鑒定響應(yīng)抗癌劑的可能性升高的患者的方法

專利名稱：鑒定響應(yīng)抗癌劑的可能性升高的患者的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)致力于用于鑒定哪些患者會(huì)最多地受益于抗癌劑治療及對(duì)患者監(jiān)測(cè)他們對(duì)抗癌劑治療的敏感性和響應(yīng)性的方法。
背景技術(shù)：
癌癥是對(duì)人類健康的最致命威脅之一。僅在美國(guó)，癌癥每年影響近130萬(wàn)新患者， 而且是位于心血管疾病之后的第二位死因，占4例死亡中的大約1例。實(shí)體瘤對(duì)大多數(shù)那些死亡負(fù)有責(zé)任。雖然某些癌癥的醫(yī)學(xué)治療中已經(jīng)取得了重大進(jìn)步，但是所有癌癥的總體 5年存活率在最近20年里只改進(jìn)了約10%。癌癥(或稱作惡性腫瘤)以不受控制的方式快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，使得及時(shí)檢測(cè)和處理極端困難。根據(jù)癌癥類型，患者通常有數(shù)個(gè)治療選項(xiàng)可用，包括化療、輻射和基于抗體的藥物。對(duì)于預(yù)測(cè)不同治療方案的臨床結(jié)果有用的診斷方法會(huì)大大有利于對(duì)這些患者進(jìn)行臨床安排。如此，需要更有效的手段來確定哪些患者會(huì)響應(yīng)哪種治療及將此類確定納入抗癌劑療法對(duì)患者的更有效的治療方案，無論用作單一藥劑或是與其它藥劑組合。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于鑒定會(huì)響應(yīng)抗癌劑治療的患者的方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供鑒定有可能響應(yīng)抗癌劑的患者的方法。該方法包括 (a)將成像劑施用于已經(jīng)接受至少一劑抗癌劑的患者；(b)檢測(cè)該患者中與腫瘤引流淋巴結(jié)有關(guān)的淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率；并(c)將該淋巴搏動(dòng)頻率與該抗癌劑處理前該淋巴管中的搏動(dòng)頻率比較，其中淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率降低至少約10%鑒定出響應(yīng)抗癌劑的可能性升高的患者。在一些實(shí)施方案中，該淋巴管連接腹股溝淋巴結(jié)至軸淋巴結(jié)(axial lymph node)。在一些實(shí)施方案中，該成像劑包含熒光染料(例如Alexafluor680)。在一些實(shí)施方案中，使用熒光顯微術(shù)來檢測(cè)淋巴搏動(dòng)頻率。在一些實(shí)施方案中，該患者為人類。在一些實(shí)施方案中，該患者已經(jīng)診斷有選自下組的癌癥結(jié)腸直腸癌，乳腺癌，肺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，腎癌，及其組合。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括(d)如果檢測(cè)到該淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率降低至少約10%的話，將有效量的抗癌劑施用于該患者。在一些實(shí)施方案中，該抗癌劑選自NRP2拮抗劑、VEGF-C拮抗劑、及其組合。在一些實(shí)施方案中，該NRP2拮抗劑為抗NRP2抗體。在一些實(shí)施方案中，該VEGF-C拮抗劑為抗VEGF-C抗體。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括(e)將有效量的第二抗癌劑施用于該患者。在一些實(shí)施方案中， 該第二抗癌劑為VEGF拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗VEGF抗體為貝伐單抗(1 ^￡1(^211111￡113)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供鑒定經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的可能性升高的患者的方法。該方法包括(a)將成像劑施用于已經(jīng)接受至少一劑抗癌劑的患者；(b)檢測(cè)該患者中與腫瘤引流淋巴結(jié)有關(guān)的淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率；并(C)將該淋巴搏動(dòng)頻率與該抗癌劑處理前該淋巴管中的搏動(dòng)頻率比較，其中淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率升高至少約10%鑒定出經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的可能性升高的患者。在一些實(shí)施方案中，該淋巴管連接腹股溝淋巴結(jié)至軸淋巴結(jié)。在一些實(shí)施方案中，該成像劑包含熒光染料。在一些實(shí)施方案中，該熒光染料為AleXaflUOr680。 在一些實(shí)施方案中，使用熒光顯微術(shù)來檢測(cè)淋巴搏動(dòng)頻率。在一些實(shí)施方案中，該患者為人類。在一些實(shí)施方案中，該患者已經(jīng)診斷有選自下組的癌癥結(jié)腸直腸癌，乳腺癌，肺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，腎癌，及其組合。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括(d)如果檢測(cè)到該淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率升高至少約10%的話，將有效量的抗癌劑施用于該患者。在一些實(shí)施方案中，該抗癌劑選自下組NRP2拮抗劑，VEGF-C拮抗劑，及其組合。在一些實(shí)施方案中， 該NRP2拮抗劑為抗NRP2抗體。在一些實(shí)施方案中，該VEGF-C拮抗劑為抗VEGF-C抗體。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括(e)將有效量的第二抗癌劑施用于該患者。在一些實(shí)施方案中，該第二抗癌劑為VEGF拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗VEGF抗體為貝伐單抗。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案提供監(jiān)測(cè)抗癌療法的有效性的方法。該方法包括(a) 將成像劑施用于已經(jīng)接受至少一劑抗癌劑的患者；(b)檢測(cè)該患者中與腫瘤引流淋巴結(jié)有關(guān)的淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率；并(c)將該淋巴搏動(dòng)頻率與該抗癌劑處理前該淋巴管中的搏動(dòng)頻率比較，其中淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率降低至少約10%鑒定出有效抗癌劑。在一些實(shí)施方案中，該淋巴管連接腹股溝淋巴結(jié)至軸淋巴結(jié)。在一些實(shí)施方案中，該成像劑包含熒光染料。在一些實(shí)施方案中，該熒光染料為AleXaflUOr680。在一些實(shí)施方案中，使用熒光顯微術(shù)來檢測(cè)淋巴搏動(dòng)頻率。在一些實(shí)施方案中，該患者為人類。在一些實(shí)施方案中，該患者已經(jīng)診斷有選自下組的癌癥結(jié)腸直腸癌，乳腺癌，肺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，腎癌，及其組合。 在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括(d)如果檢測(cè)到該淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率降低至少約10%的話，將有效量的抗癌劑施用于該患者。在一些實(shí)施方案中，該抗癌劑是選自下組的成員NRP2拮抗劑，VEGF-C拮抗劑，及其組合。在一些實(shí)施方案中，該NRP2拮抗劑為抗 NRP2抗體。在一些實(shí)施方案中，該VEGF-C拮抗劑為抗VEGF-C抗體。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括(e)將有效量的第二抗癌劑施用于該患者。在一些實(shí)施方案中，該第二抗癌劑為VEGF拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗VEGF抗體為貝伐單抗。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供優(yōu)化抗癌劑劑量的方法。該方法包括(a)將成像劑施用于已經(jīng)接受至少一劑抗癌劑的患者；(b)檢測(cè)該患者中與腫瘤引流淋巴結(jié)有關(guān)的淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率；并(c)將該淋巴搏動(dòng)頻率與該抗癌劑處理前該淋巴管中的搏動(dòng)頻率比較，其中淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率有變化鑒定出該劑量為最小有效劑量而淋巴搏動(dòng)頻率無變化鑒定出該劑量為最大有效劑量。在一些實(shí)施方案中，該抗癌劑選自NRP2拮抗劑， VEGF-C拮抗劑，及其組合。通過下面的詳述來進(jìn)一步描述這些和其它實(shí)施方案。附圖簡(jiǎn)述

圖1圖示來自測(cè)量淋巴搏動(dòng)頻率的淋巴功能測(cè)定法的結(jié)果。圖IA圖示注射15 μ 1 推注染料后通過管的搏動(dòng)淋巴運(yùn)動(dòng)的代表性時(shí)間過程圖像。圖IB圖示約M個(gè)事件/5分鐘的基線活性，n=6只動(dòng)物。圖2圖示來自測(cè)量在成像開始時(shí)在尾基部附近輸注5μ L/min、15min染料后到腹股溝淋巴結(jié)的大量淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)的淋巴功能測(cè)定法的結(jié)果。圖2A圖示代表性時(shí)間過程圖像，顯示腹股溝淋巴結(jié)，接著是軸淋巴結(jié)的初始加載。圖2B圖示基線加載率和距腹股溝淋巴結(jié)最大信號(hào)強(qiáng)度的時(shí)間，n=4只動(dòng)物。圖3圖示來自淋巴功能測(cè)定法的結(jié)果，證明腫瘤相關(guān)淋巴網(wǎng)絡(luò)中的大量淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)上調(diào)。圖3A圖示數(shù)據(jù)，證明在腫瘤植入小鼠中淋巴搏動(dòng)頻率上調(diào)約％50，n=6只動(dòng)物/組。 圖3B圖示數(shù)據(jù)，證明在腫瘤植入小鼠中大量淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)也上調(diào)，n=4只動(dòng)物/組。圖3C圖示數(shù)據(jù)，證明腫瘤植入小鼠中淋巴搏動(dòng)上調(diào)的時(shí)間過程，n=12只動(dòng)物/組。圖4圖示數(shù)據(jù)，證明抑制VEGF-C信號(hào)傳導(dǎo)降低腫瘤相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中的淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)。 圖4A圖示數(shù)據(jù)，證明在荷瘤小鼠中抗NRP2、抗VEGF-C、或抗VEGF-A慢性處理(chronic treatment)顯著降低淋巴搏動(dòng)頻率，n=6只動(dòng)物/組。圖4B圖示數(shù)據(jù)，證明在荷瘤小鼠中抗NRP2、抗VEGF-C、或抗VEGF-A慢性處理顯著降低大量淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，n=6只動(dòng)物/組。圖5圖示數(shù)據(jù)，證明在非荷瘤小鼠中抑制VEGF-C途徑?jīng)]有顯著改變淋巴功能。圖 5A圖示數(shù)據(jù)，證明在非荷瘤小鼠中抗VEGF-C慢性處理沒有顯著改變?cè)?周里測(cè)量的淋巴搏動(dòng)頻率，n=6只動(dòng)物/組。圖5B圖示數(shù)據(jù)，證明在非荷瘤小鼠中抗NRP2慢性處理沒有顯著改變?cè)?周里測(cè)量的淋巴搏動(dòng)頻率，n=4只動(dòng)物/組。圖6圖示數(shù)據(jù)，證明抗癌劑急性注射不改變淋巴功能。圖6A圖示數(shù)據(jù)，證明在荷瘤小鼠中抗NRP2、抗VEGF-C、或抗VEGF-A急性注射不導(dǎo)致淋巴搏動(dòng)頻率的任何顯著變化， n=6只動(dòng)物/組。圖6B圖示數(shù)據(jù)，證明在非荷瘤小鼠中重組VEGF-C蛋白或重組VEGF-A蛋白急性注射(acute injection)不導(dǎo)致淋巴搏動(dòng)頻率的任何顯著變化，n=6只動(dòng)物/組。圖7圖示數(shù)據(jù)，證明淋巴搏動(dòng)頻率在尾和背荷瘤小鼠二者中上調(diào)，但是在耳荷瘤小鼠中不上調(diào)。發(fā)明詳述I.導(dǎo)言本發(fā)明提供用于鑒定響應(yīng)抗癌劑的可能性升高或經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的可能性升高的患者的方法。本發(fā)明還提供用于監(jiān)測(cè)患者對(duì)抗癌劑的響應(yīng)的方法。本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)，腫瘤引流淋巴管中淋巴功能的度量(例如搏動(dòng)頻率或大量淋巴轉(zhuǎn)運(yùn))可用于鑒定對(duì)抗癌劑治療敏感或響應(yīng)的患者或鑒定經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的可能性升高的患者。II.定義術(shù)語(yǔ)“淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)”指淋巴液經(jīng)由淋巴管的移動(dòng)。淋巴管在組織中開始并將淋巴液運(yùn)送或“引流”至局部淋巴結(jié)(例如頸部淋巴結(jié)、腋窩淋巴結(jié)、鎖骨上淋巴結(jié)、縱膈淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、和股淋巴結(jié))，在那里淋巴過濾并加工并沿線送至下一個(gè)淋巴結(jié)(例如頸部淋巴結(jié)、腋窩淋巴結(jié)、鎖骨上淋巴結(jié)、縱膈淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、和股淋巴結(jié))直至液體到達(dá)胸導(dǎo)管，在那里它進(jìn)入血流。任何淋巴結(jié)可以是引流淋巴結(jié)。 “腫瘤引流淋巴結(jié)”指任何接受來自腫瘤的淋巴液的淋巴結(jié)。淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)包括例如“淋巴搏動(dòng)” 和“大量淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)”?！傲馨筒珓?dòng)，，指淋巴在通過淋巴管泵送時(shí)推進(jìn)。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“升高”指通過本文所述方法檢測(cè)的，淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率與用抗癌劑處理前淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率相比5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或或更大的總體升高。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)升高指淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率的升高，其中該升高是用抗癌劑處理前淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率的至少約 1. 5X、1. 75X,2X,3X,4X,5X,6X,7X,8X,9XU0X,25X,50X,75X^ IOOX0在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“降低”在本文中指通過本文所述方法檢測(cè)的，淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率與用抗癌劑處理前淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率相比5%、10%、20%、25%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的總體降低。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)降低指通過本文所述方法檢測(cè)的，淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率與參照淋巴管相比的降低，其中該降低是用抗癌劑處理前淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率的至少約0. 9X、0. 8X、 0. 7Χ、0· 6Χ、0· 5Χ、0· 4Χ、0· 3Χ、0· 2Χ、0· IX,0. 05Χ、或 0. 01Χ?！俺上駝敝冈诒┞队诩ぐl(fā)光時(shí)展現(xiàn)近紅外波長(zhǎng)的熒光的任何化合物。成像劑的例子包括例如含吲哚的染料(indol-containing dyes)、含羰花青的染料(carbocyanine-containing dyes)、聚次甲基染料(polymethine dyes)、 口丫唆 (acridines)、惠酉昆(anthraquinones)、苯并味P坐(benzimidazols)、/[段口引卩朵(indolenine) > 萘酰亞胺(napthalimide)、噁嗪(oxazines)、氧鐵醇(oxonols)、多烯(polyenes)、 卟吩(porphins)、方酸菁(squaraine)、苯乙烯基(styryls)、噻唑(thiazols)、黃素 (xanthins)、本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它NK染料、或其組合。成像劑通常具有近紅外范圍中的激發(fā)波長(zhǎng)。特別地，成像劑可具有約550nm至約lOOOnm、約600nm至約950nm、約700nm 至約900nm、或約750nm至約850nm的激發(fā)波長(zhǎng)。 術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)氈蛋白(neuropi 1 in) 2 ”、“NRP2 ”或“Nrp2 ”可互換使用，指神經(jīng)氈蛋白-2 (NRP2, Nrp2)及其同等型(isoform)和變體的統(tǒng)稱，如 Rossignol et al. (2000) Genomics 70:211-222中所述。神經(jīng)氈蛋白是120至130kDa非酪氨酸激酶受體。有多種 NRP-2剪接變體和可溶性同等型。神經(jīng)氈蛋白的基本結(jié)構(gòu)包含五個(gè)結(jié)構(gòu)域三個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域(ala2、bll32和C)、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、和一個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。ala2結(jié)構(gòu)域與補(bǔ)體成分Clr和 Cls (CUB)同源，其一般含有四個(gè)半胱氨酸殘基，形成兩個(gè)二硫橋。bll32結(jié)構(gòu)域與凝結(jié)因子V和VIII同源。c結(jié)構(gòu)域的中央部分稱為MAM，因?yàn)樗c與跨膜肽酶(meprin)、A5和受體酪氨酸磷酸酶μ蛋白同源。ala2和bll32結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)配體結(jié)合，而c結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕投刍虍愋投刍侵陵P(guān)重要的。Gu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277 18069-76；He and Tessier-Lavigne(1997)Cell 90739-51。“神經(jīng)氈蛋白介導(dǎo)的生物學(xué)活性”一般指其中神經(jīng)氈蛋白-1和/或神經(jīng)氈蛋白-2 發(fā)揮重大作用的生理性或病理性事件。此類活性的非限制性例子有胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育或神經(jīng)元再生、血管發(fā)生(包括血管造型)、腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移期間的軸突導(dǎo)向。如本文中使用的，“神經(jīng)氈蛋白-2介導(dǎo)的生物學(xué)活性”或“Nrp2介導(dǎo)的生物學(xué)活性”一般指其中Nrp2發(fā)揮重大作用的生理性或病理性事件，諸如例如增強(qiáng)VEGF受體活化和特別地調(diào)控淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(EC)遷移的能力、在成體淋巴管發(fā)生尤其是腫瘤淋巴管發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。術(shù)語(yǔ)“血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C ”、“ VEGF-C ”、“ VEGFC ”、“ VEGF相關(guān)蛋白”、“ VRP ”、 “ VEGF2，，和“ VEGF-2 ”可互換使用，而且指VEGF家族的成員，已知結(jié)合至少兩種細(xì)胞表面受體家族，即酪氨酸激酶VEGF受體和神經(jīng)氈蛋白(Nrp)受體。在三種VEGF受體中， VEGF-C能結(jié)合VEGFR2 (KDR受體)和VEGFR3 (Flt-4受體)，導(dǎo)致受體二聚化(Shinkaiet al. , J Biol Chem273, 31283-31288 (1998))、激酶活化和自磷酸化(Heldin, Cell 80,213-223(1995)；Waltenberger et al. , J. Biol Chem 269,26988-26995(1994))。磷酸化后的受體誘導(dǎo)多種底物活化，導(dǎo)致血管發(fā)生和淋巴管發(fā)生Perrara et al. , Nat Med 9,669-676(2003))。腫瘤細(xì)胞中VEGF-C的過表達(dá)顯示出促進(jìn)腫瘤相關(guān)淋巴管發(fā)生，導(dǎo)致增強(qiáng)的對(duì)局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移(Karpanen et al.，F(xiàn)aseb J 20，1462-1472 (2001) ；Mandriota et al. , EMBO J 20, 672-682(2001)；Skobe et al.，Nat Med 7，192-198(2001)；Stacker et al. , Nat Rev Cancer 2，573—583(2002)；Stacker et al. , Faseb J 16，922—934U002))。 VEGF-C表達(dá)還與多種人癌癥的腫瘤相關(guān)淋巴管發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(綜述見Achen et al.，2006, supra)。另外，阻斷VEGF-C介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)在小鼠中顯示出遏制腫瘤淋巴管發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(Chen et al. , Cancer Res 65,9004-9011(2005) ；He et al. , J. Natl Cancer Inst 94，8190825 (2002);Krishnan et al. , Cancer Res 63, 713-722(2003)；Lin et al. , Cancer Res 65, 6901-6909 (2005)) “血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C”、“VEGF_C”、“VEGFC”、 “ VEGF相關(guān)蛋白”、“ VRP ”、“ VEGF2 ”和“ VEGF-2 ”指全長(zhǎng)多肽和/或全長(zhǎng)多肽的活性片段。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述活性片段包括全長(zhǎng)氨基酸序列的任何部分，其具有少于美國(guó)專利 No. 6，451，764的SEQ ID NO:3所示全長(zhǎng)氨基酸序列全部419個(gè)氨基酸的氨基酸，通過述及明確將其完整公開內(nèi)容收入本文。此類活性片段含有VEGF-C生物學(xué)活性且包括但不限于成熟VEGF-C。在一個(gè)實(shí)施方案中，全長(zhǎng)VEGF-C多肽經(jīng)蛋白水解加工生成成熟形式的VEGF-C 多肽，也稱作成熟VEGF-C。此類加工包括切割信號(hào)肽和切割氨基末端肽和切割羧基末端肽以生成完全加工的成熟形式。實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明了全長(zhǎng)VEGF-C、VEGF-C的部分加工形式和 VEGF-C的完全加工成熟形式能夠結(jié)合VEGFR3 (Flt_4受體)。然而，對(duì)VEGFR2的高親和力結(jié)合只發(fā)生于VEGF-C的完全加工成熟形式。關(guān)于VEGF-C多肽的術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性”和“有生物學(xué)活性的”指與全長(zhǎng)和/或截短的VEGF-C有關(guān)的物理/化學(xué)特性和生物學(xué)功能。在一些實(shí)施方案中，VEGF-C “生物學(xué)活性”意指具有結(jié)合并刺激Flt-4受體(VEGFR!3)磷酸化的能力。一般地，VEGF-C會(huì)結(jié)合Flt-4受體的胞外域并由此活化或抑制其細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶域。因此，VEGF-C對(duì)受體的結(jié)合可在體內(nèi)或在體外導(dǎo)致增強(qiáng)或抑制具有針對(duì)VEGF-C的Flt-4受體的細(xì)胞的增殖和/或分化和/或活化。VEGF-C對(duì)Flt-4受體的結(jié)合可使用常規(guī)技術(shù)來測(cè)定，包括競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合方法，諸如RIA、ELISA、和其它競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。配體/受體復(fù)合物可使用諸如過濾、離心、流式細(xì)胞術(shù)等分離方法來鑒定(參見例如Lyman et al. , Cell, 75:1157-116 7[1993]；Urdal et al. , J. Biol. Chem. , 2632870-2877「19881；及 Gearing et al. ’ EMBO 1^,8:3667-3676 [1989])。來自結(jié)合研究的結(jié)果可使用結(jié)合數(shù)據(jù)的任何常規(guī)圖形呈現(xiàn)來分析，諸如 Scatchard 分析(Scatchard, Ann. NYAcad. Sci. , 51:660—672「19491；Goodwin et al., Cell, 73:447-456 [1993])等等。由于VEGF-C誘導(dǎo)Flt_4受體磷酸化，因此常規(guī)酪氨酸磷酸化測(cè)定法也可用作Flt-4受體/VEGF-C復(fù)合物形成的指示。在另一個(gè)實(shí)施方案中， VEGF-C “生物學(xué)活性”意指具有結(jié)合KDR受體(VEGFR2)的能力、血管通透性、以及內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖。在某些實(shí)施方案中，VEGF-C對(duì)KDR受體的結(jié)合可在體內(nèi)或在體外導(dǎo)致增強(qiáng)或抑制血管通透性以及具有針對(duì)VEGF-C的KDR受體的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和/或增殖和/或分化和/或活化。術(shù)語(yǔ)“VEGF-C拮抗劑”在本文中用于指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF-C活性的分子。在某些實(shí)施方案中，VEGF-C拮抗劑指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF-C調(diào)控血管發(fā)生、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(EC)遷移、增殖或成體淋巴管發(fā)生，尤其是腫瘤淋巴管發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移的能力的分子。VEGF-C拮抗劑包括但不限于抗VEGF-C抗體及其抗原結(jié)合片段、特異性結(jié)合VEGF-C由此隔絕其與一種或多種受體結(jié)合的受體分子和衍生物、抗VEGF-C受體抗體和VEGF-C受體拮抗劑諸如VEGFR2和VEGFR3的小分子抑制劑。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“ VEGF-C拮抗劑”具體包括結(jié)合VEGF-C且能夠中和、阻斷、抑制、消除、 降低或干擾VEGF-C活性的分子，包括抗體、抗體片段、其它結(jié)合多肽、肽、和非肽小分子。如此，術(shù)語(yǔ)“VEGF-C活性”具體包括VEGF-C介導(dǎo)的VEGF-C生物學(xué)活性(如上文定義的)。術(shù)語(yǔ)“抗VEGF-C抗體”或“結(jié)合VEGF-C的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合VEGF-C 使得該抗體在靶向VEGF-C中可用作診斷和/或治療劑的抗體?？筕EGF-C抗體記載于例如 Attorney Docket PR4391，通過述及明確將該專利申請(qǐng)的完整內(nèi)容收入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗VEGF-C抗體對(duì)無關(guān)的非VEGF-C蛋白的結(jié)合程度小于該抗體對(duì)VEGF-C的結(jié)合的約10%，如通過例如放射免疫測(cè)定法(RIA)測(cè)量的。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合VEGF-C的抗體具有彡ΙμΜ，彡IOOnM, ( IOnM, ( InM,或彡0. InM的解離常數(shù)(Kd)。在某些實(shí)施方案中，抗VEGF-C抗體結(jié)合在來自不同物種的VEGF-C間保守的VEGF-C表位。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“VEGF”或“VEGF-A”指165個(gè)氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子及相關(guān)的121個(gè)、189個(gè)和206個(gè)氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如Leung et al. (1989) Science 246:1306;及 Houck et al. (1991)Mol. Endocrin. 5:1806 所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。術(shù)語(yǔ)“VEGF”還指來自非人物種諸如小鼠、大鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物的VEGF。有時(shí)，來自特定物種的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示小鼠VEGF，等等。術(shù)語(yǔ)“VEGF”還用于指包含165個(gè)氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申請(qǐng)中可能通過例如“VEGF(8-109) ”、 "VEGF(1-109) ”或"VEGF165”來鑒別任何此類形式VEGF?！敖囟痰摹碧烊籚EGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示編號(hào)。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當(dāng)?shù)膶?duì)KDR和 Flt-I受體的結(jié)合親和力。"VEGF生物學(xué)活性”包括對(duì)任何VEGF受體的結(jié)合或任何VEGF信號(hào)傳導(dǎo)活性，調(diào)節(jié)諸如對(duì)正常的和異常的血管發(fā)生(angiogenesis)和脈管發(fā)生(vasculogenesis) (Ferrara 禾口 Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.184-25；Ferrara(1999)J. Mol. Med. 77:527-543)； 促進(jìn)胚胎脈管發(fā)生和血管發(fā)生(Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara et al. (1996)Nature 380:439-442)；及調(diào)控雌性生殖道中的和為了骨生長(zhǎng)和軟骨形成的周期性血管增殖(Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber et al. (1999) Nature Med. 5:623-628).在作為血管發(fā)生和脈管發(fā)生中的血管發(fā)生因子之外，VEGF，作為多效生長(zhǎng)因子，在生理過程諸如內(nèi)皮細(xì)胞存活、血管通透性和血管舒張、單核細(xì)胞趨化性和鈣內(nèi)流中展現(xiàn)出多種生物學(xué)效應(yīng)(Ferrara和Davis-Smyth(1997)，見上文；及Cebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci. 63601-615 (2006)) 此外，最近的研究報(bào)道了 VEGF對(duì)少數(shù)非內(nèi)皮細(xì)胞類型諸如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、胰導(dǎo)管細(xì)胞、和許旺(khwarm)細(xì)胞的促有絲分裂效 M (Guerrin et al. (1995)J. Cell Physiol. 164:385-394;Oberg-Welsh et al. (1997)Μο1· Cell. Endocrinol. 126:125-132;Sondell et al. (1999)J. Neurosci. 19:5731-5740)。
"VEGF拮抗劑”或“VEGF特異性拮抗劑”指能夠結(jié)合VEGF，降低VEGF表達(dá)水平，或者中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物學(xué)活性(包括但不限于VEGF與一種或多種 VEGF受體的結(jié)合及由VEGF介導(dǎo)的血管發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞存活或增殖)的分子。在本發(fā)明的方法中有用的VEGF特異性拮抗劑包括特異性結(jié)合VEGF的多肽、抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段、特異性結(jié)合VEGF由此使其隔絕與一種或多種受體結(jié)合的受體分子和衍生物、融合蛋白(例如 VEGF-Trap (Regeneron))、和 VEGF121-白樹毒素(Peregrine)。VEGF 特異性拮抗劑還包括VEGF多肽的拮抗性變體、針對(duì)VEGF的反義核堿基寡聚物、針對(duì)VEGF的小RNA分子、 RNA適體、肽體、和針對(duì)VEGF的核酶。VEGF特異性拮抗劑還包括結(jié)合VEGF且能夠阻斷、抑制、消除、降低、或干擾VEGF生物學(xué)活性的非肽小分子。如此，術(shù)語(yǔ)“VEGF活性”明確包括 VEGF介導(dǎo)的VEGF生物學(xué)活性。在某些實(shí)施方案中，VEGF拮抗劑將VEGF的表達(dá)水平或生物學(xué)活性降低或抑制了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多?！翱筕EGF抗體”指以足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF的抗體。在某些實(shí)施方案中，所選擇的抗體通常會(huì)具有足夠的對(duì)VEGF的結(jié)合親和力，例如，該抗體可以以介于IOOnM-IpM 之間的Kd值結(jié)合hVEGF?？贵w親和力可通過例如基于表面等離振子共振的測(cè)定法(諸如 PCT申請(qǐng)公開文本No. W02005/012359中所記載的BIAcore測(cè)定法)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (ELISA)；和競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法(例如RIA)來測(cè)定。在某些實(shí)施方案中，抗VEGF抗體可用作治療劑，用于靶向和干擾其中牽涉VEGF活性的疾病或疾患。還有，該抗體可進(jìn)行其它生物學(xué)活性測(cè)定法，例如為了評(píng)估其作為治療劑的效力。此類測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的，而且取決于抗體的靶抗原和預(yù)定用途。例子包括 HUVEC抑制測(cè)定法；腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制測(cè)定法(如例如WO 89/06692中所記載的);抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CDC)測(cè)定法(美國(guó)專利5，500，362)； 及激動(dòng)活性或造血測(cè)定法(參見WO 95/27062)。抗VEGF抗體通常不會(huì)結(jié)合其它VEGF同系物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會(huì)結(jié)合其它生長(zhǎng)因子，諸如P1GF、PDGF或bFGF。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗VEGF抗體是與雜交瘤ATCC HB 10709所生成的單克隆抗VEGF抗體A4. 6. 1結(jié)合相同表位的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗VEGF抗體是依照I^resta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體，包括但不限于稱作貝伐單抗(Bevacizumab，BV ;AVASTIN )的抗體?？筕EGF 抗體“貝伐單抗(BV)”，也稱作 “rhuMAb VEGF” 或"AVASTIN ” ,是一種依照Presta et al. (1997) Cancer Res. 57 4593-4599生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體。它涵蓋突變的人IgGl框架區(qū)和來自鼠抗hVEGF單克隆抗體A. 4. 6.1 (其阻斷人VEGF 對(duì)其受體的結(jié)合)的抗原結(jié)合互補(bǔ)決定區(qū)。貝伐單抗大約93%的氨基酸序列，包括大部分框架區(qū)，衍生自人IgGl，而大約7%的序列衍生自小鼠抗體A4. 6. 1。貝伐單抗具有約149，000 道爾頓的分子量，而且是糖基化的。貝伐單抗和其它人源化抗VEGF抗體進(jìn)一步記載于2005 年2月沈日公告的美國(guó)專利No. 6，884，879，通過述及明確將其完整公開內(nèi)容收入本文。兩種表征最全面的VEGF受體是VEGFRl (也稱作Flt-I)和VEGFR2 (鼠同系物也稱作KDR和FLK-I )。每一種受體對(duì)每一種VEGF家族成員的特異性有所不同，但是VEGF-A 結(jié)合Flt-I和KDR 二者。全長(zhǎng)Flt-I受體包括具有七個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、和具有酪氨酸激酶活性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域涉及VEGF結(jié)合，而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
特異性結(jié)合VEGF的VEGF受體分子或其片段可以在本發(fā)明的方法中用作結(jié)合和隔絕VEGF蛋白，由此阻止它發(fā)信號(hào)的VEGF抑制劑。在某些實(shí)施方案中，VEGF受體分子或其 VEGF結(jié)合片段是可溶性形式，諸如sFlt-Ι。受體的可溶性形式發(fā)揮對(duì)VEGF蛋白生物學(xué)活性的抑制效應(yīng)，其通過結(jié)合VEGF，由此阻止它結(jié)合其在靶細(xì)胞表面上存在的天然受體來實(shí)現(xiàn)。還包括VEGF受體融合蛋白，下文描述了它們的例子。嵌合VEGF受體蛋白指具有自至少兩種不同蛋白質(zhì)(其中至少一種是VEGF受體蛋白，例如f It-I或KDR受體)衍生的氨基酸序列且能夠結(jié)合并抑制VEGF生物學(xué)活性的受體分子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合VEGF受體蛋白由自只有兩種不同VEGF受體分子衍生的氨基酸序列組成；然而，可以將包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、或所有七個(gè)來自flt-Ι和/或KDR受體胞外配體結(jié)合區(qū)的Ig樣結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列連接至來自其它無關(guān)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，例如免疫球蛋白序列。與Ig樣結(jié)構(gòu)域組合的其它氨基酸序列對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)是顯而易見的。嵌合VEGF受體蛋白的例子包括但不限于可溶性Flt-1/Fc、KDR/Fc、或Flt-1/KDR/Fc (也稱作VEGFiTrap)(參見例如PCT申請(qǐng)公開文本 No. W097/44453)。可溶性VEGF受體蛋白或嵌合VEGF受體蛋白包括沒有經(jīng)跨膜結(jié)構(gòu)域而固定至細(xì)胞表面的VEGF受體蛋白。因此，VEGF受體(包括嵌合受體蛋白)的可溶性形式，雖然能夠結(jié)合并滅活VEGF，但是不包含跨膜結(jié)構(gòu)域，并如此一般不會(huì)變成與該分子在其中表達(dá)的細(xì)胞的細(xì)胞膜相結(jié)合。別的VEGF抑制劑記載于例如WO 99/24440, PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/IB99/00797, WO 95/21613, WO 99/61422，美國(guó)專利 No. 6，534，524，美國(guó)專利 No. 5，834，504，WO 98/50356, 美國(guó)專利No. 5,883，113，美國(guó)專利No. 5，886，020，美國(guó)專利No. 5，792，783，美國(guó)專利 No. 6,653,308, WO 99/10349, WO 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755，及WO 98/02437，通過述及將它們都完整收入本文。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“B20系列多肽”指包括結(jié)合VEGF的抗體的多肽。B20系列多肽包括但不限于自B20抗體的序列衍生的抗體或美國(guó)公開文本No. 20060280747,美國(guó)公開文本No. 20070141065和/或美國(guó)公開文本No. 20070020267中記載的B20衍生抗體，通過述及明確將這些專利申請(qǐng)的內(nèi)容收入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，B20系列多肽是美國(guó)公開文本No. 20060280747,美國(guó)公開文本No. 20070141065和/或美國(guó)公開文本No. 20070020267 中記載的B20-4. 1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，B20系列多肽是美國(guó)專利申請(qǐng)60/991，302中記載的B20-4. 1. 1，通過述及將其完整公開內(nèi)容收入本文。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“ G6系列多肽”指包括結(jié)合VEGF的抗體的多肽。G6系列多肽包括但不限于自G6抗體的序列衍生的抗體或美國(guó)公開文本No. 2006(^80747，美國(guó)公開文本No. 20070141065和/或美國(guó)公開文本No. 20070020267中記載的G6衍生抗體。美國(guó)公開文本No. 2006(^80747，美國(guó)公開文本No. 20070141065和/或美國(guó)公開文本 No. 20070020267中記載的G6系列多肽包括但不限于G6_8, G6-23和G6-31。對(duì)于別的抗體，參見美國(guó)專利 No. 7，060，269，6，582，959，6，703，020 ； 6，054，297 ； W098/45332;W0 96/30046 ;W094/10202;EP 0666868B 1 ；美國(guó)專利申請(qǐng)公開 No. 200600936 0，20050186208，20030206899，20030190317，20030203409，和 20050112126；及 Popkov et al.，Journal of Immunological Methods 288:149-164^004)。在某些實(shí)施方案中，其它抗體包括那些結(jié)合人 VEGF 上包含殘基 F17，M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191，K101, E103,和 C104 或者包含殘基F17, Y21, Q22, Y25, D63, 183和Q89的功能性表位的。還知道其它抗VEGF抗體，而且記載于例如Liang et al.，J Biol Chem 281,951-961(2006)ο患者對(duì)抗癌劑治療的“有效響應(yīng)”(effective response)或患者對(duì)VEGF拮抗劑治療的“響應(yīng)性”(responsiveness)或“敏感性”(sensitivity)指源自用抗癌劑(諸如例如抗VEGF-A抗體、抗VEGF-C抗體、或抗NRP2抗體)進(jìn)行的治療或作為該治療的結(jié)果，給予患者(有癌癥風(fēng)險(xiǎn)或患有癌癥)的臨床或治療受益。此類受益包括細(xì)胞或生物學(xué)應(yīng)答、完全響應(yīng)、部分響應(yīng)、穩(wěn)定的病情(沒有進(jìn)展或復(fù)發(fā))、或源自用該拮抗劑進(jìn)行的治療或作為該治療的結(jié)果的患者響應(yīng)及稍后復(fù)發(fā)。例如，有效響應(yīng)可以是診斷為與腫瘤引流淋巴結(jié)有關(guān)的淋巴管中淋巴搏動(dòng)頻率有降低的患者中在至少一次抗癌劑處理后縮小的腫瘤尺寸或延長(zhǎng)的無進(jìn)展存活。淋巴搏動(dòng)頻率的降低有效預(yù)示，或以高靈敏度預(yù)示此類有效響應(yīng)。如本文中使用的，“拮抗劑”指抑制或降低它們所結(jié)合的分子的生物學(xué)活性的化合物或藥劑。拮抗劑包括結(jié)合VEGF的抗體、合成或天然序列肽、免疫粘附素、和小分子拮抗劑，任選偶聯(lián)有或融合至另一分子?！白钄嘈浴笨贵w或“拮抗性”抗體指抑制或降低它所結(jié)合的抗原的生物學(xué)活性的抗體。如本文中使用的，“激動(dòng)性抗體”指部分或完全模擬感興趣多肽的至少一種功能活性的抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性?！胺蛛x的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會(huì)干擾該抗體的研究、診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在有些實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)例如 Lowry法的測(cè)定，抗體重量超過95%，而在有些實(shí)施方案中，重量超過99%，(2)足以通過使用例如轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或C3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用例如考馬斯藍(lán)或銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個(gè)純化步驟來制備?！疤烊豢贵w”指通常由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構(gòu)成的約 150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變域(Vh)，接著是多個(gè)恒定域。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變域(VJ，而另一端是一個(gè)恒定域。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。抗體的“可變區(qū)”或“可變域”指抗體重鏈或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。重鏈的可變域可以稱為“VH”。輕鏈的可變域可以稱為“VL”。這些結(jié)構(gòu)域一般是抗體的最易變部分且包含抗原結(jié)合位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“可變的”指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變域。 它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)(HVR)的三個(gè)區(qū)段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)FR區(qū)，它們大多采取β-折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成β-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)HVR連接。 每條鏈中的HVR通過FR區(qū)非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的HVR —起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見 Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, H 5 IK , National Institute of Health, Bethesda1MD. (1991))。 11 : ^^ 接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體在抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性中的參與。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、 δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的，一般性描述于例如 Abbas et al.，Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co.，2000)。 抗體可以是抗體與一種或多種其它蛋白質(zhì)或肽共價(jià)或非共價(jià)關(guān)聯(lián)而形成的更大融合分子的一部分。術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體而非如下文所定義的抗體片段。該術(shù)語(yǔ)具體指重鏈包含F(xiàn)c區(qū)的抗體。“裸抗體(裸露的抗體)”為本發(fā)明目的指未偶聯(lián)細(xì)胞毒性模塊或放射性標(biāo)記物的抗體?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，及一個(gè)剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F (ab' )2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原?！癋v”是包含完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈Fv種類由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv(SCFV) 種類中，一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價(jià)相連接，使得輕鏈和重鏈可以在與雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，每個(gè)可變域的三個(gè)HVR相互作用而在二聚體表面上限定了一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)HVR —起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或是只包含對(duì)抗原特異性的三個(gè)HVR 的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段包含重鏈和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域 (CHl)0Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基， 包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab' -SH是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab' ) 2抗體片段最初是作為在Fab ‘片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在Vh與八結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)一步包含多肽接頭， 其使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見例如Plilckthim，于 《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編， Springer-Verlag, New York, 1994，第 269—315 頁(yè)。術(shù)語(yǔ)“雙抗體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，該片段在同一條多肽鏈 (Vh-Vl)中包含相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(\)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體可以是二價(jià)的或雙特異性的。雙抗體更完整的記載于例如 EP 404, 097;WO 1993/01161 ;Hudson et al.，Nat. Med. 9 129-134U003)；及Hollinger et al. , PNAS USA 90:6444-6448(1993)。三抗體(Triabody)和四抗體(tetrabody)也記載于 Hudson et al. , Nat. Med. 9 129-134 (2003) 術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的突變，例如天然存在的突變。如此， 修飾語(yǔ)“單克隆”表明抗體不是分立的抗體的混合物的特征。在某些實(shí)施方案中，此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨(dú)特克隆。應(yīng)當(dāng)理解， 所選擇的靶物結(jié)合序列可進(jìn)一步改變，例如為了提高對(duì)靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢(shì)在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)“單克隆”表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來生成，包括例如雜交瘤法(例如 Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97(1975) ； Hong ο et al. , Hybridoma, 14(3)253-260(1995), Harlow et al. , AntibodiesA Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版 1988)；Hammerling et al., 于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier, N. Y. , 1981))> 重組DNA法(參見例如美國(guó)專利No. 4，816，567)、噬菌體展示技術(shù)(參見例如Clackson et al. ,Nature352:624-628(1991)；Marks et al.，J. Mol. Biol. 222:581-597(1992)；Sidhu et al. , J. Mol. Biol. 338 (2) :299-310 (2004) ； Lee et al. , J. Mol. Biol. 340 (5) : 10 73-1093(2004)；Fellouse,PNAS USA 101 (34) :12467—12472(2004);Lee et al. , J. Immunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整個(gè)人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動(dòng)物中生成人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如 WO 1998/24893;WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits etal. , PNAS USA 90:2551 (1993)；Jakobovits et al. , Nature362255-258 (1993) ；Bru ggemann et al. , Year in Immuno. 7:33(1993)；美國(guó)專利 No. 5，545，807；5，545，806 ；5，569，825;5，625，126;5，633，425;禾口 5，661，016；Marks et al. , Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg et al. , Nature 368856-859(1994)；Morrison, Natur e 368:812-813(1994)；Fishwild et al. , Nature Biotechnol. 14845—851 (1996)； Neuberger, Nature Biotechno1. 14:826(1996)；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(例如美國(guó)專利No. 4，816，567;Morrison et al. , PNAS USA81 6851-6855 (1984))。嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)類化”抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自通過例如用感興趣抗原免疫獼猴而生成的抗體。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的HVR殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、家兔、或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的HVR殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的FR殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基?？梢赃M(jìn)行這些修飾來進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個(gè)、 通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見例如Jones et al. ,Nature 321522-525(1986)；Riechmann et al. , Nature 332:323-329(1988); 禾口 Presta, Curr. 0ρ· Struct. Biol. 2:593-596(1992)。還可參見例如 Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma&Immunol. 1:105-115(1998)；Harris, Biochem. Soc. Transa ctions23:1035-1038 (1995) ； Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；及美國(guó)專利 No. 6，982，321 和 7，087，409?！叭丝贵w”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和/或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術(shù)生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來生成，包括噬菌體展示文庫(kù)(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991) ；Marks et al. , J. Mol. Biol. 222:581 (1991))。還可用于制備人單克隆抗體的是以下文獻(xiàn)中記載的方法Cole et al. , MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985)；Boerner et al.，J. Immunol. 147(1) :86-95(1991)。還可參見 van Dijk and van de Winke 1, Curr. Opin. Pharmacol.，5:368-74(2001)?？赏ㄟ^給已經(jīng)修飾以應(yīng)答抗原性刺激而生成人抗體但其內(nèi)源基因組已經(jīng)失能的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如經(jīng)過免疫的異種小鼠(xenomice)施用抗原來制備人抗體(參見例如6，075，181和6，150，584，關(guān)于XEN0M0USE 技術(shù))。還可參見例如Li et al. , PNAS USA, 103 3557-3562 (2006)，關(guān)于經(jīng)人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生成的人抗體。術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”在用于本文時(shí)指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個(gè)HVR:三個(gè)在VH中(HI、H2、H3)，三個(gè)在VL中(Li、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個(gè)HVR的最大多樣性，而且認(rèn)為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發(fā)揮獨(dú)特作用。參見例如Xu et al. Immunityl337-45(2000)；Johnson and Wu ψ Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo, ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2003)。事實(shí)上，僅由重鏈組成的天然存在camelid抗體在缺乏輕鏈時(shí)是有功能的且穩(wěn)定的。參見例如 Hamers-Casterman et al. , Nature 363446-448 (1993)；及 Sheriffet al. , Nature Struct.Biol. 3733-736(1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。作為Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)的HVR是以序列變異性為基礎(chǔ)的，而且是最常用的(Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesck, MD (1991))。Chothia 改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。AbM HVR 代表 Kabat CDR 與 Chothia 結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件的使用?！敖佑|” HVR是以對(duì)可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些HVR中每-
環(huán) KabatAbMChothia接觸
LI L24-L34L24-L34L26-L32L30-L36
L2 L50-L56L50-L56L50-L52L46-L55
L3 L89-L97L89-L97L91-L96L89-L96
HI H31-H35BH26-H35BH26-H32H30-H35B (Kabat編號(hào))
HI H31-H35H26-H35H26-H32H30-H35 (Chothia編號(hào))
H2 H50-H65H50-H58H53-H55H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101H93-H101HVR 可包括如下“延伸的 HVR" :VL 中的 24-36 或 24-34 (Li)、46-56 或 50-56 (L2) 和 89-97 或 89-96 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或 95-102(H3)。對(duì)于這些延伸的HVR定義中的每一個(gè)，可變域殘基是依照Kabat等，見上文編號(hào)的。“框架”或“FR”殘基指可變域中除本文中所定義的HVR殘基外的那些殘基。表述“依照Kabat的可變域殘基編號(hào)方式”或“依照Kabat的氨基酸位置編號(hào)方式”及其變體指Kabat et al.,見上文中的抗體編輯用于重鏈可變域或輕鏈可變域的編號(hào)系統(tǒng)。使用此編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對(duì)應(yīng)于可變域 FR或HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照 Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、^b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號(hào)方式可通過將抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)”Kabat編號(hào)序列對(duì)比同源區(qū)來確定。“親和力成熟的”抗體指在抗體的一個(gè)或多個(gè)HVR中具有一處或多處改變、導(dǎo)致該抗體對(duì)抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案， 親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級(jí)的對(duì)靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知規(guī)程來生成。例如，Marks et al. , Bio/Technology 10:779-783(1992) 記載了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進(jìn)行的親和力成熟。以下文獻(xiàn)記載了 HVR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變例如 Barbas et al.，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994) ； Schier et al. , Gene 169 147-155 (1995)；Yelton et al. , J. Immunol. 155 1994-2004(19 95) ； Jackson et al. , J. Immunol. 154(7) :3310-9(1995) ； Hawkins et al. , J. Mol. Biol.226:889-896(1992)?！吧L(zhǎng)抑制性”抗體指那些阻止或降低表達(dá)抗體所結(jié)合之抗原的細(xì)胞增殖的抗體。“誘導(dǎo)凋亡”的抗體指那些根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)凋亡測(cè)定法的測(cè)定，誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的抗體，所述測(cè)定法諸如膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細(xì)胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞破裂、和/或膜囊(稱作凋亡小體)形成。抗體“效應(yīng)器功能”指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc 區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC) ；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)下調(diào)；和B細(xì)胞活化。術(shù)語(yǔ)“Fe區(qū)”在本文中用于定義免疫球蛋白重鏈的C-端區(qū)域，包括天然序列Fc區(qū)和變異Fc區(qū)。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為自其或ftx)230位置的氨基酸殘基至羧基末端的區(qū)段。Fc區(qū)的C-末端賴氨酸(殘基447，依照EU編號(hào)系統(tǒng))可以消除，例如在生產(chǎn)或純化抗體的過程中，或者通過對(duì)編碼抗體重鏈的核酸進(jìn)行重組工程改造。因而，完整抗體組合物可以包括所有K447殘基都被消除的抗體群、無一 K447殘基被消除的抗體群、或者混合了有K447殘基的抗體和沒有K447殘基的抗體的抗體群。除非本文另有說明，免疫球蛋白重鏈的殘基編號(hào)方式是如Kabat et al.,見上文中的EU索引的編號(hào)方式?！叭鏚abat中的EU索引”指人IgGlEU抗體的殘基編號(hào)方式。“功能性Fc區(qū)”擁有天然序列Fc區(qū)的“效應(yīng)器功能”。例示性的“效應(yīng)器功能”包括Clq結(jié)合；CDC ；Fc受體結(jié)合；ADCC ；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)下調(diào)等。此類效應(yīng)器功能一般要求Fc區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變域)聯(lián)合，而且可以使用多種測(cè)定法來評(píng)估，例如本文定義中所公開的。“天然序列Fc區(qū)”包含與在自然界中找到的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc區(qū)包括天然序列人IgGlFc區(qū)(非A和A同種異型)；天然序列人IgG2Fc 區(qū)；天然序列人IgG3Fc區(qū)；和天然序列人IgG4Fc區(qū)；及其天然存在變體?！白儺怓c區(qū)”包含由于至少一處氨基酸修飾(優(yōu)選一處或多處氨基酸替代)而與天然序列Fc區(qū)有所不同的氨基酸序列。優(yōu)選的是，變異Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)相比或與親本多肽的Fc區(qū)相比具有至少一處氨基酸替代，例如在天然序列Fc區(qū)中或在親本多肽的Fc區(qū)中具有約1處至約10處氨基酸替代，優(yōu)選約1處至約5處氨基酸替代。變異Fc區(qū)在本文中優(yōu)選與天然序列Fc區(qū)和/或親本多肽的Fc區(qū)擁有至少約80%的同源性，最優(yōu)選與它們具有至少約90%的同源性，更優(yōu)選與它們具有至少約95%的同源性?！昂現(xiàn)c區(qū)的抗體”指包含F(xiàn)c區(qū)的抗體。Fc區(qū)的C-末端賴氨酸(依照EU編號(hào)系統(tǒng)的殘基447)可以消除，例如在純化抗體的過程中或者通過重組改造編碼抗體的核酸。因此， 依照本發(fā)明包含具有Fc區(qū)的抗體的組合物可包含具有K447的抗體、消除了所有K447的抗體、或具有與沒有K447殘基的抗體的混合物。"Fe受體”或“FcR”描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。在有些實(shí)施方案中，F(xiàn)cR是天然人 FcR0在有些實(shí)施方案中，F(xiàn)cR是結(jié)合IgG抗體的FcR ( γ受體)，包括屬于Fc γ RI、Fc γ RII 和Fc γ RIII亞類的受體，包括那些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括 Fc y RIIA (“活化受體”)和Fc y RIIB (“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?；罨荏wFc y RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fc γ RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序 (ITIM)(參見例如 Da e ron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997))。FcR 的綜述參見例如 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9457-492 (1991)；Capel et al. , Immunomethods 4:25-34(1994)；及 de Haas et al.，J. Lab. Clin. Med. 126 330-341 (1995)。術(shù)語(yǔ)“FcR”在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未來將會(huì)鑒定的。術(shù)語(yǔ)“Fe受體”或“FcR”還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn,它負(fù)責(zé)將母體 IgG 轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer et al. , J. Immunol. 117:587(1976)和 Kim et al. , J. Immunol. 24:2429-249(1994))并調(diào)節(jié)免疫球蛋白的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。測(cè)量對(duì)Fcfoi的結(jié)合的方法是已知的(參見例如(^hetie 1997, Hinton 2004)。測(cè)量對(duì)Fcfoi的結(jié)合的方法是已知的(參見例如 Ghetie and Ward. , Immunology Today 18 (12) : 592—8 (1997) ; Ghetie et al. , Nature Biotechnology, 15 (7) :637-40 (1997) ；Hinton et al. , J. Biol. Chem. 279(8):6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton et al·))?？蓽y(cè)定人Fcfoi高親和力結(jié)合多肽與人Fcfoi的體內(nèi)結(jié)合和血清半衰期，例如在表達(dá)人Fcfoi的轉(zhuǎn)基因小鼠或經(jīng)轉(zhuǎn)染人細(xì)胞系中，或者在施用了具有變異Fc區(qū)的多肽的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中。WO 00/42072 (Presta)記載了對(duì)FcR的結(jié)合提高或降低的抗體變體。還可參見例如 Shields et al. , J. Biol. Chem. 9 (2) 6591-6604 (2001) “人效應(yīng)細(xì)胞”指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，該細(xì)胞至少表達(dá)Fc YRIII并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來源分離，例如血液?！翱贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或“ADCC”指其中結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如NK細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性形式。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞即NK細(xì)胞只表達(dá)Fc y RIII，而單核細(xì)胞表達(dá)Fc γ RI、Fc γ RII 禾口 Fc γ RIII。Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)第 464 頁(yè)表 3 總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，諸如美國(guó)專利No. 5，500，362或5，821，337或美國(guó)專利No. 6，737，056 (Presta)中所記載的。 可用于此類測(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括PBMC和NK細(xì)胞。或者/另外，可在體內(nèi)評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes et al. , PNAS (USA) 95 652-656 (1998)中所披露的?！把a(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”指存在補(bǔ)體時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合抗體(適宜亞類的)起始的，該抗體已結(jié)合至其關(guān)聯(lián)抗原。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測(cè)定法，例如如feizzano-Santoro et al.，J. Immunol. Methods 202:163(1996)中所記載的。具有更改的Fc區(qū)氨基酸序列(具有變異Fc區(qū)的多肽)及提高或降低的Clq結(jié)合能力的多肽變體記載于例如美國(guó)專利No. 6，194，551B1和WO 1999/51642。還可參見例如 Idusogie et al.，J. Immunol. 164:4178-4184(2000)?！敖Y(jié)合親和力”通常指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原) 之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有說明，在用于本文時(shí)，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體與抗原)之間1:1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X對(duì)其配偶體 Y的親和力通?？捎媒怆x常數(shù)(Kd)來表述。親和力可通過本領(lǐng)域知道的常用方法來測(cè)量， 包括本文中所描述的那些。低親和力抗體通常緩慢地結(jié)合抗原且趨于容易解離，而高親和力抗體通常更快速地結(jié)合抗原且趨于保持更長(zhǎng)時(shí)間的結(jié)合。本領(lǐng)域知道測(cè)量結(jié)合親和力的多種方法，其中任一種都可用于本發(fā)明的目的。下文描述了具體的、示例性和例示性的、用于測(cè)量結(jié)合親和力的實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的“Kd”或“Kd值”是通過如下測(cè)定法所述使用Fab 型式的目的抗體及其抗原進(jìn)行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測(cè)定法(RIA)來測(cè)量的通過在存在未標(biāo)記抗原的滴定系列的條件下，用最小濃度的(125I)標(biāo)記抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗體包被的平板捕捉結(jié)合的抗原來測(cè)量Fab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和力(參見例如Chen，et al. , J Mol Biol 293:865-881(1999))。為了確定測(cè)定條件，用 50mM 碳酸鈉(pH 9.6)中的 5 μ g/ml 捕捉用抗 Fab 抗體(Cappel Labs)包被微量滴定板(DYNEX Technologies, Inc.) 過夜，隨后用PBS中的牛血清清蛋白在室溫(約23° C)封閉2-5小時(shí)。在非吸附平板(Nunc#269620)中，將IOOpM或^pM[125I]-抗原與連續(xù)稀釋的目的Fab混合(例如與 Presta et al.，Cancer Res. 57 4593-4599 (1997)中抗 VEGF 抗體，F(xiàn)ab-12 的評(píng)估一致)。然后將目的Fab保溫過夜；不過，保溫可持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間(例如約65個(gè)小時(shí))以保證達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉板以進(jìn)行室溫保溫(例如1小時(shí))。然后除去溶液，并用含0. l%Tween-20 表面活性劑的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150 μ 1/孔閃爍液 (MICR0SCINT-20 ; I^ackard)，然后在 T0PC0UNT 伽馬計(jì)數(shù)器(I^ackard)上對(duì)平板計(jì)數(shù) 10 分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結(jié)合之20%的濃度用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。依照另一實(shí)施方案，Kd或Kd值是通過表面等離振子共振測(cè)定法使用 BIACORE -2000 或 B丨 ACORE -3000 儀器(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在 25° C使用固定化抗原CM5芯片在約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)測(cè)量的。簡(jiǎn)而言之，依照供應(yīng)商的說明書用鹽酸N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸鈉pH 4. 8將抗原稀釋至5 μ g/ml (約0. 2 μ Μ)，然后以5 μ 1/分鐘的流速注入至獲得約十個(gè)響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25° C以約25 μ 1/分鐘的流速注入在含0. 05%TWEEN 20 表面活性劑的PBS (PBST) 中兩倍連續(xù)稀釋的Fab (0. 78nM至500nM)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通過同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖計(jì)算結(jié)合速率(k。n)和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率k。ff/k。n計(jì)算。參見例如 Chen et al.，J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根據(jù)上文表面等離振子共振測(cè)定法， 結(jié)合速率超過IO6M-1S-1,那么結(jié)合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來測(cè)定，即根據(jù)分光計(jì)諸如配備了斷流裝置的分光光度計(jì)(a stop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments) 或8000系列SLM-AMINC0 分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測(cè)量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測(cè)量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25° C 的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)=295nm ；發(fā)射=340nm，16nm帶通)的升高或降低。it M * 胃 _ 白勺 “g ^ 3 “ (on-rate, rate of association, association rate)或“k。n”也可如上所述使用BIACORE⑧-2000或BiACORE -3000系統(tǒng) (BIAcore, Inc.，Piscataway, NJ)來測(cè)定。短語(yǔ)“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文時(shí)表示兩個(gè)數(shù)值(例如，一個(gè)涉及本發(fā)明的抗體而另一個(gè)涉及參照/比較抗體)之間足夠高的相似程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為在用所述數(shù)值(例如Kd值)所測(cè)量的生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個(gè)數(shù)值之間的差異具有很小的或沒有生物學(xué)和/或統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。作為參照/比較值的函數(shù)，所述兩個(gè)數(shù)值之間的差異例如小于約50%，小于約40%，小于約30%，小于約20%，和/或小于約10%。短語(yǔ)“實(shí)質(zhì)性降低，，或“實(shí)質(zhì)性不同，，在用于本文時(shí)表示兩個(gè)數(shù)值(通常一個(gè)與某分子有關(guān)而另一個(gè)與參照/比較分子有關(guān))之間足夠高的差異程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為在用所述數(shù)值(例如Kd值)所測(cè)量的生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個(gè)數(shù)值之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。作為參照/比較分子該數(shù)值的函數(shù)，所述兩個(gè)數(shù)值之間的差異例如大于約10%， 大于約20%，大于約30%，大于約40%，和/或大于約50%。在某些實(shí)施方案中，本文中有用的人源化抗體進(jìn)一步包含IgG Fc中的氨基酸改變且展現(xiàn)超出具有野生型IgG Fc的抗體升高至少60倍、至少70倍、至少80倍、更優(yōu)選至少 100倍、優(yōu)選至少125倍、甚至更優(yōu)選至少150倍至約170倍的對(duì)人Fcfoi的結(jié)合親和力。“病癥”或“疾病”指將受益于本發(fā)明物質(zhì)/分子或方法的治療的任何狀況。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括使哺乳動(dòng)物易患所討論病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤；非白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞、上皮、基質(zhì)和囊胚腔的病癥；及炎性病癥、 免疫學(xué)病癥和其它血管發(fā)生相關(guān)病癥。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞增殖性病癥”和“增殖性病癥”指與一定程度的異常細(xì)胞增殖有關(guān)的病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞增殖性病癥指癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞增殖性病癥是血管發(fā)生。“腫瘤”在用于本文時(shí)指所有贅生性(neoplastic)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細(xì)胞和組織。術(shù)語(yǔ)“癌癥”、“癌性”、“細(xì)胞增殖性病癥”、“增殖性病癥”和“腫瘤”在本文中提到時(shí)并不互相排斥。術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動(dòng)物中特征通常為細(xì)胞增殖不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤 (h印atoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney or renalcancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、及各種類型的頭和頸癌，以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級(jí)/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細(xì)胞性(SL)NHL、中級(jí)/濾泡性 NHL、中級(jí)彌漫性NHL、高級(jí)成免疫細(xì)胞性NHL、高級(jí)成淋巴細(xì)胞性NHL、高級(jí)小無核裂細(xì)胞性NHL、貯積病(bulky disease)NHL、套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏 (Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細(xì)胞性白血病 (ALL)、毛細(xì)胞性白血病、慢性成髓細(xì)胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及與瘢痣病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦瘤有關(guān)的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關(guān)的異常血管增殖。術(shù)語(yǔ)“抗腫瘤組合物”或“抗癌組合物”或“抗癌劑”指可用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種活性治療劑，例如“抗癌劑”。治療劑(抗癌劑)的例子包括但不限于例如化療劑、生長(zhǎng)抑制劑、細(xì)胞毒劑、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發(fā)生劑、抗淋巴管發(fā)生劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑、和其它用于治療癌癥的藥劑諸如抗HER-2抗體、抗CD20 抗體、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑 (例如erlotinib(TarcevaTM)、血小板衍生生長(zhǎng)因子抑制劑(例如GleevecTM (Imatinib Mesylate) )、C0X-2抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib))、干擾素、細(xì)胞因子、能與ErbB2、 ErbB3、ErbB4、PDGFR-β ,BlyS,APRIL,BCMA, VEGF 或 VEGF 受體中的一種或多種靴物結(jié)合的拮抗劑(例如中和性抗體)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有機(jī)化學(xué)劑等。本發(fā)明還包括它們的組合?！把馨l(fā)生因子”或“血管發(fā)生劑”指涉及刺激血管發(fā)育，例如促進(jìn)血管發(fā)生 (angiogenesis)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、血管穩(wěn)定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長(zhǎng)因子或其受體。例如，血管發(fā)生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成員及其受體(VEGF-B、VEGF-C, VEGF-D, VEGFRU VEGFR2 和 VEGFR3)、PlGF, PDGF 家族、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGF)、TIE配體(血管生成素、ANGPTU ANGPT2)、TIEU TIE2、印hrin、 Bv8、德爾塔樣配體4 (DLL4)、Del-I、酸性(aFGF)和堿性(bFGF)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、FGF4、FGF9、BMP9、BMP10、卵泡抑素(Follistatin)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、 GM-CS F,肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8 (IL_8)、CXCL12、L印tin、 Midkine、神經(jīng)氈蛋白(neuropil in), NRPU NRP2,胎盤生長(zhǎng)因子、血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子尤其是PDGF-BB、PDGFR- α、或PDGFR- β、 Pleiotrophin(PTN)、Progranulin, Proliferin、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α (TGF- α )、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- β (TGF-β )、腫瘤壞死因子- α (TNF-α )、Alkl、CXCR4、Notchl、Notch4、Sema3A、 Sema3C, Sema3F, Robo4等。它會(huì)進(jìn)一步包括促進(jìn)血管發(fā)生的因子，諸如ESMl和Perlecan。 它還包括加速傷口愈合的因子，諸如生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)、VIGF、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、EGF 樣域多重 7 (EGF-like domain, multiple 7，EGFL7)、CTGF 及其家族的成員、及 TGF-α 禾 Π TGF-β。參見例如 Klagsbrun and D' Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53217-39；Streit and Detmar(2003)Oncogene 223172-3179；Ferrara&Alital ο(1999)Nature Medicine5(12):1359-1364;Tonini ^ (2003)Oncogene 22:6549-6556 (例如列舉已知血管發(fā)生因子的表 1) ； Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200—206。
術(shù)語(yǔ)“VEGF”在用于本文時(shí)指165個(gè)氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子及相關(guān)的121個(gè)、189個(gè)和206個(gè)氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如Leung等(1989) Science 246:1306和Houck等(1991)Mol. Endocrin, 5 1806所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。術(shù)語(yǔ)“VEGF”還指來自非人物種諸如小鼠、大鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物的VEGF。有時(shí)，來自特定物種的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。術(shù)語(yǔ)“VEGF”還用于指包含165個(gè)氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申請(qǐng)中可能通過例如“VEGF(8-109) ”、“VEGF(1-109)”或"VEGF165”來鑒別任何此類形式VEGF?！敖囟痰摹碧烊籚EGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示編號(hào)。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當(dāng)?shù)膶?duì)KDR和Flt-I受體的結(jié)合親和力。依照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述VEGF是人VEGF?！癡EGF拮抗齊『指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性，包括其與 VEGF或一種或多種VEGF受體或編碼它們的核酸結(jié)合的分子。優(yōu)選的是，所述VEGF拮抗劑結(jié)合VEGF或VEGF受體。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段、結(jié)合VEGF和VEGF 受體并阻斷配體-受體相互作用的多肽(例如免疫粘附素、肽體)、抗VEGF受體抗體和VEGF 受體拮抗劑諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑、結(jié)合VEGF的適體和在嚴(yán)格條件下與編碼VEGF或VEGF受體雜交的核酸(例如RNAi )。依照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述VEGF拮抗劑結(jié)合VEGF并抑制VEGF誘導(dǎo)的體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖。依照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述VEGF拮抗劑以大于非VEGF或非VEGF受體的親和力結(jié)合VEGF或VEGF受體。依照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述VEGF拮抗劑以介于IuM和IpM之間的Kd結(jié)合VEGF或VEGF受體。依照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述VEGF拮抗劑以介于500nM和IpM之間的Kd結(jié)合VEGF或VEGF受體。依照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述VEGF拮抗劑選自多肽諸如抗體、肽體、免疫粘附素、小分子或適體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是抗VEGF抗體(諸如AVASTIN 抗體)或抗VEGF受體抗體(諸如抗VEGFR2或抗VEGFR3抗體)。VEGF拮抗劑的其它例子包括VEGF-Trap、Mucagen, PTK787、SUl 1248、AG-013736、Bay 439006 (sorafenib)、 ZD-6474、CP632、CP-547632、AZD-2171、CDP-171、SU-14813、CHIR-258、AEE-788、SB786034、 BAY579352、CDP-791、EG-3306、GW-786034、RWJ-417975/CT6758 和 KRN-633?！翱筕EGF抗體”指以足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF的抗體。優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗VEGF抗體可在靶向和干預(yù)其中牽涉VEGF活性的疾病或疾患時(shí)用作治療劑?？筕EGF抗體通常不會(huì)結(jié)合其它VEGF同系物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會(huì)結(jié)合其它生長(zhǎng)因子，諸如 P1GF、PDGF或bFGF。一種優(yōu)選的抗VEGF抗體是與雜交瘤ATCC HB 10709所生成的單克隆抗VEGF抗體A4. 6. 1結(jié)合相同表位的單克隆抗體。更優(yōu)選的是，抗VEGF抗體是依照I^resta 等，Cancer Res. 57 4593-4599 (1997)生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體，包括但不限于稱為bevacizumab (貝伐單抗；BV ； Avastill⑧)的抗體。依照另一個(gè)實(shí)施方案，可以使用的抗VEGF抗體包括但不限于WO 2005/012359中披露的抗體。依照一個(gè)實(shí)施方案，所述抗 VEGF抗體包含WO 2005/012359的圖M、25J6、27和四中披露的任一抗體(例如G6、G6-23、 G6-3UG6-23. 1、G6-23. 2、B20、B20-4和B20. 4. 1)的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，稱為ranibizumab的抗VEGF抗體是為了眼病諸如糖尿病神經(jīng)病變和 AMD而施用的VEGF拮抗劑。
抗VEGF 抗體“貝伐單抗”(bevacizumab，BV)，也稱為 “rhuMAb VEGF"或
"Avastin ”，是依照 Presta et al.，Cancer Res. 574593-4599 (1997)生成的重組人源
化抗VEGF單克隆抗體。它包含突變的人IgGl框架區(qū)和來自阻斷人VEGF結(jié)合其受體的鼠抗hVEGF單克隆抗體A4.6. 1的抗原結(jié)合互補(bǔ)決定區(qū)。貝伐單抗大約93%的氨基酸序列，包括大部分框架區(qū)，衍生自人IgGl，而大約7%的序列衍生自鼠抗體A4. 6. 1。貝伐單抗具有約 149，000道爾頓的分子量，而且是糖基化的。其它抗VEGF抗體包括美國(guó)專利No. 6884879和 W02005/044853中披露的抗體?？筕EGF抗體Ranibizumab或Lucentis 抗體或rhuFab V2是人源化的、親和力成熟的抗人VEGF Fab片段。Ranibizumab是通過標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)在大腸桿菌表達(dá)載體和細(xì)菌發(fā)酵中生成的。Ranibizumab是未糖基化的且分子量為約48，000道爾頓。參見W098/45331 和 US20030190317。血管發(fā)生失調(diào)可導(dǎo)致異常血管發(fā)生，即疾病狀態(tài)中的或引起疾病狀態(tài)的新血管生長(zhǎng)過度、不足、或其它方面不當(dāng)(例如從醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)看不良的血管發(fā)生位置、時(shí)間或啟動(dòng))時(shí)， 即血管發(fā)生性病癥。過度的、不當(dāng)?shù)幕蚴Э氐难馨l(fā)生發(fā)生于有促成疾病狀態(tài)惡化或引起疾病狀態(tài)的新血管生長(zhǎng)時(shí)。新血管可供應(yīng)患病組織，破壞正常組織，而且，在癌癥的情況中， 新血管可容許腫瘤細(xì)胞逃入循環(huán)并停留在其它器官中(腫瘤轉(zhuǎn)移)。牽涉異常血管發(fā)生的疾病狀況(即血管發(fā)生性病癥)包括非腫瘤性的和腫瘤性的疾患，包括例如癌癥，尤其是血管化實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移瘤(包括結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌(尤其是小細(xì)胞肺癌)、腦癌(尤其是成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)或前列腺癌)、不想要的或異常的肥大、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、炎性腸病或IBD (克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結(jié)腸炎)銀屑病、銀屑病斑塊、結(jié)節(jié)病、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生、年齡相關(guān)黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成、虹膜前面的新血管形成(發(fā)紅)、眼新血管疾病、血管再狹窄、動(dòng)靜脈畸形(AVM)、腦脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格雷夫斯氏 (Graves)病)、慢性炎癥、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血癥、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、惡性肺積液 (malignant pulmonary effusion)、腦水腫(例如與急性中風(fēng)/閉合性頭部外傷/創(chuàng)傷有關(guān)的)、滑液炎癥、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨關(guān)節(jié)炎(OA)、頑固性腹水、多囊卵巢病、子宮內(nèi)膜異位癥、第三空間流體病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、間隔綜合征、燒傷、腸病)、子宮纖維瘤(uterine fibroids)、早產(chǎn)、慢性炎癥諸如IBD、腎同種異體移植物排斥、炎性腸病、腎病綜合征、不想要的或異常的組織塊生長(zhǎng)(非癌性的)、血友病性關(guān)節(jié)、肥厚性瘢痕、毛發(fā)生長(zhǎng)的抑制、奧-韋二氏(Osier-Weber)綜合征、膿性肉芽腫晶狀體后纖維組織增生、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液(諸如與心包炎有關(guān)的)和胸腔積液。在用于本文時(shí)，“治療”或“處理”指試圖改變所治療個(gè)體或細(xì)胞的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的期望效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、防止轉(zhuǎn)移、減緩疾病進(jìn)展的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善預(yù)后。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于延遲疾病或病癥的發(fā)生/發(fā)展?！坝行Я俊敝冈诒匦璧膭┝亢蜁r(shí)間上有效實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防效果的量。
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本發(fā)明的物質(zhì)/分子、拮抗劑或激動(dòng)劑的“治療有效量”可根據(jù)諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重及該物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拮抗劑在個(gè)體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量還指該物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拮抗劑的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果的量。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指在哺乳動(dòng)物(aka患者)中有效“治療”疾病或紊亂的本發(fā)明抗體、多肽、或拮抗劑的數(shù)量。在癌癥的情況中，藥物的治療有效量可減少癌細(xì)胞數(shù)；縮小腫瘤體積或重量；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周圍器官中； 抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度的抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或一定程度的減輕與癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀。就藥物可預(yù)防癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度而言，它可以是抑制細(xì)胞的和/或毒害細(xì)胞的。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量是生長(zhǎng)抑制量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量是延長(zhǎng)患者存活的量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量是改進(jìn)患者無進(jìn)展存活的量?！邦A(yù)防有效量”指在必需的劑量和時(shí)間上有效實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防效果的量。通常而非必然，由于預(yù)防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預(yù)防有效量低于治療有效量。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒劑”在用于本文時(shí)指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和Lu的放射性同位素；化療劑，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長(zhǎng)春花生物堿類(vinca alkaloids)(長(zhǎng)春新堿(vincristine)、長(zhǎng)春堿(vinblastine)、依托泊昔(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法倉(cāng)(melphalan)、絲裂霄素(mitomycin)C、 苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細(xì)胞毒劑。 殺腫瘤藥引起腫瘤細(xì)胞的破壞。“化療劑”指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylating agents)，諸如塞替派(thiot印a)和CYTOXAN 環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide)；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzod印a)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturecbpa)和烏瑞替派(ured印a)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)， 包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone) ) ； δ-9-四氫大
(tetrahydrocannabinol) (jffi i； ) (dronabinol), MARINOL, )；
β -拉帕醌(Iapachone)；拉帕醇(Iapachol)；秋水仙素類(colchicines)；白樺脂酸(betulinic acid)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康
(topotecan) ( HYCAMTIN )、CPT-11 (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR
)、乙酰喜樹堿、東莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin ；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8); 多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾槽塞 ^各素(eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin 5^^ (spongistatin)；氣芥類(nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、 膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride) > 美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas),諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、 福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)禾口雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車霉素 (calicheamicin)，尤其是加利車霉素Y II和加利車霉素ω Il (參見例如Agnew，Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994))；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括 dynemicin A ； 埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin), 氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin) > carabicin、洋紅霄素(carminomycin) ^^ ^ΜΜ (carzinophilin) 霉素(chromomycin)、方文線菌素D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星 (detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRI AM YCIN 多柔比星(doxorubicin) (包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素 (marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素 C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾拉霄素(nogalamycin)、撤攬霄素(olivomycin)、培洛霄素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素 (tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、 甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、 6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、 去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(印itiostanol)、美雄烷(m印itiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑， 諸如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone) ；elfornithine ； 依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡霉素(印othilone)；依托格魯(etoglucid)； 硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼達(dá)明(Ionidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)； 安絲菌素(ansamitocin)；米托月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol) ；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(Iosoxantrone) ；2-乙基酰胼 (ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine) ； PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；螺方 錯(cuò)(spirogermanium)；細(xì)交鏈 包菌麗酸(tenuazonic acid)；三亞月安酉昆(triaziquone)； 2,2'，2〃 -三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T_2毒素、疣孢菌素 (verrucarin)A、桿抱菌素(roridin) A 禾口蛇 亍菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春
地辛(vindesine) ( ELDISINF,⑧，F(xiàn)丨LDESIN );達(dá)卡巴嗪(dacartazine)；甘露醇氮
芥(mannomustine) ；二漠甘露酉享(mitobronitol) ；二漠衛(wèi)矛酉享(mitolactol)；喊泊漠燒 (pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) ("Ara_C，，)；塞替派(thiotepa)；
類紫杉醇(taxoids)，例如 TAXOL 紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb
Oncology, Princeton, N. J. )、ABRAXANE 不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的納米顆粒齊U 型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)禾口 TAXOTERE 多西他塞(doxetaxel) (Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France)；苯
丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine) ( GEMZAR ): 6-硫鳥嘌呤 (thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉬類似物，諸如順鉬(cisplatin)和卡鉬(carboplatin)；長(zhǎng)春堿(vinblastine) ( VELBAN )；鉬； 依托泊苷(etoposide) (VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)； 長(zhǎng)春新堿(vincristine) (ONCOVIN );奧沙禾Ij 鉬(oxaliplatin)；亞葉酸
(Ieucovorin)；長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine) ( NAVELBINE );能滅瘤(novantrone)；
依達(dá)曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000 ；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維A酸
(retinoids)，諸如維A酸(retinoic acid)；卡培他濱(capecitabine) ( XELODA );任
何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP (環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉬(EL0XATIN ) 聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。別的化療劑包括可用作抗體藥物偶聯(lián)物的細(xì)胞毒劑，諸如美登木生物堿(例如DMl)和auristatin (例如MMAE和MMAF)。
“化療劑”還包括作用為調(diào)節(jié)、降低、阻斷、或抑制可促進(jìn)癌生長(zhǎng)的激素效果的抗激素劑，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。實(shí)例包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、EV丨STA 雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone) 和FARESTON .托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮類；雌激素受體下調(diào)劑類(ERD)；功能為抑制或關(guān)閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動(dòng)劑，諸如LUPRON 和ELIGARD 醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)； 及抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、 氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、
AROMAS丨N 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、
RIVISOR 伏羅唑(vorozole)、FEMARA 來曲唑(letrozole)和 ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole)。另外，化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates)， 諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS 成OSTAC )、D1DROCAL 依替膦酸鈉(etidronate)、ΝΕ-58095、ΖΟΜΕΤΑ 唑來膦酸 / 唑來膦酸鹽(zoledronic acid/ zoledronate)、FOSAMAX 阿倫膦酸鹽(alendronate)、AREDIA 帕米膦酸鹽 (pamidronate)、SKELID 替魯膦酸鹽(tiludronate)或 ACTON EL 利塞膦酸鹽 (risedronate)；以及曲沙他濱(troxacitabine) (1，3_ 二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物);反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉粘著細(xì)胞增殖的信號(hào)途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如I3KC-α、Raf, H-Ras和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE 疫苗
和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗； LURTOTECAN 拓?fù)洚悩?gòu)酶 1 抑制劑；ABARELIX rmRH ；lapatinib ditosylate (ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016);及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。 “生長(zhǎng)抑制劑”在用于本文時(shí)指抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖的化合物或組合物。生長(zhǎng)抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春藥類(vincas)(長(zhǎng)春新堿(vincristine) 和長(zhǎng)春堿(vinblastine))、紫杉烷類(taxanes)、和拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑諸如蒽環(huán)類抗生素多柔比星(doxorubicin) ( (8S-順式)-10- [ (3-氨基-2，3，6-三脫氧-α -L-來蘇-吡喃己糖基)氧基]_7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-8-(羥基乙?；?-1-甲氧基-5,12-蔡二 Sf,艮口 (8S-cis)-10-[(3-amino-2, 3, 6-trideoxy-α -L-lyxo-hexapyrano syl)oxy]_7，8, 9, 10-tetrahydro-6, 8, 1l-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-l-methoxy-5 ,12-naphthacenedione)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霄素(daunorubicin)、依托泊昔 (etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯，例如 DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達(dá)卡巴嗪(dacartazine)、 雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿啼唆(5-fluorouracil)禾口 ara—C。更多信息可參見〈〈The Molecular Basis of Cancer)), Mendelsohn 禾口 Israel 編，第 1 章，題 ^J "Cell cycle regulation, oncogenes, andantieioplastic drugs", Murakaini 等X，WB Saunders, Philadelphia, 1995, jt^jkWi 13頁(yè)。紫杉烷類(紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE , Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇 (TAXOL , Bristol-Myers Squibb)的半合成類似物。紫杉醇和多西他賽促進(jìn)由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過防止解聚使微管穩(wěn)定，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞中有絲分裂的抑制。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“患者”指想要治療的任何單一動(dòng)物，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物(包括非人動(dòng)物，諸如例如犬、貓、馬、家兔、動(dòng)物園動(dòng)物、牛、豬、綿羊、和非人靈長(zhǎng)類)。最優(yōu)選的是，本文中的患者是人。“受試者”在本文中指任何單一人類受試者，包括適于接受治療的患者，他正經(jīng)受或者已經(jīng)經(jīng)受血管發(fā)生性病癥的一種或多種體征、癥狀、或其它指標(biāo)。意圖包括作為受試者的是參與臨床研究試驗(yàn)且未顯示疾病的任何臨床體征的任何受試者，或參與流行病學(xué)研究的受試者，或曾經(jīng)用作對(duì)照的受試者。所述受試者可以先前用抗癌劑治療過，或者沒有這樣治療過。受試者可以是在開始本文中的治療時(shí)未用過所用第二藥物的，即該受試者在“基線”(即在本文中治療方法中施用第一劑抗癌劑之前的一個(gè)設(shè)定點(diǎn)，諸如開始治療之前篩選受試者的日子)時(shí)可以沒有用例如抗腫瘤劑、化療劑、生長(zhǎng)抑制劑、細(xì)胞毒劑治療過。這樣的 “未接觸(藥物)”受試者一般認(rèn)為是用所述第二藥物進(jìn)行治療的候選人。術(shù)語(yǔ)“有效量”指藥物有效治療血管發(fā)生性病癥或淋巴管發(fā)生性病癥(包括例如癌癥)的量。術(shù)語(yǔ)“藥物配制劑”指其形式容許藥物的生物學(xué)活性是有效的，且不含對(duì)會(huì)施用該配制劑的受試者產(chǎn)生不可接受的毒性的別的成分的無菌制備物?！盁o菌”配制劑是無菌的或不含所有活的微生物及其孢子?！鞍b插頁(yè)”用于指通常包括在治療用產(chǎn)品或藥物的商業(yè)包裝中的說明書，它們包含有關(guān)涉及此類治療用產(chǎn)品或藥物應(yīng)用的適應(yīng)征、用法、劑量、施用、禁忌癥、與該包裝產(chǎn)品聯(lián)合的其它治療用產(chǎn)品和/或警告等的信息?！霸噭┖小敝赴辽僖环N試劑(例如用于治療血管發(fā)生性病癥的藥物，或用于特異性檢測(cè)本發(fā)明的生物標(biāo)志物基因或蛋白的探針)的任何制品(例如包裝或容器)。所述制品優(yōu)選以用于實(shí)施本發(fā)明方法的單位來宣傳、分發(fā)、或銷售。就對(duì)藥物沒有響應(yīng)而言，因先前的或當(dāng)前的一種或多種藥物的治療而經(jīng)歷“臨床上不可接受的高水平毒性”的受試者經(jīng)歷一種或多種與該藥物有關(guān)的、有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)師認(rèn)為是重大的負(fù)面副作用或不良事件，諸如例如嚴(yán)重感染、充血性心力衰竭、脫髓鞘(引起多發(fā)性硬化)、顯著的超敏感性、神經(jīng)病理性事件、高度的自身免疫、癌癥(諸如子宮內(nèi)膜癌、 非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、或黑素瘤)、結(jié)核病(TB)、等?！敖档拓?fù)面副作用的風(fēng)險(xiǎn)”指將源自本文中拮抗劑治療的副作用的風(fēng)險(xiǎn)降低至比源自用先前施用的藥物治療同一患者或另一患者所觀察到的風(fēng)險(xiǎn)要低的程度。此類副作用包括上文關(guān)于毒性所列出的副作用，而且優(yōu)選是感染、癌癥、心力衰竭、或脫髓鞘?！瓣P(guān)聯(lián)”或“聯(lián)系”指以任何方式將第一分析或方案的性能和/或結(jié)果與第二分析或方案的性能和/或結(jié)果進(jìn)行比較。例如，可以將第一分析或方案的結(jié)果用于實(shí)施第二分析或方案，和/或，可以使用第一分析或方案的結(jié)果來決定是否應(yīng)當(dāng)實(shí)施第二分析或方案。 就本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案而言，可以使用分析性測(cè)定法的結(jié)果來決定是否應(yīng)當(dāng)實(shí)施使用抗癌劑，諸如抗VEGF抗體的特定治療方案。III.方法本發(fā)明提供用于鑒定有可能響應(yīng)抗癌劑的患者的方法、用于監(jiān)測(cè)抗癌療法的有效性的方法、用于鑒定經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的可能性升高的患者的方法、和用于優(yōu)化抗癌劑劑量的方法。 該等方法包括將成像劑施用于患者，(a)將成像劑施用于已經(jīng)接受至少一劑抗癌劑的患者； (b)檢測(cè)該患者中與腫瘤引流淋巴結(jié)有關(guān)的淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率；并(C)將該淋巴搏動(dòng)頻率與該抗癌劑處理前該淋巴管中的搏動(dòng)頻率比較。淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率降低至少約10%鑒定出響應(yīng)抗癌劑的可能性升高的患者。淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率升高至少約10% 鑒定出經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的可能性升高的患者。淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率有變化鑒定出該劑量為有效劑量。淋巴管中的淋巴搏動(dòng)頻率無變化鑒定出該劑量為最大有效劑量。在一些實(shí)施方案中，該等方法進(jìn)一步包括將有效量的該抗癌劑施用于該患者。在一些實(shí)施方案中，該等方法進(jìn)一步包括將有效量的第二、第三、或第四抗癌劑施用于該患者。A.成像方法所公開的方法和測(cè)定法提供方便、有效、且潛在劃算的手段來獲得數(shù)據(jù)和信息，該數(shù)據(jù)和信息可用于通過檢測(cè)淋巴功能(例如淋巴搏動(dòng)頻率或大量淋巴轉(zhuǎn)運(yùn))來評(píng)估用于治療患者的適宜或有效療法。該等方法可以使用多種成像劑和裝置來進(jìn)行。合適的檢測(cè)方法和裝置記載于例如 Sharma et al. , Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 292:H3109_3118 (2007) ； Sharma et al. , Ann. N. Y. Acad. Sci. 1131:13-36 (2008), Rasmussen et al. , Curr. Opin. Biotech. 20:74-78^009)及 PCT
發(fā)明者A·D·巴格里, A·戈吉內(nèi)尼, M·考恩特, N·范布魯根, R·韋默 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司