用于抗原提取過程的方法和裝置的制作方法

專利名稱：用于抗原提取過程的方法和裝置的制作方法
用于抗原提取過程的方法和裝置背景診斷細胞成像使用多種方法，通過這些方法，可使細胞或組織產生的分子特異定位到那些細胞或組織。這給研究者提供那些所給分子的產生或活性的部位方面的信息。對于常規病理學中蛋白的特異定位，常規利用稱為免疫組織化學(IHC)的程序。在IHC中，將用于特異抗原的抗體施加到識別已知特異分子的固定組織樣品作為第一步驟。然后用已與酶(如辣根過氧化物酶)化學偶合的第二抗體檢測此抗體。在用顯色底物(如二氨基聯苯胺(DAB))培養后，在已于關注蛋白的特異部位結合到第一抗體的第二抗體部位產生有色沉積。此程序目前用于臨床病理學實驗室中超過200種抗體，在研究環境中多更多。組織處理的性質需要樣品在嵌入石蠟和在切片機上微切片之前“固定”，以產生適用于免疫染色的組織切片。在此過程期間，用產生保持組織細胞特征的化學交聯的甲醛處理保存蛋白。甲醛主要通過使蛋白中的伯胺基與蛋白或DNA中的其它鄰近氮原子通過-CH2-鍵交聯而保存或固定組織或細胞。然而，組織固定的過程經常掩蓋對診斷和預測目的所期望檢測的特異蛋白上的抗原。為了檢測單個靶分子，一般使程序最佳化，并且在需要時，為了檢測另外的靶分子，以不同方式處理連續切片。隨著檢測單一樣品中多種抗原的能力的提高，需要與檢測多種蛋白相容的一致的組織處理。簡述第一方面，本發明提供甲醛固定的組織樣品的抗原提取的方法，所述方法包括以下步驟在大于90°C的溫度在第一抗原提取溶液中培養甲醛固定的組織樣品，將組織樣品轉移到第二抗原提取溶液，并在大于90°C的溫度在第二抗原提取溶液中培養組織樣品。第二方面，本發明提供用于提取甲醛固定的組織樣品中的抗原的試劑盒，所述試劑盒包含提取樣品中至少一部分未提取抗原的第一抗原提取溶液，和提取樣品中至少一些另一部分未提取抗原的第二抗原提取溶液。第三方面，本發明提供用于進行抗原提取方法的樣品處理裝置，所述樣品處理裝置包含樣品處理子系統、試劑分配子系統和信號檢測子系統。附圖當參考附圖閱讀以下詳細描述時，本發明的這些和其他特征、方面和優點將變得更好理解，其中在全部附圖中相同的符號代表相同的部件

圖1為用于使甲醛固定的組織樣品與抗原提取溶液接觸的代表性樣品處理裝置。圖2為顯示與一步程序比較用二步程序的增強染色的單色顯微相片(在20X或 63X放大倍數)。圖3顯示單色顯微相片(在20X放大倍數)，其顯示在BrCA腫瘤的多元分析FISH 中用二步程序的增強染色。圖4為人工二步抗原提取方法與自動方法比較的定量分析結果的條形圖。圖5顯示在通過人工二步抗原提取方法或兩種自動抗原提取方法之一制備的樣品上對抗原-S6染色的漂白作用的單色顯微相片(在20X放大倍數)。詳述
為了更清楚和簡要地描述和指出要求保護的本發明的主題，對在以下說明及其所附權利要求中使用的具體術語提供以下定義。定義“抗體”是指特異結合到另一個分子的特定空間和極性組織從而定義為與所述特定空間和極性組織互補的免疫球蛋白。抗體可以為單克隆或多克隆，并且可通過在本領域公知的技術制備，例如宿主的免疫和血清的收集(多克隆)，或者通過制備連續雜交細胞系，并收集分泌的蛋白(單克隆)，或者通過克隆和表達核苷酸序列或其誘變處理的變種， 至少對天然抗體的特異結合所需的氨基酸序列編碼。抗體可包括完全免疫球蛋白或其片段，這些免疫球蛋白包括不同種類和同種型，如IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2a, IgG2b和IgG3、 IgM0功能抗體片段可包括能夠保持以相似親合力結合到全長抗體的抗體部分(例如，Fab、 Fv和F(ab' )2或？油')。另外，在適當時，可使用免疫球蛋白或其片段的聚集體、聚合物和綴合物，只要實質保持對特定分子的結合親合力。“抗原”是指可結合抗體或抗體片段的物質。抗原可以為內源性，由此使它們由于正常或異常細胞代謝或由于病毒或胞內細菌感染在細胞內產生。內源性抗原包括異種(異源)、自體和個體基因型或同種(同源)抗原。抗原也可以為腫瘤特異抗原或由腫瘤細胞展現。在此情況下，將它們稱為腫瘤特異抗原(TSA)，一般產生于腫瘤特異突變。抗原也可以為由腫瘤細胞和正常細胞展現的腫瘤相關抗原(TAA)。抗原也包括CD抗原，CD抗原是指由白細胞表達的任何一些細胞-表面標記，并且可用于區分細胞譜系或發育階段。這些標記可通過特異單克隆抗體識別，并且通過它們的分化簇編號。“FISH”和“CISH”分別指熒光原位雜交和顯色原位雜交。FISH是用于檢測和定位在染色體上是否存在特異DNA序列或在轉錄部位和在細胞其它部分中是否存在RNA序列的細胞遺傳學技術。FISH使用只結合到部分染色體的熒光探針，用那些部分它們顯示高度序列相似性。CISH允許在福爾馬林固定的石蠟嵌入(FFPE)組織上在亮視野顯微鏡下用常規酶促反應檢測基因擴增、染色體易位和染色體數。“免疫染色”是指檢測樣品中特異蛋白的基于抗體的方法。免疫染色包括免疫細胞化學染色和免疫組織化學染色兩者。免疫細胞化學(ICC)染色是指使用靶向細胞上的抗原的抗體的技術。可進行此染色，以確定存在某些疾病，例如癌癥的類型。免疫組織化學 (IHC)染色是指通過使用標記的抗體作為特異試劑通過抗原-抗體相互作用使組織切片中的抗原染色和定位，所述相互作用通過標記可視化，所述標記比如熒光團、反應的酶底物、 放射性元素或膠體金。“探針”是指具有結合劑和標記(如信號發生劑或酶)的劑。在一些實施方案中， 結合劑和標記(信號發生劑或酶)在單一實體中具體化。本文所用的“結合劑”是指能夠與另一個分子(如結合到抗體的抗原)反應或締合的分子。結合劑和標記可直接(例如，通過結合到結合劑的熒光分子)或間接(例如，通過連接劑，可包括分裂部位)結合，并在單一步驟施加到組織樣品。在供選的實施方案中，結合劑和標記在離散的實體中具體化(例如，能夠結合靶和酶的第一抗體或能夠結合第一抗體的信號發生劑標記的第二抗體)。在結合劑和標記(信號發生劑或酶)為分離的實體時，它們可在單一步驟或多個步驟施加到組織樣品。術語“熒光探針”是指具有偶合到熒光信號發生劑的結合劑的劑。“信號發生劑”是指能夠提供用一種或多種檢測技術(例如光譜測定法、量熱法、光譜法或目測)可檢測的信號的分子。可檢測信號的適合實例可包括光學信號和電學信號或放射信號。信號發生劑的實例包括一種或多種生色團、熒光團、拉曼活性標記或放射性標記。如上所述，關于探針，在一些實施方案中，信號發生劑和結合劑可存在于單一實體中(例如，具有熒光標記的靶結合蛋白)。或者，結合劑和信號發生劑可以為在引入樣品前或引入樣品后相互締合的離散實體(例如，受體蛋白和對抗那種特定受體蛋白的標記的抗體)。“熒光團”或“熒光信號發生劑”是指在通過曝露于特定光波長激發時發射不同波長的光的化合物。熒光團可根據它們的發射分布或“顏色”來描述。綠色熒光團(例如， Cy3、FITC和Oregon Green)可表征為其一般在515至540納米范圍波長的發射。紅色熒光團(例如，Texas Red、Cy5和四甲基若丹明)可表征為其一般在590至690納米范圍波長的發射。熒光團的實例包括但不限于4-乙酰氨基-4'-異硫氰酸基芪_2，2' - 二磺酸、吖啶、吖啶和吖啶異硫氰酸酯的衍生物、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N_[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亞胺-3，5-二磺酸鹽(Lucifer Yellow VS)、 N-(4-苯胺基-1-萘基)馬來酰亞胺、氨基苯甲酰胺、Brilliant Yellow、香豆素、香豆素衍生物、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，Coumarin 120)、7_氨基-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)、焰紅染料(cyanosine)、4'，6_ 二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚(DAPI)、5'， 5〃 -二溴連苯三酚-砜酞出1~0111叩71~呢￡11101徹(1)、7-二乙基氨基-3-(4'-異硫氰酸基苯基)4-甲基香豆素，_，4，4' -二異硫氰酸基二氫-芪_2，2' -二磺酸、4，4' - 二異硫氰酸基芪_2，2' -二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)、曙紅、曙紅衍生物(如，曙紅異硫氰酸酯)、赤蘚紅、赤蘚紅衍生物(如赤蘚紅B和赤蘚紅異硫氰酸酯)； 乙啶；熒光素和衍生物，如5-羧基熒光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基熒光素 (DTAF)、2' 7' -二甲氧基-4' 5' -二氯_6_羧基熒光素(JOE)、熒光素、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、QFITC (XRITC)；熒光胺衍生物(在與胺反應后為熒光性)；IR144 ；IR1446 ；孔雀綠異硫氰酸酯；4-甲基傘形酮；鄰甲酚酞；硝基酪氨酸；堿性副品紅；酚紅，B-藻紅素；鄰苯二甲醛衍生物(在與胺反應后為熒光性)；芘和衍生物，如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亞氨基 1-芘丁酸酯；Reactive Red 4(Cibacron. RTM. Brilliant Red 3B_A)、若丹明和衍生物(如 6-羧基-X-若丹明(ROX)、6_羧基若丹明(R6G)、麗絲胺若丹明B磺酰氯、若丹明(Iihod)、 若丹明B、若丹明123、若丹明X異硫氰酸酯、磺基若丹明B、磺基若丹明101和磺基若丹明 101的磺酰氯衍生物(Texas Red) ；N,N,N' ,N'-四甲基_6_羧基若丹明(TAMRA)；四甲基若丹明，四甲基若丹明異硫氰酸酯(TRITC)；核黃素；玫紅酸和鑭系螯合物衍生物，量子點， 菁，吡喃鐺(pyreIium)染料和方酸。“靶”是指存在于組織樣品時可檢測的組織樣品組分。靶可以為存在天然產生的特異結合劑(例如，抗體)或可制備特異結合劑(例如，小分子結合劑或適配體)的任何物質。通常，結合劑可通過靶的一個或多個離散化學部分或靶的三維結構組分(例如，產生于肽折疊的3D結構)結合到靶。靶可包括一種或多種天然或改性肽、蛋白(例如，抗體、親和體或適配體)、核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA或適配體)、多糖(例如，凝集素或糖)、脂質、酶、酶底物、配體、受體、抗原或半抗原。在一些實施方案中，靶可包括蛋白或核酸。在一些實施方案中，靶可包括蛋白和核酸二者。本發明包括總的來說涉及應用于分析、診斷或預測應用(如分析物檢測、組織化學、免疫染色、免疫組織化學、免疫細胞化學或免疫熒光)的方法的實施方案。在一些實施方案中，本文公開的方法可特別應用于免疫組織化學和免疫細胞化學。根據一個實施方案，描述了一種方法，其中處理從病理學取樣得到的組織切片，然后蛋白檢測用于生物標記評價。在一個實施方案中，方法包括兩步程序，此程序可應用于多種蛋白抗原，并且可提供高水平抗原提取。在某些實施方案中，這允許臨床相關樣品的多元診斷。在一些實施方案中，組織樣品包括來自健康或患病組織的組織切片(例如，來自結腸、乳腺組織、前列腺的組織切片)。組織樣品可包括組織切片的單一部分或片，例如，從組織切片切割的組織或細胞的薄片。在一些實施方案中，組織樣品的相同切片可在形態學和分子水平兩者分析。在一些實施方案中，可首先使組織樣品固定，然后通過醇的遞增系列脫水，滲透， 并用石蠟或其它切片介質嵌入，以便可切割組織樣品。在供選的實施方案中，可切割組織樣品，隨后固定。在一些實施方案中，可在石蠟中嵌入組織樣品并處理。可使用的石蠟的實例包括但不限于Paraplast、Broloid和Tissuecan。一旦嵌入組織樣品，就可將樣品通過切片機切成切片。切片的厚度可根據組織和分析的類型改變。在某些實施方案中，切片可具有約2微米至約5微米范圍的優選厚度。一旦切割，就可用粘合劑使切片附著到玻片。玻片粘合劑的實例可包括但不限于硅烷、明膠、聚L-賴氨酸。在實施方案中，如果石蠟用作嵌入材料，則可使組織切片去石蠟， 并在水中重新水合。組織切片可例如用有機劑(如二甲苯或醇的逐漸遞減系列)去石蠟。在其他實施方案中，甲醛固定的組織樣品可粘著到固體載體上，以允許其在制備和成像過程期間分析、轉移和移動。通過物理吸附、共價鍵形成或其組合，可使組織樣品固定在固體載體上。固體載體可包括聚合、玻璃或金屬材料。固體載體的實例包括膜、微量滴定板、珠料、過濾器、試片、玻片、蓋片和試管。在一個實施方案中，描述了一種方法，其中使甲醛固定的組織樣品與第一抗原提取溶液接觸，并加熱到大于90°C的溫度經歷大于10分鐘的時間，更優選約20分鐘時間。加熱可用高壓鍋、高壓滅菌器、水浴、熱板、微波或蒸汽加熱器進行，以對浸入抗原提取溶液的組織樣品提供均勻加熱。然后，不用另外的處理，將組織樣品轉移到第二抗原提取溶液(其預熱到大于90°C的溫度)經歷相似時間。預熱可用高壓鍋、高壓滅菌器、水浴、熱板、微波、 蒸汽加熱或其組合進行，并且可在加熱第一抗原提取溶液時進行。在第二抗原提取溶液培養樣品優選在大氣壓并且通過只在熱溶液中浸漬而進行。這可防止組織損害。在一個實施方案中，第一抗原提取溶液為具有約5和約7之間范圍pH的緩沖溶液。第一抗原提取溶液可以為用于保持PH在微酸性至中性范圍的常用緩沖溶液。在某些實施方案中，緩沖劑可包括檸檬酸、磷酸二氫鉀、硼酸、二乙基巴比妥酸、哌嗪-N，N'-雙 O-乙磺酸)、二甲基次胂酸、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其組合。在其它實施方案中，緩沖溶液可以為在升高的溫度具有約6. 0的pH的檸檬酸磷酸鈉緩沖溶液。利用加熱，第一抗原提取溶液可作用于使在樣品固定期間在福爾馬林和抗原之間可能形成的交聯鍵水解。這導致提取樣品中至少一些部分抗原。在一個實施方案中，第二抗原提取溶液為具有約7. 5至約11范圍的堿性pH的緩沖溶液。第二抗原提取溶液可以為用于保持PH在微堿性范圍的常用緩沖溶液。在某些實施
7方案中，緩沖溶液可包含三(羥基甲基)甲基胺(TRIS)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(TAPS)、N， N-雙(2-羥基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羥基甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4_2_羥基乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPEQ、2-{[三(羥基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TEQ或其組合。在另一個實施方案中，緩沖溶液可以為在升高的溫度具有約10的pH的TRIS-HCl緩沖劑。與第一抗原提取溶液一樣，第二抗原提取溶液可作用于使在樣品固定期間在福爾馬林和抗原之間可能形成的交聯鍵水解。被提取的抗原部分為樣品中未提取抗原的至少一些另一部分。應了解，在其它實施方案中，第一抗原提取溶液可以為約7. 5至約11范圍的緩沖溶液，第二抗原提取溶液可以為約5至約7范圍的緩沖溶液。通過暴露于第一和第二抗原提取溶液提取的抗原可對免疫染色更敏感，以允許分析和功能形態學研究兩者。免疫染色包括免疫組織化學(IHC)染色和免疫細胞化學(ICC) 染色兩者。在某些實施方案中，改良可包括增加的正染色強度，并減小背景染色。在某些實施方案中，在施加第二抗原提取溶液后，可進行樣品的免疫染色。可使抗體溶液(例如，探針)經歷足夠時間并在適用于使標記抗體結合到抗原的條件下與組織切片接觸。可使用兩種檢測方法直接或間接。在直接檢測中，信號發生劑標記的第一抗體 (例如，熒光團標記的第一抗體)可用抗原在組織樣品中培養，這可以可視化，不用其它抗體相互作用。在間接檢測中，未綴合的第一抗體可用抗原培養，然后，可使標記的第二抗體結合到第一抗體。可發生信號擴增，因為數個第二抗體可以與第一抗體上的不同表位反應。 在可使第二抗體綴合到酶促標記的實施方案中，可加入顯色或熒光底物，以提供抗原的可視化。在一些實施方案中，可使兩種或更多種(最多四種)第一抗體(標記或未標記)與組織樣品接觸。然后，可使未標記抗體與相應的標記的第二抗體接觸。在一些實施方案中， 其它方法可用于信號增強，例如使用標記的第三或第四抗體。在一些實施方案中，在抗原提取過程后，將核酸探針施加到樣品，以進行熒光原位雜交(FISH)或顯色原位雜交(CISH)。可用檢測系統檢測來自探針中的信號發生劑的信號。所用檢測系統的性質可取決于所用信號發生劑的性質。檢測系統可包括電子自旋共振(ESR)檢測系統、電荷耦合器件(CCD)檢測系統(例如，對于放射性同位素)、熒光檢測系統、電檢測系統、照相軟片檢測系統、化學發光檢測系統、酶檢測系統、原子力顯微鏡(AFM)檢測系統和掃描隧道顯微鏡 (STM)檢測系統(兩者例如用于檢測微珠)、光學檢測系統、近場檢測系統或總內反射(TIR) 檢測系統。可用一種或多種上述技術觀察來自第一信號發生劑的第一信號的一個或多個特征。在一些實施方案中，可用一種或多種上述技術測定信號強度、信號波長、信號位置、信號頻率或信號轉移。在一些實施方案中，可觀察、檢測并記錄信號的一個或多個前述特征。在一些實施方案中，信號發生劑可包括熒光團，并且可用熒光檢測系統測定熒光波長或熒光強度。在一些實施方案中，可原位觀察信號，即，可從通過結合劑結合到組織樣品中的靶的信號發生劑直接觀察信號。在一些實施方案中，可在組織樣品內分析來自信號發生劑的信號，排除單獨的基于陣列的檢測系統的需要。在其它實施方案中，在探針結合后，可使信號從結合劑分離，并離開生物樣品檢測。分離信號的方法可包括但不限于ELISA和質譜法、雜化微陣列。在一些實施方案中，觀察信號可包括捕獲組織樣品的圖像。在一些實施方案中，根據本文公開的方法，可用連接到成像裝置的顯微鏡作為檢測系統。在一些實施方案中，可激發信號發生劑(如，熒光團)，并可觀察得到的信號(如，熒光信號)，并以數字信號的形式記錄(如，數字化圖像)。對于用適合的熒光過濾器結合在樣品中的不同信號發生劑(如果存在)，可重復相同程序。可使化學劑施加到組織樣品以修改信號。在一些實施方案中，信號修改可包括一種或多種信號特征變化，例如，信號強度減小、信號峰轉移、共振頻率變化或導致信號去除的信號發生劑分裂(去除)。在一些實施方案中，化學劑可以為溶液的形式，并且可使組織樣品與化學劑溶液接觸預定量的時間。化學劑溶液的濃度和接觸時間可取決于期望的信號修改的類型。在一些實施方案中，可選擇用于化學劑的接觸條件，使得結合劑、靶、組織樣品和結合劑與靶之間的結合可不受影響。在一些實施方案中，化學劑可只影響信號發生劑，化學劑可不影響靶/結合劑結合或結合劑完整性。因此，例如，結合劑可包括第一抗體或第一抗體/第二組合。根據本文公開方法的化學劑可只影響信號發生劑，第一抗體或第一抗體/第二抗體組合可基本保持不受影響。在一些實施方案中，結合劑(如，第一抗體或第一抗體/第二抗體組合)可在使樣品與化學劑接觸后保持結合到組織樣品中的靶。在一些實施方案中，結合劑可在使樣品與化學劑接觸后保持結合到組織樣品中的靶，并且結合劑整體性可保持基本不受影響(例如，在化學劑存在下抗體可實質上不變性或洗脫)。在其它實施方案中，化學劑可影響靶/結合劑結合或結合劑/信號接觸/連接。在一些實施方案中，可通過“脫去探針并重新探測樣品來檢測多個靶。脫去一般指任何方法，例如但不限于浸入非標記溶液或其它物質或通過重新施加非標記溶液或其它物質(所述其它物質比如但不限于水、鹽水、緩沖鹽水或乙醇)沖洗，以提供用于從樣品離解、 分散和去除探針的介質。在一些實施方案中，可用光熒光漂白報道基因或信號發生劑，從而允許信號發生劑重新用于新的探針上而檢測多個靶。可反復重復這些過程，以達到相同樣品的多重探測。在一些實施方案中，可在使樣品與化學劑接觸后觀察信號的特征，以確定信號修改的有效性。例如，可在施加化學劑之前觀察顏色，在施加化學劑之后顏色可不存在。在另一個實例中，可在與化學劑接觸之前和在與化學劑接觸之后觀察來自熒光信號發生劑的熒光強度。在一些實施方案中，可將信號強度減小預定量稱為信號修改。在一些實施方案中， 信號修改可以指信號強度減小大于約50%范圍的量。在一些實施方案中，信號修改可以指信號強度減小大于約60%范圍的量。在一些實施方案中，信號修改可以指信號強度減小大于約80%范圍的量。在一些實施方案中，可用本文以上對第一探針所述的一種或多種程序使組織樣品與第二探針接觸。第二探針可能夠結合到不同于第一探針結合的靶的靶上。在其中多個探針可與組織樣品在第一探針接觸步驟中接觸的實施方案中，第二探針可能夠結合不同于第一探針組結合的靶的靶。在一些實施方案中，可使組織樣品與多個探針在第二探針接觸步驟中接觸。可用一種或多種上述檢測方法觀察來自第二信號發生劑(存在于隨后探針)的隨后(例如，第二、第三等)信號的一個或多個特征。在一些實施方案中，可用一種或多種上述技術測定信號強度、信號波長、信號位置、信號頻率或信號轉移。與第一信號類似，得到的隨后信號(例如，熒光信號)可以數字信號形式記錄(如，數字化圖像)。在一些實施方案中，觀察隨后信號也可包括捕獲組織樣品的光學圖像。在一些實施方案中，在使樣品與隨后(例如，第二、第三等)探針接觸后，可重復劑修改(agent modification)和隨后的探針給予多次。在一些實施方案中，在觀察來自第二探針的第二信號后，可使組織樣品與化學劑接觸，以修改來自第二探針的信號。另外，可使第三探針與組織樣品接觸，其中第三探針可能夠結合不同于第一和第二探針的靶。同樣， 可觀察來自第三探針的信號，隨后施加化學劑以修改信號。可用能夠結合到另外的靶的第 η個探針反復重復接觸、結合和觀察步驟多次，以用多種探針和/或信號發生劑為使用者提供關于多個靶的信息。在一些實施方案中，可使一系列探針與組織樣品以連續方式接觸，以得到組織樣品的多元分析。在一些實施方案中，可使一系列探針組(在一組中包括約4個探針)與組織樣品以序列方式接觸，以得到組織樣品的多元分析。多元分析一般指用相同的檢測機制分析組織樣品中的多個靶。在某些實施方案中，提供了可用于進行上述抗原提取方法的試劑盒。試劑盒可包含一種或多種抗原提取溶液。試劑盒也可進一步包含使用說明書。在一些實施方案中，試劑盒包含一種或多種用于免疫染色和檢測的另外的試劑。 例如，在一些實施方案中，試劑盒可包含信號發生劑，如生色團、熒光團、拉曼活性標記或放射性標記。試劑盒也可包含能夠如上所述改善檢測或放大信號的試劑，包括但不限于聚合酶酶、其它緩沖劑、金屬陽離子和鹽。根據一個實施方案，如圖1所示，描述了用于使甲醛固定的組織樣品15與上述抗原提取溶液和其它洗滌和染色溶液接觸的樣品處理裝置10。樣品處理裝置可包含樣品處理子系統20和試劑分配子系統30。在某些實施方案中，裝置也可包括信號檢測子系統40。 在一個實施方案中，可將樣品處理裝置作為分析裝置的組件(如自動高通量系統)結合，所述分析裝置能夠使甲醛固定的組織樣品在一個系統中染色和成像并仍進一步分析圖像。因此，在一個實施方案中，系統可包括為了定位和移動用于分析的甲醛固定的組織樣品的樣品處理子系統，和使樣品與第一抗原提取溶液、第二抗原提取溶液和免疫染色試劑的至少一種接觸的試劑分配子系統。樣品處理系統可包括多種組件，并允許樣品從一個區域移到下一個區域。例如，可用一個裝置使樣品與試劑接觸，移動并固定到用于成像的臺(stage)，臺的移動是可控制的。臺可結合到顯微鏡，并且能夠使樣品移動通過成像視野。系統也可包括信號檢測子系統(未顯示)，以通過染色過程捕獲樣品的圖像。圖像可用各種照明源捕獲。在某些實施方案中，圖像捕獲可以為能夠以不同放大倍數捕獲和轉移樣品的數字圖像的成像顯微鏡的部分。在另一個實施方案中，自動系統可包括計算機可讀介質，所述可讀介質可包括分析經染色甲醛固定組織樣品的自動技術的說明書。在其它實施方案中，樣品處理裝置可能夠循環通過抗原提取、熒光標記、成像和脫去熒光探針的多個步驟。染色也可包括免疫過氧化物酶標記。在一個實施方案中，可使用醇可溶性過氧化物酶底物，3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，隨后去除AEC沉淀物，任選用溫和過氧化物處理進一步使過氧化物酶失活，并重復染色。在其它實施方案中，可通過化學處理、熱處理或其組合脫去熒光探針。取樣處理裝置可自動化，使得可原位進行多個循環，以使樣品位移最大限度地減小，并幫助在一個組織切片或細胞樣品中映射多個標記。試驗方法利用試驗設計(DOE)方法分析影響信噪比(ration)的變量，所述信噪比為系統靈敏度的反映。變量包括溫度、暴露時間、PH和洗滌次序。圖像用kiss Axilmager Zl顯微鏡在20x或63x放大倍數獲得。圖像定量用GNU圖像操作程序(GIMP)軟件進行，在從未染色區域減去背景像素強度后計算平均像素強度/面積。將平均像素強度計算為相同組織的 10個圖像的平均值。研究使用以下材料人存檔組織來自多種來源，并包括乳腺、前列腺、肺、結腸、胎盤、唾液腺、淋巴結、腦和皮膚的樣品。所有樣品來自組織存檔。所用的用于固定的細節未知，并假定具有以下標準病理學實踐。用于AR的抗體從Lab Vision Corporation (Thermo Fisher Scientific的一部分)得到，并用標準程序在室內與Cy3和Cy5熒光染料綴合。基于檸檬酸鹽的抗原提取溶液從Vector Laboratories得到，并以6.0的最終pH值1 20 稀釋。基于Tris的緩沖劑由IOmM Tris (三(羥基甲基)氨基甲烷)、lmM EDTA(乙二胺四乙酸)、l%Tween-20(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯)組成，得到8的pH值(從新制備的IOx原料溶液制備)。用設定在HI功率的標準家用高壓鍋加熱20分鐘，并人工監控。福爾馬林固定的石蠟嵌入組織切片通過如下處理在65°C烘烤玻片1小時，并用 histochoice清潔劑從樣品切片去除蠟。發現不需要烘烤樣品，但作為標準實踐自始至終使用。然后使樣品通過一系列遞減濃度的醇洗液(一般100、95、70、50% )處理，各MlO 分鐘洗滌，然后帶到PBS溶液中的鹽水條件10分鐘。然后，在包含0. 3% Triton X-100的 PBS中用簡短處理滲透(premeablize)樣品，隨后進行提取過程。提取過程包括將樣品放入高壓鍋或微波中的溶液A (Tris pH 8. 0，具有Tween 20)經歷約20分鐘。在加熱循環結束，將樣品放入在加熱室中的預熱溶液B (檸檬酸鹽溶液PH 6)，不用另外加熱。在兩種熱溶液之間，樣品不轉移到冷PBS溶液，也不在第二溶液中暴露于另外加熱。在第二溶液中的樣品已達到室溫后(約20分鐘)，在PBS中徹底清洗樣品，然后進行任何另外的處理步驟，例如封閉或過氧化物酶處理(用于內源性過氧化物酶失活)。樣品可然后經歷免疫檢測。在第一輪免疫檢測后，可使樣品消除信號，并重新探測另外的抗原。或者，使用類似于人工過程條件的程序設置，用Discovery XT自動染色機 (Ventana Medical Systems, Inc.)處理玻片。在樣品條形編碼并制備試劑后，將玻片裝入自動染色機，并如下處理將樣品加熱，通過在EZ-pr印試劑(用于Ventana Discovery XT 的除蠟溶液)中清洗脫蠟。分別使用CCl和CC2 (Ventana提供的用在Discovery XT自動染色機上的用于抗原提取的兩種溶液)、Tris和檸檬酸基溶液進行抗原提取。為了與人工二步方法比較的目的，進行短時和中間時間抗原提取，這在Discovery XT自動染色機程序中作為溫和和標準參考。應了解，在自動系統上，組織樣品在兩個抗原提取步驟之間清洗，這是本文所述人工方法和自動方法之間的關鍵差異。然后隨著二步人工方法處理的樣品將玻片人工染色。結果和觀察為了分析，最初選擇雄激素受體抗體用于檢測人檔案前列腺組織切片中的AR。選擇此組合是由于在沒有表位解掩蔽(未顯示)存在下進行染色時缺乏可檢測信號產生。利用用于抗原解掩蔽的兩種一般緩沖劑(檸檬酸鹽或Tris)并在高壓鍋中處理樣品20分鐘， 用熒光染料產生中度強度染色。使用的檸檬酸鹽解掩蔽條件代表通過多種抗體檢測AR的常用方案。試驗了不同條件，包括單獨檸檬酸鹽(組1)、單獨Tris (組2、、先Tris然后檸檬酸鹽(組幻和先檸檬酸鹽然后Tris (組4)。所有條件在玻片上三重試驗，除了將10個玻片染色以建立基線測量的對照樣品。第一系列試驗使用Lab Vision AR抗體，隨后用驢抗兔Cy3第二抗體檢測。所有數據采集使用相等的暴露時間，并且在染色后立即收集圖像。如圖2所示，二步方法與單獨檸檬酸鹽或Tris比較時提供對AR染色的顯著增強。圖2為染色的單色圖像，在右側顯示使用二步程序增強的染色。通常，對于各組玻片，與對照樣品比較，利用二步方法對AR觀察到染色強度增加到二倍或更多。控制暴露于加熱溶液的時間，并且所有玻片接受總共50分鐘時間。對于所有試驗玻片，在家用高壓鍋中在壓力下進行第一加熱步驟。在25分鐘后，將來自組1和 2的玻片放入新的一瓶預熱溶液(在第一步驟正在進行的同時在單獨瓶中加熱的與第一步驟相同的溶液)，并使之在高壓鍋中冷卻(不在壓力下)另外25分鐘。然后在PBS中洗滌玻片，并用第一抗體在4°C染色過夜。對于來自組3和組4的玻片，將溶液在處理的后25分鐘期間改變到上述各自條件，并與其它組平行處理。也試驗對二步程序的數個變換。在一個變換中，其中使用兩種溶液的次序不影響結果。如果首先使用酸性溶液，隨后使用堿性溶液，觀察不到結果差異，反之亦然。方法中的其它變換證明對過程有害。這些包括對樣品重新加壓第二時間，和在第一和第二步驟之間在PBS中洗滌。這兩種變化均導致組織從玻片顯著損失，因此要避免。在對AR的第一抗體的試驗并且用第二抗體檢測后，試驗Cy5_直接綴合的AR抗體。用直接綴合物發現類似結果，其中在其它市售抗體的寬取樣試驗中觀察到增強的染色。 此方法也導致用一些市售級磷酸基-表位增強的染色，這些磷酸基-表位通常不穩定，并傾向于在提取過程中降解。此程序也可應用于其它應用，例如，從FFPE組織的蛋白分離，其中抗原提取方法已顯示提高蛋白提取和回收。此程序也可用于來自FFPE組織的激光捕獲顯微切割，所述 FFPE組織作為蛋白組學分析的蛋白源。在另一個實施方案中，本發明可在FISH或CISH分析之前用于FFPE樣品上。一般在DNA變性和探針雜化之前使正經過FISH或CISH分析的FFPE樣品暴露于加熱預處理步驟。根據一個實施方案，在FISH或CISH分析前，二步程序可代替加熱預處理步驟或用于制備組織樣品的其它程序。圖3顯示單色顯微相片(在20X和63X放大倍數)，其顯示用不同抗體在BrCA腫瘤的多元FISH分析中用二步程序的增強染色。方法比較也用Discovery XT自動染色機評價自動過程。在自動染色機和涉及儀器操作的人工二步方法之間有過程條件差異。例如，自動染色機用加熱和清潔劑使樣品脫蠟，而人工方法使用無毒HistochoiceTM蠟清潔試劑(Amresco)。在通過本文所述人工二步抗原提取或使用Discovery XT自動染色機的兩種類似方法制備細胞后，對于S6、磷酸基-S6ser235/236或磷酸基-S6Serf40/M4將福爾馬林固定的石賭嵌入(FFPE) LNCaP 細胞(American Type Culture Collection (ATCC,Maryland))染色。雖然抗原提取用人工或自動方法完成，但在連續信號去除/修改和重新染色中觀察到差異。在大多數情況下，使用自動系統，染色減小產生于1或5個信號修改步驟。對于S6， 使用自動方法在恰好一輪信號修改后導致完全染色損失。在所有情況下，人工二步方法提供各抗原的最佳保存。在使任一種磷酸基-表位染色時，人工二步方法也顯示較小靈敏度。差異示于圖4中，圖4為與兩種自動方法比較通過人工二步抗原提取方法提供的較大表位穩定性的定量分析的圖解表示。平均像素強度顯示評價對抗原-S6的漂白作用。 通過三種不同的脫蠟和抗原提取方法制備玻片，并在染色前經過0、1和5輪漂白。定量分析指示人工二步方法最佳保存抗原。在相同蛋白上的不同表位對漂白差別化反應，這可表明占主導的表位作用，不損失蛋白。這也顯示于圖5中，圖5為人工二步抗原提取方法與兩種自動方法比較對抗原-S6的漂白作用的單色顯微相片(在20X放大倍數)。在不脫離其精神或基本特征下，本發明可以其他具體形式具體化。因此，前述實施方案在所有方面應認為是說明性，而不是對本文所述發明的限制。因此，本發明的范圍由附加權利要求而非前述說明指示，在權利要求的等價的含義和范圍內的所有變化因此旨在包含于其中。
權利要求
1.一種甲醛固定的組織樣品的抗原提取的方法，所述方法包含以下步驟在大于90°C的溫度在第一抗原提取溶液中培養甲醛固定的組織樣品；將甲醛固定的組織樣品轉移到第二抗原提取溶液；并且在大于90°C的溫度在第二抗原提取溶液中培養甲醛固定的組織樣品。
2.權利要求1的方法，其中第一抗原提取溶液包含具有約5和約7之間pH范圍的緩沖溶液，第二抗原提取溶液包含具有約7. 5和約11之間pH范圍的緩沖溶液；或者第一抗原提取溶液包含具有約7. 5和約11之間pH范圍的緩沖溶液，第二抗原提取溶液包含具有約5和約7之間pH范圍的緩沖溶液。
3.權利要求2的方法，其中具有約5和約7之間pH范圍的緩沖溶液包含檸檬酸、磷酸二氫鉀、硼酸、二乙基巴比妥酸、哌嗪-N，N'-雙O-乙磺酸)、二甲基次胂酸、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其組合。
4.權利要求3的方法，其中具有約5和約7之間pH范圍的緩沖溶液包含檸檬酸。
5.權利要求2的方法，其中具有約7.5和約11之間pH范圍的緩沖溶液包含三(羥基甲基)甲基胺(TRIS)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(TAPS)、N，N_雙(2-羥基乙基)甘氨酸(Bicine)、 N-三(羥基甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2_羥基乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2_ {[三 (羥基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TEQ或其組合。
6.權利要求5的方法，其中具有約7.5和約11之間pH范圍的緩沖溶液包含TRIS。
7.前述權利要求中一項或多項的方法，其中甲醛固定的組織樣品嵌入石蠟中。
8.前述權利要求中一項或多項的方法，其中甲醛固定的組織樣品為器官或組織、體液、 組織或微陣列的切片部分。
9.前述權利要求中一項或多項的方法，其中利用第一抗原提取溶液和第二抗原提取溶液的培養步驟包含在加熱裝置中培養大于10分鐘的時間。
10.權利要求9的方法，其中加熱裝置為高壓鍋、高壓滅菌器、水浴、熱板、微波、蒸汽加熱或其組合。
11.前述權利要求中一項或多項的方法，所述方法進一步包含抗原免疫染色的步驟。
12.權利要求11的方法，其中免疫染色包含連續免疫過氧化物酶標記和清除。
13.前述權利要求中一項或多項的方法，其中甲醛固定的組織樣品經歷FISH或CISH分析。
14.一種用于提取甲醛固定的組織樣品中的抗原的試劑盒，所述試劑盒包含提取樣品中至少一部分未提取抗原的第一抗原提取溶液；和提取樣品中至少一些另一部分未提取抗原的第二抗原提取溶液。
15.權利要求14的試劑盒，其中第一抗原提取溶液為具有約5和約7之間pH范圍的緩沖溶液，第二抗原提取溶液為具有約7. 5和約11之間pH范圍的緩沖溶液。
16.權利要求14或15的試劑盒，其中第一抗原提取溶液包含檸檬酸、磷酸二氫鉀、硼酸、二乙基巴比妥酸、哌嗪-N，N'-雙O-乙磺酸)、二甲基次胂酸、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其組合。
17.權利要求15或16的試劑盒，其中第一抗原提取溶液包含檸檬酸。
18.權利要求14至17中一項或多項的試劑盒，其中第二抗原提取溶液包含三(羥基甲基)甲基胺(TRIS)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(TAPS)、N，N_雙(2-羥基乙基)甘氨酸(Bicine)、 N-三(羥基甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2_羥基乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2_ {[三 (羥基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TEQ或其組合。
19.權利要求18的試劑盒，其中第二抗原提取溶液包含TRIS。
20.權利要求14至19中一項或多項的試劑盒，所述試劑盒進一步包含一種或多種免疫染色劑。
21.一種用于進行權利要求11的方法的樣品處理裝置，所述樣品處理裝置包含樣品處理子系統和試劑分配子系統。
22.權利要求21的裝置，其中試劑分配子系統能夠使樣品與第一抗原提取溶液、第二抗原提取溶液和免疫染色試劑中的至少一種接觸。
23.權利要求21或22的裝置，其中試劑分配子系統能夠使樣品與試劑接觸，以去除免疫染色試劑。
24.權利要求21、22或23的裝置，其中樣品處理裝置能夠運行多于一個試劑分配循環。
25.權利要求21至M中一項或多項的裝置，所述裝置進一步包含信號檢測子系統。
26.權利要求25的裝置，其中樣品處理子系統、試劑分配子系統或信號檢測子系統中的一個或多個為自動化。
全文摘要
本發明提供甲醛固定的組織樣品的抗原提取的方法，所述方法包括在大于90℃的溫度在第一抗原提取溶液中培養甲醛固定的組織樣品，將組織樣品轉移到第二抗原提取溶液，并在大于90℃的溫度在第二抗原提取溶液中培養組織樣品。本發明還提供進行所述方法的試劑盒和樣品輸送裝置。
文檔編號G01N33/543GK102597740SQ201080038562
公開日2012年7月18日 申請日期2010年8月23日 優先權日2009年8月26日
發明者A·蘇德, C·J·塞文斯基, M·J·格爾德斯 申請人:通用電氣公司