通過毛細管電泳進行的糖化血紅蛋白分析及測定、用于毛細管電泳的緩沖液組合物及試劑盒的制作方法

專利名稱：通過毛細管電泳進行的糖化血紅蛋白分析及測定、用于毛細管電泳的緩沖液組合物及試劑盒的制作方法
通過毛細管電泳進行的糖化血紅蛋白分析及測定、用于毛細管電泳的緩沖液組合物及試劑盒技術領域
本申請涉及通過毛細管電泳進行的糖化血紅蛋白(具體而言血紅蛋白AJ的分析及測定領域。
本發明涉及一種通過生物試樣的毛細管電泳來進行分析的方法，該生物試樣包含一種或若干種血紅蛋白且具體而言一種或若干種糖化血紅蛋白，以及涉及用于該分析的適當緩沖液組合物、及用于通過毛細管電泳進行的糖化血紅蛋白的分析及測定的試劑盒。
背景技術：
血紅蛋白(Hb)是通常包含四個亞單元的球形分子，各亞單元由結合至血紅蛋白部分的多肽鏈構成。多肽鏈籠統地由名稱血紅蛋白分子的“珠蛋白部分”命名。
所有人類血紅蛋白由四條多肽鏈構成，兩條相同鏈為一組分成兩組。在成年人類中，通常存在三種類型的血紅蛋白血紅蛋白A(HbA)，其占絕大多數(其通常代表成年人中的約97%血紅蛋白)，其由2條α鏈及兩條β鏈構成(血紅蛋白α2β2)；血紅蛋白A2(HbA2，其通常代表成年人中的約1-3%血紅蛋白)，其由兩條α鏈及兩條δ鏈構成 (血紅蛋白α2δ》；及胎兒血紅蛋白(HbF)，其由兩條α鏈及兩條Υ鏈構成(血紅蛋白 α 2 Υ2)，其僅存在痕量(在成年人中通常小于血紅蛋白)且限于限制細胞群體(“F細胞”)。
血紅蛋白含有稱為次要物質的物質；其是糖化血紅蛋白。
糖化血紅蛋白(亦稱為糖基化血紅蛋白或糖基血紅蛋白)對應于通過在珠蛋白的胺官能團(NH2)上結合糖(主要為葡萄糖)而修飾的血紅蛋白分子組；血紅蛋白的NH2基團與源自還原糖的醛基團發生縮合。隨后通過阿馬道里重排穩定此非酶促反應。潛在糖化位點是血紅蛋白的四條珠蛋白鏈(視血紅蛋白的類型為α鏈及β、S、或Υ鏈)的N-端氨基酸及血紅蛋白的珠蛋白鏈中的游離氨基-ε基團(具體而言，賴氨酸殘基的那些)。
存在許多形式的糖化血紅蛋白；其視結合糖的數量、珠蛋白鏈及所述鏈上所結合糖的性質及所述糖于珠蛋白鏈上的位置而定。
當考慮任一 NH2S基上的糖化血紅蛋白分子時，使用術語“總糖化血紅蛋白”。
術語“血紅蛋白Al (HbAl) ”是指有一個糖分子結合至蛋白質一或兩條β鏈的N-端氨基酸的血紅蛋白A分子。非均相的Al部分具體而言包含次要部分Ala、~b及尤其Alc;。血紅蛋白Ala(HbAla)包括血紅蛋白Alal (HbAlal)(其中結合至N-端氨基酸的糖是果糖1，6_二磷酸)及血紅蛋白Ala2 (HbAla2)(其中結合至N-端氨基酸的糖是葡萄糖-6-磷酸)。在血紅蛋白Alb(HbAlb)的情形下，結合至N-端氨基酸的糖是丙酮酸。最終，結合至血紅蛋白A1JHbAJ 的β鏈的N-端氨基酸的糖是葡萄糖；HbA1。通過使一個葡萄糖分子與β鏈的N-端纈氨酸的NH2基團縮合獲得，源自先前形成的不穩定醛亞胺(稱為不穩定HbA1。或preAj的重排 (阿馬道里重排)形成穩定酮-胺。
最終，術語血紅蛋白Atl(HbAtl)通常涵蓋不包含結合至β鏈的N-端位置處的氨基酸的糖的非糖化A血紅蛋白及糖化A血紅蛋白。
蛋白質糖化(包括糖化血紅蛋白且具體而言血紅蛋白A1。，以及其他)是由血液中過高濃度的糖造成(如同糖尿病的情形一般)。蛋白質的糖化會改變其功能，從而造成細胞損傷、組織損傷及血管老化，并參與若干疾病(例如，動脈硬化、腎機能不全、糖尿病性視網膜病及白內障)的發展。血紅蛋白一旦糖化則不能充分運輸氧。
在所包括的所有血紅蛋白群及亞群中，HbA1。尤其令人感興趣，此乃因其用作患者的糖尿病狀態的長效標記。HbA1。的形成取決于血糖(血液中的葡萄糖濃度)。其參與紅血細胞的壽命的整個過程，通常為120天。因而，HbAlc的血液濃度指示測定前2-3個月期間的平均血糖。HbA1。的血液濃度的評價可指示該階段期間的長期高血糖癥。HbA1。的血液濃度并不受血液葡萄糖含量的短期波動的影響。因而，通過測量兩個日期之間的HbA1。含量， 可監測糖尿病的演化。
在糖尿病患者中，目的是獲得與特征為良好血糖平衡的圖表盡可能接近的HbAle 含量。在血液中，與A血紅蛋白(糖化血紅蛋白及非糖化血紅蛋白)的總濃度相比，具有正常血糖的非糖尿病人類的參照值是4%至6% HbAleWPdO-AZmm0Vm0I ；Panteghini等人， 2007)。
因而，對糖化血紅蛋白的檢測、具體而言HbA1。含量升高的檢測備受關注，用于診斷糖尿病(1型或2型)或監測糖尿病患者、具體而言用于評價抵抗糖尿病(1型或2型) 的治療功效。
然而，闡釋結果偶爾可較為困難，此乃因許多因素(具體而言異常血紅蛋白的存在)可竄改所述結果。
實際上，在某些患者中出現稱為“異常”或變體、具體而言由字母S、C、D、E、H及J 表示的血紅蛋白。血紅蛋白A部分或完全由一種或若干種異常血紅蛋白替代。具體而言， 其源自某些珠蛋白鏈的合成減少和/或由于另一氨基酸取代一氨基酸而對α、β、Y或δ 鏈的結構的修飾。因而，β鏈的修飾可產生例如S或C血紅蛋白(其中β鏈中6位置的谷氨酸分別經纈氨酸或賴氨酸取代的α 2 β 2血紅蛋白)。
這些異常血紅蛋白亦容易發生糖化。因而，存在與HbA1。一樣包含一個結合至β 鏈上的N-端纈氨酸的葡萄糖分子的血紅蛋白Sle(HbSle)及Cle(HbCle) (Abraham等人，1984)。
糖化血紅蛋白且具體而言血紅蛋白HbAle的分析及測定方法可分為2大類。
第一類(主要類)包括諸如免疫測定或親和層析等方法。其是基于結合至血紅蛋白的糖分子的結構特征。作為一實例，Wilson等人于1993的公開案及專利US 6，162，645闡述一種通過親和層析測定人類血樣中發現的糖化血紅蛋白的方法。該方法是基于使用經由聚陰離子化合物(例如，聚丙烯酸)偶聯至硼酸(boronic acid)、苯基硼酸、正硼酸(boric acid)或類似硼酸鹽化合物的固體帶正電相。當用該固相溫育欲分析血樣時，使該試樣中存在的糖化血紅蛋白分子的葡萄糖殘基與硼酸鹽化合物復合。由此將糖化血紅蛋白分子接枝于固相上。隨后可相對于未固定血紅蛋白的比例對固定于固相上的糖化血紅蛋白的比例進行定量。通過測量熒光的消光(Wilson等人，199 或通過使用針對人類血紅蛋白的標記抗體(US 6，162, 645)實施此測定。
用于糖化血紅蛋白分析及測定的第二類方法包括離子交換層析或電泳。其利用分子的理化特性且基于糖化蛋白質與非糖化蛋白質之間存在的電荷差。
在闡述于文獻中的可測定糖化血紅蛋白的各種分析方法中，電泳方法分成若干類凝膠分析包括聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦分析(Beccaria，1978 ；Simon, 1982 ； Stickland, 1982 ；Bosisio, 1994)及瓊脂凝膠分析(US 5，246，558 ；US 4，222，836 ；Menard, 1980)。毛細管電泳分析包括等電聚焦分析(Molteni，1994 ；Hempe, 1994)、使用抗-A1。抗體的自由溶液分析(US 5，431，793)、使用裸毛細管的自由溶液分析(US 5，599，433)及使用動態涂布的自由溶液分析(EP O 733 900 A2 ；US 5，611，903)。
通過生物試樣的電泳來進行的分析可分離試樣中存在的各種蛋白質、具體而言各種血紅蛋白，且使得能夠測定生物試樣中之一種或若干種目標蛋白質的量和/或比例。在毛細管電泳中，在填充有電解質的毛細管中，生物試樣的蛋白質隨其質量及其電荷的變化在電場效應下自陽極遷移至陰極。其由此產生包含一系列峰(亦稱為部分)的電泳遷移曲線，所述峰的每一種對應于一種或若干種蛋白質。異常血紅蛋白(例如HbS、HbC及HbE) 具有不同于HbA的電泳遷移率。此外，由于結合至β鏈的N-端氨基酸的糖殘基，HbA1具有減少的等電點且因此具有稍微不同于其它HbAtl型血紅蛋白的電荷。因而，在電泳場 (electrophoretic field)中或在離子交換樹脂中，HbA1的遷移速率不同于HbAtl的遷移速率，這使得可分離具有不同電荷的HbA1與HbA。。
毛細管電泳的優勢亦在于以下事實僅需要極少量欲分析的生物試樣。此外，通過此技術的分離可極為快速，此乃因為在分離期間可使用高電壓而不會造成試樣加熱過度。
在經涂布毛細管中實施通過等電聚焦的分析(Molteni，1994 ；Hempe, 1994)。使用甲基纖維素進行涂布。所用陰極電解質是氫氧化鈉(NaOH)且陽極電解質是磷酸(H3PO4)15 通過使用兩性電解質，此分析使得能夠分離血紅蛋白的各種變體，包括HbA1。，其峰極其接近 HbA的峰(ΔρΙ < 0. 10)。盡管此方法運行良好，但按常規并不易于實施且需極大精確度， 具體而言在兩性電解質的PH范圍方面(HbA1。的等電點(pi)極為接近HbAtlW等電點)。
在堿性ρΗ(ρΗ 8-10)的正硼酸鹽(borate)緩沖液中，使用已與抗HbAle單克隆抗體反應的試樣，實施利用抗-HbAle抗體的自由溶液分析(US 5，431，793)。更確切而言，使用未預先與抗-HbA1。抗體反應的工作試樣產生第一電泳圖。獲得單峰，面積為X，其含有所有血紅蛋白(包括HbAJ。通過分析已與抗-HbA1。抗體接觸的工作試樣獲得第二電泳圖。 由此分離未結合的抗-HbAle抗體、抗-HbAle抗體/HbAlc;復合物及未被抗體的復合的血紅蛋白。隨后通過第一電泳圖的峰下面積與第二電泳圖中未復合抗-HbA1。抗體的血紅蛋白之峰下面積(面積為y)之間的差值(即χ-y值)來測定HbAle的量。由此證明此方法實施起來耗時且復雜。
使用裸毛細管的自由溶液分析方法(US 5，599，433)于堿性pH(pH9_12)下包括結合至血紅蛋白的糖復合劑(正硼酸鹽)及兩性緩沖液(CAPQ。在所述條件下獲得的曲線 (示于本申請的

圖1中)顯示HbA1的峰(在專利US-5，599，433中闡述為HbAle的峰)與 HbA0的峰(參見實施例1)的分離相當小。此外，已純化次要部分的分析顯示HbAla、Alb部分與HbA1。共遷移，此會干擾最終測定結果(參見本申請的實施例2及圖幻。事實上，該技術分離HbAtl與HbA1部分，但不分離HbA1部分本身。
利用動態雙涂布的毛細管分析的技術(EP 0 733 900 A2 ;US5，611，903)僅用于基于市售毛細管電泳(Analis CEofix HbAlc試劑盒)的測試。其由用含有聚陽離子的 “起始劑”(存于溶液中，PH 4.6)首次洗滌毛細管組成，從而用該聚陽離子涂布毛細管壁。隨后利用含有聚陰離子的分析緩沖液(PH 4.6)實施第二次洗滌，其具有通過與聚陽離子相互作用提供第二涂布層的效應。則毛細管內壁上存在的負電荷的量甚至比裸毛細管上的高，從而產生更高電滲回流(electroosmotic flux)。所分析的各種形式的血紅蛋白(包括糖化Al血紅蛋白)之間獲得的拆分是令人滿意的，且分析時間較短。自實踐角度來講，必須在每一分析之間使用由試劑盒制造商提供的精確程序重新施加此雙重涂布，但該程序僅針對單毛細管設備((P/ACE，Beckman)，不適于常規分析)闡述。
因而，需要可有效分離糖化血紅蛋白(具體而言HbAJ與含有其它血紅蛋白的生物試樣中存在的其它血紅蛋白、變體、干擾形式(不穩定形式、乙酰化形式、氨甲酰化形式) 及其它次要部分(尤其HbAla及HbAlb)的試劑及簡單實踐方法。理想地，此一方法可直接自所得電泳曲線實施糖化血紅蛋白(具體而言HbAJ的半定量或定量測定。發明內容
本發明提出一種替代性毛細管電泳方法，其使得可對一種或若干種糖化血紅蛋白實施半定量或定量分析，該糖化血紅蛋白包含于包含(具體而言)其它血紅蛋白(糖化和 /或非糖化)的生物試樣中且包含至少一條珠蛋白鏈，該珠蛋白鏈包含結合至N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基。本發明的所述方法利用結合至所述糖化血紅蛋白的葡萄糖分子的結構特性及試樣的各種血紅蛋白之間存在的電荷差。
本發明者已顯示，通過使用特定緩沖液組合物可獲得糖化血紅蛋白的大大改良的分離、且更具體而言HbA1。的大大改良的分離，所述糖化血紅蛋白包含結合至至少一條珠蛋白鏈上、且具體而言鏈β上的N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基。
本發明方法的優勢之一的由于使用該緩沖液組合物，故對應于存于生物試樣中的一種或若干種類型的目標糖化血紅蛋白(一種或若干種類型的血紅蛋白，其包含結合至至少一條珠蛋白鏈上的N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基，例如HbAJ的電泳峰相對于不使用緩沖液組合物時可獲得的峰位置發生位移。此位移并不干擾試樣中其它蛋白質、具體而言其它血紅蛋白(糖化和/或非糖化)的分離。具體而言，此使得可分離HbA1。與其它次要HbA1 (具體而言HbAla及HbAlb)。因此，意味著分析結果可可靠地讀取且可使得準確測定一種或若干種目標糖化血紅蛋白，所述糖化血紅蛋白包含一個或若干個葡萄糖殘基，其中一個葡萄糖結合至至少一條珠蛋白鏈的N-端位置處的氨基酸(例如，血紅蛋白AJ。
因而，本發明方法是用于建立糖尿病患者的診斷或監測、具體而言用于評價抗糖尿病治療效力的所選方法。
因而，本申請提供一種通過糖化血紅蛋白(一種或若干種糖化血紅蛋白)的毛細管電泳來進行分析的方法，所述糖化血紅蛋白包含一個或若干個葡萄糖殘基且包含于包含一種或若干種血紅蛋白的生物試樣中，該方法包括使用包含至少一種化合物的緩沖液組合物，該化合物能夠專一性復合生物試樣的糖化血紅蛋白(一種或若干種糖化血紅蛋白)的葡萄糖殘基(一個或若干個殘基)并且于堿性ΡΗ(即大于7的ρΗ)下提供所述糖化血紅蛋白若干負電荷。
本申請上下文中所用術語“若干”意指至少兩個、即兩個或多于兩個，例如，2個、3 個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或多于10個。
本申請上下文中所用術語“至少一個”意指一個或若干。
本申請上下文中所用術語“血紅蛋白”意指血紅蛋白的任一形式或部分(包括次要部分)(不管其正常或異常)、以及所述血紅蛋白的許多變體(已闡述至少1000種血紅蛋白變體)。
本申請上下文中所用術語“糖化血紅蛋白”意指任何通過將一個或若干個糖(具體而言，一個或若干個葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖1，6- 二磷酸或丙酮酸)結合至一條或若干條珠蛋白鏈(任何珠蛋白鏈)來修飾的血紅蛋白。可將所述糖結合至珠蛋白鏈上的 N-端位置處的氨基酸和/或結合至具有游離氨基酸基團的氨基酸(例如，賴氨酸)。
本申請中所用術語“珠蛋白鏈”意指本領域技術人員已知的任一珠蛋白鏈、具體而言選自alpha(a)、beta(i3)、delta(S)及gamma(Y)鏈的鏈(不管其正常或異常)、或所述鏈中之一的變體。根據一特定實施方式，所述“珠蛋白鏈”是β鏈，例如A1血紅蛋白(具體而言、。、S或C)的β鏈。
當在本發明實施方式中提及“糖化血紅蛋白”時，應了解，所述實施方式對本申請中引用的每一特定類型的糖化血紅蛋白具有特定應用。
除非另有說明，否則本申請中所示的每一實施方式皆可獨立地和/或與任何一個或若干個其它所述實施方式組合使用。
本發明的毛細管電泳分析方法適用于包含至少一種糖化血紅蛋白的生物試樣，該糖化血紅蛋白包含一個或若干個葡萄糖殘基且必須包含結合至一條或若干條珠蛋白鏈上且具體而言在β鏈上N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基。在本申請中，所述血紅蛋白稱為“在N-端位置糖化的血紅蛋白”。
所述方法使得可分離一種或若干種在N-端位置糖化的血紅蛋白與其它糖化血紅蛋白(即，其中珠蛋白鏈無結合至N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基的糖化血紅蛋白)或非糖化血紅蛋白(其可存在于所分析的生物試樣中)。
根據一特定實施方式，β鏈上N-端位置處的氨基酸是纈氨酸。
在一優選實施方式中，本發明的分析方法欲用于分析包含血紅蛋白Alc;的生物試樣。具體而言，其適于分離血紅蛋白A1。與所分析生物試樣中可能存在的其它血紅蛋白或其它血紅蛋白(以不同方式糖化或非糖化)以及具體而言其它次要部分(例如與HbAla& HbAlb 分離)。
根據一特定實施方式，本發明的分析方法可分離血紅蛋白S1。和/或血紅蛋白Clc; 與所分析生物試樣中可存在的其它血紅蛋白(以不同方式糖化或非糖化)。
術語“緩沖液組合物”意指盡管添加少量酸或堿或盡管稀釋仍保留大約相同pH的組合物、具體而言溶液。
在本申請中使用術語“復合”(“to complex”或“complexing”)表示在兩個實體之間、具體而言在兩個分子(例如，小分子及大分子)之間經由官能團發生締合(化學或僅僅物理締合)。
在一優選實施方式中，該兩個實體中之一(能夠復合葡萄糖殘基的化合物)與來自另一實體(糖化血紅蛋白)的葡萄糖殘基的順式-二醇基團、具體而言兩個鄰位羥基組合(例如，與其反應)。
如可在“實施例”部分中所見，“專一性復合一種或若干種糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并且在堿性PH下為所述糖化血紅蛋白提供負電荷”在本申請中意指本發明上下文中所用化合物使得對應于在N-端位置由葡萄糖糖化的血紅蛋白的電泳遷移峰可位移出對應于在N-端位置由另一糖(例如，葡萄糖-6-磷酸、果糖1，6_ 二磷酸或丙酮酸)糖化的血紅蛋白的電泳遷移區以外，且優選可位移出對應于試樣中其它血紅蛋白的電泳遷移峰的區域以外。因而，不包含與β鏈的N-端氨基酸結合的任一葡萄糖殘基的次要部分(具體而言Ala 及Alb部分)并不干擾根據本發明方法進行的HbAlc;分析。
作為一實例，在本發明上下文中，可使用以下測試證實化合物專一性復合一種或若干種糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并在堿性PH下提供負電荷的能力將含有糖化血紅蛋白的各種純化部分且具體而言A0及Aic部分或ApAlb及Ala部分的參考試樣(例如，“HbAla、 HbA11^g合物”、“A1。”及“A。”，來自Exocell，USA)引入含有以下緩沖液組合物的毛細管電泳毛細管中200mM CHES、20mM腐胺、IOmM與120mM之間(例如，30mM或50mM)的測試化合物、(若需要)2. 5g/l氯化鈉、水、及(若需要)將pH值調節至大于9 (例如9. 4)的堿。隨后使用例如Capillaries (Sebia)設備于415nm的波長下實施裸毛細管自由溶液毛細管電泳。其后，研究所得電泳曲線；若對應于HbA1。的峰與對應于HbAtlW峰之間(或者視所用試樣的類型，對應于HbAle的峰與對應于HbApHbAlb及HbAla的峰之間)的分離完全，則在本發明意義上，測試化合物被視為能夠專一性復合葡萄糖殘基并能夠在堿性PH下提供負電荷。 相反，若對應于HbAle的峰及對應于HbAlb的峰(或者視所用試樣的類型，對應于HbAle的峰及對應于HbApHbAlb及HbAla的峰)迭置或重迭，則該測試化合物不被視為適用于實施本發明。
上文所示測試中的測試化合物的濃度僅以指示方式給出；若在上文所示測試上下文中，濃度為IOmM至120mM的測試化合物不能在對應于HbAle的峰與對應于試樣的其它血紅蛋白的峰的間產生足夠分離，則為獲得對應于HbAlc;的峰的最佳分離可超出此濃度范圍。
在本發明上下文中可使用任一化合物(即，通常為有機分子)、任一抗體、多肽、 肽、或在本發明意義上能夠專一性復合葡萄糖殘基并在堿性PH下提供負電荷的任意其它化合物。可使用本領域技術人員已知的任一方法產生適當抗體且其可為例如多克隆或單克隆抗體、嵌合抗體或抗體片段(例如，Fab片段)。
如可在“實施例”部分中所見，正硼酸(boric acid)并非在本發明意義上能夠專一性復合葡萄糖殘基并在堿性PH下提供負電荷的化合物，此乃因其并不使得可實施可靠分析且具體而言糖化血紅蛋白且(具體而言)HbA1。的可靠測定。下文更詳細定義適當化合物的實例。
與能夠專一性復合葡萄糖殘基的化合物復合的每一葡萄糖殘基與不同化合物分子相互作用。
根據一特定實施方式，當所述化合物以足量存于本發明緩沖液組合物中時，其尤其能夠專一性復合糖化血紅蛋白的N-端葡萄糖殘基，即對于包含結合至N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基的每一珠蛋白鏈(具體而言β鏈)而言，能夠專一性復合該葡萄糖殘基。因而，該化合物能夠專一性復合在A1。血紅蛋白或S1。或C1。血紅蛋白的β鏈上的N-端位置處結合的每一葡萄糖殘基。
根據一特定實施方式，當在本發明緩沖液組合物中存在足量該化合物時，其能夠專一性復合在N-端位置處由葡萄糖糖化的血紅蛋白的所有葡萄糖殘基。
根據一特定實施方式，當在本發明緩沖液組合物中存在足量該化合物時，不管其在珠蛋白鏈上的位置如何，該化合物均能夠專一性復合血紅蛋白的所有葡萄糖殘基。因而， 當該化合物在本發明緩沖液組合物中存在足量時，包含數量為X的葡萄糖殘基的血紅蛋白分子可結合數量為X的該化合物分子。
通過與生物試樣中糖化血紅蛋白的一個或若干個葡萄糖殘基專一性復合，該化合物在堿性PH下提供所述糖化血紅蛋白或多種血紅蛋白若干負電荷，即，使得這些糖化血紅蛋白于堿性PH下能夠帶有額外負電荷。
所述化合物可使與其復合的相同血紅蛋白的每一葡萄糖殘基皆于堿性pH下帶有若干負電荷。由于在堿性PH下這種負電荷供應，故由于包含至少一個葡萄糖殘基的血紅蛋白與所述化合物復合，其電泳遷移率得以改良。這在電泳曲線上通過對應于糖化血紅蛋白的電泳峰的位移來表現，所述糖化血紅蛋白包含一個或若干個葡萄糖殘基且存在于所分析的生物試樣中。
包含至少一個葡萄糖殘基且存于生物試樣中的所有血紅蛋白與復合葡萄糖并于堿性PH下提供負電荷的化合物形成復合物(當然，前提條件為該化合物存在足量以與這些血紅蛋白中每一種復合)。然而，不同血紅蛋白且具體而言包含至少一個葡萄糖殘基的不同血紅蛋白均具有不同等電點(由于其珠蛋白鏈的性質、這些珠蛋白鏈上的葡萄糖殘基的數量及位置、及可結合至該血紅蛋白的其它糖的數量、性質及位置)。由于通過每一葡萄糖殘基與該化合物復合而在堿性PH下提供負電荷，這些不同血紅蛋白之間的電荷差異在其呈與該化合物復合的形式時甚至更顯著。
包括結合至糖化血紅蛋白的珠蛋白鏈的至少一個上(具體而言在β鏈上)的 N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基的糖化血紅蛋白因此比其它血紅蛋白(不同糖化或非糖化)多至少一個葡萄糖。具體而言，血紅蛋白A1。在β鏈上比血紅蛋白Al的其它次要部分多至少一個葡萄糖。因此，這些在N-端位置處糖化的血紅蛋白當根據本發明與該化合物復合時在堿性PH下載有比其它血紅蛋白(不包含結合至珠蛋白鏈的N-端氨基酸的葡萄糖殘基的糖化血紅蛋白或非糖化血紅蛋白)更多的負電荷。
因而，通過增大包含葡萄糖的不同血紅蛋白之間和/或包含葡萄糖的一種或若干種血紅蛋白與所分析生物試樣中存在的其它血紅蛋白之間存在的電泳遷移率之差，可在 N-端位置處糖化的一種或若干種血紅蛋白與該試樣中可能存在的其它血紅蛋白之間、具體而言在血紅蛋白Ale與該試樣中可能存在的血紅蛋白A1血紅蛋白的其它次要部分之間達成更好分離。
因而，本發明方法可有效分離在N-端位置糖化的血紅蛋白(具體而言HbAJ與含有其它血紅蛋白的生物試樣中存在的其它血紅蛋白、某些變體及其它次要部分。此外，常規干擾分子(例如，不穩定、乙酰化或氨甲酰化形式)并不干擾使用本發明方法的HbA1。的測定。具體而言，本發明方法使得能夠在電泳分離步驟期間避免干擾，所述干擾可能是在堿性 PH下不存在通過復合提供的負電荷時由血紅蛋白A1。及生物試樣中存在的血紅蛋白A1的其它次要部分(包括HbAla及HbAlb)的共遷移所致。
隨后可在所分析生物試樣中可存在的另一或其它血紅蛋白存在下測定N-端位置處糖化的經分離血紅蛋白。因而，作為一實例，可在血紅蛋白A1的其它次要部分存在下且具體而言在HbAla和/或HbAlb存在下測定HbA1。，且所分析生物試樣中存在的這些其它次要部分不干擾該測定。
本申請中的術語“測定”(“to assay”或“assay”)意指可能在所分析生物試樣的一種或若干種其它血紅蛋白存在下測定目標血紅蛋白或多種目標血紅蛋白的量和/或測定所述目標血紅蛋白相對于該試樣中存在的血紅蛋白總量或某些血紅蛋白之量的比例。
在本發明上下文中實施的測定可為半定量測定，因而，測量給定血紅蛋白相對于該試樣中存在的另一血紅蛋白或其它血紅蛋白之量的百分比。因而，在HbA1。情形下，通常測量HbAle相對于一種或若干種其它A血紅蛋白之量的百分比；通常用對應于HbAle的電泳峰面積除以對應于HbAtl的峰面積或除以(對應于HbAle的峰面積+對應于HbAtl的峰面積) 之和、或除以所有HbA峰面積之和或除以(對應于HbAle的峰面積+對應于HbAtl的峰面積+ 對應于HbA2的峰面積)之和、或甚至除以電泳曲線的總表面積。
測定亦可為定量測定；隨后以該生物試樣中存在的給定血紅蛋白的毫摩爾數 (mmol)/摩爾另一血紅蛋白或其它血紅蛋白、例如以HbAle的毫摩爾數/摩爾HbA來表示所述結果。
根據本發明的一特定實施方式，專一性復合糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并使所述糖化血紅蛋白在堿性PH下具有負電荷的化合物包含若干官能團、具體而言兩個或兩個以上官能團。
所述官能團中的至少一個通過與(例如)葡萄糖殘基的順式-二醇基團、具體而言兩個鄰位羥基相互作用而專一性復合葡萄糖殘基(具體而言，結合至珠蛋白鏈上N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基)。作為一實例，該(這些)基團可為硼酸根基團、具體而言如本申請中所定義的硼酸根基團。
所述葡萄糖復合基團可使糖化血紅蛋白中每個復合葡萄糖殘基皆在堿性pH下具有一個負電荷，即，使每個復合血紅蛋白分子皆在堿性PH下具有一個或若干個負電荷(若血紅蛋白分子僅包含一個葡萄糖殘基則有一個負電荷，且若血紅蛋白分子包含η個葡萄糖殘基則有η個負電荷)。
該化合物的另一官能團、其它官能團之一、或其它官能團(即，不與葡萄糖復合的官能團)可使糖化血紅蛋白中的該血紅蛋白分子的每個經復合葡萄糖殘基皆在堿性PH下具有一個或若干個負電荷。
因而，在本發明的此特定實施方式中，每個根據本發明專一性復合葡萄糖殘基的化合物分子皆包含至少一個能夠復合糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基(且具體而言在N-端位置糖化的血紅蛋白的N-端葡萄糖殘基)的官能團及至少一個并不復合葡萄糖但使得該糖化血紅蛋白能夠在堿性PH下帶有多個額外負電荷的官能團，這是因為該官能團使該糖化血紅蛋白在堿性PH下具有一個或若干個補加負電荷。能夠復合葡萄糖的官能團亦可在堿性PH下提供負電荷。
根據本發明的一特定實施方式，專一性復合葡萄糖殘基并于堿性pH下提供負電荷的化合物(更確切而言該化合物的每一分子)可使糖化血紅蛋白分子(且具體而言在 N-端位置處糖化的血紅蛋白)中該糖化血紅蛋白分子的每一經復合葡萄糖殘基皆在堿性 PH下具有若干負電荷。優選地，其使一個糖化血紅蛋白分子中的每一復合葡萄糖殘基皆在堿性PH下具有至少兩個(具體而言2個、3個、4個、5個或6個)負電荷。
根據本發明的一特定實施方式，專一性復合葡萄糖殘基的一官能團或官能團中的至少一個在堿性PH下帶有負電荷。
根據本發明的一特定實施方式，能夠專一性復合糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并能使所述糖化血紅蛋白在堿性PH下具有負電荷的化合物包含一個或若干個可在堿性pH下離子化(具體而言可陰離子化)的基團。該化合物可為各種類型。舉例而言，該化合物可包含一個或若干個羧酸根、羧基、磺酸根和/或磺酰基。具體而言，該化合物可為多羧酸、具體而言二羧酸或三羧酸。該化合物亦可為聚磺酸，具體而言二磺酸或三磺酸。
根據本發明的一特定實施方式，可使糖化血紅蛋白分子中該糖化血紅蛋白分子的每一復合葡萄糖殘基在堿性PH下具有一個或若干個負電荷的基團、多個基團之一或多個基團包含一個或若干個可在如本申請中所定義堿性PH下離子化的基團且具體而言一個或若干個(具體而言2個或3個)羧酸根、羧基、磺酸根和/或磺酰基或由其組成。
根據本發明的一特定實施方式，專一性復合葡萄糖殘基的一基團、所述基團之一或所述基團包含一個或若干個硼酸根基團或由其組成。
在本申請中，術語“硼酸根基團(boronate group) ”意指具有下式的基團
權利要求
1.一種通過一種或若干種糖化血紅蛋白的毛細管電泳來進行分析的方法，所述糖化血紅蛋白包含于含有血紅蛋白的生物試樣中且包含至少一條珠蛋白鏈、具體而言β鏈，該珠蛋白鏈包含結合至N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基，所述方法包括使用包含至少一種化合物的緩沖液組合物，該化合物能夠專一性復合該生物試樣中的糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基、具體而言結合至糖化血紅蛋白中所述N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基并能使所述糖化血紅蛋白在堿性PH下具有若干負電荷。
2.如權利要求1所述的方法，其用于通過毛細管電泳分析包含于含有血紅蛋白的生物試樣中的血紅蛋白Alc;。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述能夠專一性復合該生物試樣中的糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并能在堿性PH下提供負電荷的化合物包含兩個或多于兩個的官能團， 所述官能團中的至少一種專一性復合一個或若干個葡萄糖殘基，另一官能團、其它官能團之一或所有其它官能團使所述糖化血紅蛋白在堿性PH下具有一個或若干個負電荷。
4.如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述能夠專一性復合該生物試樣中的糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并能在堿性PH下提供負電荷的化合物包含一個或若干個在堿性PH下可陰離子化的基團，具體而言一個或若干個羧酸根、羧基、磺酸根和/或磺酰基。
5.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述能夠專一性復合該生物試樣中的糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并能在堿性PH下提供負電荷的化合物包含一個(或多個)硼酸基和/或硼酸根基團，且具體而言是(i)硼酸根基化合物，其具有通式RB (OH) 2或RB (OH) ”其中基團R包含至少一個芳基和 /或烷基(直鏈、支鏈或環狀)和/或芳烷基和/或其它官能團或雜原子、和/或其組合，且所述基團R使糖化血紅蛋白中與該硼酸根基團復合的每一葡萄糖殘基在堿性PH下具有一個或若干個負電荷；或( )所述硼酸根基化合物的鹽。
6.如權利要求5所述的方法，其中該硼酸根基化合物是多取代的苯基硼酸酯、具體而言是經例如羧基和/或磺酰基基團二取代的苯基硼酸酯，且更具體而言是基團R為二酸、優選二羧酸的化合物。
7.如權利要求5或6所述的方法，其中該硼酸根基化合物是二羧基苯基硼酸，優選選自 3,4- 二羧基苯基硼酸及3，5- 二羧基苯基硼酸，更優選為3，5- 二羧基苯基硼酸。
8.如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中在該緩沖液組合物中所述能夠專一性復合該生物試樣中的糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并能在堿性PH下提供負電荷的化合物的濃度相對于蛋白質的總量、相對于該生物試樣中存在的所有血紅蛋白的總量或相對于該生物試樣中存在的所有包含葡萄糖的血紅蛋白的總量在化學計量上過量。
9.如權利要求1至8中任一項所述的方法，其中在該緩沖液組合物中所述能夠專一性復合該生物試樣中的糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并能在堿性PH下提供負電荷的化合物的濃度在0. IOmM至IOOmM范圍內、優選在IOmM至60mM范圍內、且更優選在20mM至50mM范圍內，例如30mM。
10.如權利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述緩沖液組合物還包含阻流劑， 具體而言所述阻流劑是脂族二胺、更具體而言所述阻流劑是選自以下的脂族二胺1，3_ 二氨基丙烷、1，4_ 二氨基丁烷(腐胺)、1，5_ 二氨基戊烷(尸胺)、1，6_ 二氨基己烷、精胺及DETA，或所述脂族二胺的衍生物，例如脂族聚胺、環狀聚胺或脂族二胺鹽、或其混合物之一， 且仍更具體而言所述阻流劑是腐胺或衍生物。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述緩沖液組合物中的阻流劑的濃度在0.IOmM至 40mM范圍內、優選在IOmM至30mM范圍內且更優選在15mM至25mM范圍內，例如20mM。
12.如權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述緩沖液組合物還包含-緩沖化合物，其pKa在8. 0至11. 0范圍內；和/或-堿；和/或-鹽，具體而言鈉鹽，例如氯化鈉；和/或-適當的稀釋溶液，例如水。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述緩沖化合物是兩性離子化合物，具體而言選自 AMP、AMPD, AMPSO, N- 二甘氨酸、CABS、CAPS、CAPSO, CHES, HEPBS,甲胺、TABS、TAPS、氨基乙磺酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸及iTris的化合物，例如CHES、CAPS或CAPS0。
14.如權利要求12或13所述的方法，其中所述緩沖液組合物中的所述緩沖化合物的濃度在20mM至500mM范圍內、優選在50mM至400mM范圍內且更優選在150mM至300mM范圍內，例如200mM。
15.如權利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述緩沖液組合物的pH為9或更大、優選在9. 0至11. 0范圍內且pH更優選在9. 0至10. 0范圍內，例如pH為9. 4。
16.如權利要求1至15中任一項所述的方法，其包括以下步驟a)將所述緩沖液組合物及生物試樣引入電泳毛細管中；及b)通過毛細管電泳分離所述生物試樣的各成分。
17.如權利要求16所述的方法，其中在分離所述生物試樣中各成分的步驟后實施檢測該生物試樣中所存在的一種或若干種血紅蛋白的步驟。
18.如權利要求16或17所述的方法，其還包括自與所檢測血紅蛋白之量成比例的檢測信號產生電泳圖的步驟。
19.如權利要求1至18中任一項所述的方法，其還包括如下步驟具體而言自如權利要求18中所定義的電泳圖測定所述生物試樣中所存在的一種或若干種血紅蛋白的量和/ 或該生物試樣中所存在的一種或若干種血紅蛋白相對于該生物試樣中存在的蛋白質總量、 血紅蛋白的總量或某些血紅蛋白的量的比例。
20.如權利要求1至19中任一項所述的方法，其還包括相對于一種或若干種標準化校正劑對所述生物試樣中存在的一種或若干種血紅蛋白進行定量的步驟。
21.如權利要求1至20中任一項所述的方法，其中所述生物試樣是血樣、具體而言正常或不正常血樣、經洗滌、經傾析、經離心血樣或全血血樣，若適當所述試樣經溶血。
22.如權利要求1至21中任一項所述的方法，其中將所述生物試樣稀釋于溶血溶液、具體而言選自下述的溶血溶液中-溶血溶液Capillaries 血紅蛋白(e)；-溶血溶液Hydragel HbAlc ；-溶血溶液MINICAP 血紅蛋白(e)；-純水；-補充有表面活性劑的水，具體而言補充有Triton的水；及-其混合物。
23.一種緩沖液組合物，其適于通過毛細管電泳分析一種或若干種糖化血紅蛋白，所述糖化血紅蛋白包含結合至至少一條珠蛋白鏈上、且具體而言β珠蛋白鏈上的N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基且包含于含有一種或若干種血紅蛋白的生物試樣中，所述組合物如權利要求1至15中任一項中所定義。
24.一種試劑盒，其包含如權利要求23所述的緩沖液組合物且若適當則包含使用說明。
25.如權利要求1至7中任一項中所定義的能夠專一性復合生物試樣的糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并能在堿性PH下提供負電荷的化合物、和/或如權利要求1至15或23中任一項所定義的緩沖液組合物和/或如權利要求M所述的試劑盒，其用于診斷人類或非人類哺乳動物的糖尿病和/或監測人類或非人類哺乳動物的血糖平衡。
26.一種化合物，其能夠專一性復合生物試樣的糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并能在堿性PH下提供負電荷，其用于如權利要求25所述的用途，其中所述化合物是(i)硼酸根基化合物，其具有通式RB (OH) 2或RB (OH) ”其中基團R包含至少一個芳基和 /或烷基(直鏈、支鏈或環狀)和/或芳烷基和/或其它官能團或雜原子、和/或其組合，且該基團R使糖化血紅蛋白中與該硼酸根基團復合的每一葡萄糖殘基在堿性PH下具有一個或若干個負電荷；或( )所述硼酸根基化合物的鹽。
27.—種如權利要求1至7中任一項中所定義的能夠專一性復合生物試樣的糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并能在堿性PH下提供負電荷的化合物、和/或如權利要求1至15或23 中任一項所定義的緩沖液組合物和/或如權利要求M所述的試劑盒用于下述的用途通過毛細管電泳分離一種或若干種糖化血紅蛋白與生物試樣中存在的其它蛋白質、具體而言至少一種另一血紅蛋白及優選其它血紅蛋白，所述糖化血紅蛋白包含至少一條珠蛋白鏈，該珠蛋白鏈含有結合至N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基。
全文摘要
本發明涉及一種通過糖化血紅蛋白的毛細管電泳進行分析的方法，所述糖化血紅蛋白包含于生物試樣中且包含至少一條珠蛋白鏈，該珠蛋白鏈包含結合至N-端位置處的氨基酸的葡萄糖殘基，其中所述方法包括使用包含至少一種化合物的緩沖液組合物，該化合物能夠專一性復合一種或多種糖化血紅蛋白的葡萄糖殘基并且在堿性pH下能夠向所述血紅蛋白傳遞多個負電荷。舉例而言，所述化合物可為3，4-或3，5-二羧基苯基硼酸、優選為3，5-二羧基苯基硼酸。所述方法尤其可用于分離及測定生物試樣中存在的HbA1c血紅蛋白，該生物試樣任選包含其它血紅蛋白、具體而言其它次要部分。本發明還涉及用于該分析中的緩沖液組合物、以及用于通過毛細管電泳進行的糖化血紅蛋白的分析及測定的試劑盒。
文檔編號G01N27/447GK102498392SQ201080038819
公開日2012年6月13日 申請日期2010年6月30日 優先權日2009年7月1日
發明者D.西莫寧, F.羅伯特, G.德沙姆普斯 申請人:落碧亞公司