5.9kDa肽的免疫學測定方法

專利名稱：5.9kDa肽的免疫學測定方法
5.9kDa肽的免疫學測定方法
技術領域：
本發明涉及用于從待測樣品檢測通過蛋白質組解析發現可作為肝臟疾病用肽標記物利用的，人纖維蛋白原α-E鏈、或者，是人纖維蛋白原α鏈的分解產物，有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的分子量5，900的肽(以下，稱之為5. 9kDa肽)、或者，定量待測樣品中的5. 9kDa肽濃度的免疫學測定方法、及，免疫學測定用試劑盒。另外，本發明涉及5. 9kDa肽的免疫學測定方法中使用的，識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體及識別C末端區域的抗體。
背景技術：
近年，在世界規模進行一并的蛋白質組解析，也廣泛進行使用蛋白質組解析的疾病標記物的探索(專利文獻1 2、非專利文獻1 幻。在蛋白質組解析中，一般而言，各自分離作為活體來源樣品中包含的蛋白質或其分解產物的肽，用質譜分析裝置解析分離的蛋白質或肽的氨基酸序列，核對得到的氨基酸序列和數據庫中的氨基酸序列，由此鑒定樣品中包含的蛋白質或肽。由于根據疾病的有無而在活體內表達的蛋白質不同，通過蛋白質組解析而有可將發現疾病特異性地表達量增減的蛋白質或肽作為其疾病標記物利用的可能性。通過蛋白質組解析，本發明人從在以戒酒目的住院的酒精依賴癥患者中經時采集的血清待測樣品，作為伴隨習慣飲酒而增減的新穎的血清肽之一鑒定了 5. 9kDa肽，發現可將這作為肝臟疾病診斷標記物利用(專利文獻1、非專利文獻1-2)。另外，本發明人發現，使用由M個殘基組成的5. 9kDa肽的全長肽作為抗原而得到的兩種類的單克隆抗體，使單離的5. 9kDa肽的免疫學測定成為可能(專利文獻1)。現有技術文獻專利文獻專利文獻1 國際公開第2004/058966號專利文獻2 國際公開第2004/090550號非專利文獻非專利文獻 1 Nomura, F. et al.，Proteomics，4，1187-1194，2004非專利文獻 2 =Nomura, F. et al.，J. Chromatogr. B.，855，35-41，2007非專利文獻3 :Hanash，S. M. et al.，Nature，452，571-579，2008

發明內容發明要解決的技術課題至今，使用蛋白質組解析報告了幾種臨床上有用的肽。但是，在本發明人所知的范圍內幾乎未見到使用在臨床診斷的領域廣泛一般地使用的免疫學的檢測方法而定量測定這些的疾病標記物候選肽的報告。此免疫學測定方法的確立困難的點妨礙通過蛋白質組解析發現的肽標記物的普及。
作為免疫學測定方法的確立困難的原因，第一，可舉出對肽的特異性抗體的制備困難。第二，可舉出通過蛋白質組解析發現的肽也多為活體來源樣品中存在的成熟的蛋白質的分解產物，包含作為目的的肽的序列的目的肽以外的多種分解產物混在于樣品中。這時，即便將作為目的的肽作為免疫原制出抗體，也發生與混在的分解產物的非特異性的反應，無法正確地定量分析目的肽。特別是，通過分解作為本發明的測定對象的5. 9kDa肽而產生的人纖維蛋白原是與凝固-纖溶系統無關的蛋白質，活體內大量存在其分解物。具體而言，纖維蛋白原在凝固系統中被凝血酶分解而產生纖維蛋白單體。在纖溶系統中，由于由纖維蛋白單體構成的纖維蛋白聚合物由纖溶酶在多個部位被分解，必然產生多個纖維蛋白原分解產物。例如，根據數據庫卩印1:土(16八1:188 011^口//\￥ ^· peptideatlas. org/)中的 buildHuman Plasma PeptideAtlas 2009-05，作為人纖維蛋白原α-E鏈(數據庫內蛋白質名ENSP00000306361)的分解產物觀測到239種的肽。如前所述，本發明人成功進行了，對將由M個殘基組成的5. 9kDa肽的全長肽作為抗原的5. 9kDa肽的兩種類的單克隆抗體的制成、及，單離的5. 9kDa肽的免疫學測定(專利文獻1)。但是，即便使用這些單克隆抗體，在充分地正確地測定有包含多個人纖維蛋白原分解產物的可能性的待測樣品中的5. 9kDa肽的定量中也有再改良的余地。鑒于此實狀，本發明的課題在于提供從有包含多個人纖維蛋白原α -E鏈/α鏈分解產物的可能性的待測樣品特異性地檢測5. 9kDa肽而定量的免疫學測定方法。而且，本發明的課題旨在提供用于在該免疫學測定方法中使用的試劑盒以及該免疫學測定方法及該試劑盒中使用的識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體及識別C末端區域的抗體。解決課題的技術方案已知2種含5. 9kDa肽的氨基酸序列的纖維蛋白原鏈。即為，人纖維蛋白原α-E鏈(以下，也稱之為F α-E鏈)和人纖維蛋白原α鏈(以下，也稱之為F α鏈)。F α-E鏈和Fa鏈以5. 9kDa肽的序列作為基準，N末端側上游區域的氨基酸序列完全地一致，但C末端側下游區域的氨基酸序列不同。Fa-E鏈和Fa鏈的分解產物，如前所述，除了 5. 9kDa以外，在血液樣品中存在至少200種以上的混雜肽。因此，本發明人當初制備了有Fa -E鏈和F α鏈中的幾個氨基酸序列的多種肽作為抗原的多種抗體，在它們之中將以5. 9kDa肽的序列的最近傍區域作為抗原的抗體作為混雜肽除去用抗體，將其余作為5. 9kDa肽測定用抗體使用，嘗試了測定5. 9kDa肽。S卩，在使用多種混雜肽除去用抗體除去混雜肽的操作之后，嘗試了使用5. 9kDa肽測定用抗體測定樣品中的5. 9kDa肽。具體而言，為了制成混雜肽除去用抗體而使用的抗原肽作為(al)F α -E鏈或F α鏈中的5. 9kDa肽的N末端側上游區域7個的氨基酸序列(氨基酸序列EFPSRGK)、(a2)識別Fa -E鏈中的5. 9kDa肽區域的C末端側下游區域的13個的氨基酸序列(氨基酸序列RDCDDVLQTHPSG)的抗體、及，(a3)Fa鏈中的5. 9kDa肽區域的C末端側下游區域13個的氨基酸序列(氨基酸序列RGIHTSPLGKPSL)。另外，作為5. 9kDa肽測定用抗體，最終，以使用(bl)識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體、( )識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體為良好。但是，令人驚訝地，本發明人發現，不經前述的混雜肽的除去操作，通過僅免疫學測定使5. 9kDa肽與識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體和識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體接觸而得到的5. 9kDa肽和兩種抗體的免疫復合物，盡管通過通常的蛋白印跡法在待測樣品中檢測到這兩種抗體結合的混雜肽，但也不受要通過前述的混雜肽除去操作除去的混雜肽的影響，可從有含多種人纖維蛋白原α-E鏈/α鏈分解產物的可能性的待測樣品基本上僅測定5. 9kDa肽，從而完成本發明。從而，本發明涉及接下來舉的待測樣品中的5. 9kDa肽的免疫學測定方法、免疫學測定用試劑盒及它們中使用的抗體。[1] 5. 9kDa肽的免疫學測定方法，其特征在于，使識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體或其抗體片段，以及識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體或其抗體片段與待測樣品中的有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的分子量5，900的肽(5. 9kDa肽)接觸而生成5. 9kDa肽和該2種抗體或它們的抗體片段的免疫復合物，以及測定得到的免疫復合物。[2]上述[1]所述的免疫學測定方法，其中，識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體是識別在5. 9kDa肽的從N末端起第1 39的氨基酸區域中存在的任何表位的抗體，識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體是識別在5. 9kDa肽的從N末端起第18 M的氨基酸區域中存在、并且相比識別上述N末端區域的抗體所識別的表位位于更C末端側的任何表位的抗體，這2種抗體所識別的表位不互相重復，并且，這2種抗體不互相妨礙與5. 9kDa肽的結合。[3]上述[1]或[2]所述的免疫學測定方法，其中識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體是識別在5. 9kDa肽的從N末端起第1 17的氨基酸區域中存在的表位的抗體。[4]上述[1] [3]之任一項所述的免疫學測定方法，其中識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體是識別在5. 9kDa肽的從N末端起第40 M的氨基酸區域中存在的表位的抗體。[5]上述[1] [4]之任一項所述的免疫學測定方法，其中通過夾心ELISA法測定免疫復合物。[6]上述[1] [4]之任一項所述的免疫學測定方法，其中通過乳膠免疫凝集測定法測定免疫復合物。[7]上述[1] [6]之任一項所述的免疫學測定方法，其中待測樣品是全血、血清、血漿、尿、唾液、腦脊髓液、胸水、腹水、心囊水、關節液、或者，淋巴液，且有包含5.9kDa肽的可能性。[8] 5. 9kDa肽的免疫學測定用試劑盒，其包含識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體或其抗體片段、和識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體或其抗體片段。[9]上述[8]所述的免疫學測定用試劑盒，其包含識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體或其抗體片段、和識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體或其抗體片段，
任何一方的抗體或其抗體片段是被標記的標記抗體或標記抗體片段，另一方的抗體或其抗體片段是結合到固相的固相結合抗體或固相結合抗體片段，且用于由夾心ELISA法的測定5. 9kDa肽。[10]上述[8]所述的免疫學測定用試劑盒，其包含致敏不溶性載體粒子的識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體或其抗體片段，和致敏不溶性載體粒子的識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體或其抗體片段，且用于由乳膠免疫凝集測定法的測定5. 9kDa肽。[11]上述[10]所述的免疫學測定用試劑盒，其含用識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體或其抗體片段，以及識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體或其抗體片段的2種抗體或它們的抗體片段的兩方致敏1個不溶性載體粒子而得到的1種不溶性載體粒子；用該2種抗體或它們的抗體片段分別致敏不同的不溶性載體粒子而得到的2種不溶性載體粒子；或者，這3種不溶性載體粒子的混合物。[12]抗體或其抗體片段，其識別5.9kDa肽的從N末端起第1 17的氨基酸區域中存在的表位。[13]抗體或其抗體片段，其識別5. 9kDa肽的從N末端起第40 M的氨基酸區域中存在的表位。發明效果通過本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法，從有含多種混雜肽的可能性的待測樣品，可簡便并且正確地特異性地測定5. 9kDa肽。雖然使用質譜分析裝置的5. QkDa肽的定量測定也可能，通過使用更簡便地有同等的精度，并且，通量高的本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法，定量作為肝臟疾病診斷用肽標記物的5. 9kDa肽，使容易地進行習慣飲酒者或問題飲酒者發癥肝臟疾病的可能性或，飲酒以外的原因的肝臟疾病、例如，肝炎、肝硬變、或者，脂肪肝的診斷變得可能。

圖1是示使用實施例2中制成的，作為第一抗體使用抗-5.9C，作為第二抗體使用抗-5. 9N的本發明的夾心ELISA測定系統，和比較例1中制成的，作為第一抗體使用抗-5. 9W1，作為第二抗體使用抗-5. 9W2的夾心ELISA測定系統，測定血清中的5. 9kDa肽濃度之時的標準曲線的圖。縱軸表示在波長450nm處的吸光度，橫軸表示將樣品1/333稀釋之前的5. 9kDa肽濃度(μ g/ml)。圖2是示將同一血清樣品中的5.9kDa肽濃度用本發明的ELISA測定定量的結果與使用SI-MS法定量的結果的相關的圖。縱軸表示用本發明的ELISA測定測定的5. 9kDa肽濃度(μ g/ml)、橫軸表示通過SI-MS法算出的5. 9kDa肽濃度(μ g/ml)。白色圓點表示從健康者得到的血清8個待測樣品、黑色圓點表示從酒精依賴癥患者得到的血清8個待測樣品。
圖3是示將同一血清樣品中的5.9kDa肽濃度用本發明的乳膠免疫凝集測定(LATEX測定)定量的結果與通過本發明的ELISA測定定量的結果的相關的圖。縱軸表示通過本發明的LATEX測定測定的5. 9kDa肽濃度(μ g/ml)、橫軸表示通過本發明的ELISA測定測定的5. 9kDa肽濃度(μ g/ml)。實施方式通過本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒測定的5. 9kDa肽是有SEQ ID NO :1所示的由討個氨基酸殘基組成的氨基酸序列，其理論分子量是5904. 2的肽。該肽在人纖維蛋白原α-E鏈及人纖維蛋白原α鏈的從N末端起第576 629的氨基酸區域中存在，通過人纖維蛋白原α-E鏈及人纖維蛋白原α鏈分解而產生。通過本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒測定的5. 9kDa肽是伴隨習慣飲酒等的要因而從活體來源樣品的檢測量減少的肝臟疾病診斷用肽標記物。成為本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法的對象的待測樣品而言，只要是有包含5. 9kDa肽的可能性的活體來源樣品就不特別限制，可舉出各種體液或細胞組織提取液等，從作為5. 9kD的臨床標記物的功能及樣品采集的簡便性的觀點，優選從疑似患肝臟疾病的患者采集的體液。其中，體液而言，可舉出全血、血清、血漿、尿、唾液、淋巴液、腦脊髓液、或者，含腹水-胸水-心囊水-關節液的穿刺液等，在其中也是，特別優選含有凝固纖溶系統中涉及的纖維蛋白原及纖維蛋白，和含由這些產生的5. 9kDa肽的多種的分解產物的可能性高的血液來源樣品、即，全血、血漿、血清。尤其是，由本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法測定的待測樣品而言，適宜是從疑似患肝臟疾病的患者采集的血清。本發明的5. 9kD肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體及識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體是，可在5. 9kDa肽中存在的幾個表位之中，識別不互相重復的表位，并且，不互相妨礙與5. 9kDa肽的結合的抗體。其中，本發明中使用的識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體所識別的表位相比本發明中使用的識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體所識別的表位存在于更N末端側。其中，本發明的5. 9kDa肽免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體及識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體只要是可進行對于5. 9kDa肽特異性的免疫學測定，則是單克隆抗體也可，是多克隆抗體也可。另外，該抗體的同種型不特別限定，例如，可舉出IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM的同種型的抗體，從抗體純化的容易度的觀點來看，優選IgG型的抗體。然后，對于用于得到該抗體的制備方法-產生生物也不特別限定，例如，可舉出使用小鼠來源雜交瘤細胞株的該抗體的制備。關于本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體及識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體，表位通常是指，由6 11個左右的氨基酸殘基組成的抗原的分子表面中存在的氨基酸區域，抗體所識別而結合的抗原的特定的結構單位。通常、1個抗原有多個表位。關于本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體及識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體，2種抗體不互相妨礙與5. 9kDa肽的結合是指，例如，另一方的抗體識別5. 9kDa肽中的表位而結合之時，其抗體將另一方的抗體所識別的表位的全部或一部分立體覆蓋而抑制另一方的抗體的表位識別，或者，另一方的抗體識別表位而結合之時通過2個抗體接觸等的實施方式，無另一方的抗體的向5. QkDa肽的結合被另一方的抗體的結合阻礙。其中，為了使識別抗原中的不重復的表位的抗體不妨礙互相與一方的抗原的結合，2個不重復的表位要有的間隔，依賴于抗原可取的立體結構，但優選為在2個表位間存在6個殘基以上的氨基酸區域、更優選為20個殘基以上的氨基酸區域，再者優選為在2個表位間的氨基酸區域中含取β轉角結構的氨基酸區域。通過在2個表位間存在某種程度的間隔，2種抗體互相成立體障礙的可能性減少。再者，通過在不重復的2個表位間存在由4個氨基酸殘基形成的肽鏈急劇地轉折的β轉角結構，識別各自的表位的抗體互相接觸的可能性減少。實施例中詳述，通過確認表位存在于SEQ ID NO 1所示的5. ^cDa肽的氨基酸序列的從N末端起第1 17或第40 M的氨基酸區域，本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體優選為識別SEQ IDNO :1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的從N末端起第1 39的氨基酸區域中存在的任何表位的抗體，更優選為識別SEQ ID NO :1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的從N末端起第1 17的氨基酸區域中存在的表位的抗體。另一方面，本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體，優選為識別在SEQ ID NO 1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的從N末端起第18 M的氨基酸區域中存在的任何中存在，并且，相比上述識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體所識別的表位位于更C末端側的表位的抗體，更優選為識別在SEQ ID NO 1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的從N末端起第40 M的氨基酸區域中存在的表位的抗體。本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的識別5. 9kDa肽的從N末端起第1 17或第40 M的氨基酸區域中存在的表位的抗體而言，可舉出將含SEQ ID NO 1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的從N末端起第1 17或第40 M的氨基酸序列的肽、或者，該氨基酸序列中有1到數個氨基酸的選自缺失、取代、附加或插入的至少1種的變異，并且，有含該氨基酸序列的連續的90%以上的氨基酸序列的肽作為抗原而得到的抗體、或者，將作為該抗原的肽和載體結合而得到的復合物作為免疫原而得到的抗體。其中，作為抗原的肽，例如，可使用公知的肽合成技術化學合成而得到。另外，上述載體而言，可使用作為匙孔青貝的血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、雞血清白蛋白、聚-L-賴氨酸、聚丙氨酰賴氨酸、二棕櫚基賴氨酸、破傷風類病毒或多糖類等的載體而公知的載體。其中，使載體和作為抗原的肽結合的方法而言，可舉出例如，作為抗原的肽中包含的，或者，利用人工地導入作為抗原的肽的Cys殘基的SH基而使載體和作為抗原的肽結合的MBS (馬來酰亞胺苯甲酰氧基琥珀酸亞胺)法。本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的識別5. 9kDa肽的從N末端起第1 17及第40 M的氨基酸區域中存在的表位的抗體是單克隆抗體也可，是多克隆抗體也可。作為本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的識別5. 9kDa肽的從N末端起第1 17的氨基酸區域中存在的表位的抗體，可舉出，優選為，將在含SEQ ID NO :1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的從N末端起第1 17的氨基酸序列的抗原肽的N末端或C末端導入為了使抗原肽和上述載體結合而使用的Cys殘基的肽和上述載體的復合物作為免疫原而得到的抗體、更優選為，將在其抗原肽的C末端導入為了使抗原肽和載體結合而使用的Cys殘基的肽、即有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的肽和作為載體的KLH的復合物作為免疫原而得到的抗體、特別是優選為，由本發明人建立的雜交瘤5. 9N-06(國際保藏號NITEBP-797)產生的單克隆抗體。另一方面，作為本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的識別5. 9kDa肽的從N末端起第40 M的氨基酸區域中存在的表位的抗體，可舉出，優選為，將在含SEQ ID N0:1所示的5.9kDa肽的氨基酸序列的從N末端起第40 M的氨基酸序列的抗原肽的N末端或C末端導入為了使抗原肽和上述載體結合而使用的Cys殘基的肽和上述載體的復合物作為免疫原而得到的抗體、更優選為，將在其抗原肽的N末端導入為了使抗原肽和載體結合而使用的Cys殘基的肽、即有SEQ IDNO 3所示的氨基酸序列的肽和作為載體的KLH的復合物作為免疫原而得到的抗體、特別是優選為，由本發明人建立的雜交瘤5. 9C-02(國際保藏號NITEBP-798)產生的單克隆抗體。在本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中，只要可識別各自的抗體所識別的表位，可同樣地使用識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體的抗體片段、及，識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體的抗體片段。另外，對于本發明中提供的識別5. 9kDa肽的從N末端起第1 17的氨基酸區域中存在的表位的抗體或識別5. 9kDa肽的從N末端起第40 M的氨基酸區域中存在的表位的抗體，只要可識別各自的抗體所識別的表位，也同樣地提供它們的抗體片段。這些的抗體片段而言，不特別限定。具體而言，可舉出Fab、Fab，、F(ab，)2、scFv、Diabody、dSFV、含互補決定區域(以下，也稱之為OTR)的肽。Fab是在將IgG型抗體用蛋白質分解酶木瓜蛋白酶處理而得到的片段之中，H鏈的N末端側約一半和L鏈全體通過二硫(S-S)鍵結合的分子量約5萬Da的有對抗原的特異性結合能力的抗體片段。在本發明中，Fab，例如，可將本發明中提供的識別5.9kDa肽的從N末端起第1 17的氨基酸區域中存在的表位的抗體或識別5. 9kDa肽的從N末端起第40 M的氨基酸區域中存在的表位的抗體用蛋白質分解酶木瓜蛋白酶處理而得到。F(ab' )2是在將IgG型抗體用蛋白質分解酶胃蛋白酶處理而得到的片段之中，相比Fab經鉸鏈區域的S-S鍵結合的略大的，分子量約10萬Da的有對抗原的特異性結合能力的抗體片段。在本發明中，F(ab' )2，例如，可將本發明中提供的識別5.9kDa肽的從N末端起第1 17的氨基酸區域中存在的表位的抗體或識別5. 9kDa肽的從N末端起第40 54的氨基酸區域中存在的表位的抗體用蛋白質分解酶胃蛋白酶處理而得到。或者，可通過將下述的Fab’硫醚鍵合或S-S鍵合而制成。Fab，是切斷上述F(ab，)2的鉸鏈區域的S-S鍵的分子量約5萬Da的有對抗原的特異性結合能力的抗體片段。在本發明中，可將F (ab’)2用還原劑二硫蘇糖醇處理而得到。scFv是將1條H鏈可變區域(VH)和1條L鏈可變區域(VL)用12個殘基以上的適當的肽接頭⑵連結的VH-P-VL乃至VL-P-VH多肽，且有對抗原的特異性結合能力的抗體片段。
雙抗體是抗原結合特異性的相同或不同的scFv形成2聚體的抗體片段，對相同的抗原有高于scFV的反應性的，或者，對不同的抗原有同樣的特異性結合能力的抗體片段。dsFv是將H鏈可變區域及L鏈可變區域中的各自1個氨基酸殘基用Cys殘基取代的多肽經該Cys殘基間的S-S鍵結合的抗體片段。含CDR的肽是含H鏈可變區域或L鏈可變區域的⑶R的至少1個區域以上而構成。含多個CDR的肽可通過直接或經適當的肽接頭結合而制備。本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的各種的抗體是，將含各自的抗原、例如，各自的抗體所識別的表位的5. 9kDa肽片段、其變體、5. 9kDa肽的全長肽、5. 9kDa肽的全長肽的變體、或者這些的肽和上述載體的復合物作為免疫原而免疫動物之后，關于多克隆抗體，從其動物的血清可通過公知的方法制備，關于單克隆抗體，可從通過將由其動物的脾臟等來源的產生抗體的細胞和骨髓瘤細胞融合而得到的雜交瘤經回收及純化而得到。其中，作為免疫原的肽從人血液等的活體來源樣品純化而得到也可，使用公知的肽合成技術化學合成而得到也可。不限于此，由重組體產生的肽也可作為抗原使用。產生本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的各種的抗體的雜交瘤可根據公知的方法、例如，Kohler和Milstein的方法(Kohler, G. & Milstein，C. Nature，256，495-497，1975)制成。即，將上述免疫原與公知的佐劑一同混和之后，將制成的佐劑液向小鼠、大鼠、倉鼠、山羊等的各種免疫動物間隔時間免疫必要次數，確認抗體價的升高后，將由其動物的脾臟等來源的產生抗體的細胞和小鼠、大鼠等的哺乳動物的骨髓瘤細胞進行細胞融合而制成雜交瘤。本發明人制成并建立的，產生前述的本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的識別5. 9kDa肽的從N末端起第1 17的氨基酸區域中存在的表位的抗體的雜交瘤5. 9N-06、及，產生前述的本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的識別5. 9kDa肽的從C末端起第40 M的氨基酸區域中存在的表位的抗體的雜交瘤5. 9C-02在2009年8月19日國內保藏到〒四2-0818日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8獨立行政法人制品評價技術基盤機構(NITE)專利微生物保藏中心(NPMD)，作為保藏號，各自賦予NITE P-797及NITE P-798。其后，將這些的國內保藏，在2010年8月20日基于布達佩斯條約進行向國際保藏的移管請求，在2010年9月13日，作為國際保藏號，各自賦予NITE BP-797及NITEBP-798。為了從雜交瘤獲得本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的各種的單克隆抗體，首先，對制成的雜交瘤使用選擇培養基進行選擇，將選擇的雜交瘤的培養上清用如ELISA法一樣的適當的免疫測定法分析，選擇產生目的的單克隆抗體的雜交瘤。接下來，將選擇的克隆用如有限稀釋法等一樣的方法進行克隆而單克隆化。接下來，將克隆的雜交瘤用通常細胞培養中使用的培養基、例如α -MEM、RPMI1640、ASF、S-clone等進行培養，可由其培養上清回收單克隆抗體。將作為雜交瘤的來源的動物、裸鼠預先用姥鮫烷處理，通過向該動物腹腔內注射細胞而貯留腹水，從其腹水回收單克隆抗體也可。最后，由上清、腹水回收單克隆抗體的方法而言，可使用通常的方法。例如，可舉出由硫酸銨、硫酸鈉等的鹽析法或層析、離子交換層析、一般而言，由蛋
11白G等的親和層析等。本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的各種的抗體或其抗體片段也可通過將編碼這些的DNA序列通過公知的方法解析之后，制成含其DNA序列的基因重組載體，將制成的基因重組載體導入適當的宿主、例如，大腸桿菌或酵母，由得到的基因重組體回收該抗體或其抗體片段，純化而得到。本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中生成的免疫復合物是，通過將前述的本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的識別5. 9kDa肽的N末端的抗體或其抗體片段及識別5. 9kDa肽的C末端的抗體或其抗體片段分別同時與5. 9kDa肽接觸-結合，或者，通過一方的抗體或其抗體片段與5. 9kDa肽接觸-結合而形成的5. 9kDa肽和抗體或其抗體片段的復合物上再接觸-結合另一方的抗體或其抗體片段而形成的，5. 9kDa肽和2種抗體或它們的抗體片段的復合物。其中，形成的復合物是3聚體也可，是其以上的多聚體也可。在本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中生成的免疫復合物中，形成復合物的前述的本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的識別5. 9kDa肽的N末端的抗體或其抗體片段及識別5. 9kDa肽的C末端的抗體或其抗體片段之中一方維持其抗原識別能力的實施方式中，將固相、即，聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯等向作為原料的基材、例如，塑料管或微滴定板直接或間接物理結合或化學結合、利用親和性等結合也可。另外，在不結合于上述固相的另一方的抗體或其抗體片段維持其抗原識別能力的實施方式中，用標記物質、例如，HRP等的標記酶、膠體金、銪等的標記金屬、FTTC、若丹明、德克薩斯紅、Alexa、GFP等的化學、生物性各種熒光物質、32P、51Cr等的放射性物質等標記也可。或者，在本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中生成的免疫復合物中，在前述的本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的識別5. 9kDa肽的N末端的抗體或其抗體片段及識別5. 9kDa肽的C末端的抗體或其抗體片段的兩方維持其抗原識別能力的實施方式中，將不溶性載體粒子、例如，如聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物一樣的有機高分子向如乳膠或氧化硅、氧化鋁一樣的無機氧化物等直接或間接物理結合或化學結合、利用親和性等結合也可。測定本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中生成的免疫復合物的手段而言，可例示酶聯免疫測定法(ELISA法)、免疫比濁測定法(TIA法)、乳膠免疫凝集測定法(LATEX法)、電化學發光法、熒光法等。另外免疫層析法、利用試驗紙的方法也有效。從有優良的靈敏度及定量性的方面，測定本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中生成的免疫復合物的手段而言，優選ELISA法，更優選夾心ELISA法。另外，從測定簡便并且迅速的方面來看，測定本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中生成的免疫復合物的手段而言，優選乳膠免疫凝集測定法。本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中進行的由夾心ELISA法的測定是，在前述的本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的識別5. 9kDa肽的N末端的抗體或其抗體片段及識別5. 9kDa肽的C末端的抗體或其抗體片段之中一方維持其抗原識別能力的實施方式中，使用由標記物質、例如，HRP等的標記酶、膠體金、銪等的標記金屬、FTTC、若丹明、德克薩斯紅、Alexa, GFP等的化學、生物學的各種熒光物質、32P、51Cr等的放射性物質等標記的標記抗體或標記抗體片段。再者，本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中進行的由夾心ELISA法的測定是，在上述標記抗體或標記抗體片段中未使用的另一方的抗體或其抗體片段維持其抗原識別能力的實施方式中，使用將固相、即，聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯等向作為原料的基材、例如，塑料管或微滴定板直接或間接物理結合或化學結合、利用親和性等結合的固相結合抗體或固相結合抗體片段。本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中進行的由夾心ELISA法的測定可使用上述標記抗體或標記抗體片段和固相結合抗體或固相結合抗體片段，通過公知的方法進行。即，首先，向固相結合抗體或固相結合抗體片段加待測樣品而使反應，反應一定時間之后，清洗固相，加標記抗體或標記抗體片段而再反應2次。接下來，再度清洗固相，加發色底物等而進行反應。其中，發色底物而言，作為標記抗體或標記抗體片段的標記物質使用HRP時，可使用已知的DAB、TMB等。本發明中提供的由夾心ELISA法的5. 9kDa肽免疫學測定用試劑盒具備前述的本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中進行的由夾心ELISA法的測定中使用的標記抗體或標記抗體片段及固相結合抗體或固相結合抗體片段。再者，本發明中提供的由夾心ELISA法的5. 9kDa肽免疫學測定用試劑盒可含底物、待測樣品稀釋液、清洗液、陽性對照、陰性對照等。其中，為了簡便并且迅速地測定多個待測樣品，優選以用自動ELISA裝置測定可能的免疫學測定試劑盒構成。本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中進行的由乳膠免疫凝集測定法的測定使用致敏不溶性載體粒子的前述的本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法及免疫學測定用試劑盒中使用的，或者，本發明中提供的識別5. 9kDa肽的N末端的抗體或其抗體片段和識別5. 9kDa肽的C末端的抗體或其抗體片段。其中，向不溶性載體粒子的抗體或其抗體片段的致敏是指，在維持其抗原識別能力的實施方式中，直接或間接物理結合或化學結合、利用親和性等而向不溶性載體粒子結合抗體或其抗體片段。不溶性載體粒子而言，可舉出例如，如聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物一樣的有機高分子的如乳膠或氧化硅、氧化鋁一樣的無機氧化物等。致敏不溶性載體粒子的上述2種抗體或它們的抗體片段的使用實施方式而言，使用由上述2種抗體或它們的抗體片段的兩方致敏1個不溶性載體粒子而得到的僅1種不溶性載體粒子也可，將由上述2種抗體或它們的抗體片段分別致敏不同的不溶性載體粒子而得到的2種不溶性載體粒子混合而使用也可，將這3種不溶性載體粒子混合而使用也可。本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中進行的由乳膠免疫凝集測定法的測定可使用上述2種不溶性載體粒子，通過公知的方法進行。S卩，向待測樣品加上述2種不溶性載體粒子而進行反應，反應一定時間之后，測定形成的凝集。本發明中提供的由乳膠免疫凝集測定法的5. 9kDa肽免疫學測定用試劑盒具備致敏前述的本發明的5. 9kDa肽的免疫學測定方法中進行的由乳膠免疫凝集測定法的測定中使用的不溶性載體粒子的識別5. 9kDa肽的N末端的抗體或其抗體片段和識別5. 9kDa肽的C末端的抗體或其抗體片段。再者，本發明中提供的由乳膠免疫凝集測定法的5. 9kDa肽免疫學測定試劑盒可含待測樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照等。其中，為了簡便并且迅速地測定多個待測樣品，優選作為用自動乳膠免疫凝集測定裝置測定可能的免疫學測定試劑盒而構成。接下來舉實施例更詳細地說明本發明，但本發明不受這些實施例的任何限定。實施例實施例1識別5.9kDa肽的N末端區域的抗體、及，識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體的制成及其特性的鑒定(1)免疫原的制成為了制成識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體、及，識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體，制成包含含有5. 9kDa肽的N末端或C末端的氨基酸序列的肽的免疫原。具體而言，首先，合成在由SEQ ID NO 1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的從N末端起第1 17的17個氨基酸殘基組成的抗原肽(以下，也稱之為5. 9N)的C末端導入為了結合抗原肽和載體而使用的Cys殘基的肽、即有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的肽。另外，合成5. 9kDa肽的C末端起的15個殘基、S卩，在由SEQ ID NO :1所示的5. 9kDa肽的氨基酸序列的從N末端起第40 M的15個氨基酸殘基組成的抗原肽(以下，也稱之為5. 9C)的N末端導入為了結合抗原肽和載體而使用的Cys殘基的肽、即有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的肽。接下來，向這些的肽的N末端Cys殘基或C末端Cys殘基通過MBS (馬來酰亞胺苯甲酰氧基琥珀酸亞胺)法綴合作為載體的匙孔青貝血藍蛋白(KLH)，制成作為免疫原使用的復合物。O)向小鼠的免疫上述⑴中得到的免疫原施用給小鼠，得到免疫小鼠。具體而言，首先，將上述(1)中制成的含5. 9N、或者，5. 9C的免疫原分別用PBS溶解至達到lmg/ml。接下來，取50 μ 1(50 μ g)與弗羅因德完全佐劑(和光純藥工業)50 μ 1充分混和至乳化。接下來，將制備的懸浮液向Balb/c6周齡雌小鼠(日本Clea)在二乙基醚麻醉下各自腹腔內施用。2周后，將含同量的5. 9N、或者，5. 9C的免疫原與弗羅因德不完全佐劑(和光純藥工業)混和，通過與弗羅因德完全佐劑之時完全同樣的操作，作為乳化懸浮液，各自施用到小鼠。往后每2周進行同樣的操作，在第4次，作為最終免疫將含5. 9N、或者，5. 9C的免疫原50 μ 1 (50 μ g)通過小鼠尾靜脈注射施用。(3)雜交瘤的確立將上述O)中得到的免疫小鼠的脾臟細胞和骨髓瘤細胞融合而制成雜交瘤。具體而言，首先，最終免疫含5. 9N、或者，5. 9C的免疫原的3天后，將由各自的小鼠在二乙基醚麻醉下外科摘出的脾臟無菌分散，制備脾臟細胞。細胞融合根據Kohler和Milstein 的方法(Kohler，G.& Milstein，C. Nature，256，495-497，1975)進行，使用聚乙二醇(PEG4000) (Merck)將脾臟細胞和骨髓瘤細胞P3-X63-Ag8_Ul (P3U1)融合。融合比率是相對于脾臟細胞數8\107個而骨髓瘤細胞？3163488』1( 3肌)2\107個，是約4 1。將融合細胞分散到 10% FCS(INVITROGEN) α -MEM(IRVINE)HAT (Cosmo Bio)培養基而分注到96孔微滴定培養板(住友Bakelite)，在37°C、5% CO2條件下培養。⑷集落的篩選
在確立上述(3)的雜交瘤的約2周后，確認集落的生長，篩選產生抗體的雜交瘤。具體而言，首先，為了制成篩選用板而將上述(1)中合成的5.9N、或者，5.9C溶解到PBS中，分注到96孔微滴定板(Nunc)至達到2 μ g/100 μ 1/孔。接下來，將板于4°C靜置2晚之后，用含0.05% Tween20 (PBS-T)(和光純藥工業)的PBS清洗3次，為了抑制非特異性反應而分注200μ1用PBS稀釋4倍的N-102(日本油脂)溶液，再于4°C靜置1晚。接下來，將完成的板用PBS-T清洗1次之后，使與上述(3)中得到的雜交瘤的培養上清100 μ 1反應，再進行清洗之后，加作為第二抗體的HRP標記抗小鼠免疫球蛋白抗體(Zymed)而進行反應。清洗后，加100 μ 1作為HRP的發色底物的，TMB溶液(Kainos)而發色一定時間之后，再添加100 μ 1作為停止液的IN硫酸(和光純藥工業)，對測定波長450nm處的吸光度進行測定。通過上述篩選，對于判斷為陽性的克隆，通過有限稀釋法進行再克隆，再度確認上清。作為結果，得到與致敏5. 9N的板反應的雜交瘤5. 9N-06、及，與致敏5. 9C的板反應的雜交瘤5. 9C-02。再有，得到的雜交瘤的培養上清與對照的BSA板完全不反應。雜交瘤5. 9N-06及5. 9C-02在2009年8月19日國內保藏到〒292-0818本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8獨立行政法人制品評價技術基盤機構(NITE)專利微生物保藏中心(NPMD)，作為保藏號，各自賦予NITE P-797及NITE P-798。其后，將這些的國內保藏在2010年8月20日，基于布達佩斯條約進行向國際保藏的移管請求，在2010年9月13日作為國際保藏號，各自賦予NITE BP-797及NITEBP-798。(5)抗體的同種型鑒定鑒定上述中得到的雜交瘤5.9N-06、及，雜交瘤5.9C-02各自產生的單克隆抗體抗-5. 9N、及，抗-5. 9C的同種型。具體而言，使用單克隆抗體分型試劑盒(Amersham Pharmacia)，根據附帶的使用說明書，檢驗各自的雜交瘤產生的抗體的同種型。作為結果，確認單克隆抗體抗-5. 9N、及，抗-5. 9C屬于表1所示的同種型。表1單克隆抗體的同種型
權利要求
1.5. 9kDa肽的免疫學測定方法，其特征在于，使識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體或其抗體片段，以及識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體或其抗體片段與待測樣品中的有SEQID NO 1所示的氨基酸序列的分子量5，900的肽(5. 9kDa肽)接觸而生成5. 9kDa肽和該2種抗體或它們的抗體片段的免疫復合物，以及測定得到的免疫復合物。
2.權利要求1所述的免疫學測定方法，其中，識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體是識別在5. 9kDa肽的從N末端起第1 39的氨基酸區域中存在的任何表位的抗體，識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體是識別在5. 9kDa肽的從N末端起第18 M的氨基酸區域中存在、并且相比識別上述N末端區域的抗體所識別的表位位于更C末端側的任何表位的抗體，且這2種抗體所識別的表位不互相重復，并且，這2種抗體不互相妨礙與5. 9kDa肽的結合。
3.權利要求1或2所述的免疫學測定方法，其中識別5.9kDa肽的N末端區域的抗體是識別在5. 9kDa肽的從N末端起第1 17的氨基酸區域中存在的表位的抗體。
4.權利要求1 3之任一項所述的免疫學測定方法，其中識別5.9kDa肽的C末端區域的抗體是識別在5. 9kDa肽的從N末端起第40 M的氨基酸區域中存在的表位的抗體。
5.權利要求1 4之任一項所述的免疫學測定方法，其中通過夾心ELISA法測定免疫復合物。
6.權利要求1 4之任一項所述的免疫學測定方法，其中通過乳膠免疫凝集測定法測定免疫復合物。
7.權利要求1 6之任一項所述的免疫學測定方法，其中待測樣品是全血、血清、血漿、尿、唾液、腦脊髓液、胸水、腹水、心囊水、關節液、或者，淋巴液，且有包含5. 9kDa肽的可能性。
8.5. 9kDa肽的免疫學測定用試劑盒，其包含識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體或其抗體片段、和識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體或其抗體片段。
9.權利要求8所述的免疫學測定用試劑盒，其包含識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體或其抗體片段、和識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體或其抗體片段，且任何一方的抗體或其抗體片段是被標記的標記抗體或標記抗體片段，另一方的抗體或其抗體片段是結合到固相的固相結合抗體或固相結合抗體片段，且其用于由夾心ELISA法測定5. 9kDa肽。
10.權利要求8所述的免疫學測定用試劑盒，其包含致敏不溶性載體粒子的識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體或其抗體片段，和致敏不溶性載體粒子的識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體或其抗體片段，且其用于由乳膠免疫凝集測定法測定5. 9kDa肽。
11.權利要求10所述的免疫學測定用試劑盒，其包含用識別5. 9kDa肽的N末端區域的抗體或其抗體片段，以及識別5. 9kDa肽的C末端區域的抗體或其抗體片段的2種抗體或它們的抗體片段的兩方致敏1個不溶性載體粒子而得到的1種不溶性載體粒子；用該2種抗體或其抗體片段分別致敏不同的不溶性載體粒子而得到的2種不溶性載體粒子；或者這3種不溶性載體粒子的混合物。
12.抗體或其抗體片段，其識別在5.9kDa肽的從N末端起第1 17的氨基酸區域中存在的表位。
13.抗體或其抗體片段，其識別在5.9kDa肽的從N末端起第40 M的氨基酸區域中存在的表位。
全文摘要
通過使識別肽標記物的N末端的抗體和識別肽標記物的C末端的抗體與疑似在含有混雜肽的活體來源樣品中存在的作為人纖維蛋白原α-E鏈或α鏈的分解產物的分子量5.9kDa的肝臟疾病診斷用肽標記物接觸而形成該肽標記物和2種抗體的免疫復合物，以及免疫學測定得到的免疫復合物來可特異性地測定該肽標記物。
文檔編號G01N33/53GK102597772SQ20108004860
公開日2012年7月18日 申請日期2010年10月13日 優先權日2009年10月28日
發明者三浦俊英, 佐藤百惠, 小島良, 曾川一幸, 清川嚴, 菊地涉, 野村文夫, 野田健太 申請人:日東紡績株式會社