用于診斷針對病毒的免疫應答的方法

專利名稱：用于診斷針對病毒的免疫應答的方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域。本發明尤其涉及病毒學和免疫學領域，更具體地本發明涉及用于診斷針對病毒的細胞免疫應答的方法，其使用滅活的病毒，如流感病毒。
背景技術：
對高致病性和流行性流感病毒進行研究需要BSL-3的高度密封設施。這種設施的限制實質上影響了實驗室潛力。因此，存在對能夠檢測針對高致病性流感病毒的免疫應答 的測定的需要，其可以在不需要BSL-3高度密封設施的情況下進行。通過將高致病性和流行性流感病毒滅活，可以在不具有BSL-3分級的實驗室中使用這些病毒。目前，在生產裂解和亞單位流感疫苗的過程中，福爾馬林化學處理應用于滅活流感病毒，并且還可用于全流感病毒滅活(1，2)。福爾馬林通過不可逆地交聯蛋白質起作用，從而徹底去除病毒感染性(3)。因此，此過程有效地滅活了流感病毒并且允許在BSL-3限制之外使用福爾馬林處理的滅活病毒。通過標準血細胞凝集和神經氨酸酶抑制試驗確定針對流感的體液免疫應答(4，5，12)。然而，已經顯示難以檢測針對滅活流感病毒的細胞免疫應答。通過常規的51Cr釋放測定確定CTL活性缺乏靈敏度(6)。在51Cr釋放測定之前，7天體外刺激期間的記憶CTL擴增很可能遮掩任何差異，表明體外擴增會降低該測定的靈敏度。更靈敏的測定如ELISP0T測定能夠檢測由鄰近細胞產生的分泌細胞因子，并且不需要體外擴增步驟(7)。盡管ELISP0T是靈敏的，此測定并不能同時檢測多重效應子功能并且不能區分不同的功能性群體。重要的是，已經顯示具有多重效應子功能(即產生多種細胞因子和/或細胞毒性物質)的T細胞(多功能T細胞)對確定免疫應答質量是重要的。因此，通過流式細胞儀檢測這些細胞有助于確定疫苗質量和疫苗設計(8)。Rutebemberwa等人(9)公開了用二硫二卩比唳(Aldrithiol)滅活HIV-1的方法。然后分離PBMC并將其暴露于滅活的病毒，進行流式細胞測定以檢測尤其是IFN-Y。Skarsvik等人(10)公開了如何用熱滅活的柯薩奇(Coxsackie)病毒刺激PBMC,其隨后用若干標記物通過流式細胞測定檢測T細胞活化。Betts等人(11)公開了用代表HIV-I的抗原部分的混合肽刺激PBMC，其隨后用若干標記物通過流式細胞分析檢測T細胞活化。然而，對確定針對整個活病毒的完整的生理學相關CD8 T細胞應答來說，使用重疊肽不是有效的選擇。產生覆蓋完整病毒蛋白組的重疊肽庫并同時擁有足夠的待用這些庫刺激的PBMC實際上是不可能的。另外，外源添加的肽缺少了在MHC分子呈遞前對肽的胞內處理，從而可能錯過依賴于胞內翻譯后修飾的應答。此夕卜，天然處理允許在天然水平將肽呈遞，其導致生理學相關的體外免疫應答，而外源添加的肽可能導致刺激生理學無關的T細胞應答。然而，現有技術沒有公開使用滅活病毒檢測針對病毒的T細胞應答的方法，其中T細胞應答可靠地反映足夠強度的由活病毒獲得的應答。現有技術尤其沒有公開這樣的用于檢測針對流感病毒的T細胞應答的方法。因此，本領域仍存在著對提供用于可靠地并同時靈敏地檢測多種標記物并用于確定針對病毒特別是流感病毒的T細胞應答的表型(phenotyping)(在效應子功能的數量和類型以及不同標記物的表達方面)的手段和方法的需要。本發明的目的是提供這樣的手段和方法。發明概述檢測針對病毒的免疫應答中的一個復雜因素是活病毒的使用通常被視為對確定CD8+T細胞應答是絕對必須的，因為只有活病毒感染的T細胞允許在I型MHC分子上通過直接呈遞途徑表達病毒表位(K. L. Rock, The Journal of Immunology, 2010,184,9-15)。然而，因為活病毒感染需要用于高致病性病毒的BSL-3條件，我們已經開發了允許檢測用滅活病毒刺激后的CD8 T細胞應答的方法。本技術利用了替代的呈遞路線，其為樹突狀細胞和巨噬細胞獨有的，通過稱作交叉呈遞的過程將其外部環境中的抗原呈遞在I型MHC肽上(K. L. Rock, The Journal of Immunology,2010，184，9-15)。在第一方面，本發明涉及用于檢測對象中針對病毒的免疫應答存在的方法。所述方法優選為用于檢測針對病毒的細胞免疫應答的方法。更具體地，該方法檢測針對病毒的 T細胞應答。用于檢測對象中針對病毒的免疫應答的方法優選包括步驟a)將來自所述對象的PBMC與滅活的病毒孵育；和，b)通過流式細胞術檢測所述PBMC中至少一種T細胞活性標記物的表達。在所述方法中有利的是，使用滅活病毒與來自對象的PBMC孵育，以使得在不具有BSL-3分級的實驗室中實施該方法是可行的。用于滅活病毒的不同手段是本領域已知的。例如用于滅活病毒的化學手段包括用有效劑量的一或多種下述試劑處理去污劑(如TritonX-100)、甲醛、福爾馬林、￠-丙內酯或硫柳汞。用于滅活的另外的化學手段可包括用亞甲基藍、補骨脂素、羧酸富勒烯(C60)或其任何組合處理。滅活病毒的其它方法為本領域已知的，例如，如二元乙胺、乙酰乙烯亞胺和物理手段如加熱、紫外線或Y射線。對于本發明的方法所用的滅活病毒的制備，可應用任何這些手段或其組合。本文中滅活病毒可理解為優選指不具有可檢測的感染性的病毒制備物。本發明所用的滅活病毒制備物的感染性可用本領域公知的方法確定(見例如Goldstein和Tauraso, 1970, supra)。一般地,滅活制備物的感染性相比于對應的非處理和/或空白處理(mock-treated)的病毒制備物的感染性，其中滅活病毒制備物的滴度比非處理和/或空白處理的病毒制備物的滴度低至少6、7、8、9或10個數量級。優選地，在滅活制備物中檢測不到病毒感染性。在用于制備本發明所用的滅活病毒的優選的方法中，通過用至少約0.02% v/v的福爾馬林處理病毒至少18小時來獲得滅活病毒。優選地，在37°C處理病毒。技術人員將會理解，最小滅活時間和福爾馬林濃度可以不同，例如當使用較低福爾馬林濃度時將需要較長的滅活時間，而對較高福爾馬林濃度而言可需要較短時間。因此，在用于制備本發明所用的滅活病毒的優選的方法中，通過用福爾馬林在這樣的條件下(即持續一段時間，在一定濃度的福爾馬林中和一定的溫度下)處理病毒來獲得滅活病毒，所述條件產生與用至少約0. 02% v/v的福爾馬林在37°C處理病毒至少18小時所獲得的相同的滅活程度(即滅活病毒制備物的滴度為相同數量級，其低于未經處理和/或空白處理的相同病毒制備物的滴度)。在另外的用于制備本發明所用的滅活病毒的優選的方法中，通過如透析、滲濾或色譜(如尺寸排阻或親和色譜)處理從滅活病毒制備物中去除滅活劑(如甲醛)。用于這樣的處理的手段和方法是本領域公知的。毫無疑問，病毒制備物的滅活將在具有所需的BSL分級的實驗室中進行。然而，在滅活并去除滅活劑后，滅活病毒制備物可以根據本發明轉移至并儲存于和/或使用于不具有BSL-3分級的實驗室中。在本發明的方法中將滅活病毒與PBMC孵育。PBMC (外周血單核細胞)可用多種本領域公知的方法從人或其它哺乳動物血中獲得(見例如Coligan等人，1994，In =Coico R，ed. Current protocols in immunology. Vol. 2 John Wiley 和 Sons, Inc. ,1994 :711-2)。例如，包含PBMC的組合物例如可由通過來自哺乳動物或人血的成分單采(aphaeresis)、Ficoll密度梯度離心和/或血紅細胞裂解可獲得的PBMC組成。在本發明的方法中，PBMC和滅活病毒在培養基中并在如本領域公知的適合于T細胞維持、增殖和/或刺激的條件下孵育(見例如Current protocols in immunology,CoicoR，ed，John Wiley和Sons，Inc.，1994)。在本發明的方法中，在用流式細胞術檢測細胞因子 表達之前，PBMC和滅活病毒優選孵育約24-96小時。因此，在本發明的方法中，優選在PBMC與病毒孵育約24-96小時后檢測細胞因子表達，即在“感染”后或更確切是刺激后約24-96小時。更優選地，在PBMC與病毒孵育至少36、48、60、66、68或70小時后，并優選PBMC與病毒孵育不超過96、90、84、78或74小時后檢測細胞因子表達。更優選地，在PBMC與病毒孵育后72小時左右檢測細胞因子表達。在本發明的方法的一個實施方案中，檢測至少2種不同的T細胞活性標記物的表達。優選地，在所述方法中同時檢測至少2種不同的T細胞活性標記物的表達，例如通過使用至少2種不同的熒光標記(同時)檢測每種T細胞活性標記物。一般地，在本發明的方法中，可通過使用待檢測的標記物或抗原特異性的(單克隆)抗體在流式細胞儀中合適地檢測T細胞活性和/或分化抗原的標記物(如CD4和CD8)，所述抗體通過與熒光標記(即熒光團)綴合而標記。對技術人員，可獲得種類繁多的用于與針對待檢測的細胞因子或分化抗原的抗體相綴合的熒光標記。可與一抗相綴合的合適的熒光團包括但不限于，熒光素、羅丹明、德克薩斯紅、VECTOR紅、ELF(酶標熒光)、Cy2、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy7、Fluor X、鈣黃綠素、鈣黃綠素-AM、CRYPT0FLU0R、Orange (42kDa)、Tangerine(35kDa)、Gold(31kDa)、Red(42kDa)>Crimson(40kDa)> BHMP > BHDMAP > Br-Oregon >Lucifer黃、Alexa染料系列、N-[6-(7-硝基苯_2_氧雜-1，3_重氮_4_基)氨基]乙酰](NBD)、B0DIPY、氟硼二吡咯亞甲基、Oregon綠、MITOTRACKER紅、藻紅蛋白、藻膽蛋白BPE (240kDa)、RPE (240kDa) CPC(264kDa)、APC(異藻藍蛋白，104kDa)、光譜藍、光譜淺藍綠、光譜綠、光譜金、光譜橙、光譜紅、紅外線(IR)染料、環化⑶P-核糖(c⑶PR)、Calcofluor白、麗絲胺、傘形花內酯、酪氨酸或色氨酸。在本發明的方法中，用流式細胞術檢測PBMC中至少一種T細胞活性標記物的表達。所述標記物優選為細胞毒T細胞活性標記物。另外的T細胞活性標記物可為細胞因子。如本文所用，術語“細胞因子(cytokine) ”或“細胞因子(cytokines) ”是指作用/影響免疫系統細胞的常見類型的生物學分子。所述定義指，包括但不限于，那些局部起作用或可在血液中循環的生物學分子。示例性的細胞因子包括但不限于，干擾素、白介素、腫瘤壞死因子和多種集落刺激因子。本文中，T細胞特異性細胞因子理解為在T細胞如CD4+T細胞和CDS+T細胞中表達的細胞因子。或者，檢測表達的所述T細胞活性標記物不是細胞因子而是另外表明T細胞活性的標記物，例如細胞毒性T細胞活性的標記物，如抗原刺激后T細胞脫顆粒的標記物。在本發明的方法的另一個實施方案中，檢測表達T細胞活性標記物的T細胞的類型。優選地，本發明的方法檢測給定的T細胞活性標記物是否在至少為⑶4+和⑶8+細胞中的一種的T細胞類型中表達。更優選地，本發明的方法(同時)檢測給定的T細胞活性標記物是否在CD4+T細胞中表達以及該標記物是否在CD8+T細胞中表達。在本發明方法的一個實施方案中，T細胞活性標記物(其表達在所述方法中檢測)選自 CD107a、CD107b、IFN- y、IL-2, IL-10 和 TNF- a。由⑶107a和⑶107b (LAMP-1/LAMP-2)組成的⑶107分子在抗原刺激后的T細胞脫顆粒過程中瞬時表達于T細胞表面(Betts等人，2004，Meth. Cell Biol.，75 :497-512)。CD107的表達直接涉及細胞毒性化合物的排出(extrusion)，其是T細胞細胞毒性應答的一部分。CD107分子存在于細胞中的細胞毒性顆粒膜中。在排出的時候，CD107分子暴露于細 胞外側。通過向細胞培養物中加入標記的抗體,CD107分子將被標記并通過流式細胞術可視化。因此，⑶107的表達是⑶107產生和此分子必然在細胞膜上表達的結果。在本發明的方法中，可通過檢測⑶107a和⑶107b中的至少一種來檢測作為T細胞活性標記物的⑶107的表達。⑶107a (分化簇107a)和⑶107b (分化簇107b)也分別稱為溶酶體相關膜蛋白質I和 2(LAMP^LAMP2) (Chang 等人，2003，J. Biol. Regul. Homeost. Agents 16(2) :147-151)。本文中人⑶107a理解為具有NCBI編號NP_005552(第3版，2009年9月)的氨基酸序列的糖蛋白或其等位變體。本文中人⑶107b理解為具有NCBI編號NP_002285 (第5版，2009年10月)的氨基酸序列的糖蛋白或其等位變體。CD107a和b涉及將碳水化合物配體呈遞給選擇素(selectin)和在溶酶體、核內體和質膜之間穿梭的蛋白質。IFN- Y或干擾素-Y (IFN- y )是二聚化的可溶性細胞因子，其為II型干擾素唯一的成員(Gray等人，1982，Nature 298(5877) :859-863)。IFN-y為細胞因子，其對針對病毒和胞內細菌感染的固有免疫和適應性免疫是關鍵的，并且對腫瘤控制也是關鍵的。作為固有免疫應答的一部分，IFN-Y主要由天然殺傷(NK)細胞和天然殺傷T(NKT)細胞產生，以及一旦抗原特異性免疫發生，其由⑶4+和⑶8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)效應性T細胞產生。本文中人IFN- y理解為具有NCBI編號NP_000610 (第28版，2009年9月)的氨基酸序列的蛋白質或其等位變體。IL-2，白介素-2，是白細胞介素，其為人體對微生物感染的天然應答的工具。結合于T細胞受體(TCR)的抗原刺激IL-2的分泌(Stern和Smith，1986，Science 233 203-206)。本文中人IL-2理解為具有NCBI編號NP_000577 (第28版，2009年9月)的氨基酸序列的蛋白質或其等位變體。IL-10,白介素-10，通過抑制促炎細胞因子的產生而在抑制免疫應答和炎癥反應中起主要作用。據報告，在急性病毒感染過程中由感染外圍的抗病毒CD8+和CD4+效應性T細胞產生的IL-10調節了在急性流感病毒感染過程中的炎癥反應(Sun，2009，NatureMedicine, 15 (3) :277-84)。本文中人 IL-10 理解為具有 NCBI 編號 CAG46825 (第 16 版，2008年10月)的氨基酸序列的蛋白質或其等位變體。TNF-a,腫瘤壞死因子a (cachexin或cachectin),是參與全身性炎癥的細胞因子，并且是刺激急性期反應的細胞因子組的成員。本文中人TNF-a理解為具有NCBI編號NP_000585 (版本28，2009年9月)的氨基酸序列的蛋白質或其等位變體。本發明的方法所用的針對標記物、細胞因子和分化抗原的熒光標記抗體可商購獲得。其實例，在例如本文的實施例中表明。本發明的方法可用于檢測對象中針對任何病毒的免疫應答的存在，所述病毒包括例如正粘病毒科如流感病毒；逆轉錄病毒科如人免疫缺陷病毒(HIV);風疫病毒；副粘病毒科如副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒；黃病毒科如黃熱病病毒、登革熱病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、日本腦炎病毒(JEV)、蜱傳腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒或西尼羅河病毒；皰疫病毒科如單純皰疫病毒、巨細胞病毒、Epstein-Barr病毒；布尼亞病毒科；沙粒病毒科；漢坦病毒科如漢坦病毒；冠狀病毒科；乳多空病毒科如人乳頭瘤病毒；彈狀病毒科如狂犬病毒；冠狀病毒科如人冠狀病毒；披膜病毒科；動脈炎病毒科；絲狀病毒科如埃博拉病毒；沙粒病毒科；痘病毒科如天花病毒和非洲豬瘟病毒。在優選的實施方案中，本發明的方法用于檢測對象中針對流感病毒的免疫應答的 存在。因此，在根據本發明優選的方法中，滅活病毒為滅活的流感病毒。流感病毒可為流感病毒屬A、B或C的流感病毒，其中最優選A。本發明的方法優選檢測的免疫應答所針對的流感病毒 A 的亞型包括 H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3 和 H10N7，其包括2009年的流行性豬源A型(HlNl)流感病毒(S0IV或HlNlv)。本發明的方法可有利地用于針對病毒的免疫應答的表型分類(phenotyping)。具體地，可在類型的數目和每細胞的效應子功能強度以及不同標記物(由細胞)的表達方面進行T細胞應答的表型分類。本發明的方法中，PBMC來自哺乳動物對象。獲得PBMC的對象可為非人的測試動物，如例如小鼠、大鼠、棉鼠兔(Sigmodon sp.)、非人靈長類或雪貂(如地中海雪貂(Mustela putorius furo))。另外,在本發明的方法的一個實施方案中，獲得PBMC的對象可為人，所述PBMC來自人對象而滅活病毒為能夠感染人和/或疑似感染人的病毒的滅活形式。在本發明的方法中，向PBMC添加的滅活病毒的量至少為足夠誘導(細胞)免疫應答的，所述免疫應答可通過如本文描述的標記物的表達而確定。最方便地，待向PBMC添加的滅活病毒的量涉及其活化前的病毒量。因此，向PBMC添加的滅活病毒的量為對應于(等于)能夠產生如下M. 0. I.的活化前的病毒的量，所述M. 0. I.為至少約0. 1,0. 2,0. 5、I或
2,優選不高于10或5，更優選為大約1-3，最優選為大約2。在本發明的方法的另外的實施方案中，可通過使用莫能霉素(如Golgi-stop，BDBiosciences), 一種在內質網中引起蛋白質積累的蛋白質胞內運輸抑制劑，改善對胞內標記物表達的檢測。優選在檢測前的最后幾小時，例如在培養最后的20、16、12或8小時期間向培養的PBMC中添加莫能霉素。為了檢測胞內標記物的表達，通常通過本領域本身已知的方法進一步固定并可滲透化處理PBMC。第二方面，本發明涉及用于檢測對象中針對病毒的T細胞應答的方法，其中所述方法包括步驟a)將來自所述對象的PBMC與滅活的病毒孵育；和，b)檢測PBMC中CD107的表達。所述方法大體如上文所描述地進行，除了本發明這方面至少確定PBMC中⑶107的表達，而⑶107的表達不必要通過流式細胞術確定。因此，在本發明的第二方面，可用技術人員已知的多種方法確定用滅活病毒刺激的PBMC中的⑶107的表達。如上文表明，可通過檢測⑶107a和⑶107b中至少一種的表達而檢測⑶107的表達。另外應理解，在本發明的不同方面，可在細胞中和細胞上(表面)檢測CD107的表達。如本文所用，當與檢測基因的表達有關時，使用術語“表達”(例如⑶107或另一個標記物的表達)可指檢測基因的轉錄(即，檢測mRNA水平)和/或檢測基因的翻譯(檢測產生的蛋白質)。檢測基因的表達是指主動確定基因是否表達的行為。這可包括確定與對照相比基因表達是否上調，與對照相比是否下調或與對照相比是否不變。因此，檢測表達的步驟不要求基因表達實際上上調或下調，但相反，還可包括檢測基因表達沒有變化(即，檢出基因不表達或基因表達無變化)。通過任何本領域已知的多種方法測量轉錄物和/或蛋白質的表達。對RNA表達，方法包括但不限于提取細胞mRNA并使用可與編碼全長或部分基因的轉錄物雜交的標記的探針進行Northern印跡；使用基因特異性引物、聚合酶鏈式反應(PCR)和反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增mRNA，隨后通過任何不同的手段定量檢測產物；從細胞提取總RNA，然后將其標記并用于探測在任何不同表面上的編碼所述基因的cDNA或寡核苷酸；原位雜交；和檢測報告基因。測量蛋白質表達水平的方法一般包括但不限于蛋白質印跡、免疫印跡、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、酶聯免疫吸附斑點法(ELISP0T) 或熒光斑點測定、放射免疫測定(RIA)、免疫沉淀、表面等離子體共振、化學發光、熒光偏振、磷光、免疫組化分析、基質輔助激光解析/電離飛行時間(MALDI-T0F)質譜、微細胞計數、微陣列、顯微技術、熒光激活細胞分選(FACS)和流式細胞術。在本發明的方法的一個實施方案中，除了檢測⑶107表達，任選地可檢測另外的標記物的表達，例如IFN-Y、IL-2、IL-10和TNF-a中的一或多種。本發明另一方面涉及“試劑盒”，其包含本發明的方法中使用的元件。這樣的試劑盒可以包含載體，其中容納一或多個如管或小瓶的容器。試劑盒可包含如上述定義的滅活病毒，用于檢測標記物、細胞因子和/或分化抗原的未標記或已標記的抗體，和其它本文提及的試劑，如培養基、莫能霉素、用于固定和可滲透化處理細胞的試劑和流式細胞術試劑。在優選的實施方案中，試劑盒至少包含滅活病毒制備物和用于檢測標記物、細胞因子和/或分化抗原的抗體。試劑可以凍干的形式存在，或在適當的緩沖液中。試劑盒還可包含實施本發明所必須的任何其它組件，如從對象獲得PBMC的裝置、緩沖液、移液器，微孔板和書面說明。本發明的試劑盒的這樣的其它組件本身是已知的。在本文檔和其權利要求中，動詞“包含”和以其非限制性含義使用的其詞形變化意指包括了跟隨在該詞后的項，但并不排除未具體提及的項。另外，用不定冠詞“a”或“an”指代的元素并不排除存在多于一個元素的可能，除非上下文明確地要求存在一個并只存在一個所述元素。因此不定冠詞“a”或“an”通常意指“至少一個”。所有在本說明書中引用的專利和參考文獻以其整體通過弓I用并入本文。提供下述實施例僅用于說明的目的，而不是為了以任何方式限制本發明的范圍。


圖I.人PBMC流式細胞術分析，其用空白培養物上清液刺激作為陰性對照，或用葡萄球菌(Staphylococcus)腸毒素B(SEB)刺激作為陽性對照，用活A/H3N2病毒(A/Wisconsin/67/2005 ;活 flu)刺激，或用滅活的 A/H3N2 病毒(A/Wisconsin/67/2005)刺激，其用熱處理(H. I. flu)、福爾馬林處理(F. I. flu)或BPL處理(BPL. I. flu)滅活。如所標明，在感染/刺激后24小時、72小時和16天測量CD8+ T細胞中的IFNi (a)、TNF_a (b)、⑶40L(c)和⑶107(d)表達。通過在MDCK細胞上連續3個10天培養滅活制備物，在細胞中沒有發生任何細胞病理效應來驗證病毒滅活。圖2.人PBMC的流式細胞術分析，其用活的或福爾馬林滅活的(FI)A/H3N2病毒(A/Wisconsin/67/2005)刺激或用福爾馬林處理的空白培養物上清液作為陰性對照進行刺激。如所標明，在感染后24、48、72和168小時測量CD4+(a、c、e和g)和CD8+(b、d、f和h)T細胞中的 IFN-y (a 和 b)、TNF-a (c 和 d)、CD107a(e 和 f)和 IL_2(g 和 h)表達。■空白；▼ H3N2病毒； FI H3N2病毒。圖3.人PBMC的流式細胞術分析，其用活的或FI-A/H3N2病毒，用福爾馬林處理的空白培養物上清液作為陰性對照或用葡萄球菌腸毒素B(SEB)作為陽性對照進行刺激。如所標明，在感染后72小時測量CD4+和CD8+T細胞中的IFN- y (a)、TNF- a (b)、CD40L (c)和 IL-2 (d)表達。圖4.來自2個最近感染了 SOIV A/H1N1的個體(供體A和B)的人PBMC的流式細胞術分析，其用福爾馬林滅活的流行性SOIV A/H1N1 (A/Paris/2590/2009)病毒(FI SOIVH1N1)，季節性活的或 FI-A/H1N1 (A/New Caledonia/20/99)病毒，活的或 FI-A/H3N2 病毒，福爾馬林處理的空白培養物上清作為陰性對照或用葡萄球菌腸毒素B(SEB)作為陽性對照刺激。如所標明，在感染后72小時測量CD4+(a和c)和CD8+(b和d) T細胞中的CD107a(a和b)和IL-2(c和d)表達。圖5.來自供體MB-126的人PBMC的流式細胞術分析，其用福爾馬林滅活的(FD-A/H1N1病毒(A/New Caledonia//20/99)刺激，并用IL-10特異性抗體染色或用同種型匹配抗體作為陰性對照。如所標明，在刺激后18、36、54和72小時測量⑶4+(A)和⑶8+(B)T細胞中的表達。
實施例I.實施例II. I.材料和方法I. I. I供體的納入和PBMC的分離根據人類實驗準則(項目編號S03. 0015-X)從 Sanquin Blood Bank North WestRegion獲取健康個體的血棕黃層。另外，從2個之前健康的具有實驗室確認的A型流感(HlNl)v感染的個體(51歲的女性，55歲的男性)，分別在癥狀開始的13天和19天后獲得外周血單核細胞(PBMC)。在研究開始前所有參加者提供了書面的知情同意書。本研究已獲烏特勒支大學醫學中心的醫學倫理委員會批準。通過密度離心分離人PBMC并在90%的FCS (Hyclone, Logan, Utah) /10% 的 DMSO (Sigma-Aldrich St. Louis, USA)中于-13CTC低溫保藏直至分析。1.1.2流感病毒S. van der Werf 博士(Institute Pasteur,Paris,France)懷慨地提供了季節性流感病毒株 H3N2 A/Wisconsin/67/2005 和 HlNl A/New Caledonia/20/99 以及 SOIV HlNlA/Paris/2590/2009株。通過感染MDCK細胞生產所有的病毒株。未感染的MDCK細胞培養基(空白)用作陰性對照。1.1.3病毒滅活I. I. 3. I福爾馬林滅活將流感病毒培養物上清液與PBS中0. 02% v/v的福爾馬林(37%福爾馬林，Merck)于 37°C孵育 18 小時。滅活后，立即使用 DispoDialyzers MWCOlOkDa (Spectrum LaboratoryInc, Rancho Dominguez, USA)透析清除福爾馬林，以防止影響病毒學和免疫測定。樣品儲存于-80°C直至使用。I. I. 3. 2 P -丙內酯(BPL)滅活將流感病毒培養物上清液與1:1060稀釋于pH7. 3的0. IM磷酸緩沖液中的 BPL(BPL, 5ml燒瓶中的98%溶液,Acros, www. acros. com)于4°C孵育18小時。接下來通過37°C孵育2小時水解BPL。樣品儲存于-80°C直至使用。I. I. 3. 2 熱滅活將流感病毒培養物上清于65°C孵育30小時。樣品儲存于_80°C直至使用。I. I. 4刺激PBMC和流式細胞術分析用活病毒以感染復數(101)2感染？81 ，或用等量的滅活病毒刺激？81 ，并在含10% FCS、P/S的RPMI培養基中以48孔板(Greiner Bio-one)中每孔I X IO6細胞培養。用福爾馬林滅活空白感染的細胞培養物上清液并用作陰性對照(空白)。葡萄球菌腸毒素B (SEB)用作陽性對照。在5%的CO2中將細胞37°C孵育不同時間。在培養結束前16小時加入0)107&特異的抗體？￡出0 Biosciences, San Jose，USA)。為了檢測胞內細胞因子的產生，在培養的最后16小時期間加入莫能霉素(Golgi-stop, BD Biosciences)。孵育后，收獲PBMC,轉移入V底平板(Greiner BioOne)并用FACS緩沖液(PBS，0.5% BSA, 5mM EDTA)洗滌。黑暗中用 CD4 太平洋藍(Biolegend, San Diego，USA)、CD8 PerCP Cy5. 5 (BD Biosciences)和活/死可修復的死細胞染劑(Invitrogen, Paisley, UK) 4°C染色30分鐘。用IOOy I的FACS緩沖液洗漆PBMC—次。隨后,在CytoFix/CytoPerm溶液(BD Biosiences)中于4°C黑暗中將PBMC固定并可滲透化處理20分鐘。用IOOii I Perm/Wash緩沖液(BD Bioscience)洗滌PBMC三次并在黑暗中用 IFN-Y APC (BD Bioscience)、IL-2FITC (eBioscience，San Diego,USA)、CD40L APC Alexa Fluor750 (eBioscience)和 TNF-a PeCy7 (BD Bioscience) 4 °C染色30分鐘。染色后，用100 u IPerm/ffash緩沖液洗滌PBMC兩次并用100 u I FACS緩沖液洗滌I次。在150 ill的FACS緩沖液中重懸PBMC并且直接使用FACS Canto II (BD Bioscience)獲取PBMC。根據前方-側向散射特性和活_死染色分析，獲取至少100，000存活的淋巴細胞。使用FACSDiva軟件(BD Bioscience)分析結果。I. 1.5滅活病毒的驗證I. I. 5. I通過在MDCK細胞上培養來驗證滅活將對照和處理的流感病毒培養物上清液置于MDCK細胞上盲傳最多3代。因此，將匯合的MDCK細胞與50 u I培養物上清液和5ml感染培養基于37°C在T25 cm2-燒瓶中孵育60分鐘。一小時后用磷酸緩沖鹽水(PBS)漂洗單分子層，用感染培養基(2.5i!g/ml胰蛋白酶)覆蓋并在37°C孵育10天。10天的孵育期后，燒瓶接受一次凍融循環。在不存在cpe情況下，收獲的培養物材料用作在MDCK細胞上隨后的傳代的接種物(50 u I)。所有收獲的培養物上清液儲存于_80°C。
I. I. 5. 2通過血細胞凝集測定驗證滅活在PBS中制備2倍系列稀釋的活的和滅活的流感病毒培養物上清液，并與PBS中0. 25%的火雞紅細胞4°C孵育。60分鐘后，讀取血細胞凝集滴度，其表示為產生完全血細胞凝集的最高稀釋度的倒數。I. I. 5. 3通過基質PCR驗證滅活用MagNA Pure LC總核酸分離試劑盒，在MagNA Pure LC(v3. 0)提取機械手(Roche, Mannheim, Germany)上從200 ii I流感病毒培養物上清液中提取總核酸(50 y I)。為了定性分析培養料中流感病毒負鏈基因組RNA，使用鳥類成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶(AMV-RT) (Promega, WI, USA)和正鏈基質基因引物 5' AAG ACC AAT CCT GTC ACC TCT GA3' (M-Fw)進行反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)以產生副本DNA (cDNA)。為了在培養材料中檢測病毒正鏈RNA轉錄物，使用rTth DNA聚合酶(Applied Biosystems, CA，USA)和基 質基因反義引物 5' CAA AGC GTC TAC GCT GCA GTC C 3' (M-Rv)將總 RNA 轉錄為 cDNA,隨后用RNAse H(Roche)和RNase A(Sigma-Aldrich)處理以去除所有的RNA。隨后，使用LightCycler 480 實時 PCR 系統(Roche)、LightCycler TaqMan Master (Roche)、弓丨物對M-Fw和M-Rv、并用FAM/BHQ-1 標記的擴增子特異的探針5' TTT GTG TTC ACG CTC ACCGTG CC 3/擴增104堿基對的基質基因片段。I. 2 結果I. 2. I三種不同的滅活流感病毒的方法比較及其對T細胞應答的影響我們首先利用不同的技術滅活流感病毒。然后將用不同技術滅活的病毒用于刺激PBMC并且接下來評估CD8+T細胞應答。用于滅活病毒的方法包括熱滅活、福爾馬林滅活和^丙內酯(BPL)滅活(見上文I. I. 3)。將用滅活病毒刺激后獲得的CD8+T細胞應答與用活病毒刺激獲得的應答相比較。將葡萄球菌外毒素B(SEB)刺激用作陽性對照。確定CD4+和CD8+T細胞中IFN- y ,TNF- a、CD40L、CD107a和IL-2應答。圖I顯示了 BPL滅活的病毒在CD8+T細胞中給出非常不一致的應答，熱滅活的病毒給出很少或無應答，但福爾馬林滅活的病毒產生了一致的CD8+T細胞應答，其為用活病毒感染獲得的強度的約75%。對CD4+T細胞，獲得了相似的結果(結果未顯示)。I. 2. 2對福爾馬林滅活的季節性流感病毒的T細胞應答用福爾馬林處理流感病毒僅輕微地降低血細胞凝集和神經氨酸酶活性并顯示了最高保留程度的HA和NA活性。因此，將福爾馬林滅活(FI)的流感病毒用于確定福爾馬林處理后T細胞表位抗原性是否保留。首先，將PBMC與活的或FI-A/H3N2病毒(A/Wisconsin/67/2005)孵育，之后在感染后(p. i.)的24、48、72和168小時測量IFN-Y、TNF-a、⑶107a和IL-2的表達以確定檢測T細胞應答的最優時間點。福爾馬林處理的空白刺激的PBMC用于確定所有標記物的背景表達。用活的A/H3N2病毒刺激PBMC導致在⑶4+和⑶8+T細胞中⑶107a和IL-2的表達顯著提高，并且在p. i. 48小時-96小時之間最高(圖2)。在用FI-A/H3N2病毒刺激的PBMC中觀察到相似的表達模式。然而，與活的A/H3N2刺激相比，用FI-A/H3N2刺激后⑶107a+和IL-2+細胞要晚大約24小時達到最高百分比。另夕卜，與活的H3N2病毒誘導的百分比相比，由FI-A/H3N2誘導的CD107a+和IL-2+T細胞百分比較低，但是仍顯著地高于由空白刺激誘導的百分比。與⑶107a+和IL-2+T細胞的誘導相似，用活的和FI-A/H3N2刺激PBMC誘導不顯著的IFN- y +和TNF- a +T細胞增加趨勢。一般來說，在P. i. 72小時檢測活的和FI-A/H3N2刺激的T細胞應答是最優的并進一步用于檢驗其它流感病毒亞型。此時間點另外用于檢驗對活的和FI-A/H1N1流感病毒亞型(A/NewCaledonia/20/99)的T細胞應答(圖3)。在活的和FI-A/H1N1刺激后，A/H1N1病毒還誘導顯著數目的CD107a+和IL-2+T細胞。此外，由FI-A/H1N1誘導的CD107a+和IL-2+T細胞的百分比顯著地高于由空白感染誘導的百分比。與A/H3N2病毒相比，由FI-A/H1N1刺激所誘導的IFN- y +和TNF- a +T細胞并不顯著。一并地，這些數據證實，除了 HA和NA活性，季節性流感病毒的T細胞表位抗原性也在福爾馬林處理后高度地保留。
2. I. 3對福爾馬林滅活的流行性SOIV A/H1N1的T細胞應答由于福爾馬林處理有效地滅活了季節性流感病毒但保留了 T細胞表位抗原性，我們希望確定在用福爾馬林滅活后，流行性SOIV A/H1N1病毒的T細胞表位抗原性是否也保留。為了確定對FI-SOIV A/H1N1 (A/Paris/2590/2009)的T細胞應答，我們使用了從兩個近期感染SOIV A/H1N1的個體分離的PBMC以確保存在顯著數量的SOIV A/H1N1特異性T細胞并確定所誘導的CD107a+和IL-2+T細胞。用FI-空白、季節性活的或FI-A/H1N1 (A/NewCaledonia/20/99)病毒處理的PBMC作為對照。用FI-SOIV A/H1N1體外刺激來自近期感染SOIV A/H1N1的個體的PBMC，證實了兩個供體中⑶4+和⑶8+T細胞亞組中⑶107a+T細胞百分比都有顯著地提高。季節性活的和FI-A/H1N1病毒誘導了相似的⑶107a+細胞提高。另夕卜，活的A/H1N1、FI-A/H1N1和FI-S0IV A/H1N1刺激在來自供體A的PBMC中誘導了 IL-2+T細胞并且在CD8+T細胞亞組中最明顯。然而，用活的A/H1N1、FI-A/H1N1或FI-SOIV A/H1N1刺激來自供體B的PBMC，在CD4+和CD8+T細胞亞組中不誘導IL2+T細胞，表明了在T細胞應答中一定的供體變異。一并地，這些數據證實，在福爾馬林處理后流行性SOIV A/H1N1病毒保留了刺激T細胞的能力，表明對此流行性流感病毒也保留了 T細胞表位抗原性。參考文獻I. Goldstein, M. A. & Tauraso, N. M. (1970) "Effect of formalin, beta-propiolactone, merthiolate, and ultraviolet light upon influenza virus infectivitychicken cell agglutination, hemagglutination, and antigenicity〃AppI Microbiol. 19:290-294.2. Geeraedts, F. , Goutagny, N. , Hornung, V. , Severa, M. , de, H. A. , Pool, J. , Wilschut, J. , Fitzgerald, K. A. , & Huckriede, A. (2008)"Superior immunogenicity ofinactivated whole virus H5N1 influenza vaccine is primarily controlled byToll-like receptor signalling" PLoS.Pathog. 4:el000138.3. Bachmann，M. F. , Bast, C. , Hengartner，H. , & Zinkernagel，R.M. (1994)^Immunogenicity of a viral model vaccine after different inactivationprocedures" Med. Microbiol. Immunol. 183:95-104.4. Jonas E. Salk (1944) "A Simplified Procedure for TitratingHemagglutinating Capacity of Influenza-Virus and the Corresponding Antibody^TheJournal of Immunology 49:87-98.5. Van Deusen, R. A. , Hinshaw, V. S. , Senne, D. A. , & Pellacani, D. (1983) "Microneuraminidase—inhibition assay for classification of influenza A virusneuraminidases〃Avian Dis.27:745-750.6. Mbawuike，I.，Zang，Y.，& Couch, R. B. (2007) "Humoral and cell-mediatedimmune responses of humans to inactivated influenza vaccine with or withoutQS21 adjuvant^Vaccine25:3263-3269.7. La I van i，A.，Brookes, R.，Hamb Ie ton，S. , Britton, W. J.，Hill, A. V.，&McMichael，A. J. (1997)"Rapid effector function in CD8+memory T cells^J.Exp.Med. 186:859-865.8. Seder, R. A.，Darrah, P. A.，& Roederer, M. (2008) "T-cell quality in memoryand protection: implications for vaccine design"Nature Reviews Immunology8:247-258|doi:10. 1038/nri22749. Rutebemberwa et al. (2007)"Evaluation of aldrithiol-2-inactivated preparations of HIV type I subtypes A，B，and D as reagents to monitor T cellresponses"AIDS Res. Hum. Retroviruses 23:532-542.10. Skarsvik et al. (2006) "Decreased in vitro type I immune responseagainst Coxsackie virus B4 in children with type I diabetes. "Diabetes55:996-1003.11.Betts et al. (2006)^HIV nonprogressors preferentially maintainhighly functional HIV-specific CD8 (+) T cells"Blood 107:4781-4789.12. Lambre, C. R.，H. Terzidis, A. Greffard, and R. G. Webster. 1990. Measurementof anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin andmicrotitre plates coated with natural substrates. J. Immunol. Methods 135:49-57.
權利要求
1.用于檢測對象中針對病毒的T細胞應答的方法，其中所述方法包括以下步驟 a)將來自所述對象的PBMC與用福爾馬林滅活的病毒孵育； b)用流式細胞術檢測至少一種T細胞活性標記物的表達。
2.權利要求 I的方法,其中檢測至少2種不同標記物的表達。
3.權利要求I或2的方法，其中檢測表達所述標記物的T細胞的類型。
4.權利要求3的方法，其中所述T細胞的類型為CD4+細胞和CD8+細胞中的至少一種。
5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述至少一種標記物選自⑶107a、⑶107b、IFN- y、IL-2、IL-10 和 TNF- a。
6.前述權利要求中任一項的方法，其中所述滅活病毒為滅活流感病毒。
7.權利要求6的方法，其中通過處理病毒獲得所述滅活流感病毒，所述處理與用至少0. 02% v/v的福爾馬林于37°C處理至少18小時產生相同程度的滅活病毒。
8.前述權利要求中任一項的方法，其中在所述PBMC與所述病毒孵育約24-96小時后檢測所述標記物的表達。
9.權利要求8的方法，其中在所述PBMC與所述病毒孵育約60-84小時后檢測所述標記物的表達。
10.前述權利要求中任一項的方法，其中所述滅活病毒的量對應于活化前的病毒產生約1-3的M. 0. I.，優選約2的M. 0. I.的量。
11.前述權利要求中任一項的方法，其中所述PBMC來自人對象，并且其中所述滅活病毒為能夠感染人或疑似感染人的病毒的滅活形式。
12.用于檢測對象中針對病毒的T細胞應答的方法，其中所述方法包括以下步驟 a)將來自所述對象的PBMC與滅活的病毒孵育； b)檢測PBMC中⑶107a和⑶107b中至少一種的表達，和任選地檢測一或多種其它T細胞特異性細胞因子的表達。
13.權利要求12的方法，其中所述滅活病毒為滅活流感病毒。
14.用于檢測針對病毒的T細胞應答的試劑盒，其中所述試劑盒包含裝有滅活病毒制備物的容器和裝有用于檢測T細胞活性標記物的抗體的容器。
全文摘要
本發明涉及用于診斷針對病毒的細胞免疫應答方法，其使用滅活病毒。在本發明的方法中，將來自對象的PBMC與滅活病毒制備物孵育并隨后檢測對象的PBMC中至少一種T細胞特異性細胞因子的表達來檢測針對病毒的細胞免疫應答，優選通過流式細胞術。在所述方法中有利的是，使用滅活病毒與來自對象的PBMC孵育，以使可以在不具有BSL-3分級的實驗室中實施該方法。優選地，所述方法為使用福爾馬林滅活的病毒，通過檢測CD107、IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α的一或多種的表達來檢測針對流感病毒的CD4+和CD8+T細胞應答的方法。本發明還涉及試劑盒，其包含對在對象中檢測針對病毒的細胞免疫應答有用的組件。
文檔編號G01N33/569GK102656455SQ201080054095
公開日2012年9月5日 申請日期2010年10月21日 優先權日2009年10月21日
發明者E·C·瑟圖特, W·M·劉 申請人:由衛生福利和體育大臣代表的荷蘭王國