制備反應混合物和相關產品的方法

專利名稱：制備反應混合物和相關產品的方法
技術領域：
本發明涉及(生物)化學試劑的吸移。具體地講，本發明涉及一種向用于聚合酶鏈反應(PCR)擴增、特別是定量PCR(qPCR)擴增的微孔吸移試劑的方法。另外，本發明涉及用于輔助吸移的新產品。
背景技術：
當吸移PCR反應物時，可以將所有必需成分(即試劑)一種接一種地添加至反應管，或者優選地首先組合它們中的至少一些作為主混合物(master mix)隨后將該混合物分成多個樣品來添加。通常必須獨立添加的一種成分為受到研究的樣品。微量滴定板中樣品、管子或樣品孔的數量可以為每個設置(setup)幾百或甚至幾千個。 不僅在PCR中而且在許多其它(生物)化學反應中，正確添加試劑即以正確的次序和量添加試劑對于獲得有效結果是決定性的。失敗的實驗導致時間和金錢的損失。經濟重要性可能巨大。這是因為成分、塑料器具和人員工作時間的浪費所致。此外，獲得實驗結果的延遲可能很嚴重。已存在針對這一熟知問題的各種解決辦法。存在針對該問題的機械解決辦法。本領域已知與樣品管和板一起使用的各種自動化吸移機器人、多通道移液和引導系統(例如Finnzymes Piko Light Plate,BioTx WellAware )。若干年來，還存在可用的PCR主混合物或緩沖液，其含有某些可見染料以輔助吸移和跟蹤電泳運行。這些混合物一般還具有用于增加溶液密度的某些成分以輔助電泳凝膠加樣。US 6942964公開一種使用吸移輔助染料的產品，該染料也用作凝膠加樣和跟蹤染料。已將著色劑與聚合酶結合，其有助于用戶觀察該聚合酶是否已被吸移至PCR混合物或主混合物。類似產品為BioLine Accuzyme Red。USB Corporation的RubyTaq特征為一種聚合酶,其包括在瓊脂糖凝膠運行期間分離的兩種染料品紅色(在500bp[2%凝膠]和1500bp
之間運行)和黃色(IObp以下運行)的混合物。Fermentas和Promega也已將著色劑添加至酶反應緩沖液。可以觀察到FermentasJ DreamTaq Green反應緩沖液為綠色,但該顏色在凝膠電泳期間分離成藍色帶和黃色帶。Promega GoTaq 和 GoTaq Green Mastermix 的表現類似。還存在這樣的可用產品，其中添加至聚合酶的染料并不旨在輔助電泳階段。實例包括 ABgene Red Hot。NEB提供一種產品(Crimson Taq)，其特征為添加至DNA聚合酶反應緩沖液的染料酸性紅。該產品還使用6%葡聚糖作為密度增強劑。Qiagen的CoralLoad染料既可作為單獨管中的濃縮物獲得，用于添加到無色的主混合物，也可作為任選的預制IOXPCR緩沖液獲得。其含有兩種凝膠跟蹤染料(橙色和紅色)。KR 2002/0045167公開了冷凍干燥的PCR混合物，其含有著色劑以確認PCR成分的溶解。US 6153412也公開了冷凍干燥的反應混合物，其用于識別凍干PCR試劑的存在并且確保PCR試劑和測試樣品的完全混合。另一方面，US 5565339公開染料在熱起動蠟中的用途，所述蠟不溶解于反應混合物中。Absolute Blue QPCR Master Mix含有惰性藍色染料以使反應設置中的吸移容易。WO 2007/088506也公開了一種染色的主混合物。所用生物系統具有包括在其qPCR產物中的ROX被動參考染料。該染料的目的是提供穩定的熒光水平，該熒光水平可用于將不同反應之間和反應期間的一個樣品中的任何非PCR相關熒光變化歸一化。該方法還建議至少部分地將吸移準確性的偏差歸一化。建議僅在傳統的終點PCR中使用上述產物中除最后三個以外的全部產物。除了這些著色劑之外，它們一般含有密度增強劑以使樣品材料進入凝膠孔的底部(參見例如US6942964)。在沒有密度增強劑的情況下，樣品將分散到周圍液體中。
終點PCR中所用的著色劑通常與定量PCR(qPCR)不相容。這通常是因為它們阻止正在進行的反應的實時光學測量。具體地講，染料一般具有與qPCR熒光的檢測波長重疊的光譜或者所述染料的吸收率過高。對所用染料的一般要求包括對PCR反應或反應物pH的穩定性的非抑制性效應。在主混合物或聚合酶內提供染料的上述解決辦法的其它缺點在于，它們不能對吸移樣品(即在PCR中待擴增的材料)提供幫助。然而，樣品吸移是其中對過程保持跟蹤最重要也最難的步驟。任何的可用的各種機械系統均不能完全解決該問題。它們十分昂貴，并且主要由于體積差異而不能始終在視覺上觀察到吸移錯誤，這意味著在獲得失敗結果之前不可能檢測到錯誤。因此，存在對增強的吸移助劑的需要。具體地講，存在對也可用于樣品吸移階段的這種吸移助劑的需要。發明概述本發明的目的是提供一種新溶液，其用于在PCR測定的制備期間輔助吸移且尤其用于使得檢測吸移的不同階段中的錯誤更容易。本發明的目的通過在獨立權利要求中定義的本發明來實現。在PCR測定的吸移階段中，將至少兩種試劑溶液混合以獲得經受PCR的最終混合物。本發明是基于這樣的構思用不同的初始著色劑對試劑溶液著色，所述著色劑在混合之后產生不同于初始著色劑的顏色的可區別的顏色。因此，可以直接通過溶液的顏色來分辨其是第一試劑溶液，還是第二試劑溶液或是這些的混合物。更具體地講，該方法包括提供第一試劑溶液，其包含實施測定所需的至少一種其它物質和為溶液提供第一顏色的第一著色劑；和提供第二試劑溶液，其包含實施所述測定所需的至少一種其它物質和為溶液提供不同于第一顏色的第二顏色的第二著色劑；和將第一和第二試劑溶液混合以提供將經受PCR處理的混合溶液，該混合溶液由于所述第一和第二著色劑而具有不同于第一和第二顏色的第三顏色。
在典型應用中，試劑溶液之一為樣品溶液，即含有或旨在接受將在PCR測定中擴增的生物樣品的溶液，而其它試劑溶液含有實施測定所需的某些另外的至少一種其它物質，例如聚合酶溶液或主混合物(master mix)。樣品溶液可以是緩沖溶液(下文稱"樣品緩沖溶液")。因此，具有第一顏色的微孔表明在該孔中僅存在不含其它試劑如主混合物的樣品溶液。具有第二顏色的微孔表明已添加了主混合物但尚不存在樣品。最終，具有第三顏色的微孔表示已正確地向主混合物中添加了樣品。可以視覺地或通過自動光學裝置來檢查顏色。在一個實施方案中，試劑溶液之一是洗脫緩沖液，如與核酸純化試劑盒組合使用的洗脫緩沖液。在一個實施方案中，試劑溶液之一是用于促進固態樣品裂解以釋放核酸的稀釋緩沖液。試劑溶液也可以用于在PCR之前稀釋、消化或沉淀被釋放的成分。因此，可以在吸移直接PCR測定時使用本發明。 在其它實施方案中,試劑溶液之一是用于cDNA合成反應、逆轉錄酶反應或亞硫酸氫鹽反應的溶液。在一個實施方案中，試劑溶液之一是用于制備PCR處理的樣品的某些其它溶液。本發明還提供一種染料用于產生兩種或更多種著色PCR試劑溶液的新用途，所述著色PCR試劑溶液能夠形成具有可與試劑溶液的初始顏色區別的顏色的混合溶液。其它實施方式為從屬權利要求的主題。本發明的具體目的是實現一種與定量PCR相容的吸移輔助溶液。這是通過使用不顯著干擾熒光過程(即激發和發射)或qPCR中所用光學檢測的那種著色劑和著色劑濃縮物而實現。具體地講，經受qPCR的反應混合物至少在qPCR激發和發射波長處為透明或半透明的。這通常意味著反應混合物的最大吸收率小于O. 5，尤其小于O. 15(使用Imm光程測量)，以及著色劑的吸收窗口與所用熒光qPCR染料或被修飾的DNA低聚核苷酸探針的激發或發射波長至少未顯著重疊。在一個實施方案中，制備用于定量PCR的反應混合物，該反應混合物包含熒光染料、引物或探針，并且其中任何所述著色劑的吸收峰與所述熒光染料、引物或探針的發射或激發波長不重疊。如果存在重疊，則其不應顯著減弱qPCR信號，通常意味反應混合物在所述波長下的總吸收率小于O. 05，優選小于O. 03，尤其小于O. I。本發明提供重要優點。因為初始溶液和得到的溶液相互具有不同顏色，所以不僅能區別初始溶液，而且能區別初始溶液和其混合物。另外，可以從著色溶液快速感知該溶液是否正確混合以及是否存在與所需反應體積的顯著偏差。此外，顏色使得更容易觀察是否有任何液體噴濺或溢漏在其可能潛在地導致污染、微孔密封問題等等的不當位置。尤其對于熱循環之前施加在微量滴定板上的粘附性密封膜，密封接觸點中的任何液體均可損害該密封并因此損害整個PCR測定。如果使用著色劑使實施的吸移步驟視覺化，則本發明也可以與機械解決辦法一起使用以將錯誤率降低得甚至更低。當使用吸移機器人時，可以在所需步驟之后增加基于光學檢測的品質檢查步驟，或可在視覺上快速檢查試劑的體積和顏色。出于上述原因，以本發明方式使用的染料和其它著色劑可在反應設置中且尤其在將試劑加樣到反應板中期間輔助保持跟蹤。因此，該方法為移液樣品提供重要輔助并提高的確定性。在qPCR中，在PCR反應之后不需要將擴增的產物加樣到凝膠中。因此，不需要密度增強劑。因而，本發明的溶液可以不含密度增強劑或僅含有少量密度增強劑(即低于凝膠電泳所需量)。根據一個實施方案，除上述第一和第二試劑溶液以外，提供一個或多個另外的試劑溶液，其包含為溶液提供不同顏色的另外的著色劑。該溶液能夠在混合之后形成另外的溶液，其由于所述另外的著色劑而具有其它可區別的顏色。因此，本發明不僅可用于在該過程的一個具體階段(例如將樣品吸移到主混合物)中輔助吸移，而且還用于在其它步驟、尤其是樣品吸移步驟之前或之后的步驟期間輔助吸移。更詳細的說，該方法可以包括提供第三試劑溶液，其包含實施所述測定所需的至 少一個其它物質，該第三試劑溶液含有為該溶液提供不同于上述第一、第二和第三顏色的第四顏色的第三著色劑；和將該第三試劑溶液與該第一和第二試劑溶液混合以提供混合的試劑溶液，其由于所述第一、第二和第三著色劑而具有不同于第一、第二、第三和第四顏色的第五顏色。具體地講，第一試劑溶液可以是樣品，第二反應溶液是主混合物，并且第三試劑溶液可以是引物溶液。除非測定說明中以其它方式定義，否則應用的次序并不重要。或者，上述方法可以包括提供第三試劑溶液，其含有為溶液提供不同于第一、第二和第三顏色的第四顏色的第三著色劑；和將第一試劑溶液與所述第二和第三試劑溶液單獨混合，以獲得分別具有不同于彼此和第一、第二和第四顏色的第三和第五顏色。例如，第二試劑溶液可以含有一組引物，并且第三試劑溶液可以含有第二組引物。同樣在這實施方案中，所有初始成分和所有得到的混合物的顏色都是唯一的。還可以將兩個上述實施方案連接，使得第二和第三試劑溶液最終單獨地與本身通過將至少兩個不同的著色試劑溶液混合而制備的試劑溶液混合。其它種類的組合也是可能的。"試劑溶液"是含有對PCR目的必需或有利的至少一種試劑的任何溶液。最典型成分是聚合酶、核苷酸、引物、離子、鎂、其它鹽、pH緩沖劑、dNTP或熒光qPCR染料或探針、低聚核苷酸、核酸結合劑、核酸模板。該試劑也可以是其它聚合酶反應添加劑，其對聚合酶反應或其監測具有影響。除非特別指出，否則術語"樣品溶液"涵蓋緩沖的和非緩沖的樣品溶液，其尚不含模板或者已向其中添加了將用PCR擴增的模板。術語"樣品溶液"被術語"試劑溶液"涵蓋。術語"主混合物(master mix)"是指發生PCR必需的所有或大部分成分或因子(通常是除模板和引物之外(它們均是樣品和擴增子特異性的)的所有成分或因子)的混合物。市售的主混合物通常是濃縮溶液。主混合物可以含有多個樣品共用的試劑，但其也可僅針對一個樣品而構建。使用主混合物幫助降低因吸移體積間差異所致的樣品間的吸移錯誤和變化。其還使吸移所花時間最少化。qPCR主混合物是實施qPCR反應所期望的主混合物。因此，其可以含有熒光染料或突光標記的低聚核苷酸引物或探針。術語"預混合物"是指含有除模板之外的所有PCR反應必需成分的主混合物。
本文中術語"顏色"是指(溶液)對視覺范圍內白光的任何可檢測光譜響應。因此，在溶液的吸收光譜中存在至少一種這樣的波長范圍，其為溶液提供著色視覺外觀(與水的幾乎100%透光度形成對比)。白色，黑色和灰色色調在本文中作為顏色計算。如隨后所示，高于約O. 01 (Imm光程)的吸收率為溶液提供視覺上可感知的顏色，而高于約O. 001 (Imm光程)的吸收率可相對容易地通過基于硬件的光譜檢測裝置來檢測。術語"不同顏色"是指顏色優選地通過裸眼、但至少用光譜檢測裝置可以區別。具體地講，"不同顏色"可以在它們的吸收光譜中具有分隔至少30nm的最大峰。優選地，不同顏色選自紅色、黃色、藍色或青色、品紅色、黃色和它們視覺上可區別的組合和色調，例如綠色、橙色和紫色。術語"著色劑"是指能夠均勻混合或溶解在溶液內并能夠為溶液提供可感知顏色的任何物質。根據一個實施方案，著色劑是染料，尤其是水性染料，優選是非氧化性水性染料。術語"透明"或"半透明"的含著色劑溶液具體地講是指在可用于實施qPCR的 至少某些熒光激發和/或發射波長處具有光學透射窗口的溶液，所述波長取決于反應混合物中所含的熒光團、熒光染料和/或被修飾的DNA低聚核苷酸探針。一般而言，激發波長在350和690nm之間，尤其在490和650nm之間。發射波長一般在350nm至730nm之間，尤其在515nm至680nm之間。透明溶液在光學上是基本上非漫射性的，而半透明溶液漫射性地通過光。術語"樣品"是指含有所關注的核酸或將針對所關注的核酸的存在進行分析的固體材料或溶液。術語"稀釋緩沖液"是指在PCR設置(setup)之前可用于樣品預處理的溶液。預處理可包括樣品裂解，其用于釋放核酸、稀釋、結合、化學裂解、沉淀和酶消化某些成分。術語"制備性處理"是指獲得可全部或部分用作后續PCR反應中樣品的產物的任何反應、吸移步驟或預處理。一般而言,通過將溶液與第一和第二著色劑混合所實現的第三顏色是該溶液的第一和第二顏色的色彩組合。因此，第三顏色可以作為第一和第二顏色的光譜的光譜總和而產生。然而，不排除第三顏色是通過更復雜過程形成，例如第一和第二著色劑的反應，或因熒光過程所致，例如熒光共振能量轉移(FRET)，前提是熒光波長不同于所用qPCR熒光團的波長。接著，參考附圖
更詳細描述本發明的實施方案和優點。附圖簡述圖IA示出分別含有著色樣品緩沖液、著色試劑溶液和它們的著色混合物的三個微孔的橫斷面圖。圖IB示出微量滴定板的俯視圖，該微量滴定板包含空孔和含著色樣品緩沖液、著色試劑溶液、它們的著色混合物混合物的孔以及含光學透明液體的孔。圖2a和圖2b示出進行本發明的示例性方式的流程圖。圖3示出本發明的一個實施方案的本發明方法的流程圖。圖4a至圖4d示出在吸移輔助染料的情況下(4a和4b)和在沒有吸移輔助染料的情況下(4c和4d)用主混合物和樣品獲得的標準系列。
圖5a至圖5d示出與吸收率測量實施例有關的吸收光譜。圖6a至圖6c和圖7a至圖7c示出cDNA合成反應中著色劑的使用。實施方案的詳細說明為使平板設置更容易，根據一個實施方案，本發明提供一種染料組合，其輔助在(q) PCR處理的吸移階段中跟蹤吸移主混合物、樣品和這些的混合。因此，優選對染料進行優化，使得它們可對qPCR反應具有最小影響(例如將不影響所用的樣品或DNA聚合酶)并且將不顯著影響熒光的光學檢測。換句話說，所用染料與qPCR測定相容。用于qPCR 目的的典型熒光團包括Alexa 350、FAM 、TET 、VIC 、JOE 、HEX 、CY 3、TAMRA 、ROX 、Texas Red 、CY 5、CY 5. 5 和 Quasar 705，其發射 和激發波長示于表I中。表I.
發射I激發 Alexa 350 350 440 FAM494 518
JOE520 548
VIC538 554
HEX535 556
Cy3552 570
TAMRA565 580
Cy3. 5581 596
Texas Red583 603
ROX585 605
Cy5643 667
Cy5. 5675 694
Quasar705 690 705圖IA示出本發明的基本原理。微孔12A含有具有第一顏色(橫線)的著色樣品緩沖液14A。微孔12B含有具有第二顏色(豎線)的著色的主混合物14B。微孔12C含有樣品緩沖液與著色主混合物的著色混合物，其具有由第一和第二顏色產生的第三顏色(橫線和豎線)。
圖IB示出微量滴定板10，除圖IA中示出和標記的溶液以外，其還含有空孔12和不具有顏色的非著色液體14D(圓點)。另外，示出稀釋的反應混合物14E，其是通過用非著色液體14D稀釋初始反應混合物14C而獲得，該稀釋的反應混合物具有與初始反應混合物14C相同的基本色，但具有提高的透明性，即降低的吸收率(稀疏的橫線和豎線)。如隨后將更詳細描述，根據本發明一個實施方案，不僅可監測顏色，而且可監測稀釋程度。優選所述染料可在視覺上(即通過裸眼)檢測和彼此區分。因此，不同顏色在波譜上相對密集地分布，并且不需要特殊設備。然而，在利用光學光譜檢測器或計算機視覺的自動設備中，也可使用在光譜量表(spectral scale)上更細微分布的顏色，而不損害區別不同顏色的能力。根據一個實施方案，該組合包含藍色的主混合物和黃色的樣品緩沖液。當混合在一起時，它們形成清晰的綠色溶液。平板中的藍色表明已添加了主混合物但尚不存在樣品。當樣品添加時，顏色變為綠色。如果孔中溶液為黃色，則其意味著僅存在樣品而不存在主混合物。根據一個實施方案，藍色染料包含二甲苯藍。根據一個實施方案，黃色染料包含喹啉黃。已發現這些染料分別與聚合酶和樣品緩沖液相容。其它潛在染料包含亮藍、專利藍、靛藍胭脂紅、酸性紅I、間甲酚紫、甲酚紅、中性紅、溴甲酚綠、酸性紫5、溴酚藍和橘黃G。其它潛在染料在US 6942964中列出。根據一個實施方案，該染料足夠強，以向各自溶液提供視覺上可感知的顏色，但又足夠弱而不干擾熒光檢測，和/或足夠弱而不干擾采用通常用于凝膠電泳遷移跟蹤的其它染料進行的凝膠電泳遷移跟蹤。例如，上述二甲苯藍和喹啉黃屬于這一組染料。因此，如果著色的擴增反應混合物經受終點凝膠電泳分析，則著色劑對該分析無影響。代替地，可向擴增的混合物添加具有電泳染料的常規加樣緩沖液。適度染色也保持溶液的總體視覺外觀透明或半透明。染料的適宜濃度取決于染料本身。根據針對機器輔助顏色檢測的一個實施方案，調節初始溶液中染料的濃度以在其最大吸收波長(Imm光程)下產生O. 001-0. 5的吸收率。根據針對視覺顏色檢測的一個實施方案，調節染料的濃度以在其最大吸收波長(Imm光程)下產生O. 01-0. 5、尤其是O. 03-0. 5的吸收率。根據最優選實施方案，吸收率是O. 03-0. 15，其確保即使吸收率峰會與qPCR激發和/或發射波長稍微地重疊，顏色具有視覺可檢測性并且對qPCR測量的影響可以忽略或很小。如果這種重疊存在，則優選的是，不管最大吸收率如何，qPCR激發和/或發射波長下的總吸收率小于O. 05，優選小于O. 03，尤其小于O. 01 (Imm光程)。當兩個(或更多)初始溶液具有不同顏色的染料時，在任何具體波長下均不存在顯著的累積吸收率。也應注意，上述吸收率是稀釋到所需PCR處理濃度的溶液的優選吸收率。如果溶液作為濃縮物遞送，則優選吸收率相應地更高。根據替代性實施方案，溶液中的至少一種具備染料，該染料既適于在qPCR中使用(即不影響在所用波長處的熒光檢測)且足夠強以在凝膠電泳中被檢測到，而且相對于樣品在凝膠上以適當距離運行。因此，不一定需要單獨的加樣緩沖液。取決于期望的用途，含有染料的樣品緩沖液可以作為稀釋物或濃縮物遞送。圖2示出將著色樣品溶液(步驟20)和至少一種試劑溶液(步驟21，任選22)吸 移到單個容器中并將所述溶液混合(步驟23)的一般概念。在使混合物經受PCR(步驟25)之前，檢查混合溶液的顏色(步驟24)。應注意，為了簡明，可能有其它吸移和處理步驟未示出。下文解釋利用本發明的一般構思的若干實施方案。根據一個實施方案，提供數個著色樣品緩沖溶液，其中使用不同著色劑來為樣品緩沖液提供不同顏色。根據另一實施方案，將數個著色樣品緩沖液與相同的著色試劑混合物混合，獲得不同顏色的反應混合物。因此，在多樣品PCR測定中，可以基于溶液的顏色而區別不同樣品。例如，黃色樣品緩沖液和紅色樣品緩沖液與藍色主混合物混合，可以提供綠色和品紅色反應混合物，從而不僅可以立即驗證正確混合，而且還可以立即驗證樣品的類型。根據一個實施方案，提供一種主混合物和數個著色引物混合物，其中使用不同著色劑來為混合物提供不同顏色(主混合物顏色1，引物混合物顏色2和顏色3)。將引物混合物與主混合物(mister mix)組合，獲得不同的著色混合物(顏色4和6)。此外，通過向所得混合物添加著色樣品(顏色7)，獲得可區別的PCR溶液(顏色8和9)。在該過程的各種情況下，溶液的顏色指示溶液的內容物。如圖3中所示，根據一個實施方案，提供數個主混合物或其它預混合物(步驟31、32)(所述預混合物具備不同著色劑以使預混合物被不同地著色(即預混合物I :顏色2，預混合物2 :顏色3，···預混合物η:顏色n+1))和具有另一顏色(顏色I)的樣品(步驟30)。將預混合物單獨與樣品混合(步驟33a、33b)并且檢查所得溶液的顏色(步驟34a、34b)。優選對所述顏色進行選擇，使得預混合物溶液和樣品溶液的組合獲得唯一顏色從而使所述溶液可與彼此和初始預混合物和樣品溶液區分。在檢查(34a、34b)之后，原則上，所述溶液準備進行PCR。應注意，為了簡明，可能有其它吸移和處理步驟未在圖3中示出。更通常地，可以提供數個初始溶液(各自含有PCR反應需要的成分，例如聚合酶、引物、離子、dNTP或熒光qPCR染料或探針或其它添加劑)(所述初始溶液具備不同著色劑以使這些溶液不同地著色(即溶液I :顏色2，溶液2 :顏色3，...溶液η :顏色n+1))和具 有另一顏色(顏色I)的樣品。優選對這些顏色進行選擇，使得溶液的各組合獲得唯一顏色從而使得所述溶液可與其它溶液區分。高實用價值的本發明選定變型在下文描述。洗脫緩沖液中染料的使用用于分子生物學實驗的核酸通常由復合體樣品材料純化得到。存在各種用于純化的方法，包括基于提取、沉淀、雜化和不同模式的色譜法或過濾等等的方法。在大部分技術中，核酸溶解或洗脫于所選溶液中。沉淀的核酸可以溶于各種溶液中。當使用基于其它DNA相互作用的其它方法時，對洗脫緩沖液存在更多需要，例如適宜離子強度。廣泛使用基于在高離子強度條件下DNA與氧化硅結合的純化方法。用低離子強度緩沖液或純水從氧化硅基質洗脫結合DNA。基于氧化硅結合方法的許多試劑盒是可得到的，并且該試劑盒通常含有洗脫緩沖液。為降低實驗工作流程中吸移步驟的數量，著色劑可以包括在洗脫緩沖液中，或者試劑盒提供的緩沖液可以替代著色的緩沖液。通過這樣做，用戶不必以單獨步驟添加顏色。例如，含有染料的樣品緩沖液可以用作與許多商用或自制DNA純化試劑盒組合的樣品洗脫緩沖液。可以用含有染料的樣品緩沖液來簡單地替換由許多可得到的試劑盒提供的洗脫緩沖液。或者，可以在試劑盒提供的洗脫緩沖液中添加少量染料濃縮物，而不過多稀釋該樣品。
如上所述，其它著色試劑溶液可以是該過程需要的任何其它溶液。稀釋緩沖液中染料的使用(直接PCR)新的酶技術使得可能顯著簡化用于PCR的樣品制劑并且甚至可能將未純化樣品直接用于PCR。然而在許多實驗中，樣品需要分開到若干反應中，并且通常優選能夠存儲樣品的一些以用于可能的重復或其它目的。因此，其中樣品裂解并溶于特殊樣品緩沖液中的直接PCR方案十分受歡迎。在這種所謂的稀釋方案中，稀釋緩沖液可以含有裂解該樣品的不同藥劑。除這些試劑以外，可以向該稀釋緩沖液添加著色劑以使后續吸移步驟更容易。如上所述，其它著色試劑溶液可以是該過程需要的任何其它溶液。為展示該實施方案，采用基于DNA與氧化硅結合的試劑盒進行兩組從牛乳樣品的提取。一組遵循指南，另一組中洗脫緩沖液被具有黃色染料的IX樣品緩沖液替換。將純化樣品用于qPCR，并且比較所述兩組的qPCR結果。未觀察到顯著差異。
逆轉錄反應中染料的使用進行大多數實時PCR以進行基因表達研究。在這些實驗中，所關注的核酸是RNA，并且因此不是用于標準qPCR的直接適宜模板。在qPCR之前，RNA樣品必須在qPCR步驟之前被逆轉錄。逆轉錄和qPCR反應可以組合并隨后在相同反應混合物中實施。然而，通常該條件是兩種反應的折中并且對于任一種都不是最佳的。在大多數情況下，更佳的是進行單獨的逆轉錄反應并且在單獨qPCR反應中將生成的cDNA用作模板。在逆轉錄反應設置中，與針對qPCR所述一樣，在吸移期間，保持樣品的跟蹤存在相同挑戰。本發明的實施方案描述了在cDNA合成反應中可以如何使用著色劑以克服該挑戰。cDNA合成反應中著色劑的使用展示如下制備兩種cDNA合成反應系列，一種具有黃色著色劑，最終濃度10倍于qPCR的指導濃度，另一種不具有另外的染料。將具有1000ng、500ng、10ng、IngUOOpg和IOpg稀釋物的HeLa總RNA稀釋系列用作模板。根據說明書(產品編號F-470，Finnzymes)以其它方式進行反應。然后，將1，5μ I等份的各反應物用作采用DyNAmo SYBR Flash qPCR主混合物的qPCR中的模板。參考圖6a_6c和圖7a_7c,生成兩個標準曲線,第一個(圖6c)代表具有添加的染料的系列，而另一個(圖7c)代表不含該染料。結果表明cDNA合成可以在著色劑存在下實施，并且維持反應的定量性質。在實施中，染料可以伴隨轉錄酶、伴隨樣品、伴隨緩沖溶液或者單獨地作為濃縮物進入反應。亞硫酸氡鹽反應中染料的使用與以上討論類似地，還可以將染料添加至參與亞硫酸氫鹽處理的任何成分中，然后將由此所得的樣品與第二反應溶液混合。如可從上述實施例看出，染料不僅可存在于混合該最終PCR反應混合物時，而且還存在于制備性處理步驟中，尤其涉及樣品制備的那些步驟中，例如逆轉錄反應(例如cDNA合成中)、亞硫酸氫鹽反應、樣品洗脫或樣品稀釋。這些實例并非限制，而如本領域技術人員所理解，染料還可以按不同方式引入這些反應中，例如伴隨酶、伴隨反應緩沖液、伴隨樣品或者單獨地引入。當制備性處理步驟中也存在顏色時，也有助于這些步驟的吸移。然而，根據優選實施方案，當將最終反應溶液與(例如)聚合酶或主混合物混合時，形成至少一個著色溶液。圖2以一般水平示出在至少一個制備性處理步驟29'之前向該過程引入至少一種著色試劑溶液(步驟20')的原理。預處理可以也涉及一種或多種其它物質的引入(步驟28,)。在預處理之后，該方法可以通過以下方式與如上文所解釋的類似地繼續進行將制備性處理步驟的產物(或其等份試樣)與第二著色試劑溶液混合(步驟21'和23')，檢查混合溶液的顏色(步驟24')以及進行(q) PCR (步驟25')。下面描述吸移過程的監測。優選地，不同顏色可通過裸眼區別。然而，也可以利用能夠區別顏色的硬件輔助光
學測量。根據一個實施方案，在吸移過程期間，自動地通過能夠光譜分辯的光學裝置至少 一次地檢查待吸移的一個或多個微孔的狀況。根據一個實施方案，在吸移過程的不同階段中至少兩次地自動檢查微孔的狀況。優選地，在每個單獨吸移步驟之后，進行這種檢查。著色劑的濃度降低，并且著色溶液的顏色因每次添加非著色(即光學透明)液體而變弱。另一方面，添加著色物質改變色澤。因此，孔中溶液的顏色的強度和/或色澤指示吸移的階段。通過自動測量微孔的光譜響應，可以監測吸移過程的進程。根據一個實施方案，使用計算機程序進行上述監測，該計算機程序適合于將在所需吸移步驟之后所測量的光譜響應與對這些步驟的預定義限制進行比較。將這種限制設計成反映溶液顏色的正確色澤和/或強度，并考慮所添加的試劑。將測量值未在合格范圍內的微孔標記為不正確吸移。溶液顏色的檢測優選基于吸收率測量。檢測儀器(其可以是例如自動吸移裝置或(q)PCR熱循環裝置的組成部分)含有吸收率測量裝置，即光源，光檢測器和用于測定微孔的內容物至少在一個波長或波長范圍下的吸收率的器件。優選地，吸收率測量器件包括分光光度計。借助于本發明，吸移和PCR測定的可靠性可有所改進，因為可以檢測顏色的色澤和強度的即使很小的變化，以及因此可以檢測孔的內容物的即使很小的變化。根據替代性實施方案，檢測儀器被包括在單獨裝置中，在關鍵性吸移步驟之后可以自動地或手動地將反應溶液轉移到該單獨裝置。在該單獨裝置中，進行快速讀板，隨后將平板轉移用于其它處理。因此，本發明還提供一種用于監測吸移的裝置，其包括用于接受含有數個微孔的微量滴定板的設備；和用于測量微孔的內容物的光學吸收率的設備。用于檢測吸收率的所述器件適合于檢測樣品的光譜吸收率分布(用于顏色檢測)和/或樣品的顏色強度(用于稀釋物檢測)。優選地，該裝置具有能夠監測整個吸移過程的上述兩個功能。光學檢測設備優選與計算裝置連接，該計算裝置分析和存儲測量的吸收率并且實施計算或者測量數據與預存儲數據的比較。檢測儀器可以含有微量板接受模塊，其可以被冷卻以保持反應溶液的溫度足夠低。對大多數熱啟動聚合酶而言,冷卻并非必需。當反應容器的體積小，即小于5μ 1，尤其小于1μ I時，自動檢測是特別有幫助的，因為在這些情況下對溶液的顏色和體積進行可靠視覺觀察更加困難。微孔可以是分離的或包含在任何已知類型的微量滴定帶或板中。優選地，由透明材料制造孔，使得可通過該孔的壁進行視覺檢查或光譜測量。染色實施例以O. 0026% (w/v)的濃度將二甲苯藍作為著色劑添加到DyNAmoFlash SYBR 綠色 qPCR 和 DyNAmo Flash Probe qPCR 主混合物(來自 Finnzymes, Finland)中。得到清澈藍色透明溶液。以0，00174% (w/v)的濃度將喹啉黃添加到樣品緩沖液中。該樣品緩沖液包含1_ Tris-HCL pH8, 5和0，ImM EDTA。結果，得到清澈黃色透明溶液。將著色樣品緩沖液與著色主混合物混合，產生清澈綠色透明混合物。擴增實施例 圖4a_4d示出在實施例I的吸移輔助染料的情況下(圖4a和4b)和在沒有實施例I的吸移輔助染料的情況下(4c和4d)用主混合物和樣品獲得的標準系列。這兩個系列都根據產品說明書中方案采用DyNAmo Flash Probe主混合物來擴增人基因組DNA序列而進行。引物序列是ACCTCCAAACTGGCTGTAAC與ATCTCCTCCTCATTGCAAAG。檢測基于具有序列TGGCCCCTTGAAGACAGCAG的水解探針。擴增子尺寸是121bp。根據擴增曲線(圖4a和4c)與標準曲線(圖4b和4d)的相互類似性，可以發現染料的存在不影響反應效率或不顯著影響熒光強度。吸移實施例利用本發明來實施以下吸移順序將著色(藍色)2X混合物與引物和探針、添加劑和水充分混合以獲得用于多個反應的預混合物。將預混合物吸移到微量滴定板的多個孔(15 μ I/孔)中。將著色的(黃色)DNA樣品溶液吸移到預混合物上(5 μ I/孔)。所得溶液的顏色經人工檢查是正確的(綠色)。在上述步驟之后，所得溶液準備經受(q)PCR。對于qPCR，優選將試劑離心到孔的底部。吸收率測量實施例測量用于上述實施例的染料的不同稀釋物和現有著色主混合物的稀釋物的吸收率，并視覺觀察比較以評價不同波長下的視覺可感知范圍。具體地講，該目的是用不同染料測定視覺可感知的吸收率范圍，并還檢查市售染料是否可適宜與FAM和SYBR熒光染料一起使用，FAM和SYBR熒光染料是qPCR中使用最普遍的染料。通過使用Imm和O. Imm光程的Nanodrop ND-1000分光光度計實施測量。將結果(包括顏色的視覺可檢測性，樣品的吸收率最大值和吸收率)以及實驗中所用的溶液和染料的類型示于下表1-7中。表1-3示出用將與FAM或SYBR—起使用的優選染料獲得的結果，而表4-7示出通過市售著色PCR溶液獲得的比較實施例。在表中，使用以下符號+++強烈的顏色++易于發現的顏色+弱顏色但在標準實驗室環境中對裸眼可見-在標準實驗室環境中對裸眼不可見的顏色對于用星號O表示的情況而言，吸收峰不完全明確或清楚。
表I
權利要求
1.一種制備用于聚合酶鏈反應(PCR)測定的反應混合物的方法，其包括 提供第一試劑溶液，其包含實施所述測定所需的至少一種物質； 提供第二試劑溶液，其包含實施所述測定所需的至少一種其它物質； 將所述第一和第二試劑溶液混合以提供將經受PCR處理的混合溶液； 其特征在于， 所述第一試劑溶液含有為所述第一試劑溶液提供第一顏色的第一著色劑； 所述第二試劑溶液含有為所述溶液提供不同于所述第一顏色的第二顏色的第二著色劑； 所述混合獲得混合溶液，其由于所述第一和第二著色劑而具有不同于所述第一和第二顏色的第三顏色。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述試劑溶液之一是樣品溶液，其包含將在所述PCR測定中擴增的生物樣品。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述試劑溶液中的至少一種包含以下的一種或多種聚合酶、引物、離子、dNTP或熒光qPCR染料或探針。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述試劑溶液中的至少一種是PCR主混合物，尤其qPCR主混合物或PCR或qPCR預混合物。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述試劑溶液中的至少一種是樣品洗脫緩沖溶液。
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述試劑溶液中的至少一種是樣品稀釋緩沖溶液。
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述試劑溶液中的至少一種用于制備性處理步驟中，例如在將所述第一和第二試劑溶液混合之前進行的樣品裂解、cDNA合成反應、逆轉錄反應、樣品消化、亞硫酸氫鹽反應、樣品洗脫或樣品稀釋。
8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，使用染料作為所述第一和/或第二著色劑。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一和/或第二著色劑選自喹啉黃、二甲苯藍、亮藍、專利藍、靛藍胭脂紅、酸性紅I、間甲酚紫、甲酚紅、中性紅、溴甲酚綠、酸性紫5、溴酚藍和橘黃G。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，提供一種或多種另外的試劑溶液，所述另外的試劑溶液包含提供不同于所述第一和第二顏色的溶液顏色的另外的著色齊U，由此所述另外的試劑溶液能夠在與所述第一或第二試劑溶液或所述混合溶液混合之后形成另外的混合溶液，所述另外的混合溶液由于所述另外的著色劑而具有其它可區別的顏色。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于， 提供第三試劑溶液，其包含實施所述測定所需的至少一個其它物質，所述第三試劑溶液含有為所述溶液提供不同于所述第一、第二和第三顏色的第四顏色的第三著色劑；和 將所述第二試劑溶液與所述第一和第二試劑溶液混合以提供混合的試劑溶液，其由于所述第一、第二和第三著色劑而具有不同于所述第一、第二、第三和第四顏色的第五顏色。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述第一試劑溶液是樣品溶液，所述第二試劑溶液是主混合物，并且所述第三試劑溶液是引物溶液。
13.根據權利要求I至10中任一項所述的方法，其特征在于， 提供第三試劑溶液，其含有為所述溶液提供不同于所述第一、第二和第三顏色的第四顏色的第三著色劑；和 將所述第一試劑溶液與所述第二和第三試劑溶液單獨混合以獲得第一和第二混合溶液，所述第一和第二混合溶液分別具有不同于彼此和所述第一、第二和第四顏色的第三和第五顏色。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一試劑溶液是(q)PCR主混合物，所述第二試劑溶液含有一組引物并且所述第三試劑溶液含有不同于所述第一組引物的第二組引物。
15.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，制備用于定量PCR的反應混合物，所述反應混合物包含熒光劑，并且其中任何所述著色劑的吸收峰都未與所述熒光劑的發射或激發波長重疊，或者所述反應混合物在所述波長處的總吸收率為至少小于0. 05，優選小于0. 03,尤其小于0. I (Imm光程)。
16.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在Imm光程情況下，所述試劑溶液在其最大吸收波長處的吸收率為0. 001-0. 5，尤其0. 01-0. 5，優選0. 03-0. 15。
17.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，基于觀察所述顏色的存在而檢查所述試劑溶液是否已正確混合。
18.根據權利要求17所述的方法，其特征在于，所述檢查使用能夠進行光譜分辨的光學裝置自動地進行。
19.根據權利要求17所述的方法，其特征在于，所述檢查通過視覺檢查來進行。
20.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一試劑溶液是聚合酶溶液或聚合酶緩沖溶液。
21.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一試劑溶液選自 聚合酶溶液、聚合酶緩沖液；并且所述第二試劑溶液選自引物、探針和樣品。
22.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述混合通過將所述試劑溶液吸移到微量滴定帶或板的一個或多個孔來進行。
23.一種用于聚合酶鏈反應(PCR)測定的溶液組，其包含 第一試劑溶液，其包含實施所述PCR測定所需的至少一種物質； 第二試劑溶液，其包含實施所述PCR測定所需的至少一種其它物質； 其特征在于， 所述第一試劑溶液具備具有第一顏色的第一著色劑； 所述第二試劑溶液具備具有不同于所述第一顏色的第二顏色的第二著色劑； 所述第一和第二試劑溶液能夠在混合之后形成混合溶液，其由于所述第一和第二著色劑而具有不同于所述第一和第二顏色的第三顏色。
24.根據權利要求23所述的溶液組，其特征在于，所述試劑溶液中的至少一種是用于接受待擴增模板的樣品溶液。
25.根據權利要求23或24所述的溶液組，其特征在于，所述試劑溶液中的至少一種含有以下的一種或多種聚合酶、引物、離子或dNTP或熒光qPCR染料或探針；其優選是PCR主混合物，特別是qPCR主混合物。
26.根據權利要求23至25中任一項所述的溶液組，其特征在于，所述試劑溶液中的至少一種是洗脫緩沖液或稀釋緩沖液。
27.根據權利要求23至26中任一項所述的溶液組，其特征在于，所述第一和/或第二著色劑選自以下喹啉黃、二甲苯藍、亮藍、專利藍、靛藍胭脂紅、酸性紅I、間甲酚紫、甲酚紅、中性紅、溴甲酚綠、酸性紫5、溴酚藍和橘黃G。
28.根據權利要求23至27中任一項所述的溶液組，其特征在于，當稀釋到所需PCR處理濃度時，在Imm光程情況下，各試劑溶液中的所述著色劑的濃度對應于所述溶液在其最大吸收波長處的吸收率0. 001-0. 5、尤其0. 01-0. 5、優選0. 03-0. 15。
29.根據權利要求23至28中任一項所述的溶液組，其特征在于，所述第一試劑溶液和/或所述第二試劑溶液是濃縮物。
30.根據權利要求23至29中任一項所述的溶液組，其特征在于，所述第一試劑溶液和所述第二試劑溶液能夠形成適于qPCR的透明或半透明混合溶液。
31.根據權利要求23至30中任一項所述的溶液組，其特征在于，所述第一試劑溶液選自聚合酶溶液、聚合酶緩沖液；并且所述第二試劑溶液選自引物、探針和樣品。
32.根據權利要求23至31中任一項所述的溶液組，其特征在于，所述混合溶液包含熒光劑，并且其中任何所述著色劑的吸收峰不與所述熒光劑的發射或激發波長重疊。
33.根據權利要求23至32中任一項所述的溶液組，其特征在于，所述混合溶液包含熒光劑，并且所述混合溶液在所述熒光劑的發射或激發波長處的總吸收率為小于0. 05，優選小于0. 03，尤其小于0. I (Imm光程)。
34.根據權利要求I至22中任一項所述的方法或根據權利要求23至33所述的溶液組用于制備用于定量PCR的反應混合物的用途。
全文摘要
本發明涉及一種制備用于聚合酶鏈反應(PCR)測定的反應混合物的方法和一種用于PCR的溶液組。該方法包括提供樣品溶液，其包含將在所述PCR測定中擴增的生物樣品和為所述溶液提供第一顏色的第一著色劑；提供試劑溶液，其包含實施所述測定所需的至少一種其它物質和為所述溶液提供不同于第一顏色的第二顏色的第二著色劑；和將所述樣品溶液和第一試劑溶液混合以提供將經受PCR處理的混合溶液，該混合溶液由于所述第一和第二著色劑而具有不同于第一和第二顏色的第三顏色。本發明顯著輔助吸移PCR測定。
文檔編號G01N21/25GK102712951SQ201080044691
公開日2012年10月3日 申請日期2010年10月4日 優先權日2009年10月2日
發明者J·庫爾克拉, K·埃克林, S·烏西弗塔 申請人:芬蘭生化酶公司