胃癌的檢測標志物的制作方法

專利名稱：胃癌的檢測標志物的制作方法
技術領域：
本發明涉及癌癥的檢測。具體地，本發明涉及遺傳和/或蛋白質標志物用于檢測癌癥的用途，并且更特別地，涉及遺傳和/或蛋白質標志物用于檢測胃癌的用途。背景在早期檢測到癌癥并得到治療時，癌癥患者的存活得到很大程度的提高。在胃癌的情況中，與診斷為晚期疾病患者大約10%的5-年存活率相比，診斷為早期疾病的患者具有90%的5-年存活率。然而，大多數胃癌患者通常患有晚期疾病。因此，導致胃癌早期診斷的發展可以導致改善的患者預后。生物樣品中特定癌癥相關標志物的鑒定可以提供癌癥早期診斷的有價值的方法， 導致早期治療和提高的預后，所述生物樣品包括體液，例如，血液、尿液、腹膜沖洗液和糞便提取物。特定癌癥標志物還可以提供監測疾病進展的手段，能夠追蹤外科手術治療、放療和化療的療效。然而，對于許多主要的癌癥，可用的標志物存在靈敏度和特異性不足的問題。 例如，對于胃癌最常用的標志物cal9-9、ca72-4和癌胚抗原(CEA)只能檢測出約15-50% 的任一階段的胃腫瘤，對于早期疾病，降至大約2-11%。因此，存在非常高頻率的可導致患者和保健醫生認為不存在疾病的假陰性測試，然而實際上，患者患有需要立即注意的嚴重癌癥。此外，這些標志物在高達1/3受到良性胃病影響的個體中產生假陽性信號。發明概述本發明的幾個方面提供了可以提供早期癌癥檢測并且降低假陽性和假陰性測試結果頻率的方法、組合物和裝置。在特定的實施方案中，分子分析可以用于鑒定在胃腫瘤組織中與非惡性胃組織相比高表達，但不必定是過表達的基因。這樣的分析包括微陣列和定量聚合酶鏈式反應 (qPCR)方法。癌癥基因、RNA以及由那些基因編碼的蛋白質在此稱為胃腫瘤標志物(GTM)。 將理解術語GTM不需要標志物只對胃腫瘤是特異性的。而是，GTM的表達在其他類型的腫瘤中得到提高，所述腫瘤包括惡性或非惡性腫瘤，包括胃癌、膀胱癌、結直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、皮膚癌(例如，黑素瘤)、肝癌、食道癌、子宮內膜癌和腦癌。然而，應當理解，術語GTM 不包括現有技術的標志物，如CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原和CEA，或任何其他之前已經鑒定為表示胃腫瘤的標志物。從腫瘤中分泌或逸出一些GTM，其水平足以以高度可靠性來診斷胃癌，并且在其他情況中，兩種或多種GTM的測量可以提供可靠的胃癌診斷。由細胞分泌或裂解出來的蛋白質，單獨或互相結合，具有作為用于胃癌診斷的血清或體液標志物或作為用于監測已確定疾病進展標志物的效用。可以使用本領域已知的方法，并且包括使用單克隆抗體、多克隆抗血清等，來進行蛋白質標志物的檢測。具體地，本發明提供了一種用于檢測胃癌的方法，包括(i)提供生物樣品；和(ii)檢測所述樣品中人酶原粒蛋白16( “ZG16”)的水平。在一個方面中，患者中ZG16的過表達表示患者患有胃癌。根據本發明的其他GTM家族成員可以選自黏蛋白5AC( “MUC5AC”)或黏蛋白17 (“MUC17")。該方法可以涉及 ZG16 和 MUC5AC、ZG16 和 MUC17，或 ZG16 和 MUC5AC 和 MUC17 的檢測。所述其他GTM家族成員還可以包含一個或多個更多的GTM家族成員，例如， MUC5AC、MUC17、ZG16、羧肽酶 N、多肽 2，83kDa 鏈(CPN2)、基質金屬蛋白酶 12 (MMPU)、抑制素(“訊冊々”)、胰島素樣生長因子7( “IGFBP7”)、Y-谷氨酰水解酶(“GGH”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白聚糖(“LEPRE1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cyStatin)S( “CST4”)、 分泌型卷曲相關蛋白4( “SFRP4”)、aSp0rin( “ASPN”)、具有EF手型結構域的細胞生長調節劑1( “CGREF1”)、激肽釋放酶IO(KLKlO)、金屬蛋白酶的組織抑制劑1( “TIMP1”)、 分泌型酸性富含半胱氨酸蛋白(“SPARC”)、轉化生長因子，13-誘導的(“TGFBI”)、 含有EGF的fibulin-樣胞外基質蛋白2( “EFEMP2”)、基膜聚糖(lumican) ( “LUM”)、 stannin ( “SNN”)、分泌型磷蛋白1( “SPP1 ”)、硫酸軟骨素蛋白聚糖2 ( “CSPG2”)、N_酰基鞘氨醇酰胺水解酶(“ASAH1”)、絲氨酸蛋白酶11( “PRSS11”)、分泌型卷曲相關蛋白 2( “SFRP2”)J^^_A2，XIIB 組(“PLA2G12B”)、spondin2，胞外基質蛋白(“SP0N2”)、 嗅介蛋白(olfactomedin) 1 ( “0LFM1”)、含有血小板反應蛋白重復1 ( “TSRC1 ”)、血小板反應蛋白2( “THBS2”)、adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SA( “CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN( 乂511”)、賴氨酰氧化酶樣酶2( “L0XL2”)、甲狀腺球蛋白(“TG”)、轉化生長因子 β 1( “TGFB1”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade H成員1 ( “SERPINH1 ”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade B成員5 (“SERPINB5”)、基質金屬蛋白酶2 (“ΜΜΡ2”)、前蛋白 (proprotein)轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 5型(“PCSK5”)、乙酰透明質酸(hyaluronan) 糖蛋白連接蛋白 4 ( “ HAPLN4 ”)、CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原、CEA、MUC5AC 和 MUC17。根據本發明的組合GTM標志物的一個實例是MUC5AC、MUC17、ZG16、半胱氨酸蛋白酶抑制劑 SN、serpinHl 和 serpinB5。可以使用任何合適的用于檢測GTM水平的方法，并且可以包括檢測GTM mRNA、GTM cDNA的水平，使用與所述GTM cDNA的至少一部分互補的寡核苷酸，使用正向引物和反向引物的qRT-PCR方法，檢測GTM蛋白的水平，檢測GTM肽的水平，例如，使用針對所述GTM的抗體。可以使用任何合適的抗體，并且可以是單克隆抗體或多克隆抗血清。可以使用夾層型免疫試驗方法或使用抗體芯片來進行該方法。本發明還提供了一種用于檢測GTM的裝置，其包括其上具有GTM捕獲試劑的基質；和與所述基質相連的檢測儀，所述檢測儀能夠檢測與所述捕獲試劑相結合的GTM。GTM捕獲試劑可以是GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM肽特異性的寡核苷酸或抗體。本發明的再一個方面是用于檢測癌癥的試劑盒，其包括其上具有GTM捕獲試劑的基質；用于顯現所述GTM捕獲試劑和GTM的復合物的工具；和使用說明書，其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。GTM捕獲試劑是對GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM肽有選擇性的GTM特異性寡核苷酸或GTM特異性抗體。本發明還提供了用于檢測胃癌的方法，其包括步驟提供來自處于患有胃癌風險中的患者的測試樣品；測量所述測試樣品中GTM蛋白的存在；和
將所述測試樣品中存在的GTM的量與獲自未患有胃癌受試者的對照樣品的值進行比較，其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。在進一步的方面中，本發明提供了一種用于篩選胃癌的方法，其包括步驟提供來自測試受試者的測試樣品；測量所述測試樣品中GTM的存在；和將所述測試樣品中存在的GTM的量與獲自未患有胃癌受試者的對照樣品的值進行比較，其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。 GTM可以是GTM蛋白或肽，或GTM特異性的寡核苷酸。寡核苷酸可以是DNA或RNA。根據該方法，測量步驟可以使用ELISA試驗。測試樣品可以獲自血漿、組織、尿液、胃液、血清和糞便。附圖簡述參照其特定實施方案和參照附圖來描述本發明，其中

圖1描繪了微陣列分析表，顯示了在腫瘤組織中相對高表達的基因。將腫瘤組織和非惡性組織中每個基因的信號強度進行了分級。該表顯示了比現有胃癌標志物CEA(由基因CEACAM5編碼)具有更高等級的GTM。圖2描繪了顯示出抗體陣列分析中所用的血清樣品特征的表。圖3描繪了直方圖，其顯示了腫瘤和非惡性樣品根據其(a)ZG16和(b)MUC17表達水平的分布。使用RT-qPCR獲得了兩個基因的表達水平。圖4描繪了 boxplot，顯示了使用抗體陣列和RCA檢測的胃癌患者和對照的血清中 (a)MUC17 禾口 (b)ZG16 的檢測。詳述定義在詳細描述本發明的實施方案之前，提供本文中所用術語的一些定義將是有用的。術語“GTM”或“胃腫瘤標志物，，或“GTM家族成員，，意思是與胃癌相關或另外鑒定與胃癌相關分子的基因、基因片段、RNA、RNA片段、蛋白質或蛋白質片段。作為本發明的一部分公開的GTM不包括現有技術中已知的與胃癌相關的分子，例如，CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原和CEA。然而，本發明的標志物可以與之前公開的GTM以新的和創造性的組合來一起使用。術語“標志物”指與生物學現象的存在定量或定性相關的分子。“標志物”的實例包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因產物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白質或蛋白質片段；或任何相關的代謝產物、副產物或任何其他鑒定分子，如抗體或抗體片段，不管是否與現象下的機理直接或間接相關。本發明的標志物包括如本文所公開的核苷酸序列(例如，GenBank序列)，特別是全長序列、其任何編碼序列、任何片段或任何互補物， 以及上述定義的其任何可測量標志物。如本文所用，“抗體”及類似術語指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有特異結合抗原(與之發生免疫反應)的抗原結合位點的分子。這些包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、FC、Fab、Fab，和Fal^2片段，以及Fab表達文庫。抗體分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任何一類，這些類別根據分子中存在的重鏈的性質而彼此不同。這些還包括亞類，如IgGl、IgG2等。輕鏈可以是κ鏈或λ鏈。本文提及的抗體包括所有類、亞類和類型。還包括嵌合抗體，例如，對超過一種的來源(例如，小鼠或人序列)是特異性的單克隆抗體或其片段。還包括駝類抗體(camelid antibody)、鯊魚抗體或納米抗體。術語“癌癥”和“癌性的”是指或者描述了哺乳動物中通常以異常或失調的細胞生長為特征的生理狀態。癌癥和癌癥病理可以與例如轉移、干擾鄰近細胞的正常機能、以異常水平釋放細胞因子或其他分泌產物、抑制或加重炎性或免疫應答、瘤形成、癌前病變、惡性腫瘤、周圍或遠距離組織或器官如淋巴結的侵入等相關。特別包括的是黑素瘤。術語“腫瘤”指的是所有腫瘤細胞生長和增殖，不管惡性還是良性的，以及所有癌前和癌細胞和組織。術語“胃癌”指的是源自胃的腫瘤。這些腫瘤能夠轉移至任何器官。術語“差異地表達” “差異的表達”及相似短語是指相對于在對照受試者(例如， 參照樣品)中的表達，在患有病癥(特別是癌癥，如黑素瘤)的受試者(例如，測試樣品) 中的表達被激活至較高或較低水平的基因標志物。該術語還包括其表達在如下情況被激活至較高或較低的水平的標志物在相同疾病的不同階段；在具有好或差的預后的疾病中； 或在具有較高或較低增殖水平的細胞中。差異表達的標志物可以在多核苷酸水平或多肽水平被激活或抑制，或可以接受選擇性剪接而導致不同的多肽產物。例如，這些差異可以通過 mRNA水平、表面表達、多肽分泌或其他分配上的變化而得到證明。差異表達可以包括比較兩個或多個標志物(例如，基因或其基因產物)間的表達； 或比較兩個或多個標志物(例如，基因或其基因產物)間的表達比率；或比較相同標志物的兩種不同加工的產物(例如，轉錄產物或多肽)，其在正常受試者和患病受試者之間不同； 或在相同疾病的不同階段之間不同；或在具有好或差的預后的疾病之間不同；或在具有較高和較低增殖水平的細胞之間不同；或在正常組織和患病組織(特別是癌癥或黑素瘤)之間不同。差異表達包括基因或其表達產物在例如正常和患病細胞中、或在經歷不同疾病事件或疾病階段的細胞中、或在具有不同增殖水平的細胞中，在時間或細胞表達模式上的定量以及定性差異。術語“表達”包括多核苷酸和多肽的產生，特別地，從基因或基因的一部分產生 RNA(例如，mRNA)，且包括RNA或基因或基因的一部分編碼的多肽的產生，以及與表達相關的可檢測物質的出現。例如，例如從多肽-多肽相互作用、多肽-核苷酸相互作用等形成復合物，也包括在術語“表達”的范圍內。另一個實例是結合配體，如雜交探針或抗體，與基因或其他多核苷酸或寡核苷酸、多肽或蛋白質片段的結合以及結合配體的顯影。因此，微陣列、雜交印跡(如Northern印跡)，或免疫印跡(如Wfestern印跡)，或珠陣列上的，或通過 PCR分析的斑點強度，包括在生物分子下的術語“表達”的范圍內。術語“表達閾值”和“限定的表達閾值”可以互換使用，并且指的是正談論的標志物的水平，在該水平外，多核苷酸或多肽作為患者存活的預測標志物。閾值將取決于所建立的預測模型，所述模型從臨床研究(如以下實施例中所述的那些)實驗性地產生。根據所用的預測模型，設定表達閾值以獲得最大的靈敏度，或最大的特異性，或最小的誤差(最大的分類級別)。例如，設定較高的閾值，以獲得最小誤差，但這可能導致較低的靈敏度。因此， 對于任何給定的預測模型，將使用臨床研究來設定通常獲得最高靈敏度同時具有最小誤差率的表達閾值。對于任何情況的表達閾值的確定在本領域技術人員的知識范圍內。術語“靈敏度”意思是(通過模型)測試的患病個體為陽性的比例。因此，提高的靈敏度意味著較低的假陰性測試結果。術語“特異性”意思是(通過模型)測試未患病個體為陰性的比例。因此，提高的特異性意味著較低的假陽性測試結果。術語“微陣列”指的是捕獲劑(優選，多核苷酸(例如，探針)或多肽)在基質上的有序或無序排列。參見，例如，Microarray Analysis (微陣列分析)，M. Schena，John Wiley & Sons，2002 ;Microarray Biochip ^Technology (微陣列生物芯片技術)，Μ. Schena 編輯， Eaton Publishing, 2000 ；Guide to Analysis of DNA Microarray Data (DNA 微陣列數據分析指導)，S.Knudsen, John Wiley & Sons, 2004 禾口 Protein Microarray Technology, D. Kambhampati 'ΦΜ, John Wiley & Sons，2004。術語“寡核苷酸”指的是多核苷酸，通常是探針或引物，包括，但不限于，單鏈脫氧核糖核苷酸、單鏈或雙鏈核糖核苷酸，RNA: DNA雜合體及雙鏈DNA。寡核苷酸，如單鏈DNA探針寡核苷酸，經常利用化學方法來合成，例如，使用可購得的自動寡核苷酸合成儀，或通過多種其他方法，包括體外表達系統、重組技術以及在細胞和生物中的表達。術語“過表達”或“過表達的”指的是患者中高于正常組織中所看到的基因或標志物的表達水平。如果是正常組織中表達的1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9、2倍或高于 2倍，則認為表達是過表達的。術語“多核苷酸”，以單數或復數使用時，通常指的是任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。這包括，但不限于，單鏈和雙鏈DNA、包括單鏈和雙鏈區域的DNA、單鏈和雙鏈RNA，以及包括單鏈和雙鏈區域的RNA， 包含可以是單鏈或更一般地是雙鏈或包括單鏈和雙鏈區域的DNA和RNA的雜合分子。還包括包含RNA或DNA或既包含RNA又包含DNA的三鏈區域。特別包括mRNA、cDNA和基因組 DNA，及其任何片段。該術語包括包含一個或更多個修飾堿基(如，氚化堿基或稀有堿基，如肌苷)的DNA和RNA。本發明的多核苷酸可以包括編碼或非編碼序列，或正義或反義序列。 將理解本文中每次涉及“多核苷酸”或類似術語，將包括全長序列及其任何片段、衍生物或變體。如本文所用，“多肽”指的是寡肽、肽或蛋白質序列，或其片段，以及天然產生的、重組的、合成的或半合成的分子。其中本文引用的“多肽”指的是天然產生的蛋白質分子的氨基酸序列，“多肽”及類似術語不意味著限定氨基酸序列為全長分子的完整天然氨基酸序列。將理解本文中每次涉及“多肽”或類似術語，將包括全長序列及其任何片段、衍生物或變體。術語“qPCR”或“QPCR”指的是例如PCR Technique Quantitative PCR(PCR 技術 定量 PCR)，J. W. Larrick 編輯，Eaton Publishing，1997 和 A-Z of Quantitative PCR(定量PCR的A-Z)，S. Bustin編輯，IUL Press, 2004中所述的定量聚合酶鏈式反應。術語RCA是滾環擴增的縮寫。RCA是一種涉及環形模版的重復拷貝而以線性方式來擴大信號的技術。雜交反應的“嚴謹性”是本領域普通技術人員容易測定的，并且通常取決于探針長度、洗滌溫度和鹽濃度根據經驗計算。通常，較長的探針需要較高的溫度，用于正確的退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常取決于在低于解鏈溫度的環境中存在互補鏈時，變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間所需的同源性程度越高，可以使用的相對溫度越高。因此，斷定較高的相對溫度將傾向于使得反應條件更嚴謹，而較低的溫度因此使反應條件不太嚴謹。雜交反應嚴謹性的其他詳細內容和解釋可以在例如Ausuble 等，Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學通用實驗方案)，Wiley Interscience Publishers, (1995)中找至丨J。如本文所定義，“嚴謹條件”或“高嚴謹條件”通常為(1)使用低離子強度和高溫進行洗滌，例如0. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 1 %十二烷基硫酸鈉，50°C ； (2) 雜交期間使用變性劑，如甲酰胺，例如50% (ν/ν)甲酰胺，與0. 牛血清白蛋白/0. Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5，與750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，42°C ；或(3)使用 50% 甲酰胺，5XSSC(0. 75M NaCl, 0. 075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6. 8)，0. 焦磷酸鈉，5X，Denhardt' s溶液，超聲波處理的鮭精DNA(50 μ g/ml)，0. 1 % SDS，和10%硫酸葡聚糖，42°C，并在0. 2X SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中于42°C和50%甲酰胺中于55°C洗滌，接著是包括于55°C在含EDTA的0. IXSSC中的高嚴謹洗滌。“中等嚴謹條件”可如 Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，New York, Cold Spring Harbor I^ress，1989所述的來予以確認， 并且包括使用不如上文所述那么嚴謹的洗滌溶液和雜交條件(例如，溫度、離子強度和 SDS%)0中等嚴謹條件的一個實例是于37°C在包含20%甲酰胺，5XSSC(150mM NaCl, 15mM 檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH 7. 6) ,SXDenhardt' s溶液，10%硫酸葡聚糖和20mg/ml變性剪切鮭精DNA的溶液中過夜溫育，接著在IXSSC中于約37-50°C下洗滌濾器。本領域技術人員將會明了如何按照需要對溫度、離子強度等進行調整，以適應諸如探針長度等因素。術語“MUC5AC”意思是黏蛋白5AC (Seq ID No. 1和4)，并且包括標志物MUC5AC，包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因產物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白質，或蛋白質片段；或任何相關的代謝產物、副產物，或任何其他鑒定分子，如抗體或抗體片段。術語“MUC17”意思是細胞表面結合的人黏蛋白17 (Seq ID No 2和5)，并且包括標志物MUC17，包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因產物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白質，或蛋白質片段；或任何相關的代謝產物、副產物，或任何其他鑒定分子，如抗體或抗體片段。術語“ZG16”意思是人酶原粒蛋白16 (Seq ID No 3和6)，并且包括標志物ZG16， 包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因產物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白質，或蛋白質片段；或任何相關的代謝產物、副產物，或任何其他鑒定分子，如抗體或抗體片段。除非另有說明，本發明的實施將采用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、 細胞生物學和生物化學的常規技術，這落入本領域技術范圍內。這樣的技術在文獻中有充分的說明，如Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)， 第 2 版，Sambrook 等，1989 Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)，MJ Gait 編
1984 ；Animal Cell Culture, R. I. Freshney 'ΦΜ, 1987 ；Methods in Enzymology ( g| 學方法)，Academic Press, Inc. ；Handbook of Experimental Immunology (實驗免疫學手冊)，第 4 版，D.M.Weir & CC. Blackwell 編輯，Blackwell Science Inc. , 1987 ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (哺乳動物細胞的基因轉移載體)，J. M. Miller & Μ· P. Calos 編輯，1987 ;Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學通用實驗方案)，F. Μ· Ausubel 等編輯，1987 ；以及 PCR :The Polymerase Chain Reaction (PCR 聚合酶鏈式反應)，Mullis等編輯，1994。將理解以上術語可以指蛋白質、DNA序列和/或RNA序列。還將理解以上術語還指具有本文所示同源序列的非人蛋白質、DNA和/或RNA。發明詳述通常，腫瘤標志物在腫瘤組織和相應的非惡性組織之間差異地表達。這提供了一種區分患有和未患有癌癥的患者的方法。然而，很可能即使那些標志物在腫瘤組織中不是過表達的，腫瘤組織的解剖學結構和生理學特征也將導致血清和其他生物液體中標志物累積的差異。特別地，預測與非惡性組織相比，異常的腫瘤細胞極性、滲漏的脈管系統和腫瘤組織的高間隙壓力將促進特定的標志物流出腫瘤組織。因此，猜測在胃腫瘤組織中以非常高的水平表達，但與非惡性胃組織相比未必是過表達的分泌蛋白質將構成有用的胃癌標志物。使用微陣列分析和定量聚合酶鏈式反應(qPCR)的組合，已經鑒定出用于胃癌檢測的新標志物。這種新的胃腫瘤標志物(GTM)，在胃癌的早期檢測中提供了更多工具。具體地，本發明包括新的 GTM :MUC5AC6eq ID No 1 和 4)、MUC17 (kq ID No 2 和 5)和 ZG16 (kq ID No 3 和 6)。新的GTM可以單獨使用，或備選地，可以組合在一起作為標記(包含兩種或多種 GTM)。根據本發明的標記包括MUC5AC、MUC17和ZG16中的至少一種，和至少一種另外的GTM， 其可以是根據本發明的GTM，或任何其他GTM，包括已知的GTM。已知的適于結合本發明公開的GTM—起使用的GTM包括羧肽酶N、多肽2，83kDa鏈 (CPN2)、基質金屬蛋白酶12(MMP12)、抑制素(“INHBA”)、胰島素樣生長因子7 (“ IGFBP7”)、 Y-谷氨酰水解酶(“GGH”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白聚糖(“LEPRE1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑S( “CST4”)、分泌型卷曲相關蛋白4( “SFRP4”)、aSp0rin( “ASPN”)、具有EF手型結構域的細胞生長調節劑1( “CGREF1”)、激肽釋放酶IO(KLKlO)、金屬蛋白酶的組織抑制劑1( “TIMP1”)、分泌型酸性富含半胱氨酸蛋白(“SPARC”)、轉化生長因子，13-誘導的 (“TGFBI”)、含有EGF的fibulin-樣胞外基質蛋白2( “EFEMP2”)、基膜聚糖(“LUM”)、 stannin ( “SNN”)、分泌型磷蛋白1( “SPP1 ”)、硫酸軟骨素蛋白聚糖2 ( “CSPG2”)、N_酰基鞘氨醇酰胺水解酶(“ASAH1”)、絲氨酸蛋白酶11( “PRSS11”)、分泌型卷曲相關蛋白 2( “5卩1^2”)、磷脂酶六2，父1仍組(“PLA2G12B”)、spondin2，胞外基質蛋白(“SP0N2”)、嗅介蛋白1 (“0LFM1”)、含有血小板反應蛋白重復1 (“TSRC1”)、血小板反應蛋白2 (“THBS2”)、 adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SA( “CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN( “CST1”)、賴氨酰氧化酶樣酶2( “L0XL2”)、甲狀腺球蛋白(“TG”)、轉化生長因子β1( “TGFB1”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade H成員1( “SERPINH1”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade B成員5( “SERPINB5”)、基質金屬蛋白酶2 ( “ΜΜΡ2”)、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 5型(“PCSK5”)、乙酰透明質酸糖蛋白連接蛋白4( “HAPLN4”)、CA19-9、 CA72-4、胃蛋白酶原和CEA，或之前已經鑒定為表示胃腫瘤的任何其他標志物。CN 102459646 A說明書8/21 頁通過術語“可靠性”，我們包括假陽性和/或假陰性的低發生率。因此，使用較高可靠性的標志物，與使用該標志物形成的診斷相關的假陽性和/或假陰性較低。因此，在特定的實施方案中，提供了允許以高于現有技術標志物的可靠性約50%的可靠性來檢測胃癌的標志物。在其他實施方案中，提供了可靠性高于約70%的標志物；在其他實施方案中，高于約73 %，在更多的其他實施方案中，高于約80 %，在更進一步的實施方案中，高于約90 %， 在其他實施方案中，高于約95 %，在更多的實施方案中，高于約98%，并且在特定的實施方案中，約100%的可靠性。癌癥檢測的一般方法以下列出了用于測定表達水平的一般方法，盡管將認識到用于測定表達水平的任何方法將是合適的。定量PCR(qPCR)可以使用GTM特異性引物和探針，對腫瘤樣品、血清和血漿進行定量PCR(qPCR)。 在受控的反應中，PCR反應中形成的產物量(Sambrook, J.，E Fritsch, E.和T Maniatis, Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press =Cold Spring Harbor)與起始模板的量相關。可以通過 PCR 反應處于對數期時，在試劑變得限制之前，停止PCR反應來進行PCR產物的定量。然后將PCR 產物在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中電泳，用溴化乙錠或相當的DNA染色劑進行染色，并且通過密度測定法來測量染色強度。或者，可以使用PCR儀器，如Applied Biosystems'Prism 7000或Roche LightCycler來測定PCR反應的進展，這些儀器實時地測量產物積累。實時 PCR測量DNA嵌入染料如Sybr綠進入合成的PCR產物中的熒光，或報告分子從淬滅分子中裂解出來時釋放的熒光；報告分子和淬滅分子結合至寡核苷酸探針中，所述寡核苷酸探針在DNA鏈從引物寡核苷酸延伸后與目標DNA分子雜交。寡核苷酸探針在下一個PCR循環中通過Taq聚合酶的酶作用得到置換和降解，將報告分子從淬滅分子中釋放出來。在一種稱為korpion 的變型中，探針與引物共價連接。反轉錄PCR (RT-PCR)RT-PCR可以用于比較正常以及用或未用藥物治療的腫瘤組織中不同樣品群中的 RNA水平，以表征表達模式、分辨密切相關的RNA和分析RNA結構。對于RT-PCR，第一步是從目標樣品中分離出RNA。起始材料通常是分別從人腫瘤或腫瘤細胞系以及相應的正常組織或細胞系分離的總RNA。可以從多種樣品分離RNA，樣品例如為來自乳房、肺、結腸(例如，大腸或小腸)、結直腸、胃、食管、肛門、直腸、前列腺、腦、 肝臟、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、睪丸、卵巢、子宮、膀胱等組織的腫瘤樣品，來自原發性腫瘤或腫瘤細胞系，以及來自從健康供體收集的樣品。如果RNA來源是腫瘤，例如，可以從冷凍或存檔的石蠟包埋和固定的(例如，福爾馬林固定的)組織樣品中提取出RNA。通過RT-PCR制作基因表達譜的第一步是將RNA模板反轉錄為cDNA，接著在PCR反應中進行指數擴增。兩種最常用的反轉錄酶是禽成髓細胞瘤病毒反轉錄酶(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶(MMLV-RT)。反轉錄步驟通常利用特異性引物、隨機六聚體或寡聚dT引物引發，這將視情況和制作表達譜的目標而定。例如，可以利用GeneAmp RNA PCR 試劑盒(Perkin Elmer，CA，USA)，按照生產商的說明，對提取的RNA進行反轉錄。然后將所得到的cDNA在隨后的PCR反應中用作模板。
雖然PCR步驟能夠利用多種熱穩定的DNA依賴性DNA聚合酶，但通常采用Taq DNA 聚合酶，其具有5’_3’核酸酶活性，但缺乏3’_5’校對核酸內切酶活性。因此，TaqMan qPCR 通常利用Taq或Tth聚合酶的5’核酸酶活性來水解結合目標擴增子的雜交探針，但任何具有等同5’核酸酶活性的酶均可使用。可以利用兩個寡核苷酸引物來產生PCR反應典型的擴增子。設計第三個寡核苷酸或探針來檢測位于兩個PCR引物之間的核苷酸序列。探針是不能通過Taq DNA聚合酶延伸的，并用報告熒光染料和淬滅熒光染料標記。當兩種染料如其在探針上一樣位置緊靠在一起時，任何激光誘導的報告染料的發射將被淬滅染料淬滅。在擴增反應期間，Taq DNA聚合酶以模板依賴性的方式切割探針。所得到的探針片段在溶液中解離，并且來自所釋放的報告染料的信號不受第二個熒光團的淬滅作用的影響。每合成一個新的分子，就釋放一分子的報告染料，并且未淬滅的報告染料的檢測提供了數據定量解釋的基礎。TaqMan RT-PCR可以使用可購得的設備來進行，如，例如ABI PRISM 7700序列檢測系統(Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)或 Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，德國)。在優選的實施方案中，在實時定量PCR裝置 (如ABI PRISM 7700序列檢測)上運行5’核酸酶程序。該系統由熱循環儀、激光、電荷耦合器件(CCD)、照相機和計算機組成。該系統在熱循環儀上以96孔的形式擴增樣品。在擴增過程中，通過光纖光纜實時采集所有96個孔的激光誘導的熒光信號，并在CCD處進行檢測。該系統包括用于運行儀器和用于分析數據的軟件。5’核酸酶試驗數據最初表達為Ct或閾值循環。如上文所討論的那樣，在每一循環中記錄熒光值，其代表在擴增反應中到該點時所擴增的產物量。第一次記錄到具有統計學顯著性的熒光信號時的點為閾值循環。實時定量PCR (qRT-PCR)RT-PCR技術較為新近的一種變型是實時定量PCR，其通過雙重標記的熒光生成探針(即TaqMan探針)測量PCR產物的積累。實時PCR與定量競爭PCR和定量比較PCR都兼容。前者利用每個目標序列的內部競爭物進行標準化，而后者利用樣品內所含的歸一化基因或持家基因進行RT-PCR。更多細節由例如Held等，Genome Research 6:986-994(1996) 來提供。可以使用固定的、石蠟包埋的組織作為RNA來源來測定表達水平。根據本發明的一個方面，設計PCR引物，使其在待擴增的基因中存在的內含子序列的兩側。在該實施方案中，引物/探針設計的第一步是描述出基因內的內含子序列。這可以通過公眾可獲得的軟件來進行，如由 Kent，W. J. ,Genome Res. 12(4) =656-64(2002)開發的 DNA BLAT 軟件，或 BLAST軟件，包括其變型。后續步驟按照PCR引物和探針設計的成熟方法來進行。為了避免非特異性信號，在設計引物和探針時遮蔽內含子內的重復序列是有用的。這可以通過使用Baylor College of Medicine在線獲得的R印eat Masker程序容易地實現，該程序相對于重復元件文庫篩選DNA序列，并返回其中已經遮蔽了重復元件的查詢序列。然后可以將已經遮蔽的序列用于設計引物和探針序列，利用任何可購得的或其他公眾可獲得的引物/探針設計包，如I^imer Express (Applied Biosystems) ；MGB設計試驗 (Applied Biosystems) ；Primer3(Steve Rozen 禾口 Helen J. Skaletsky(2000)Primer3 on the VIMNV for general users and for biologist programmers (用于一般使用者禾口生物學家程序員的 VIMNV 上的 Primer3)，見Krawetz S, Misener S (編輯)Bioinformatics Methods and Protocols =Methods in Molecular Biology(生物信息學方法和實驗方案 分子生物學方法),Humana Press, Totowa, NJ, 365-386 頁)。PCR引物設計中考慮的最重要的因素包括引物長度、解鏈溫度(Tm)和G/C含量、特異性、互補引物序列和3'端序列。通常，最佳PCR引物一般為17-30個堿基長，并含有約 20-80%,如，例如約50-60%的G+C堿基。通常優選50_80°C，例如，約50_70°C的解鏈溫度。 有關PCR引物和探針設計的更多指南，參見，例如Dieffenbach，C. W.等，General Concepts for PCR Primer Design (PCR 弓 L i殳 i十白勺一M g )， H :PCR Primer, A Laboratory Manual (PCR 引物，實驗室手冊)，Co Id Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, 133-155 頁 Jnnis 和 Gelfand，Optimization of PCR(PCR 的優化)，見PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR 實驗方案，方法和應用指導)，CRC Press, London, 1994, 5-11 頁；禾口 Plasterer, Τ· N. Primerselect Primer and probe design (引物選擇引物和探針設計)，Methods Mol.Biol.70 :520-527 (1997)，在此特意將其全部公開內容明確引入作為參考。微陣列分析差異表達也可以使用微陣列技術來鑒定或驗證。因此，可以使用微陣列技術在新鮮或者石蠟包埋的腫瘤組織中測量GTM的表達譜。在這種方法中，在微芯片基質上覆蓋或排列目標多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)。排列的序列(即，捕獲探針)隨之與來自目標細胞或組織(即，靶標)的特異性多核苷酸雜交。與RT-PCR方法一樣，RNA來源通常為從人腫瘤或腫瘤細胞系以及相應的正常組織或細胞系中分離出來的總RNA。因此，RNA 可以分離自多種原發性腫瘤或腫瘤細胞系。如果RNA的來源是原發性腫瘤，則可以例如從冷凍或存檔的福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)組織樣品和固定的(例如，福爾馬林固定的)組織樣品中提取RNA，這些樣品在日常的臨床實踐中都是常規制備和保存的。在微陣列技術的特定實施方案中，向基質上施加PCR擴增的cDNA克隆的插入片段。基質可以包括高達1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或75個核苷酸序列。在其他方面中，基質可以包括至少10，000個核苷酸序列。固定在微芯片上的微陣列序列適合于在嚴謹條件下雜交。作為其他實施方案，用于微陣列的靶標可以為至少50、100、200、400、500、 1000 或 2000 個堿基長；或 50-100、100-200、100-500、100-1000、100-2000 或 500-5000 個堿基長。作為另外的實施方案，用于微陣列的捕獲探針可以為至少10、15、20、25、50、75、80 或 100 個堿基長；或 10-15、10-20、10-25、10-50、10-75、10-80 或 20-80 個堿基長。通過反轉錄從目標組織提取的RNA，通過熒光核苷酸的摻入可以生成熒光標記的 cDNA探針。施加到芯片上的標記cDNA探針與陣列上的每個DNA斑點特異性地雜交。嚴謹洗滌以除去非特異性結合的探針后，通過共焦激光顯微鏡或通過另一種檢測方法(如CCD 照相機)來掃描芯片。對每個陣列化元素的雜交的定量允許評估相應mRNA的豐度。利用雙色熒光，從兩個RNA源生成分開標記的cDNA探針，其成對地與陣列雜交。由此，對應于每個特定基因的來自兩個來源的轉錄物的相對豐度可以得以同時確定。這種小型化規模的雜交提供了對大量基因表達模式的方便快捷的評價。此類方法已經證明具有檢測微量轉錄物和可再現地檢測至少大約兩倍的表達水平差異所需的靈敏度，其中所述微量轉錄物僅以每個細胞幾個拷貝的水平表達Gchena等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 93(2) :106-149(1996))。微陣列分析可以通過可購得的設備按照生產商的實驗方案來進行，如使用Affymetrix GenChip技術、Illunima微陣列技術或hcyte微陣列技術。 對大規模分析基因表達的微陣列方法的研發，使得可以在多種腫瘤類型中系統地尋找癌癥分類和結果預測的分子標志物。RNA分離、純化和擴增用于mRNA提取的一般方法是本領域公知的，并公開在分子生物學的標準教科書中，包括 Ausubel 等，Current Protocols of Molecular Biology (分子生物學通用實驗方案)，John Wiley and Sons (1997)。例如，Rupp 禾口 Locker, Lab Invest. 56 :A67 (1987)，以及De Sandres等，BioiTechniques 18 :42044(1995)中公開了從石賭包埋的組織中提取RNA 的方法。特別地，可以使用來自商業生產商如Qiagen的純化試劑盒、成套緩沖液和蛋白酶， 按照生產商的說明，來進行RNA分離。例如，可以使用Qiagen RNeasy微型柱從培養細胞分離總RNA。其他可購得的RNA分離試劑盒包括MasterPure Complete DNA和RNA純化試劑盒(EPICENTRE(D，Madison，WI)和 Paraffin Block RNA 分離試劑盒(Ambion, Inc.) 可以使用RNA Mat-60 (Tel-Test公司)從組織樣品分離總RNA。例如，可以通過氯化銫密度梯度離心分離由腫瘤制備的RNA。利用固定的石蠟包埋的組織作為RNA來源進行基因表達譜制作的代表性實驗方案的步驟包括mRNA分離、純化、引物延伸和擴增，在多篇發表的期刊文章中給出(例如 Τ. E. Godfrey 等，J. Molec. Diagnostics 2 :84-91 (2000) ；K. Specht 等，Am. J. Pathol. 158 419-29(2001))。簡言之，一個代表性方法從切割約10微米厚的石蠟包埋腫瘤組織樣品切片開始。然后提取RNA，除去蛋白質和DNA。分析RNA濃度后，如果需要，可以包括RNA修復和/或擴增步驟，并且利用基因特異性啟動子反轉錄RNA，接著進行RT-PCR。最后，分析數據以基于所研究的腫瘤樣品中鑒定到的特征性基因表達模式來確定患者可用的最佳治療選擇。免疫組織化學和蛋白質組學免疫組織化學法也適用于檢測本發明的增殖標志物的表達水平。因此，利用每種標志物特異性的抗體或抗血清，優選多克隆抗血清，最優選單克隆抗體，來檢測表達。可以通過用例如放射性標記、熒光標記、半抗原標記(如，生物素)，或酶(如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)直接標記抗體本身來檢測抗體。或者，可以將未標記的一級抗體與標記的二級抗體聯合使用，所述二級抗體包括一級抗體特異性的抗血清、多克隆抗血清或單克隆抗體。免疫組織化學實驗方案和試劑盒是本領域公知的并且可商購。蛋白質組學可以用來分析特定時間點樣品(例如，組織、器官或細胞培養物)中存在的多肽。特別地，蛋白質組學技術可以用來評估樣品中多肽表達的全局變化(也稱為表達蛋白質組學)。蛋白質組學分析通常包括(1)通過2-D凝膠電泳Q-D PAGE)分離樣品中單獨的多肽；(2)鑒定從凝膠中回收的單獨的多肽，例如，通過質譜或N-端測序，和(3)利用生物信息學分析數據。蛋白質組學方法對于其他基因表達譜研究方法是有價值的補充， 并且可以單獨使用或與其他方法結合使用，以檢測本發明的增殖標志物的產物。使用標志物選擇性的核酸探針的雜交方法這些方法涉及將核酸探針結合支持體，并且在合適的條件下與源自測試樣品的 RNA 或 cDNA 雜交(Sambrook, J. ，E Fritsch, E.禾口 T Maniatis，Molecular Cloing :ALaboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press =Cold Spring Harbor (2001))。這些方法適用于源自腫瘤組織或液體樣品的GTM。 通常用熒光或放射性分子來標記RNA或cDNA，以能夠檢測和定量。在一些應用中，可以用分支的、熒光標記的結構將雜交DNA標記，以增強信號強度(Nolte，F. S. Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens (用于臨床樣品中核酸序列的直接定量的分支DNA信號擴增)，Adv. Clin. Chem. 33，201-35 (1998))。在通過凝膠圖像的熒光檢測或密度測定定量雜交量之前， 通過在低鹽溶液(如，0. 1XSSC，0. 5% SDS)中強烈洗滌來除去未雜交的標記。支持體可以是固體，如尼龍或硝基纖維素膜，或由在液體懸浮液中時雜交的微球體或珠子組成。為了可以洗滌和純化，珠子可以是磁性的(Haukanes，B-I和Kvam，C.，Application of magnetic beads in bioassays (磁性珠子在生物試驗中的應用)，Bio/technology 11,60-63(1993)) 或是熒光標記的，以能夠進行流式細胞術(參見，例如Spiro，Α.，Lowe, Μ.和Brown，D.， A Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry (使用流式細胞術的用于DNA序列的多路鑒定和定量的基于珠子的方法)，Appl. Env. Micro. 66，4258-4265 (2000))。雜交技術的一種變型是 QuantiGene Plexe 測定(Genospectra，Fremont)，其結合了熒光珠子支持體和分支DNA信號擴增。雜交技術的再一種變型是Quantikine mRNA測定(R&D Systems, Minneapolis).方法按照生產商的說明書中所述的。簡言之，測定使用與洋地黃毒苷綴合的寡核苷酸雜交探針。在比色試驗中，使用偶聯堿性磷酸酶的抗洋地黃毒苷抗體來檢測雜交。其他的方法是本領域公知的，并且在本文中不需要更多描述。酶聯免疫測定(ELISA)簡言之，在夾層ELISA測定中，將對抗GTM的多克隆或單克隆抗體結合固相支持體(Crowther，J. R. The ELISA guidebook (ELISA 參考指南)，Humama Press :New Jersey (2000) ；Harlow, Ε.禾口 Lane, D. , Using antibodies :a laboratory manual (使用抗體實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor (1999)) 或懸浮液珠子。其他方法是本領域公知的，并且在本文中不需要更多描述。單克隆抗體可以是雜交瘤衍生的，或選自噬菌體抗體文庫(Hust M.和Dubel S. ,Phage display vectors for the in vitro generation of human antibody fragments (用于體夕卜產生人抗體片段的噬菌體展示載體)，Methods Mol Biol. 295 :71-96(2005))。用非目標蛋白制備物和去污劑將非特異性結合位點阻斷。然后用來自含有GTM抗原的患者的樣品或組織的制備物溫育捕獲抗體。在用檢測目標GTM的二級抗體溫育抗體/抗原復合物之前，洗滌混合物。二級抗體通常綴合熒光分子或可以在酶反應中檢測或用綴合報告子的第三抗體檢測的其他報告分子(Crowther，同上)。或者，在直接ELISA中，含有GTM的制備物可以結合支持體或珠子，并且用抗體-報告子綴合物直接檢測目標抗原(Crowther，同上)。用于生產單克隆抗體和多克隆抗血清的方法是本領域公知的，并且在本文中不需要更多描述。免疫檢測這些方法還可以用于免疫檢測在外科手術取出腫瘤前后取自胃癌患者的血清或血漿中的標志物家族成員、免疫檢測患有其他癌癥的患者中的標志物家族成員，所述其他癌癥包括但不限于，結直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、食道癌、胃癌、子宮內膜癌和腦癌，以及免疫檢測來自胃癌患者的尿液和糞便中的標志物家族成員。還可以使用其他標準免疫檢測技術，如免疫印跡或免疫沉淀，來檢測組織或樣品中的 GTM(Harlow，E.禾口 Lane，D.，Using antibodies :a laboratory manual (使用抗體實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor (1999))。在免疫印跡中，將來自含有GTM的組織或液體的蛋白質制備物在變性或非變性條件下通過聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后將蛋白質轉移至膜支持體上，如尼龍。然后按照對免疫組織化學所述的，將GTM與單克隆或多克隆抗體直接或間接反應。或者，在一些制備物中，可以將蛋白質直接點在膜上，而沒有之前的電泳分離。可以通過密度測定來定量信號。在免疫沉淀中，用抗GTM的單克隆或多克隆抗體溫育含有GTM的可溶性制備物。然后用惰性珠子溫育反應物，所述惰性珠子由具有共價連接的A蛋白或G蛋白的瓊脂糖或聚丙烯酰胺制備。A或G蛋白珠子與抗體特異性地反應，形成結合珠子的抗體-GTM-抗原的固定化復合物。洗滌后，可以通過免疫印跡或ELISA檢測和定量結合的GTM。閾值測定對于使用GTM的測試，將得到能夠使樣品對于胃癌稱為陽性或陰性的閾值。這些閾值將通過正在研究胃癌存在的患者群的分析來測定。閾值對于不同的測試應用將不同； 例如，使用大部分無泌尿科癥狀的患者群來測定用于群篩選測試中的閾值，并且這些閾值不同于用于監測胃癌復發患者的測試中所用的那些。可以選擇閾值，以在所需的臨床背景中提供實際水平的測試特異性；即，允許合理靈敏度但沒有過量接受假陽性結果患者的特異性。該特異性可以在80-90%的范圍內。獲得測試閾值的備選方法是對于不同的測試閾值，將靈敏度相對于特異性作圖(R0C曲線)，然后選擇曲線的拐點。作為單個閾值的備選，測試可以使用測試間隔，其提供了不同程度的疾病存在的可能性，并且其具有與這些可能性相關的不同臨床結果。例如，測試可以具有三個間隔；一個與高風險(例如，90%)的胃癌存在相關，第二個與低風險的胃癌相關，而第三個認為是懷疑患病的。“懷疑”的間隔將與限定的時間段內的重復測試的推薦相關。胃癌標志物的抗體在其他方面中，本發明包括制備針對GTM的抗體。使用本文中所述的方法，可以使用微陣列和/或qRT-PCR方法來鑒定新的GTM。一旦鑒定出推定的標志物，可以足量生產以適合于引發免疫應答。在一些情況中，可以使用全長GTM，而在其他情況中，GTM的肽片段足夠作為免疫原。可以將免疫原注入合適的宿主中(例如，小鼠、兔子等)，并且如果需要，可以注入佐劑，如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，以提高免疫應答。可以認識到制備抗體在免疫學領域中是常規的，并且在本文中不需要更多描述。因此，可以產生針對使用本文中所述方法鑒定的GTM的抗體，包括單克隆或噬菌體展示抗體。在進一步的實施方案中，可以制備針對本文中鑒定的腫瘤標志物的蛋白質或蛋白質核心的抗體或針對對于GTM獨特的寡核苷酸序列的抗體。盡管特定的蛋白質可以糖基化，因此在特定的情況中，糖基化模式的變化可導致缺乏常規糖基化模式的GTM形式的錯誤檢測。因此，在本發明的特定方面中，GTM免疫原可以包括脫糖基化的GTM或脫糖基化的 GTM片段。可以使用一種或多種本領域已知的糖苷酶來完成脫糖基化。或者，GTMcDNA可以在缺乏糖基化的細胞系中表達，如在原核細胞系中表達，包括大腸桿菌等。可以制備其中具有GTM編碼寡核苷酸的載體。許多這樣的載體可以基于本領域已知的標準載體。載體可以用于轉染多種細胞系，以產生GTM-產生細胞系，其可以用于產生所需量的GTM，用于研發特定的抗體或其他試劑，用于檢測GTM或用于標準化為GTM研發的測定法。試劑盒基于本發明的發現，可以設想和產生幾種類型的測試試劑盒。首先，可以制備具有預先裝載了檢測分子(或“捕獲試劑”)的檢測裝置的試劑盒。在用于檢測GTM mRNA的實施方案中，這樣的裝置可以包括基質(例如，玻璃，硅，石英，金屬等)，在其上結合了寡核苷酸，作為與待檢測的mRNA雜交的捕獲試劑。在一些實施方案中，可以通過mRNA(用cy3、 cy5、放射性標記或其他標記來標記)與基質上的寡核苷酸雜交來完成mRNA的直接檢測。在其他實施方案中，可以通過首先制備所需mRNA的互補DNA(cDNA)來完成mRNA的檢測。然后，可以將標記的cDNA與基質上的寡核苷酸雜交，并檢測。抗體還可以作為捕獲試劑用于試劑盒中。在一些實施方案中，基質(例如，多孔平板)可以具有與其連接的特異性GTM捕獲試劑。在一些實施方案中，試劑盒可以包括阻斷試劑。阻斷試劑可以用于降低非特異性結合。例如，可以使用過量的來自不含有GTM寡核苷酸的任何常規來源的DNA(如，鮭精DNA)來降低非特異性的寡核苷酸結合。可以使用過量的阻斷蛋白(如，血清白蛋白)來降低非特異性的抗體結合。可以認識到用于檢測寡核苷酸和蛋白質的多種方法是本領域已知的，并且可以使用特異性地檢測GTM相關分子的任何策略，并且認為在本發明的范圍內。結合固相支持體時，例如，使用抗體芯片時，也可以使用抗體，抗體芯片允許使用單個芯片檢測多種標志物。除了基質以外，測試試劑盒可以包含捕獲試劑(如，探針)、洗滌溶液(例如，SSC、 其他鹽、緩沖劑、去污劑等)，以及檢測部分(例如，cy3、cy5、放射性標記等)。試劑盒還可以包括使用說明書和包裝。可以使用任何合適的技術來檢測樣品中的癌癥標志物，這些技術可以包括，但不限于，寡核苷酸探針、QPCR或針對癌癥標志物產生的抗體。將認識到待測試的樣品不限于懷疑是腫瘤的組織樣品。標志物可以分泌至血清或其他體液中。因此，樣品可以包括任何身體樣品，并且包括生檢樣品、血液、血清、腹膜沖洗物、腦脊髓液、尿液和糞便樣品。還將認識到本發明不限于人類的癌癥檢測，而且還適于任何動物的癌癥檢測，包括，但不限于，狗、貓、馬、牛、綿羊、鹿、豬和已知患癌癥的任何其他動物。體液中胃癌標志物的測試在幾個實施方案中，理想地可以對獲自血液、血漿、血清、腹膜液(例如，獲自腹膜沖洗物)或其他體液(如，尿液、淋巴、腦脊液、胃液)的樣品或糞便樣品進行GTM測定。通常，測試這些液體中寡核苷酸、蛋白質和肽的方法是本領域已知的。可以使用如 Northern印跡、Southern印跡或微陣列方法，或qPCR的雜交方法來進行寡核苷酸的檢測。 用于檢測蛋白質的方法，包括如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、具有抗體的蛋白質芯片、懸浮液珠子放射免疫測定(RIA) ,Western印跡和凝集素結合。然而，為了說明的目的，可以使用夾層型酶聯免疫吸附測定(ELISA)來定量GTM的液體水平。對于血漿測定，將5uL等份的適當稀釋的樣品或連續稀釋的標準GTM和75uL的過氧化物酶綴合的抗-人GTM抗體加入微量滴定平板的孔中。在30°C下30分鐘的溫育期后，用磷酸緩沖鹽水{PBS}中的0.05% 吐溫20洗滌孔，來除去未結合的抗體。然后在30°C下用含有鄰-亞苯基二胺的H2A溫育結合的GTM和抗-GTM抗體復合物15分鐘。通過加入IM H2SO4來停止反應，并且用微量滴定平板讀出器來測量492nm處的吸光值。可以認識到抗-GTM抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗血清。還可以認識到可以合適地研究任何其他體液。在生理學意義上，標志物不必是分泌的才是有用的。相反，標志物蛋白質或基因進入血清的任何機制在產生可檢測的、可定量水平的標志物中是有效的。因此，可溶性蛋白從細胞的正常分泌、膜蛋白從質膜的脫落、選擇性剪接形式的mRNA或從其表達的蛋白質的分泌、細胞死亡(或凋亡)可以產生足夠水平的有用標志物。對于使用血清標志物作為診斷和/或評價多種癌癥類型療效的工具，存在越來越多的支持。Yoshikawa等，(Cancer Letters, 151 :81-86 Q000))，描述了胃癌患者血菜中的基質金屬蛋白酶-1的組織抑制劑。Rudland 等，(Cancer Research 62 :3417-3427(2002))描述了骨橋蛋白作為人乳
癌中的轉移相關蛋白。Buckhaults 等，(Cancer Research 61 :6996-7001 (2002))描述了結直腸腫瘤中特定分泌的和表達的細胞表面基因。Kim等，(JAMA 287(13) :1671-1679(2002))描述了骨橋蛋白作為卵巢癌的潛在診斷生物標志物。Hotte 等，(AJ. American Cancer Society 95(3) :507-512 Q002))，描述了血菜骨橋蛋白作為人體液中可檢測的蛋白質，并且與特定的惡性腫瘤相關。Martin^, (Prostate Cancer Prostatic Dis. 2004^3^ 9 日(PMID :15007379) (摘要))，描述了人激肽釋放酶2，前列腺特異性抗原(PSA)和游離PSA作為檢測前列腺癌的標志物的用途。Hall 等，(Laryngoscope 113(1) :77-81 (2003) (PMID U679418)(摘要))，描述了血清甲狀腺球蛋白在甲狀腺癌中的預測價值。Mazzaferri 等，(J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (4) 1433-1441 Q003)(摘要))， 描述了甲狀腺球蛋白作為甲狀腺癌患者的潛在監測方法。Whitley 等，(Dim Lab. Med. 24(1) =29-47(2004)(摘要))，描述了甲狀腺球蛋白作為甲狀腺癌的血清標志物。Kuo 等，(Clin. Chim. Acta. 294(1-2) 157-168 Q000)(摘要))，描述了 HCF-和 HBV-感染患者中的血清基質金屬蛋白酶-2和-9。Koopman 等，(Cancer Epidemiol. Biomarkers Prey 13(3) :487-491 O004)(摘要))，描述了骨橋蛋白作為胰腺癌的生物標志物。Pellegrini 等，(Cancer Immunol. Immunother. 49(7) :388-394(2000)(摘要))， 描述了可溶性癌胚抗原和TIMPl作為入侵前結直腸癌的標志物的測量。
Melle 等，(Clin. Chem. 53 (4),629-635 (2007)(摘要))，描述了 HSP27 作為胰腺癌的血清標志物。Leman 等，(Urology, 69 (4) 714-20 (2007)(摘要))，描述了 EPCA-2 作為前列腺癌的血清標志物。Tsigkou 等，(I Clin Endocrinol Metab，92 (7) 25洸_31 (2007)(摘要))，描述了總抑制素作為卵巢癌的潛在血清標志物。Marchi 等，(Cancer 112，1313-13M ^)08)(摘要))，描述了前載脂蛋白 AI 作為肺癌患者腦部轉移的血清標志物。方法使用以下的一般方法來評價多種方法對胃腫瘤相關標志物的分子鑒定的適用性。腫瘤收集從首爾國立大學醫院(Seoul National University Hospital)切除的外科手術樣本收集胃腫瘤樣品和非惡性胃組織。基于癥狀、生理發現和組織的組織學檢查來進行胃癌的診斷。RNA 提取在一些實施方案中，通過測定取自腫瘤的樣品中的RNA水平來分析胃腫瘤相關基因的表達。將冷凍外科手術樣本包埋在OCT介質中。使用切片機從組織塊切出60微米的切片，在TriReagent 水(3 1)混合物中均質化，然后氯仿萃取。然后使用RNeasy 程序(Qiagen)從水相純化總RNA。總共從58個胃腫瘤和58個非惡性(“正常”)胃組織樣品中提取了 RNA，并用于以下所述的微陣列分析中。還從16個癌細胞系中提取出RNA，并合并作為參照RNA。微陣列載玻片制備環氧涂布的玻璃載玻片獲自MWG Biotech AG，K^ersberg，德國，并且根據生產商的實驗方案，使用Gene Machines微陣列機器人用_30，000個50mer寡核苷酸印刷。RNA標記和雜交在含有5-(3-氨基烯丙基)_2’脫氧尿苷_5’ -三磷酸鹽的反應物中，使用 Superscript II反轉錄酶(Invitrogen)從IOug總RNA轉錄cDNA。然后將反應物在 Microcon柱中去離子，接著在室溫下，在碳酸氫鹽緩沖液中用Cy3或Cy5溫育。使用 Qiaquick柱^jiagen)除去未結合的染料，并且將樣品在SpeedVac中濃縮至15ul。然后將 Cy3和Cy5標記的cDNA與Ambion ULTRAhyb緩沖液混合，在100°C下變性2分鐘，并在雜交室中，在42°C下，與微陣列載玻片雜交16小時。然后洗滌載玻片，并在Axon 4000A掃描儀中，在兩個功率設定下掃描兩次，以產生基因表達的原始熒光數據。歸一化程序為了測量腫瘤和非癌組織中癌基因的表達，通過減去局部背景熒光強度來校正由 Genepixta軟件檢測的中值熒光強度。排除了背景校正強度低于零的點。為了促進歸一化， 將強度比例和整體點強度進行了對數轉化。使用LOCFITta包中實現的局部回歸對染料和空間偏差校正了對數轉化的強度比例。同時對于整體點強度和位置回歸了對數轉化的強度比例。局部回歸的殘差提供了校正的對數-倍數變化。對于質量控制，相對于點強度和位置， 對每個歸一化的微陣列的比例作圖。隨后目測檢查圖的可能剩余的假象。此外，方差分析(ANOVA)模型適用于針尖(pin-tip)偏差的檢測。將歸一化的所有結果和參數插入用于統計學分析的Postgres-數據庫中。標志物選擇根據每個基因在腫瘤和非惡性組織中的相對信號強度，將29，718個基因的每個微陣列基因表達數據進行分級。進一步的分析限于(i)編碼分泌蛋白的基因，( )在腫瘤組織中具有高于對編碼現有腫瘤標志物CEA的基因(CEACAiK)觀察到的強度等級的基因和 (iii)在血液或脈管組織中不具有顯著表達的基因，如通過Unigene數據庫中的EST計數所測定的(Wheeler DL等，200 。通過鑒定預期含有N-端信號肽的轉錄物來預測分泌蛋白。丟棄具有不在頭20個N-端氨基酸的預測的跨膜螺旋的蛋白[Krogh A.等，2001]。使用TARGETP[Emanuelsson O等，2000]預測更多的亞細胞定位。相關寡核苷酸的參考號(MWG寡聚物#)，以及選定GTM的NCBImRNA和蛋白質參考序列顯示于圖1中。圖1還顯示了選定的GTM在腫瘤和非惡性組織中的等級強度。下文中顯示了本發明的GTM的全部DNA序列。定量實時PCR在其他實施方案中，可以將實時或定量PCR(qPCR)用于PCR模板拷貝數的絕對或相對定量。使用 Primer Express V 2. OTM(Applied Biosystems)設計 MUC17 的引物組(正向GAGGTGGTCAGCAGCATTGAC ；反向CCTGGGAAGAGTG GTTTTTTAGC)，并使用 STOR 綠色標記來檢測擴增的產物。通過Assay-on-Demand 表達試驗Hs. 00380609_ml (Applied Biosystems)來表示ZG16。在ABI Prism 7000序列檢測系統上在標準循環條件下進行了擴增。使用由單個cDNA表示的每個RNA樣品在兩個96孔平板上進行試驗。分析了高達 45個來自胃腫瘤和非惡性胃組織的RNA樣品。每個平板含有參照cDNA標準曲線，在625-倍濃度范圍內，以一式兩份進行。分析由計算ACT組成(目標基因CT-平均參照cDNA CT) 0 ACT與負log2倍數變化成正比。然后計算相對于中值非惡性log2倍數變化的log2倍數變化(log2倍數變化-中值正常log2對數變化)。然后將這些倍數變化聚類成頻率級并作圖。蛋白質表達和抗體產生為了證實蛋白質水平的ZG16，必須產生抗重組蛋白的新抗體。使用正向引物 CACCAATGCCATTCAGGCCAGGT 和反向引物 TCAGCATCTGCTGCAGCTA 從人細胞系 cDNA PCR 擴增 ZG16的編碼區17-167。將PCR產物凝膠純化并且克隆至來自hvitrogen的“(Gateway”進入載體“pENTR/dTOPO”中，然后測序以證實序列的正確插入。使用“(Gateway”系統，然后從 pENTR/dTOPO將ZG16克隆至含有N端6XHIS標記物的hvitrogen表達載體pDEST17中。 在BL21-AI大腸桿菌細胞(Invitrogen)中進行ZG16的表達，將細胞在37°C下在搖床上生長，直至它們處于中間對數期(0D_ = 0. 5)，由此在0. 2%最終濃度的阿拉伯糖下誘導，并且在37°C下在搖床上再生長3小時。通過在6000 X g下離心15分鐘來收集細胞，并將上清液丟棄。將細胞重懸浮于PBS(pH7.0)中，并且使用60%功率的Sonics Vibra cell通過超聲波來裂解。通過在12000 Xg下離心10分鐘來澄清裂解的細胞，并且丟棄上清液。將細胞沉淀物在含有0. 5% TritonX-100的PBS緩沖液(pH7. 0)中洗滌三次，接著用PBS (pH7. 0) 洗滌一次。然后，使用PBS中的8M脲(pH8. 0)將沉淀物再洗滌一次。通過在12000Xg下離心來澄清每個洗滌步驟，并且丟棄上清液。然后將沉淀物溶解于含有IOmM TRIS (pH8. 0)、 8M脲、IOOmM NaCl的增溶緩沖液中，在室溫下過夜。將增溶緩沖液在12000 Xg下進一步離心，通過0. 45nm膜過濾，并且裝載于用含有PBS (ρΗ7. 0)、8M脲和20mM咪唑的洗滌緩沖液預先洗滌過的Mkpharose柱上。裝載后，用10柱體積的洗滌緩沖液洗滌柱子，并且將溶解的蛋白質在補充500mM咪唑的洗滌緩沖液中洗脫。將洗脫的蛋白質脫鹽至PBS(pH7.0) 和8M脲緩沖液中，并且在含有50mM乙酸鈉(pH4. 5)、0. IM NDSB-201、10%甘油、lmM/0. ImM GSH/GSSH的重折疊緩沖液中通過逐滴稀釋來重折疊。通過在12000Xg下離心來澄清重折疊緩沖液，并且使用具有IOKDa標稱分子截留的Centripr印濾器(Millipore)來濃縮重折疊蛋白。使用G25脫鹽柱將重折疊蛋白緩沖液交換至補充了 10%甘油的含有IOOmM乙酸鈉的緩沖液(PH5.0)中，并且將等份試樣存儲在_80°C。考馬斯染色的10% SDS PAGE凝膠和 Western印跡分析總體表明了高達95%純度的18KDa的His-標記的蛋白質的存在。切除 18KDa考馬斯染色帶并通過MALDI-T0F/T0F MS/MS鑒定含有ZG16。通過用純化的ZG16蛋白淘選噬菌體展示抗體文庫來獲得抗ZG16的抗體 (Antibodies by Design ；Morphosys AG 的一個分部，德國。www, morphosys. com)。抗體陣列使用抗體陣列來證實候選標志物。血清樣品獲自胃癌、結直腸癌(外科手術前后)患者，和獲自非惡性疾病的外科手術患者。通過Dunedin Public Hospital，新西蘭，和Christchurch Cancer Society組織庫，Christchurch，新西蘭，來制備樣品。使用 GeneMachines OminGrid 100陣列機器人將獲自商業來源或選自噬菌體文庫(Morphosys) 的抗ZG16和MUC17的抗體印刷在玻璃載玻片上(Schott Nexterion Slide H)。用疏水筆將每個陣列圈上范圍。然后將載玻片在3 X PBS-0. 5 %吐溫20 (3 X PBS-T)中洗滌，接著用50mM 硼酸鈉緩沖液中的50mM乙醇胺，pH8. 0來封閉，接著用酪蛋白酸鹽封閉緩沖液(3XPBS-T，
酪蛋白酸鈉)封閉。然后將生物素標記的血清樣品添加至載玻片上，接著在4°C下溫育過夜。然后將載玻片在3XPBS-T中洗滌，接著空氣干燥。然后使用滾環擴增(RCA)來檢測結合的抗體，之前有大量描述(Haab BB, Lizardi PM, RCA-enhanced protein detection arrays (RCA增強的蛋白質檢測陣列)，Methods Mol Biol. 2006 ；328 15-29)。簡言之，用已經綴合寡核苷酸引物(5’-CCT GGT GCT CAA ATT TCA GTT CTG C-3’)的抗生物素抗體溫育載玻片。然后在潮濕的密封室中在37°C下將環狀DNA模板與載玻片雜交30min，接著將載玻片在遞減濃度的PBS-T(3XPBS-0. 05%吐溫20，IXPBS-0. 05%吐溫20和0. 1XPBS-0. 05% 吐溫20)中洗滌并干燥。然后使用？11口9在301下將模板延伸池！·，接著洗滌載玻片，并通過離心干燥。然后使用同源熒光標記的探針來檢測擴增的模板。用Axon 4000A掃描儀掃描載玻片，并用GenePix Pro 6. 1. 0. 4軟件測量信號。使用來自R的li_a (Smith，200 包(用于統計計算的R包(R Development Core)的normalizeBetweenArrays函數，使用分位數歸一化來調節Cy5熒光強度。分位數歸一化調節強度值，通過將來自不同區組的強度分位數設定至相同值，使得強度分布對于每個區組是相同的(每個區組對應于單獨的樣品)。每個強度值的等級在該程序過程中沒有改變，只有強度的相對量值發生了改變。設想描述抗原濃度范圍的潛在概率分布函數對于所有樣品是相同的。該程序提高了所有樣品見的區組之間信號的平均相關性，并且還在考慮僅參照的區組時，其表明了數據質量的改進。在采取重復之間的中值來獲得每種抗體的歸一化強度之前，除去Gen印ix-標記的點。因此，我們已經鑒定出對于研發試劑、檢測和評價胃癌的裝置和試劑盒有用的三種基因和/或蛋白質。可以使用一個或多個胃癌標志物，單獨或結合使用，以提供用于胃癌的可靠分子測試。
實施例在此所述的實施例是為了說明本發明的實施方案的目的。其他實施方案、方法和分析類型在分子診斷領域的普通技術人員的能力范圍內，并且在本文中不需要詳細描述。 認為本領域范圍內的其他實施方案是本發明的一部分。實施例1 胃惡性腫瘤的標志物的鑒定使用獲自胃腫瘤和非惡性樣品的基因表達數據來選擇標志物。將以下標準用于標志物選擇(i)分泌蛋白特征性的信號序列的存在，(ii)腫瘤組織中微陣列信號強度等級和(iii)血液或脈管組織中相應EST的水平。這些標準的使用能夠鑒定在腫瘤組織中大量表達但可能在血清、血液或血漿中具有低背景的分泌標志物。圖1描繪了一張表，其顯示了使用以上標準選擇的胃惡性腫瘤的三個標志物，MUC5AC，MUC17和ZG16。圖1包括基因符號 (“符號”)、MWG寡聚物號、NCBI mRNA參照序列號、蛋白質參照序列號、使用腫瘤組織衍生的陣列上基因的等級強度和使用非惡性組織衍生的陣列上基因的等級強度。所有三個GTM 具有比CEACAM5高的表達(強度)等級，CEACAM5是編碼現有胃癌標志物CEA的基因。最低的表達等級可能是四，718。等級的檢查還顯示出這些GTM在腫瘤組織中的表達與非惡性組織相當，表明基因在癌形成過程中未得到強烈下調。血液和脈管組織中這三個GTM的 unigene EST 計數(Wheeler 等，2003)全部為零。實施例2 qRT-PCR分析使用更靈敏和精確的基因表達定量技術qPCR，在腫瘤組織中證實了 GTM ZG16和 MUC17的豐度和身份。使用方法部分中所述的引物和探針，通過RT-qPCR分析了來自相同患者的高達45個胃腫瘤樣品和等量的非惡性胃組織樣品。使用達到產物擴增閾值水平(Ct) 所需的PCR循環數來定量這些基因的表達。qPCR分析證實了陣列數據通過qPCR容易地在腫瘤組織中檢測到兩個標志物，并且不存在腫瘤組織與非惡性組織相比表達顯著下降的證據。通過圖加-b中的直方圖說明了這些RNA在腫瘤組織中與非惡性組織相比的豐度。實施例3 血清中胃腫瘤標志物蛋白的檢測在特定的實施方案中，可以使用針對完整蛋白質、蛋白質片段(肽)或蛋白質核心的抗體來完成GTM蛋白的檢測。檢測和定量蛋白質和肽表達的方法是本領域已知的，并且可以包括依賴于相對蛋白質或肽產生的特異性抗體的方法。可以使用本領域公知的方法來制備單克隆抗體和多克隆抗血清，并且在本文中不需要更多描述。為了檢測血清中的GTM，使用Gene Machine OmniGrid 機器人技術將抗GTM的抗體印刷在玻璃載玻片上。將每個抗體在陣列上重復8次。然后在用抗體載玻片溫育之前，用生物素標記來自33名胃癌患者和41名對照的血清樣品。用抗-生物素抗體檢測結合的蛋白，并且使用滾環擴增(RCA)和熒光標記來擴增信號。使用Axon 4000a掃描儀和Gem5Pix 6. 1. 0. 4軟件來定量結合的蛋白質的含量。患者的特征顯示于圖2中。
將來自陣列上每個抗體的熒光信號歸一化，并且將8個重復的中值信號以任意熒光單位來表示。說明數據分布的盒形圖顯示于圖3中。對于MUC17的中值信號，胃癌患者為18，836AU，對照組為16，130。這些中值是顯著差異的(p = 0. 007)。對于獲自MorphoSys 的兩個噬菌體展示ZG16抗體(5902和5905)，觀察到中值之間的顯著差異。胃癌患者樣品中ZG16_5902的中值信號為2139AU，相比，對照的為1837AU ；患者中的中值ZG16_5905信號為3063AU，相比，對照的為1675AU。患者和對照之間對于ZG16_5902和ZG16_5905的中值信號是顯著不同的(各自為P = 0.05和ρ = 0.005)。該數據證明MUC17和ZG16以顯著高于對照的水平存在于胃癌患者的血清中。患者和對照組之間的更多區別將通過免疫學測試程序的改進、對目標抗原具有更高特異性的抗體的鑒定和標志物的聯合使用來實現。實施例8 用含有GTM的載體轉染的細胞在進一步的實施方案中，提供了可以表達GTM、GTM片段或肽標志物的細胞。因此可以使用原核細胞和真核細胞。例如，大腸桿菌(原核細胞)可以用來產生大量缺乏成熟糖基化的GTM (如果特定GTM通常是糖基化的)。COS細胞、293細胞和多種其他真核細胞可以用于產生糖基化的GTM，或具有正確的折疊，并且因此，具有天然形式的GTM蛋白的三維結構。轉染這些細胞的方法是本領域已知的，并且在本文中不需要更多描述。實施例9:試劑盒基于本發明的發現，可以產生幾種類型的測試試劑盒。首先，可以制備具有預先裝載了檢測分子(或“捕獲試劑”)的檢測裝置的試劑盒。在用于檢測GTM mRNA的實施方案中，這樣的裝置可以包括基質(例如，玻璃，硅，石英，金屬等)，其上的寡核苷酸作為與待檢測的mRNA雜交的捕獲試劑。在一些實施方案中，可以通過mRNA (用cy3、cy5、放射性標記或其他標記來標記)與基質上的寡核苷酸雜交來完成mRNA的直接檢測。在其他實施方案中，可以通過首先制備所需mRNA的互補DNA(cDNA)來完成mRNA的檢測。然后，可以將標記的cDNA與基質上的寡核苷酸雜交，并檢測。與所用的檢測方法無關，測試GTM表達與表達的標準測量的比較是所希望的。例如，可以將RNA表達對總細胞DNA、組成型表達的RNA (例如，核糖體RNA)的表達或其他相對不變的標志物標準化。抗體也可以用于試劑盒中作為捕獲試劑。在一些實施方案中，基質(例如，多孔平板)可以具有與其連接的特異性GTM捕獲試劑。在一些實施方案中，試劑盒可以包括封閉試劑。封閉試劑可以用于降低非特異性結合。例如，可以使用來自不含有GTM寡核苷酸的任何常規來源的過量DNA(如，鮭精DNA)來降低非特異性的寡核苷酸結合。可以使用過量的封閉蛋白(如，血清白蛋白)來降低非特異性的抗體結合。可以認識到用于檢測寡核苷酸和蛋白質的多種方法是本領域已知的，并且可以使用特異性地檢測GTM相關分子的任何策略，并且認為在本發明的范圍內。在依賴于抗體檢測的實施方案中，可以基于每個細胞，或基于全部細胞、組織或液體蛋白、液體體積、組織質量(重量)來表示GTM蛋白或肽。此外，可以基于相對高豐度血清蛋白(如，白蛋白)來表示血清中的GTM。除了基質，測試試劑盒可以包括捕獲試劑(如，探針)、洗滌溶液(例如，SSC、其他鹽、緩沖液、去污劑等)以及檢測部分(例如，cy3、cy5、放射性標記等)。試劑盒還可以包括使用說明書和包裝。盡管參照其特定實施方案描述了本發明，但將認識到可以使用涉及使用所公開標志物的其他實施方案，而沒有脫離本發明的范圍。工業實用性檢測GTM家族成員的方法包括使用微陣列和/或實時PCR方法來檢測核酸，以及檢測蛋白質和肽。本發明的組合物和方法可用于診斷裝置和試劑盒的制備、疾病的診斷、評價療效和生產適用于測量生物樣品中GTM家族成員表達的試劑。參考文獻Emanuelsson 0, Nielsen H, Rrunak S, von Heiine G. PredictinR subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence. J Mol Biol.2000 Jul 21 ；300 (4) :1005-16.KroRh A,Larsson B,von Heiine G,Sonnhammer EL. PredictinR transmembrane protein topology with a hidden Markov model -application to complete genomes. J. Mol Biol. 2001 Jan 19 ；305 (3) :567-80.Smyth, G. K. (2005) · Limma : 1 inear models for microarray data. In ' Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor' . R. Gentleman,V. Carey,S. Dudoit,R. Irizarry,ff. Huber(eds), Springer, New York, pages 397—420.R Development Core Team(2008) · R:A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0，URL http://www. R-proiect. org.Wheeler DL, et al. Database Resources of the National Center for Biotechnology. Nucl Acids Res 31 :28-33 ；2003.
權利要求
1.一種用于檢測胃癌的方法，包括⑴提供生物樣品；和( )檢測所述樣品中人酶原粒蛋白16 ( “ZG16”)的水平。
2.權利要求1的方法，其中生物樣品中ZG16的過表達表明癌癥。
3.權利要求1或權利要求2的方法，包括檢測一種或多種其他GTM家族成員的水平。
4.權利要求1至3任一項的方法，其中所述方法進一步包括檢測選自黏蛋白 5AC( “MUC5AC”)和黏蛋白17( “MUC17”)的其他GTM家族成員的水平。
5.權利要求1至4任一項的方法，其中所述一種或多種其他GTM家族成員選自由 MUC5AC、MUC17、ZG16、羧肽酶N、多肽 2，83kDa鏈(“CPN2”)、基質金屬蛋白酶 12 (“MMP12”)、抑制素(“ INHBA”)、胰島素樣生長因子7 (“IGFBP7”)、γ -谷氨酰水解酶(“GGH”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白聚糖(“LEPRE1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑S( “CST4”)、分泌型卷曲相關蛋白 4(“SFRP4”)、aSp0rin(“ASPN”)、具有EF手型結構域的細胞生長調節劑1 (“CGREF1”)、激肽釋放酶10 (KLKlO)、金屬蛋白酶的組織抑制劑1( “TIMP1”)、分泌型酸性富含半胱氨酸蛋白 (“SPARC”)、轉化生長因子，13-誘導的(“TGFBI”)、含有EGF的fibulin-樣胞外基質蛋白 2 ( “EFEMP2”)、基膜聚糖(Iumican) ( “LUM”)、stannin ( “SNN”)、分泌型磷蛋白 1 ( “SPP1”)、 硫酸軟骨素蛋白聚糖2( “CSPG2”)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(“ASAHl”)、絲氨酸蛋白酶 11 ( “PRSS11”)、分泌型卷曲相關蛋白 2( “SFRP2”)、磷脂酶 A2，XIIB 組(“PLA2G12B”)、 spondin 2，胞外基質蛋白(“SP0N2”)、嗅介蛋白(olfactomedin) 1 ( “0LFM1”)、含有血小板反應蛋白重復1( “TSRC1”)、血小板反應蛋白2( “THBS2”)、adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SA( “CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN( 乂511”)、賴氨酰氧化酶樣酶2( “L0XL2”)、甲狀腺球蛋白(“TG”)、轉化生長因子i31(“TGFBl”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade H成員1( “SERPINH1”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade B成員5( “SERPINB5”)、 基質金屬蛋白酶2( “匪 2”)、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/1 ^^1 5型(“PCSK5”)、乙酰透明質酸糖蛋白連接蛋白4( “HAPLN4”)、CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原和CEA組成的組。
6.權利要求1至5任一項的方法，其中所測試的GTM標志物包括MUC5AC、MUC17、ZG16、 半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白Hl和絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B5。
7.權利要求1至6任一項的方法，其中通過檢測GTMmRNA的水平進行所述檢測步驟。
8.權利要求1至6任一項的方法，其中通過檢測GTMcDNA的水平進行所述檢測步驟。
9.權利要求8的方法，其中使用與所述GTMcDNA的至少一部分互補的寡核苷酸進行所述檢測步驟。
10.權利要求8的方法，其中使用正向引物和反向引物用qRT-PCR方法進行所述檢測步馬聚ο
11.權利要求1至6任一項的方法，其中通過檢測GTM蛋白的水平進行所述檢測步驟。
12.權利要求1至6任一項的方法，其中通過檢測GTM肽的水平進行所述檢測步驟。
13.權利要求11或12的方法，其中使用針對所述GTM的抗體進行所述檢測步驟。
14.權利要求11至13任一項的方法，其中使用夾層型免疫測定方法，或使用抗體芯片進行所述檢測步驟。
15.權利要求11至13任一項的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
16.權利要求11至14任一項的方法，其中所述抗體是多克隆抗血清。
17.一種用于檢測GTM的裝置，其包括 基質，其上具有GTM捕獲試劑；和與所述基質相連的檢測儀，所述檢測儀能夠檢測與所述捕獲試劑結合的GTM，其中所述 GTM包括人酶原粒蛋白16 ( “ZG16”)。
18.權利要求17的裝置，其中所述GTM捕獲試劑是寡核苷酸。
19.權利要求17的裝置，其中所述GTM捕獲試劑是對GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM肽特異的抗體。
20.一種用于檢測癌癥的試劑盒，其包含 基質，其上具有GTM捕獲試劑；用于顯示所述GTM捕獲試劑和GTM復合物的工具； 試劑；和使用說明書，其中所述GTM包括人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。
21.權利要求20的試劑盒，其中所述GTM捕獲試劑是GTM-特異性寡核苷酸。
22.權利要求20的試劑盒，其中所述GTM捕獲試劑是對GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM 肽選擇性的GTM特異性抗體。
23.一種檢測胃癌的方法，包括步驟提供來自處于患胃癌風險中的患者的測試樣品；測量所述測試樣品中GTM蛋白的存在；和將所述測試樣品中存在的GTM的量與獲自不患胃癌受試者的對照樣品的值進行比較， 其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16 ( “ZG16”)。
24.一種用于篩選胃癌的方法，包括步驟 提供來自測試受試者的測試樣品； 測量所述測試樣品中GTM的存在；和將所述測試樣品中存在的GTM的量與獲自不患胃癌受試者的對照樣品的值進行比較， 其中所述GTM包括人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。
25.權利要求M的方法，其中所述GTM是GTM蛋白或肽。
26.權利要求M的方法，其中所述GTM是GTM特異性的寡核苷酸。
27.權利要求沈的方法，其中所述寡核苷酸是DNA。
28.權利要求沈的方法，其中所述寡核苷酸是RNA。
29.權利要求M至觀任一項的方法，其中所述測量步驟使用ELISA測定法。
30.權利要求M至四任一項的方法，其中所述測試樣品獲自血漿。
31.權利要求M至30任一項的方法，其中所述測試樣品獲自組織、尿液、胃液、血清和糞便。
全文摘要
腫瘤的早期檢測是腫瘤(包括胃腫瘤)患者存活的主要決定因素。GTM基因家族的成員可以在胃腫瘤組織中差異地表達，并且因此可以用作檢測胃癌和其他類型癌癥的標志物。本發明提供了用于檢測腫瘤(包括胃腫瘤)的新GTM，并且特別是人酶原粒蛋白16(ZG16)。GTM可以單獨使用或與其他已知GTM一起使用，來提供用于腫瘤(包括胃腫瘤)檢測的新標記。
文檔編號G01N33/53GK102459646SQ201080031553
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月14日 優先權日2009年5月15日
發明者P·J·吉爾福德 申請人:環太平洋生物技術有限公司