專利名稱：采用昆蟲模型測定化合物的腸吸收的方法
采用昆蟲模型測定化合物的腸吸收的方法發明領域
本發明涉及昆蟲模型，其用于反映化合物的脊椎動物吸收，所述化合物諸如藥物， 所述脊椎動物的吸收諸如在腸或原腸中。特別地，該模型基于昆蟲諸如蝗蟲的去頭制備物， 其中將導管插入中腸，并于不同時間點將血淋巴采樣。
發明背景
藥物發現是一件昂貴的事情，其中一項主要的資金費用和耗時是體內研究。為了降低這些成本開發了大量體外模型并用作為篩濾器來選擇用于體內研究的最適宜的化合物。然而，體外模型經常過于簡化并可能就此誤導決策過程。因此，存在對中間模型的需求， 其比體外模型更可靠并同時比傳統的脊椎動物體內模型更快和更省錢。
經口途徑的藥物吸收是在醫藥工業中集中并不斷地研究的課題，因為良好的生物利用度意味著藥物能夠到達全身性循環。口服吸收不僅受到藥物性質的影響還受到胃腸道生理的影響，包括劑型的藥物溶出度、藥物與水性環境和膜的相互作用方式、透膜滲透性， 和首過器官諸如腸、肝和肺的不可逆去除(Martinez和Amidon，2002)。
在肝臟之外，腸是調節口服施用藥物的吸收程度的主要組織，因為腸和肝涉及首過去除(Gibaldi等人，1971 ；Rowland, 1972)。藥物吸收的大部分發生在小腸，其中絨毛和微絨毛的存在顯著增加了吸收面積。十二指腸和空腸具有最大的表面積，因為絨毛和微絨毛在這些區域的高度集中，回腸的表面積最小(Magee和Dalley，1986)。
腸是獨特的，其中腸的靜脈血構成供應肝臟的血的大部分，占75%總的肝臟血流。 通過腸吸收的藥物將到達肝臟和肺臟進行代謝和清除(Gugler等人，1975 ；Xu等人，1989 ； Hirayama 等人，1990)。
由于大量因素會影響腸功能并因此還影響口服施用藥物的攝取(Xu等人，1989 ； Hirayama 和 Pang, 1990，Chen 和 Pang, 1997，Welling, 1984 ；Kimura 和 Higaki，2002)，高度需求表現脊椎動物的腸功能且還是高度可再現的腸模型。
由于在口服藥物攝入后，腸作為重要的首過器官的顯要性，評價腸吸收、代謝、和排泄的高通量體外系統被開發用于預測給定化學物質的生物利用度。基因表達系統(Smit 等人，1998b ；Cvetkovic 等人，1999 ；Gotoh 等人，2000 ；Shitara 等人，2002)提供了涉及各轉運蛋白或酶的直接信息。然后有腸膜片段/制備物(Wilson和Treanor，1975 ;Hopfer 等人，1976 ；Lasker 和 Rickert，1978 Johnson 等人，2001)，細胞(Koster 和 Noordhoek， 1983 ;Traber 等人，1991)，反轉囊(Munck, 1965 ；Barr and Riegelman，1970)，和烏氏室 (the Ussing chamber) (Fiddian-Green 和 Silen，1975)。對于流量測量，供應區(donor compartment)被用于藥物施用，接收區(receiving compartment)被用于采樣。當藥物給予粘膜側，采樣允許藥物吸收、代謝和流出量以及進入基底外側區的檢測。此外，可以在漿膜區給藥以確定從基底外側到粘膜腔的凈流量。
受歡迎的體外系統是源自人結腸癌細胞的Caco-2細胞系(Hidalgo等人，1989)。 缺點是存在不被攪動的水層，其可形成親脂藥物轉運的障礙(Hidalgo等人，1991)。Caco-2 滲透模型的開發具有巨大的推動性進步并引導不同藥物類別作為PgP底物的測試(Burton等人，1993)。
原位血管灌注的大鼠小腸制備物是用于研究口服和全身性施用的試劑的分布的有用制備物(Windmueller和Spaeth, 1977，以及Doherty和Pang, 2000)。在該制備物中， 保留了關于循環的小腸天然構造以致可以同時研究代謝、吸收和分泌的程度。該技術允許涉及全身性或腔體藥物施用(包括腔體施用于封閉的環路或區段)的首次通過實驗或再循環實驗。
存在體內技術用于研究腸藥物吸收。Doluisio方法必須使用原位大鼠腸技術用于將藥物施用進入腔體(Doluisio等人，1969)。在某些大鼠制備物中，選擇區段的流入量和流出量被監測用于藥物消失率，動脈血被取樣并且血量通過輸液被補充(Barr和 Riegelman，1970)。某些研究涉及向選擇的或封閉的大鼠(Hirayama等人，1990)或人 (Gramatt6和Richter，1994)的區段(十二指腸、空腸、或回腸)的藥物腔體滴注。
昆蟲的消化道分為三個主要區域前腸、中腸和后腸。前腸和后腸都源自外胚層而中腸源自內胚層。前腸中的細胞通常是平扁的且與吸收或分泌無關。前腸的一部分是作為儲存器官的嗉囊并且在大多數昆蟲中是前腸的可伸展部分。嗉囊作為儲存器官的效果(特別是對于液體進食性昆蟲)在于其對親水性分子的不通透性。在直翅類昆蟲中，嗉囊發展成具有用于破碎食物的強壯表皮板或牙的切磨器具。
中腸細胞積極參與酶的生產以及營養的吸收。大多數細胞是所謂的主細胞。這些細胞是高柱狀細胞并相似于脊椎動物腸的腸上皮細胞，這些細胞展現出面向腔體側的大量微絨毛。該形態學明顯指出主細胞是非常代謝活躍的并且是營養吸收和消化性酶分泌的主要參與者(Lehane和Billingsley，1996)。還相似于脊椎動物腸的有中腸中的增殖區或核 (nidi)，具有與脊椎動物腸中的干細胞相同的功能(Illa-Bochaca和Montuenga，2006)。既然昆蟲中腸中的主細胞，與脊椎動物的腸上皮細胞相似，具有有限的生命跨度(這需要高再生能力)。源自核的未分化的細胞、子細胞提供未分化的柱狀主細胞和內分泌細胞。
后腸通常分化為幽門、回腸和直腸。該部分腸的主要功能是吸收水(其被傳送入馬氏管)并因此在該部分腸中的細胞是代謝活躍的。
由于植物進食性昆蟲還必須處理包含在食物中的可能對于昆蟲有毒的化合物，發育了有效的細胞色素P-450系統，其將這些化合物轉化為水溶性產物并通過馬氏管排出。 該P-450系統在中腸中是高度存在的。
昆蟲腸的結構和功能使之成為用于研究腸藥物攝取的有力候選并且使之可以是用于高效研究和早期特征化、編制和選擇旨在口服施用的化合物的相關模型。
本發明的主題是使用有助于反映脊椎動物在腸或原腸中的藥物吸收的昆蟲模型。
發明概述
本發明的總目的在于開發用于測定不同化合物的胃腸吸收的昆蟲篩選模型，用以在早期藥物發現階段改進化合物篩選步驟/過程。該目的相對于先有技術提供了許多優點，因為昆蟲模型對于決策過程是比現有體外模型更可靠的工具，并且將加速藥物篩選過程和降低后期磨耗率(attrition rate)。此外，將減少在藥物開發階段中的犧牲的哺乳動物的數量。
本申請發明人出乎意料地發現昆蟲中的中腸比先前所假定的與哺乳動物的腸有更多的共性。經發現，這些昆蟲中的中腸以非常相似于在人中所觀察到的途徑積極參與酶生產和營養吸收。
據此，本發明涉及有助于反映化合物的脊椎動物吸收的昆蟲模型，所述化合物諸如藥物，所述吸收諸如在腸或胃中。特別地，該模型基于昆蟲的去頭制備物，諸如蝗蟲，其中將導管插入中腸并收集血淋巴，例如通過插入另一根導管到腹部，通過經校準的微毛細管， 通過注射器，通過吸管或其它手段。該模型允許從腸的相關部分至血淋巴的藥物攝取的研究。相比于嚙齒動物的口服施用，本模型允許快速測試作為化合物穿過腸粘膜的能力和選做口服施用的候選的化合物能力的早期評價。另一項優點是使用昆蟲的去頭制備物便于控制暴露于腸的化合物的實際量。
本發明的昆蟲可因此用作為確定化合物的胃腸吸收的中間模型。
本發明因此能夠首次提供產生用于測定化合物的腸內吸收的簡單體內系統的合理策略。
一方面，本發明提供用于預測化合物腸吸收的方法，所述化合物諸如藥物，所述腸吸收諸如在脊椎動物中，所述方法包括以下步驟
將昆蟲去頭；
將第一導管或探針插入昆蟲的中腸；
收集血淋巴例如通過將第二導管插入昆蟲的腹部或者通過使用經校準的微毛細管、漢密爾頓氏注射器(Hamilton syringe)或吸管；
通過第一導管向昆蟲的中腸施用化合物；
采取一個或多個血淋巴樣品；
測定在一個或多個血淋巴樣品中的藥物濃度；和
計算藥物的吸收。
在本發明優選的實施形式中，昆蟲選自下組網翅目(Dictyoptera)、直翅目 (Orthoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、雙翅目(Diptera)、竹節蟲目(Cheleutoptera)和鱗翅目(L印idoptera)。為了確保在中腸中的有效吸收，化合物優選通過導管或探針被施用至昆蟲的中腸。
此外，本發明通過用于測定化合物的腸吸收的模型昆蟲，所述化合物諸如藥物，所述腸吸收諸如在脊椎動物中，所述模型通過以下步驟獲得
將昆蟲去頭；
將第一導管或探針插入昆蟲的中腸；和
收集血淋巴例如通過將第二導管插入昆蟲的腹部或者通過使用經校準的微毛細管、漢密爾頓氏注射器或吸管；
通過第一導管向昆蟲的中腸施用化合物；
采取一個或多個血淋巴樣品；
測定在一個或多個血淋巴樣品中的藥物濃度；和
計算藥物的吸收。
優選所述昆蟲選自下組蜚蠊科(Blattoidea)、蝗總科(Acridoidea)、竹節蟲目、 Apine、短角亞目(Brachycera)、和鱗翅目。
在本發明特別優選的實施形式中，所述昆蟲選自蝗總科(蝗蟲)和蜚蠊目(蜚蠊)。
在本發明的各個方面和實施形式中提供在下述權利要求中闡明的主題。
發明祥述
本發明提供用于初始評價和預測不同化合物的腸攝取的新的方法學。本發明一般性地特別有用于在藥物開發的早期有效篩選新合成的化合物。
根據本發明的藥物以其最寬的范圍定義為如下化合物，當其被吸收入活生物體時，改變正常身體功能。具體而言，根據本發明的藥物是可以用于治療、治愈、預防或診斷疾病或者另外用于提高身體或精神健康的化合物。根據本發明特別關注精神活性藥物，它們是穿過BBB且主要作用于中樞神經系統并改變腦功能從而導致感覺、情緒、意識、認知和行為的改變的化合物。
本發明涉及但不限于選自以下目的昆蟲的使用(分類學根據DjurensV3i:ld，Ed B. Hanstrom; ForlagshusetNorden AB,Malmo, 1964)
權利要求
1.采用模型昆蟲用于評價化合物腸吸收的方法，所述化合物諸如藥物，所述腸吸收諸如在脊椎動物中，實施方法包括以下步驟 將昆蟲去頭；眷將第一導管或探針插入昆蟲的中腸； 收集血淋巴例如通過將第二導管插入昆蟲的腹部或者通過使用經校準的微毛細管、 漢密爾頓氏注射器或吸管； 通過第一導管向昆蟲的中腸施用化合物； 采取一個或多個血淋巴樣品； 測定在一個或多個血淋巴樣品中的藥物濃度；和眷計算藥物的吸收。
2.權利要求1的方法，其中所述昆蟲選自下組網翅目(Dictyoptera)、直翅目 (Orthoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、雙翅目(Diptera)、竹節蟲目(Cheleutoptera)和鱗翅目(Lepidoptera)0
3.權利要求1或2的方法，其中所述藥物的濃度通過LC/MS測定。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述化合物通過第一導管給藥至昆蟲的中腸。
5.用于測定化合物的腸吸收的模型昆蟲，所述化合物諸如藥物，所述腸吸收諸如在脊椎動物中，所述模型由包含以下步驟的方法獲得 將昆蟲去頭；眷將第一導管或探針插入昆蟲的中腸；和 收集血淋巴例如通過將第二導管插入昆蟲的腹部或者通過使用經校準的微毛細管、 漢密爾頓氏注射器或吸管。
6.根據權利要求5的模型昆蟲，其中所述昆蟲選自下組網翅目(Dictyoptera)、直翅目(Orthoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、雙翅目(Diptera)、竹節蟲目(Cheleutoptera)和鱗翅目(L印idoptera)。
全文摘要
提供在脊椎動物特別是人中用于測定不同化合物的胃腸吸收的昆蟲篩選模型，用以在早期藥物開發階段改進化合物篩選步驟/過程。其相對于先有技術提供了許多優點，因為昆蟲模型對于決策過程是比現有體外模型更可靠的工具，并且將加速藥物篩選過程和降低后期磨耗率。此外，將減少在藥物開發階段中的犧牲的哺乳動物的數量。
文檔編號G01N33/50GK102498400SQ201080035380
公開日2012年6月13日 申請日期2010年8月10日 優先權日2009年8月12日
發明者G·安德森, O·安德森, P·阿德爾尼爾森 申請人:恩托莫法瑪有限責任公司