,5, 721，367,5, 789，215、5，643，763,5, 569，825,5, 877，397,6, 300，129,5, 874，299,6, 255，458 和 7，041，871，其公開內容通過引用結合到本文中。另參見歐洲專利號0 546 073 BI、國際專利公布號WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884，其各自的公開內容通過引用以其整體結合到本文中。另參見 Taylor 等(1992) Nucleic Acids Res. 20 :6287 ;Chen 等(1993)Int. Tmmuno/. 5 :647 ；Tuaillon 等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :3720-4 ；Choi 等(1993) Nature Genetics^ 117 ;Lonberg 等(1994) Nature )^ :856-859 Taylor等(1994) International Immunology^；Tuaillon^ (1995) J. Tmmuno/. 154 6453-65 ；Fishwild 等(1996) Nature Biotechnolosv14 :845 ；以及 Tuaillon 等(2000)Eur. J. Immunol.叢2998_3005，其各自的公開內容通過引用以其整體結合到本文中。 在某些實施方案中，提供去免疫化抗體(例如與人GPI部分或與GPI錨定蛋白結合的抗體)或其抗原結合片段。可對去免疫化抗體或其抗原結合片段進行修飾以賦予抗體或其抗原結合片段對指定物種無免疫原性或較少免疫原性。可利用本領域技術人員已知的任何各種技術，通過修飾抗體或其抗原結合片段來實現去免疫化(參見例如PCT公布號WO 04/108158和WO 00/34317)。例如，可采用例如重組技術，通過鑒定抗體或其抗原結合片段的氨基酸序列內的潛在的T細胞表位和/或B細胞表位，并從抗體或其抗原結合片段中除去一個或多個潛在的T細胞表位和/或B細胞表位，使抗體或其抗原結合片段去免疫化。然后可任選產生并測試修飾抗體或其抗原結合片段以鑒定保持一種或多種所需生物活性(例如結合親和力)但降低了免疫原性的抗體或其抗原結合片段。可采用本領域已知技術，例如計算方法(參見例如PCT公布號WO 02/069232)、體外技術或計算機技術和生物測定法或物理方法(例如測定肽與MHC分子的結合、測定肽MHC復合物與來自接受抗體或其抗原結合片段的物種的T細胞受體的結合、使用轉基因動物與接受抗體或其抗原結合片段的物種的MHC分子測試蛋白質或其肽部分或者用來自接受抗體或其抗原結合片段的物種的免疫系統細胞再生的轉基因動物測試等)，實施用于鑒定潛在的T細胞表位和/或B細胞表位的方法。在各種實施方案中，本文所述去免疫化抗體包括去免疫化抗原結合片段、Fab、Fv、SCFv、Fab’和F(ab’)2、單克隆抗體、鼠抗體、工程抗體(例如嵌合抗體、單鏈抗體、CDR移植抗體、人源化抗體、完全人抗體和人工選擇的抗體)、合成抗體和半合成抗體。在一些實施方案中，產生重組DNA，其包含編碼抗體表達細胞系的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域的插入序列。術語DNA包括編碼單鏈DNA、所述編碼DNA及其互補DNA組成的雙鏈DNA或這些互補(單鏈)DNA本身。此外，可以酶合成或化學合成編碼抗體(例如抗GPI抗體或抗GPI錨定蛋白抗體)的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域的DNA，以含有編碼重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域的真實DNA (authentic DNA)序列或其突變體。真實DNA的突變體是編碼上述抗體的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域的DNA，其中一個或多個氨基酸缺失、插入或被一個或多個其它氨基酸交換。在人源化和表達最優化應用中，優選所述修飾位于抗體的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域的⑶R之外。術語突變體DNA還包括沉默突變體，其中一個或多個核苷酸被具有編碼相同氨基酸的新的密碼子的其它核苷酸置換。術語突變體序列還包括簡并序列。簡并序列是遺傳密碼含義內的簡并，因為無數的核苷酸被其它核苷酸置換而又不引起起始編碼的氨基酸序列的變化。由于其不同的限制位點和/或特定宿主(特別是大腸桿菌)優選的特定密碼子的頻率所致，這種簡并序列可用于獲得重鏈鼠可變結構域和/或輕鏈鼠可變結構域的最佳表達。術語突變體欲包括按照本領域已知方法通過真實DNA的體外誘變而獲得的DNA突變體。對于完全四聚體免疫球蛋白分子的裝配和嵌合抗體的表達，使編碼重鏈和輕鏈可變結構域的重組DNA插入序列與相應的編碼重鏈和輕鏈恒定結構域的DNA融合，然后轉移到合適的宿主細胞中，例如在摻入雜交載體中后轉移。可以使用包含插入序列的重組DNA，所述插入序列編碼與人恒定結構域IgG (例如Y I、Y 2、Y 3或Y 4，特別是實施方案Y I或Y 4)融合的目標抗體的重鏈鼠可變結構域。還提供包含插入序列的重組DNA，所述插入序列編碼與人恒定結構域K或X (優選K)融合的抗體的輕鏈鼠可變結構域。 另一個實施方案涉及編碼重組多肽的重組DNA，其中重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域通過間隔基連接，任選包含有利于抗體在宿主細胞中加工的信號序列和/或編碼有利于抗體純化的肽和/或切割位點和/或肽間隔基和/或作用劑的DNA序列。編碼作用劑的DNA應是指編碼可用于診斷或治療應用中的作用劑的DNA。因此，特別表示作為毒素或酶、尤其是能夠催化前藥活化的酶的作用劑分子。編碼這種作用劑的DNA具有天然存在的酶或毒素編碼DNA的序列或其突變體，并可通過本領域眾所周知的方法制備。因此，本公開內容的單克隆抗體或抗原結合片段可以是不與其它作用劑(例如治療藥物或檢測標記)綴合的裸抗體或抗原結合片段。或者，單克隆抗體或抗原結合片段可與以下作用劑綴合例如細胞毒性劑、小分子、激素、酶、生長因子、細胞因子、核酶、肽模擬物、化學物質、前藥、包含編碼序列的核酸分子(例如反義物、RNAi、基因靶向構建體等)或檢測標記(例如NMR或X光造影劑、熒光分子等)。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段(例如Fab、Fv、單鏈scFv、Fab’和F(ab’)2)與延長抗體或抗原結合片段的半壽期的分子連接(參見題名“綴合物”的部分)。可獲得在哺乳動物細胞中表達克隆的重鏈和輕鏈基因的若干可能的載體系統。一類載體有賴于所需基因序列整合至宿主細胞基因組。可通過同時引入以下抗藥基因，來選擇具有穩定整合的DNA的細胞例如大腸桿菌gpt (MulIigan和Berg (1981) Proc. Natl.Acad. Sci. USA, TS'. 2072)或 Tn5 neo (Southern 和 Berg (1982) Mol. Appl. Genet.1:327)。選擇標記基因可與待表達的DNA基因序列連接，或通過共轉染導入同一細胞(Wigler等(1979)化77垃:77)。第二類載體利用賦予染色體外質粒自主復制能力的DNA元件。這些載體可來源于動物病毒，例如牛乳頭瘤病毒(Sarver等(1982) Proc. Natl. Acad.Sci. tt5H:7147)、多瘤病毒(Deans 等(1984)Natl. Acad. Sci. USAm_\ 1292)或 SV40 病毒(Lusky 和 Botchan (1981)淑卿293:79)。由于免疫球蛋白CDNA只由表示編碼抗體蛋白的成熟mRNA的序列組成，因此免疫球蛋白mRNA的合成需要調節基因轉錄和加工RNA的其它基因表達元件。這些元件可包括剪接信號、轉錄啟動子(包括誘導型啟動子)、增強子和終止信號。摻入這類元件的cDNA表達載體包括以下文獻描述的載體0kayama和Berg (1983) MoL Cell Biol. 3:280 ；Cepko等(1984)1053 ;以及 Kaufman (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. "5 迎:689。從本公開內容來看顯而易見，抗GPI部分抗體或抗GPI錨定蛋白抗體可用于診斷疾病(例如診斷PNH或發生血小板減少癥的風險增加)、監測疾病進展和選擇合適療法(包括聯合療法)以治療受試者的PNH、血小板減少癥或血栓形成的方法。在本公開內容的診斷實施方案中，預期雙特異性抗體。雙特異性抗體是與至少兩種不同抗原具有結合特異性的單克隆的優選人抗體或人源化抗體。在本發明的情況下，結合特異性之一針對細胞上的GPI部分或GPI錨定蛋白(例如白細胞或紅細胞)，另一種針對任何其它抗原，優選針對細胞表面蛋白或受體或受體亞基。用于制備雙特異性抗體的方法屬于本領域技術人員的能力范圍。傳統上，重組產生雙特異性抗體以兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表達為基礎，其中兩條重鏈具有不同的特異性(Milstein和Cuello (1983)淑卿305:537-539)。具有所需結合特異性的抗 體可變結構域(抗體-抗原結合位點)可與免疫球蛋白恒定結構域序列融合。融合優選是與免疫球蛋白重鏈恒定結構域，包括至少部分的鉸鏈、Ch2和Ch3區。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物的DNA和免疫球蛋白輕鏈(如有需要)插入獨立的表達載體中，并共轉染至合適的宿主生物中。有關制備雙特異性抗體的現有已知說明性方法的更多詳情參見例如Suresh 等(1986) Methods in Enzymology 121:210 PCT 公布號 WO 96/27011 ；Brennan等(1985) 5bie/ ce229:81 :Shalabv 等，T. Exp. Med. (1992) 175:217-225 Kostelnv 等(1992) J. Immunol. 148 (5) : 1547-1553 Hollinger 等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
:6444-6448 ；Gruber 等(1994) J. Immunol. 152:5368 ；以及 Tutt 等(1991) J.Immunol. 147:60。雙特異性抗體還包括交聯或雜綴合物(heteroconjugate antibodies)。雜綴合物可采用任何合宜的交聯方法制備。連同許多交聯技術一起，合適的交聯劑是本領域公知的，公開于美國專利號4，676，980。也已描述了直接由重組細胞培養物制備和分離雙特異性抗體片段的各項技術。例如，使用亮氨酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等(1992) J. Immunol.148(5) :1547-1553)。得自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽可通過基因融合與兩個不同抗體的Fab’部分連接。可在鉸鏈區還原抗體同二聚體，形成單體，然后再氧化形成抗體異二聚體。還可利用該方法產生抗體同二聚體。Hollinger等(1993) Proc. Natl. Acad.Sci. l/SA90:6444~6448描述的“雙鏈抗體”技術提供了用于制備雙特異性抗體片段的備選機制。該片段包含與輕鏈可變結構域(VL)通過接頭連接的重鏈可變結構域(VH)，所述接頭短到不允許相同鏈中兩個結構域之間配對。因此，一個片段的VH和VL結構域被迫使與另一個片段的互補VL和VH結構域配對，從而形成兩個抗原結合部位。還報道了通過用單鏈Fv (scFv) 二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略(參見例如Gruber等(1994)J. Immunol. 1^:5368)。或者，抗體可以是以下文獻描述的“線性抗體”例如Zapata等(1995) Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062。簡單地說，這些抗體包含一對串聯Fd區段(Vh-ChI-Vh-ChI)，其形成抗原結合區對。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。綴合物
在一些實施方案中，本文所述試劑(例如非裂解氣單胞菌溶素多肽或與GPI部分或GPI錨定蛋白結合的抗體)可與異源部分綴合。異源部分可以是例如異源蛋白質(見上文)、治療藥物(例如毒素或藥物)或檢測標記，例如但不限于放射性標記、酶標記、突光標記或發光標記。合適的放射性標記包括例如32P、33P、14C、125I、131I、35S和3h。合適的熒光標記包括而不限于熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、GFP、DyLight 488、藻紅蛋白(PE)、碘化丙啶(PI)、PerCP、PE-Alexa Fluor 700、Cy5、別藻藍蛋白、Cy7和PE-Alexa Fluor 750。發光標記包括例如各種發光鑭系元素(例如銪或鋱)螯合物中的任一種。例如，合適的銪螯合物包括二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)的銪螯合物。酶標記包括例如堿性磷酸酶、CAT、螢光素酶和辣根過氧化物酶。將異源部分與試劑綴合的合適方法是蛋白質化學領域眾所周知的。例如，可采用許多已知的化學交聯劑的任一種使兩種蛋白質交聯。所述交聯劑的實例是通過包含“受阻的” 二硫鍵在內的鍵連接兩個氨基酸殘基的交聯劑。在這些鍵中，交聯單元內的二硫鍵受保護(通過二硫鍵任一側的阻礙基團)不被例如還原型谷胱甘肽或二硫化物還原酶作用還原。一種合適的試劑4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-a-甲基-a (2-吡啶基聯硫基)甲苯(SMPT)，在兩種蛋白質之間利用一種蛋白質的末端賴氨酸和另一種蛋白質的末端半胱氨酸形成這類鍵。還可使用通過各蛋白質上的不同偶聯部分交聯的異雙官能試劑。其它有用的交聯劑包括而不限于連接以下基團的試劑兩個氨基(例如N-5-疊氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亞胺)、兩個巰基(例如1，4-雙-馬來酰亞胺基丁烷)、氨基與巰基(例如間馬來 酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、氨基與羧基(例如4-[對疊氮基水楊基酰氨基]丁胺)和氨基與存在于精氨酸側鏈的胍基(例如對疊氮基苯基乙二醛一水合物)。放射性標記可通過共價鍵或非共價鍵(例如離子鍵或疏水鍵)與試劑綴合。它們可與蛋白質的任何部分綴合，前提是所述綴合不干擾試劑與GPI部分或GPI錨定蛋白結合的能力。在一些實施方案中，如果試劑是蛋白質，則放射性標記可與試劑的氨基酸骨架直接綴合。或者，還可包含放射性標記作為較大分子的部分(例如間-[125I]碘苯基-N-羥基琥珀酰亞胺([125I]mIPNHS)中的1251，其與游離氨基結合形成相關蛋白質的間碘苯基(mIP)衍生物(參見例如Rogers等(1997) 7； Nucl. Med. 1221-1229)或螯合物(例如與DOTA或DTPA的螯合物)，其進而與蛋白質骨架結合。使放射性標記或含有放射性標記的較大分子/螯合物與本文所述試劑綴合的方法是本領域已知的。這類方法包括在有利于放射性標記或螯合物與所述試劑結合的條件下(例如pH、鹽濃度和/或溫度)，將所述試劑與放射性標記一起溫育(參見例如美國專利號6，001，329，其公開內容通過引用以其整體結合到本文中)。使熒光標記(有時稱為“熒光團”)與試劑(例如非裂解氣單胞菌溶素蛋白或抗體)綴合的方法是蛋白質化學領域已知的。例如，可使用與熒光團連接的琥珀酰亞胺基(NHS)酯或TFP酯部分，使熒光團與蛋白質的游離氨基(例如賴氨酸的游離氨基)或巰基(例如半胱氨酸的巰基)綴合。在一些實施方案中，可使熒光團與異雙官能交聯劑部分(例如磺基-SMCC)綴合。合適的綴合方法包括在有利于熒光團與試劑結合的條件下，使試劑與熒光團一起溫育。參見例如Welch和Redvanly (2003) “Handbook ofRadiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications, ” John Wiley and Sons(ISBN :0471495603)。用于使熒光團與蛋白質綴合的各種試劑盒是市售的，例如，AlexaFluor 488 蛋白質標記試劑盒(Protein Labeling Kit)和 Alexa Fluor 647 蛋白質標記試劑盒(Molecular Probes，Invitrogen ) □在一些實施方案中，焚光團可以1-2 mol染料/mol蛋白質與試劑綴合。
在一些實施方案中，試劑(例如氣單胞菌溶素蛋白或與GPI部分或GPI錨定蛋白結合的抗體)可用例如改進抗體自身在循環中(例如在血液、血清或其它組織中)的穩定和/或保留的部分修飾。例如，可按以下文獻所述使本文所述試劑聚乙二醇化例如 Lee 等(1999) Bioconjug. Chem 10(6) 973~8 ；Kinstler 等(2002) Advanced DrugDeliveries Reviews 54:477-485 ；以及 Roberts 等(2002) Advanced Drug Deli veryReviews M:459-476。穩定部分可改進受試者機體(例如血液或組織)中試劑的穩定性或保留達至少I. 5倍(例如至少2、5、10、15、20、25、30、40倍或50倍以上)。生物樣品和樣品收集
用于本文所述方法的合適的生物樣品包括包含一種或多種白細胞和/或一種或多種紅細胞的任何生物流體、細胞群、組織或其部分。生物樣品可以是例如獲自受試者(例如哺乳動物，例如人)的樣品或可來源于所述受試者。例如，樣品可以是通過活組織檢查得到的組織切片或者置于或適應組織培養的細胞。生物樣品還可以是生物流體，例如尿液、全血或其部分(例如血漿)、唾液、精液、痰、腦脊液、眼淚或粘液。如有需要，可將生物樣品進一步 分級分離成含有特殊細胞類型的流分。例如可將全血樣品分級分離成血清或含有特殊類型的血液細胞例如紅細胞或白細胞(leukocyte)的流分。如有需要，生物樣品可以是受試者的不同生物樣品的組合，例如組織和流體樣品的組合。生物樣品可獲自受試者,例如患有、疑似患有陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)或有發生陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥風險的受試者。可采用獲取生物樣品的任何合適方法，但示例性方法包括例如靜脈切開術、拭子(例如口腔拭子)、灌洗液或細針穿刺活組織檢查法(fine needle aspirate biopsy procedure)。易于細針穿刺的組織的非限制性實例包括淋巴結、肺、甲狀腺、乳房和肝臟。生物樣品還可獲自骨髓。還可通過例如顯微切割(例如激光捕獲顯微切割(LCM)或激光顯微切割(LMD))、膀胱沖洗、涂片(PAP涂片)或導管灌洗來收集樣品。用于獲取和/或保存保持生物樣品中細胞的活性或完整性的樣品的方法為本領域技術人員所熟知。例如，可將生物樣品與一種或多種其它的作用劑進一步接觸，例如合適的緩沖劑和/或抑制劑，包括蛋白酶抑制劑、意在保持或使細胞中的變化(例如摩爾滲透壓濃度或PH的變化)或細胞表面上的細胞表面蛋白(例如GPI連接的蛋白質)或GPI部分的變性降到最小的作用劑。這種抑制劑包括例如螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA);蛋白酶抑制劑，例如苯甲磺酰氟(PMSF)、抑蛋白酶肽和亮抑酶肽。以下文件描述了用于保存或以其它方式操作完整細胞的合適的緩沖劑和條件例如Pollard和Walker (1997), “Basic Cell Culture Protocols, ” Methods in Molecular Biology 第75卷，Humana Press ；Masters (2000) “Animal cell culture: a practical approach, ”Practical approach series 第 232 卷，Oxford University Press ;以及 Jones (1996)“Human cell culture protocols, ” Methods in molecular medicine 第 2 卷，HumanaPress”。還可對樣品進行處理以清除干擾物質或使干擾物質的存在情況減到最低。例如，可對生物樣品進行分級分離或純化以除去一種或多種非目標材料(例如細胞)。分級分離或純化生物樣品的方法包括但不限于流式細胞術、熒光激活細胞分選術和沉淀。診斷和治療方法如上所述并如在工作實施例中詳盡說明的一樣，本發明人發現了 PNH II型造血細胞(例如II型白細胞和/或II型紅細胞)的存在情況或量與患者的血小板減少癥之間的臨床關系。例如，本發明人已證實與受測生物樣品中相同組織學類型(相同譜系)的全部白細胞相比，PNH II型白細胞群為至少I. 2% (例如至少I. 2,1. 5、2、3、5、7、9、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57、60、62、65% 或 65. 3% 以上)的患者比不具有可檢測的PNH II型白細胞群的患者或PNH II型白細胞群低于I. 2%的患者極更可能是血小板減少性的。與沒有可檢測的II型粒細胞群的患者樣品相比，具有PNH II型粒細胞群的患者樣品具有類似的外周白細胞計數、外周紅細胞計數、絕對嗜中性粒細胞計數和血紅蛋白(Hgb)水平，這表明了血小板計數的差異可能不是因潛在骨髓產生的差異所致。換句話說，具有可檢測的PNH II型粒細胞克隆的患者中血小板計數降低可能是因末期補體介導的血小板消耗或破壞增加所致，這可能與PNH患者死亡的主要原因血栓形成有關。參見例如Franchini (2006) HematolosvW (3) : 139-146。因此，本公開內容的特征在于利用與患者樣品中PNH II型白細胞的百分比有關的信息以確定患者是否處于發生血小板減少癥和/或血栓形成的風險增加的狀態的方法。類似地，本發明人已確定與不具有可檢測的PNH II型RBC群的患者或PNH II型RBC群低于0. 02%的患者相比，PNH II型RBC 群至少為 0. 02% (例如至少 0. 02,0. 03,0. 04,0. 05,0. 06,0. 07,0. 08,0. 09,0. 1,0. 2,0. 3、
0.4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、I、I. I、I. 2、I. 3、I. 4、I. 5、I. 6、I. 7、I. 8、I. 9、2、2. I、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、3. 8、3. 9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71. 3% 或 75% 以上)的患者極更可能是血小板減少性的。因此，本公開內容的特征還在于利用與患者中PNHII型RBC克隆量相關的信息以確定患者是否有發生血小板減少癥和/或血栓形成的風險的方法。可采用以下方法檢測與患者生物樣品中相同組織學類型(相同譜系)的細胞總量相比PNH II型造血細胞(例如II型PNH白細胞)的存在情況或測定PNH II型造血細胞(例如II型PNH白細胞)的百分比。在其中檢查大量白細胞的實施方案中，所述方法可用于供從業人員將相同組織學類型(相同譜系)的PNH I型、II型和III型白細胞群區分開來，以便準確地測定與所述大量中相同組織學類型的白細胞總數相比，總的異常PNH群(即II型加III型細胞)的大小(和/或供從業人員測定所述大量中PNH II型白細胞的百分比)。首先，使細胞群(例如白細胞、紅細胞或白細胞和紅細胞的組合)與結合(i) GPI部分或(ii) GPI連接的蛋白質的試劑在允許試劑與GPI部分或GPI連接的蛋白質(如果在存在于樣品中的細胞表面上存在)結合的條件下接觸一段時間。細胞群可存在于生物樣品中(例如全血樣品；參見題為“生物樣品和樣品收集”的部分)，例如獲自患者的生物樣品。例如，存在于患者的全血樣品中的細胞可與氣單胞菌溶素蛋白(例如非裂解形式的氣單胞菌溶素)或與GPI部分或GPI錨定蛋白(例如CD59)結合的抗體接觸。參見例如Hall和Rosse (1996) BIoocI^l (12) : 5332-5340和美國專利號6, 593, 095。可根據與細胞表面結合的試劑的量，區分與試劑接觸的至少一部分細胞(例如白細胞或RBC)。例如，如果使用可檢測標記的試劑，則可測定與表面結合的試劑的量為由與細胞表面結合的可檢測標記的試劑所產生的信號總量的函數。如上所述，試劑與細胞結合的量反映了 GPI部分和/或GPI錨定蛋白表達的量，其表明細胞是否是PNH III型細胞(GPI和GPI錨定蛋白幾乎不表達或不表達)、正常細胞(I型細胞；與III型細胞相比，具有相對較高水平的GPI和GPI錨定蛋白表達)還是PNH II型細胞(與I型細胞和III型細胞相比，具有中等水平的GPI和GPI錨定蛋白表達)。區分或檢查方法可包括例如流式細胞術。在一些實施方案中，采用所述方法檢測試劑與患者樣品的RBC結合的量。在一些實施方案中，可采用所述方法檢測試劑與患者樣品的白細胞結合的量。特別適宜在本文所述診斷方法中評價的白細胞包括例如粒細胞和單核細胞(例如巨噬細胞)。樣品可來自患有、疑似患有陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)或有發生陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)的風險的患者。在一些實施方案中，患者具有一種或多種癥狀，包括例如庫姆斯陰性血管內溶血(Coombs negative intravascular hemolysis)、LDH水平升高、復發性缺鐵性貧血、反常部位血栓形成、間歇性吞咽困難或腹痛。在一些實施方案中，為了輔助鑒定正常細胞或PNH細胞，也可對一組對照細胞群 實施所述檢測方法。在評價目標細胞群之前、同時或之后可對對照群進行評價。如下面更詳細的論述一樣，從業人員可選擇對已知為PNH II型細胞的對照細胞群、已知為PNH III型細胞的對照細胞群和/或已知為正常或I型細胞的對照細胞群實施所述方法以測定與用于特殊細胞類型的試劑的結合的典型量或平均量。可利用該對照信息把目標細胞(例如白細胞或紅細胞)歸類或鑒定為正常細胞、PNH II型細胞和/或PNH III型細胞。取決于生物樣品內細胞群的特定組成，根據高結合試劑量、低結合試劑量或結合試劑的中等水平，可將所述群的至少一些細胞與其它細胞區分開來。在一些情況下，僅具有高結合試劑量的細胞可存在(例如來自健康患者或未患PNH的患者的細胞)。在一些情況下，較大百分比的細胞將幾乎沒有或沒有與其表面結合的試劑(例如具有高百分比的PNHIII型細胞的PNH患者的白細胞或RBC)。在一些實施方案中，可根據與細胞結合的試劑的量，將與試劑接觸的細胞群歸類為高、低和中等類別。在一些實施方案中，可根據與其細胞表面結合的試劑的量，對一種或多種細胞(例如一種或多種經區分或檢查的細胞)進行分類。如以工作實施例為例說明和圖I中的描述一樣，可采用流式細胞術方法容易地將群中各細胞歸類為高試劑結合的、低或差試劑結合的和中等試劑結合的。例如，使獲自PNH患者的白細胞與以下兩種不同的試劑接觸■ 與GPI部分(例如可檢測標記的非裂解氣單胞菌溶素蛋白)結合的第一試劑和與GPI錨定蛋白結合的第二試劑(例如與人CD24結合的可檢測標記的抗體)。第一試劑和第二試劑用不同的可檢測標記進行標記。然后對經接觸的細胞進行流式細胞術。根據各試劑與細胞結合的量，流式細胞術領域的技術人員可容易地采用該方法區分細胞。參見例如Macey (2007)“Flow Cytometry: principles and applications, ” Humana Press (ISBN: 1588296911)和Brodsky等(2000) Am J Clin Pathol114:459-466。如圖I所示，可容易地采用流式細胞術方法將獲自PNH患者的粒細胞歸類為具有各試劑的高結合量(右上方的細胞群；正常細胞或I型細胞)、各試劑的低結合量(左下方的細胞群；111型細胞)和各試劑的中等結合量(底中部的細胞群；11型細胞)。可通過將與細胞結合的試劑的量與對照量(例如試劑與PNH I型細胞、PNH II型細胞和/或PNH III型細胞結合的對照量)進行比較，來進行細胞的分類。試劑與PNH I型細胞結合的對照量可以例如所觀察到試劑與獲自一個或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40個以上)健康個體的相同組織學類型的細胞結合的平均量為基礎。試劑與PNH III型細胞結合的對照量可以例如所觀察到的獲自一個或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、或40個以上)PNH患者的相同類型細胞結合的平均量為基礎。試劑與PNH II型細胞結合的對照量可以例如所觀察到的獲自一個或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40個以上)患有PNH并具有相同組織學類型(相同譜系)的PNH II型細胞的可檢測群的患者的相同類型的細胞結合的平均量為基礎。例如，為了根據與細胞表面結合的試劑的量對目標白細胞進行分類，從業人員可將與細胞結合的試劑的量與試劑與已知為PNH I型白細胞的白細胞、已知為PNH II型白細胞的白細胞和/或已知為PNH III型白細胞的白細胞結合的典型量或平均量進行比較。在一些實施方案中，可通過確定試劑與細胞結合的量是否落入表明相同組織學類型的PNH I型細胞、PNH II型細胞或PNH III型細胞的預定范圍內，來進行目標細胞(例如白細胞或RBC)的區分或分類。在一些實施方案中，目標造血細胞的區分或分類可包括確定試劑與細胞表面結合的量是否落入預定截止值之上還是之下。截止值通常是試劑與細胞表面結合的量(或自細胞檢測的信號的量)，超過或低于該值被視為表明某種細胞類型即PNHI型細胞、PNH II型細胞或PNH III型細胞。 一些截止值不是絕對的，因為診斷相關性(例如試劑與細胞表面結合的量與細胞是PNH II型細胞的可能性)在截止值任一側的數值范圍內仍可保持顯著性。要理解的是，最佳截止值的求精可根據所用試劑的質量、所用統計方法和檢測設備(例如流式細胞術)的先進程度以及所檢查的樣品的數目和來源來確定。因此，可根據周期性重新評價或方法的改變或樣品分布，上下調整截止值。本文所用“血小板減少癥”是指其中患者的血小板計數小于200，000個血小板/U L血液(例如小于150，000、小于140，000、小于130，000、小于120，000、小于110，000、小于100，000或小于90，000個血小板/ ii L血液)的病況。在一些實施方案中，血小板減少癥患者的血小板計數小于100，000個血小板/ ii L血液。如上所述，有關PNH II型細胞的百分比的信息可用于確定患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態的方法。有關患者生物樣品中PNH II型細胞(例如II型白細胞和/或II型紅細胞)的百分比的信息可傳達(例如電子或印刷形式)給醫學從業人員，以便從業人員將其用于為患者選擇合適治療方案。根據與受測生物樣品中相同組織學類型的白細胞的總數相比至少 I. 2% (例如至少 I. 2,1. 5、2、3、5、7、9、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57、60、62、65% 或 65. 3% 以上)的 PNH II 型白細胞群，從業人員可確定患者有發生血小板減少癥的風險，或很可能是血小板減少性的。同樣地，與不具有可檢測的PNH II型RBC群的患者或PNH II型RBC群低于0. 02%的患者相比，受測生物樣品中全部RBC的PNH II型RBC群為至少0. 02% (例如至少0. 02,0. 03,0. 04,0. 05,0. 06、
0.07、0. 08、0. 09、0. U0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1、1. Ul. 2、1. 3、1. 4、1. 5、1. 6、
1.7、1. 8、1. 9、2、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3.7,3.8,3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71.3%或75%以上)的患者極更可能是血小板減少性的。具有至少1.2%的PNH II型白細胞群或至少0.02%的PNH II型紅細胞群的患者發生血栓的可能性可為正常個體或不具有該PNH II型細胞百分比的患者的例如至少I. 5倍(例如2、2. 5、3、3. 5、4、4. 5,5,5. 5,6,6. 5,7,7. 5、8、8. 5,9,9. 5,10,10. 5、11、11. 5,12,12. 5、15、20、30 倍或甚至 40倍以上)。醫學從業人員可能要求其它試驗以測定患者的血小板計數。用于測定受試者血液來源的樣品中的血小板計數的方法是醫學領域公知的，并描述于例如Sallah等(1998)Postgraduate MedicineX^: 209-210 Kottke~Mar chant (1994) Hema to I Oncol ClinNorth Am. 8:809-853 ；Redei 等(1995) J Crit 777/ 10:133-137 ；Butkiewicz 等(2006)Thrombosis Research 118 (2) : 199-204 ;Tomita 等(2000) Am J Hema to I 63 (3) : 131-135 ；以及 Schrezenmeier 等(1998) Br T HaematollQQ (3) : 571~5760如果患者被醫學從業人員確定為是血小板減少性的或可能是血小板減少性的，則從業人員可選擇、開予處方或給予患者抗血小板減少療法。抗血小板減少療法可以是例如皮質類固醇、血小板輸注、脾切除術或血小板產生刺激藥物。血小板產生刺激藥物可以是例如血小板生成素(TPO)或血小板生成素模擬物。參見例如Kuter和Begley (2002)^7oo^l00:3457-3469 ；Li 等(2001) ^7oot/98:3241-3248 ;以及 Vadhan-Raj 等(2000) AnnIntern #漢/132:364-368。TPO模擬物肽可具有美國專利申請公布號20030049683的圖5中 描述的氨基酸序列，其公開內容(特別是圖5)通過引用以其整體予以結合。如果患者的生物樣品中PNH II型白細胞的百分比約為I. 2%，則醫學從業人員還可確定患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態。醫學從業人員因此可為患者選擇合適的抗血栓療法。例如，從業人員可選擇、開予處方或給予患者抗凝血藥或溶血栓藥。抗凝血藥可以是例如香豆定、肝素或其衍生物。溶血栓藥可以是例如組織纖溶酶原激活物(例如Retavase 、Rapilysin )、鏈激酶或尿激酶型纖溶酶原激活物。在一些實施方案中，所測定的具有大于或等于I. 2%的PNH II型白細胞群或者大于或等于0. 02%的PNH II型紅細胞群的患者可診斷為患有PNH。在一些實施方案中，被測定具有大于或等于I. 2%的PNH II型白細胞群或者大于或等于0.02%的PNH II型紅細胞群的被診斷患有PNH的患者或之前已診斷的PNH患者可開予補體抑制劑和/或用補體抑制劑治療。可按照本公開內容使用結合或以別的方式阻斷任何人補體組分的產生和/或活性的任何化合物。例如，補體抑制劑可以是例如小分子、核酸或核酸類似物、肽模擬物或不是核酸或蛋白質的大分子。這些物質包括但不限于有機小分子、RNA適配體、L-RNA適配體、Spiegelmers、反義化合物、雙鏈RNA、小干擾RNA、鎖定核酸抑制劑和肽核酸抑制劑。在一些實施方案中，補體抑制劑可以是蛋白質或蛋白質片段。在一些實施方案中，對人補體組分有特異性的抗體在本文中是有用的。一些化合物包括針對補體組分Cl、C2、C3、C4、C5 (或其片段；見下文)、C6、C7、C8、C9、因子D、因子
B、因子P、MBL、MASP-I和MASP-2的抗體，因此防止產生與C5a有關的過敏毒素活性和/或防止與C5b有關的膜攻擊復合物的裝配。還可用于本發明方法的有天然存在的補體抑制化合物或可溶形式的補體抑制化合物，例如CRl、LEX-CRl、MCP、DAF、CD59、因子H、眼鏡蛇毒因子、FUT-175、補體結合抑制素和K76 COOH0可用于結合或以別的方式阻斷任何人補體組分的產生和/或活性的其它化合物包括但不限于蛋白質、蛋白質片段、肽、小分子、RNA適配體包括ARC187 (其是市售的，可獲自 Archemix Corporation, Cambridge, MA) > L-RNA 適配體、spiegelmers、反義化合物、絲氨酸蛋白酶抑制劑、可用于RNA干擾(RNAi)的分子例如雙鏈RNA包括小干擾RNA (siRNA)、鎖定核酸(LNA)抑制劑、肽核酸(PNA)抑制劑等。在一些實施方案中，補體抑制劑抑制補體活化。例如，補體抑制劑可結合并抑制Cl (例如Clq、Clr或Cls)的補體活化活性，或者補體抑制劑可結合并抑制C2、C3或C4(例如抑制C2、C3或C4的切割)。在一些實施方案中，抑制劑抑制補體替代途徑和/或經典途徑的C3轉化酶和/或C5轉化酶的形成或裝配。在一些實施方案中，補體抑制劑抑制末端補體形成，例如C5b-9膜攻擊復合物的形成。例如，抗體補體抑制劑可包括抗C5抗體。這種抗C5抗體可直接與C5和/或C5b相互作用，從而抑制C5b的形成和/或生理功能。示例性的抗C5抗體包括例如依庫珠單抗(Soliris ;Alexion Pharmaceuticals,Inc. , Cheshire, CT ;參見例如Kaplan (2002) Curr Opin Investig Drugs 3 (7) : 1017-23 ；Hill (2005) Clin Adv Hema to I Oncol 3 (11) :849-50 ；以及 Rother 等(2007) NatureBiotechnolosvlh (11) : 1256-1488)和培克珠單抗(Alexion Pharmaceuticals, Inc.,Cheshire, CT ;參見例如 Whiss (2002) Curr Opin Investig Drugs 3 (6) : 870-7 ；Patel 等(2005) Drugs Today (Bare) M (3) : 165-70 以及 Thomas 等(1996) Mol Immunol.33(17-18): 1389-401)。用于將合適的抗血栓療法和/或抗血小板減少療法給予有需要的患者的方法是醫學領域公知的。在一些實施方案中，用于確定患者是否處于血小板減少癥或血栓形成的風險增加的狀態的方法可輔以計算機。例如，該方法可包括接收包括PNH患者的醫學概況的數據，所述概況包括有關患者生物樣品中相同組織學類型(相同譜系)的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比的信息；并對至少包括所述信息的數據部分進行處理以確定患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態。在另一實例中，該方法可包括提供有關患者生物樣品中相同組織學類型的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比的信息；將信息輸入計算機；并應用計算機和輸入信息計算表明患者是否處于血栓形成的風險增加的狀態的參數。患者發生血小板減少癥或血栓形成的相對風險可通過計算機打印輸出和/或可存儲在計算機可讀介質上。試劑盒
本文的特征還在于用于以下方面的試劑盒確定患者的生物樣品是否含有PNH II型白細胞群和/或確定患者是否處于發生血小板減少癥或血栓形成的風險增加的狀態。試劑盒可包括例如一種或多種選自以下的可檢測標記的綴合物氣單胞菌溶素綴合物(例如非裂解變體氣單胞菌溶素蛋白綴合物)或結合GPI錨定蛋白的抗體的綴合物。試劑盒還可包括含有GPI表達細胞或GPI結合顆粒的對照樣品；和任選用于檢測GPI表達細胞的存在情況的說明書。試劑盒還可包括用于獲取人的生物樣品(例如血樣)的一種或多種器件和/或上述任何試劑盒組分。下面的實施例旨在說明，而非限制本發明。
實施例實施例I.材料與方法
獲取共2，921名患者的外周血樣品以測試PNH II型細胞和PNH III型細胞的存在情況。將血樣抽入裝有EDTA的無菌小瓶。
為了測定各患者樣品中存在的正常白細胞(I型細胞)、PNH II型和PNH III型白細胞的百分比，將外周血混合，并用一種或多種下列綴合物染色與AlexaFluor 488綴合的非裂解氣單胞菌溶素變體蛋白(Protox Biotech FL2-S)、與藻紅蛋白(PE)綴合的抗CD24抗體(Beckman Coulter克隆ALB9)、與PC5綴合的抗CD15抗體(克隆80H5)和與PC7綴合的抗⑶45抗體(克隆J. 33)。在將血液與一種或多種上述試劑一起在室溫下溫育15-30分鐘后，將血液用Immunoprep (Beckman Coulter)裂解,并用PBA緩沖液(磷酸緩沖鹽溶液、1%牛血清白蛋白和10 mM NaN3)洗滌2次。然后將細胞重新懸浮于PBA緩沖液中，使用FC 500流式細胞儀(Beckman Coulter)進行分析。如果鑒定出PNH II型或III型粒細胞群，則也使用與一種或多種下列綴合物接觸的患者血液，針對II型或III型群對單核細胞進行檢查與AlexaFluor 488綴合的非裂解氣單胞菌溶素變體蛋白(Protox BiotechFL2-S)、結合與藻紅蛋白(PE)綴合的CD33的抗體(克隆D3HL60. 251)、結合與ECD綴合的CD14的抗體(克隆RM052)、結合與PC5綴合的CD64的抗體(克隆22)和結合與PC7綴合的CD45的抗體(克隆J. 33)，其允許對單核細胞進行譜系特異性門控。為了測定正常紅細胞(I型細胞)、PNH II型和PNH III型紅細胞的百分比，將20U I在EDTA中的外周血加入3 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，充分混合。使50 U I稀釋的 患者血液與一種或多種下列綴合物接觸與FITC綴合的抗⑶235a抗體(Beckman Coulter克隆11E4B-7-6 / KC16)和與PE綴合的抗CD59抗體(Invitrogen克隆MEM-43)。將血液和綴合物在室溫下避光溫育I小時，同時每15分鐘進行渦旋。在I小時溫育后，血液用PBS洗漆兩次，重新懸浮于PBS中，并在FC 500流式細胞儀(Beckman Coulter)上進行分析。實施例2
采用基于高靈敏度流式細胞術的測定，對2，921名患者的全血樣品(提交該樣品用于PNH的診斷試驗)進行分析以檢測白細胞(特別是粒細胞)上GPI和GPI錨定蛋白的表達水平，從而測定各樣品中的I型、PNH II型和PNH III型白細胞(粒細胞)群。還利用該測定檢測各個患者樣品中的I型、PNH II型和PNH III型紅細胞群。該方法利用熒光標記的非裂解氣單胞菌溶素蛋白變體以及抗特異性GPI錨定的譜系特異性蛋白質抗原的抗體。圖I中描述了 I名患者樣品的示例性流式細胞術分析。使全血樣品的細胞與熒光標記的氣單胞菌溶素試劑(Alexa Fluor)和藻紅蛋白(PE)標記的與GPI錨定蛋白CD24結合的抗體接觸。對全血樣品的細胞進行流式細胞術分析，根據從與粒細胞表面結合的各種試劑檢測的信號的量顯現其中的粒細胞。如圖I所示，將自AlexaFluor和PE標記檢測的最大信號量的粒細胞(右上方型細胞)與信號非常低或缺乏信號的粒細胞群(左下方型粒細胞)和產生中等信號量的粒細胞(中部群型粒細胞)相分離。使用以下兩種試劑檢查PNH紅細胞群可檢測標記的與⑶235結合的抗體和可檢測標記的與CD59結合的試劑。使用可檢測標記的氣單胞菌溶素蛋白和若干抗GPI錨定的譜系特異性細胞表面蛋白(包括⑶24、⑶14、⑶16、⑶66b和⑶55)的抗體，對PNH白細胞群進行檢查。216個患者樣品的可檢測的PNH III型粒細胞群〉樣品中粒細胞總數的0. 01%，且絕對計數為至少50個PNH III型粒細胞。可得到這些患者中162位的與幾個參數有關的臨床信息(例如血紅蛋白水平、LDH水平和血小板計數)(參見表I)。表I.具有可檢測的PNH III型或II型粒細胞群的患者的臨床特征(其中可獲得
權利要求
1.一種用于預測患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態的方法，所述方法包括 測定患者生物樣品中相同組織學類型的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比；和 預測患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態，其中如果PNH II型白細胞的百分比大于或等于I. 2%，則所述患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態。
2.權利要求I的方法，其中所述白細胞是粒細胞。
3.權利要求I的方法，其中所述白細胞是單核細胞。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述生物樣品是全血樣品。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其還包括從患者中獲取生物樣品。
6.權利要求1-5中任一項的方法，其中I.2%-65. 3%的PNH II型白細胞群表明患者處于血栓形成的風險增加的狀態。
7.權利要求1-6中任一項的方法，其中大于或等于5%的PNHII型白細胞群表明患者處于血栓形成的風險增加的狀態。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中大于或等于10%的PNHII型白細胞群表明患者處于血栓形成的風險增加的狀態。
9.權利要求1-8中任一項的方法，其中大于或等于20%的PNHII型白細胞群表明患者處于血栓形成的風險增加的狀態。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中大于或等于50%的PNHII型白細胞群表明患者處于血栓形成的風險增加的狀態。
11.權利要求1-10中任一項的方法，如果患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態，則所述方法還包括針對出現至少一種血栓形成癥狀監測患者。
12.權利要求1-11中任一項的方法，如果患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態，則所述方法還包括為患者選擇抗血栓療法。
13.權利要求12的方法，其中所述抗血栓療法是抗凝血藥或溶血栓藥。
14.權利要求13的方法，其中所述抗凝血藥是香豆定、肝素或其衍生物。
15.權利要求13的方法，其中所述溶血栓藥是組織纖溶酶原激活物、鏈激酶或尿激酶型纖溶酶原激活物。
16.權利要求1-15中任一項的方法，如果患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態，則所述方法還包括給予患者抗血栓療法。
17.一種用于為患者選擇療法的方法，所述方法包括為已確定具有大于或等于I. 2%的PNH II型白細胞群的患者選擇抗血栓療法和抗血小板減少療法的一種或兩種。
18.一種用于治療患者的方法，如果患者具有大于I. 2%的PNH II型白細胞群，則所述方法包括給予有需要的患者抗血栓療法和抗血小板減少療法的一種或兩種。
19.權利要求17或18的方法，其中所述抗血栓療法是抗凝血藥或溶血栓藥。
20.權利要求17-19中任一項的方法，其中所述抗血小板減少療法是血小板輸注。
21.一種用于確定患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態的基于計算機的方法，所述方法包括 接收包括PNH患者的醫學概況的數據，所述概況包括有關患者生物樣品中相同組織學類型的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比的信息；和對至少含有確定患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態的信息的數據部分進行處理，其中如果II型白細胞的百分比大于或等于I. 2%，則所述患者處于發生血栓形成的風險增加的狀態。
22.一種用于確定患者是否處于發生血栓形成的風險增加的狀態的基于計算機的方法，所述方法包括 提供有關患者生物樣品中相同組織學類型的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比的信息； 將信息輸入計算機；和 利用計算機和輸入信息計算表明患者是否處于血栓形成的風險增加的狀態的參數，其中如果II型白細胞的百分比大于或等于I. 2%，則所述患者處于發生血栓形成的風險增加 的狀態。
23.權利要求1-22中任一項的方法，其中氣單胞菌溶素蛋白的非裂解變體形式用來測定PNH II型白細胞的百分比。
24.一種用于鑒定PNH II型白細胞的方法，所述方法包括 使大量白細胞與結合(i) GPI或(ii) GPI錨定蛋白的試劑接觸；和 根據與細胞結合的試劑的量，將一種或多種白細胞鑒定為PNH II型白細胞，其中與試劑結合PNH III型白細胞的量和試劑結合I型白細胞的量相比，試劑結合白細胞的中等量表明白細胞是PNH II型白細胞。
25.一種用于區分白細胞群的方法，所述方法包括 使大量白細胞與結合(i) GPI或(ii) GPI錨定蛋白的試劑接觸；和 根據結合細胞的試劑的量，將至少一部分白細胞與所述大量的其它白細胞區分開來，其中所述PNH II型白細胞如存在的話，足以與相同組織學類型的I型白細胞和PNH III型白細胞區分開來，以供測定所述大量中相同組織學類型的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比。
26.權利要求24或25的方法，其還包括測定所述大量中相同組織學類型的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比。
27.一種用于測定PNH II型白細胞的百分比的方法，所述方法包括 提供與結合(i) GPI或(ii) GPI錨定蛋白的試劑接觸的大量白細胞； 根據結合細胞的試劑的量，將至少一部分白細胞與所述大量的其它白細胞區分開來，其中PNH II型白細胞如存在的話，足以與相同組織學類型的I型白細胞和PNH III型白細胞區分開來，以供測定所述大量中相同組織學類型的全部白細胞的PNH II型白細胞的百分比；和 測定PNH II型白細胞的百分比。
28.權利要求26或27的方法，其還包括測定PNHIII型白細胞的百分比。
29.權利要求25-27中任一項的方法，其中所述區分法包括流式細胞術。
30.權利要求24-28中任一項的方法，其中所述大量白細胞獲自患有、疑似患有PNH或有發生PNH的風險的患者。
31.權利要求26-30中任一項的方法，其還包括記錄PNHII型白細胞的百分比。
32.權利要求31的方法，其中所述記錄是在計算機可讀介質上。
33.權利要求24-32中任一項的方法，其中所述試劑與人GPI部分結合。
34.權利要求33的方法，其中所述試劑包括氣單胞菌溶素蛋白。
35.權利要求33或34的方法，其中所述試劑包含與蛋白質的野生型形式相比是非裂解的或是基本上非裂解的氣單胞菌溶素蛋白的變體形式。
36.權利要求33-35中任一項的方法，其中所述試劑包含SEQID N0:2或7中所述氨基酸序列，其中253位的蘇氨酸被半胱氨酸取代，且300位上的丙氨酸用半胱氨酸取代。
37.權利要求33的方法，其中所述試劑是抗體或其抗原結合片段。
38.權利要求24-32中任一項的方法，其中所述試劑與GPI錨定蛋白結合。
39.權利要求38的方法，其中所述GPI錨定蛋白選自堿性磷酸酶、5’核苷酸酶乙酰膽堿酯酶、二肽酶、LFA-3、NCAM、PH-20、CD55、CD59、Thy-I、Qa_2、CD14、CD33、CD16 (Fcy 受體III)、癌胚抗原(CEA)、CD24、CD66b、CD87、CD48 和 CD52。
40.權利要求38或39的方法，其中所述試劑是抗體或其抗原結合片段。
41.權利要求24-40中任一項的方法，其中使所述大量白細胞與結合GPI的試劑和結合GPI連接的蛋白質的試劑接觸。
全文摘要
本公開內容涉及用于檢測生物樣品中PNHII型細胞群的方法以及根據患者血液中PNHII型細胞的百分比確定患者是否處于發生血小板減少癥或血栓形成的風險增加的狀態的方法。本公開內容的特征還在于用于所述方法的試劑和綴合物。
文檔編號G01N33/577GK102753976SQ201080060850
公開日2012年10月24日 申請日期2010年11月9日 優先權日2009年11月9日
發明者A.伊林沃思, M.莫瓦利亞, R.P.羅瑟, S.法斯麥奈特 申請人:阿雷克森制藥公司