用于提高基于固相的生物測定中信號可讀性的信號產生和信號定位的方法

專利名稱：用于提高基于固相的生物測定中信號可讀性的信號產生和信號定位的方法
用于提高基于固相的生物測定中信號可讀性的信號產生和
信號定位的方法本發明涉及例如體液等液體樣品中的分析物的測定，分析物例如抗原。更具體而言，本發明涉及用于檢測體液中分析物的非催化性方法，體液例如尿液、血液、血清、血漿、 唾液或糞便的提取液，所述方法使用在使用固相平臺的床旁(point of care, PoC)測試裝置(例如側流裝置)中包含可檢測物質的綴合物。本發明也可應用于非臨床的情形，例如檢測食物和水的污染物，或者用于獸醫領域或軍事。本發明使用載體介質以攜帶用于測定中信號產生和信號定位的不同的試劑。載體介質包含(i)溶劑(例如，水溶液，包括緩沖液、鹽溶液、水；有機溶劑，例如乙醇、丙醇等醇； 醚，例如四氫呋喃(THF)，及極性非質子溶劑，例如二甲基亞砜(DMSO)；( )增稠劑，其作為膠體混合物溶解在溶劑中，該膠體混合物形成賦予所得的從高粘度流體到凝膠的特性范圍內的載體介質特性的內部結構。凝膠型載體介質具有固體外觀，但是主要由溶劑組成。實例包括聚合物，例如聚丙烯酰胺和聚異丁烯；多糖，例如淀粉、纖維素、獲自褐藻的藻酸鹽、瓊脂、角叉菜膠、果膠；天然膠，例如槐樹豆膠和瓜爾豆膠； 蛋白質，例如膠原、白蛋白和明膠。在一些實施方案中，載體介質也可包含信號顯示劑，其是將信號前體分子轉變為產生可檢測信號的狀態的物質。在其他實施方案中，信號顯示劑并不是必需的，因為多個信號前體分子通過物理方法轉變為多個可檢測的信號分子，物理方法例如溫度變化、PH變化、 聲處理(sonication)、光輻射或微波加熱。載體介質的功能為(i)阻止信號分子擴散，導致信號積累。( )提高固相平臺上信號的可讀性(清晰度、信號保留時間的延長)，并從而提高靈敏度。在一些實施方案中，其中多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子是由化學或生化方法所引起，載體介質具有第三種功能(iii)通過將多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子而產生信號。對于使用可見光檢測的測定，載體介質基本上為光學透明的。許多類型的靶標-受體測定已經用于檢測體液中各種靶物質的存在情況，體液例如尿液、血液、血清、血漿、唾液或糞便提取液。這些測定通常包括抗原抗體反應，帶有放射性的、酶的、熒光的、發光的、化學發光的或視覺上可觀察的金屬標簽的合成綴合物，并使用專門設計的反應室。在所有的這些測定中，存在對選擇的靶標(例如抗原)特異的受體(例如抗體)，和用于檢測靶標-受體反應產物的存在情況且通常是檢測其量的工具。許多目前的測試設計為提供半定量或定量測定，但在許多情況下，所需要的是提供靶標物類存在情況的陽性或陰性表示的定性檢測。這種定性測定的實例包括血型測定、大多數類型的尿分析和非常重要的作為直腸癌篩查測定的大便隱血測試。對于這些測試，優選視覺上可觀察的指示，例如有色顆粒(例如金顆粒)的積累、存在凝集或者顏色改變。
然而，由于在測試液中受關注的靶標濃度常常低，定性測定必須是非常靈敏的。已開發夾心測定和使用金屬溶膠或其他類型的有色顆粒的其他靈敏的檢測方法。然而，這些技術并沒有解決在快速檢測法中遭遇的所有問題，且一直在尋求進一步的改進。舉例來說，在側流夾心測定中，膠體金常常用作第一抗體(1)的標記，而另一抗體 (2)固定在膜(例如硝酸纖維素膜)上的界限明確的檢測部位。如果所述分析物存在于樣品中，那么分析物與金標記抗體(1)反應并遷移至硝酸纖維素膜結合的抗體( 。在此就形成夾心，然后將這些夾心復合物收集和濃縮在檢測部位中。通過與銀離子的另外反應，可使該部位更加可見至一定的程度(放大的)。然而，分析靈敏度并不顯著并且此技術并不容易應用于某些測定，例如測定低 (但診斷學上非常重要)的濃度范圍內的促甲狀腺激素(TSH)、前列腺特異性抗原(PSA)J^ 鈣蛋白I或肌鈣蛋白T。因此，為了使這些測定更有效，使用了其他標記(稱為“信號放大前體分子”)，其在測定反應結束時能被放大，例如在夾心抗體⑵分析物_{抗體(I)-標記}形成結束時。如果放大標記是包含結晶熒光素二乙酸酯(FDA)的微膠囊(由數百萬個FDA分子組成)，那么通過分解微膠囊和水解非發熒光的FDA分子為發熒光的熒光素分子在測定反應后完成放大。此放大在授權的歐洲專利號EP1309867中被充分地證實和描述，其公開內容通過引用結合到本文中。通常，放大反應發生在釋放劑的溶液中。由于稀釋的因素，即釋放的熒光素分子在釋放劑的反應體積中變得稀釋，這導致分析靈敏度較理想值有輕微下降。遺憾的是，在某些情況下，放大的益處可被信號消散的缺點抵消或者甚至被超過。 例如，如果檢測或測定在膜上進行，例如在側流測試條上，加入用于實現信號放大的釋放劑的溶液導致放大的信號順著膜擴散。釋放的/放大的分子沒有被定位，因此在放大后信號可能難以檢測。在基礎測試反應完成后，加入任何溶液均導致檢測線、點或區域的擴大。擴散使檢測部位擴大，并且可靠地測量檢測部位的顏色強度是不可能的。現有技術也包括標記可為具有高轉換數的酶的實例，當它與它的底物反應時，該酶形成非常多的反應產物分子。同樣，這是在水溶液中進行，更具體而言，在具有酶的特異性底物分子的緩沖溶液中。基于酶的系統的一個缺點是，由于它們有催化性，放大在發生底物轉變時開始，且這是一個前進式過程。放大取決于底物濃度和對酶反應選擇的時間。如果不加入終止劑，酶將在測量時間期間(及之后)起作用，因此沒有一個恒定的信號。加入終止劑將增加稀釋作用。因此，本發明一個目的是通過阻止信號分子的擴散克服現有技術的限制，并藉此通過維持信號的清晰度和延長信號保留時間來提高信號的可讀性，使得能夠可靠地檢測信號。本發明還一個目的在于提供一種用于檢測流體樣品(尤其體液樣品)中的分析物的快速靈敏方法。另一個目的是提供一種與常規測定相比具有高靈敏度的測定。又一個目的是提供一種用于檢測流體中低水平的分析物的測試裝置。^X載體介質載體介質阻Ih多個可檢測的信號產牛分子的擴散，引起信號積累。這導致提高在固相平臺上的多個可檢測的信號產生分子的可讀性(清晰度、信號保留時間的延長)，并因此提高靈敏度。載體介質包含(i)溶劑(例如，水溶液，包括緩沖液、鹽溶液、水；有機溶劑，例如乙醇、丙醇等醇； 醚，例如四氫呋喃(THF)，及極性非質子溶劑，例如二甲基亞砜(DMSO)；(ii)增稠劑，其作為膠體混合物溶解在溶劑中，該膠體混合物形成賦予所得的從高粘度流體到凝膠的特性范圍內的載體介質特性的內部結構。對于需要化學或生化活化的信號前體分子，載體介質也包含(iii)信號顯示劑，其是將信號前體分子轉變為產生可檢測信號的狀態的物質。遭MlU這是用于使液體溶液、乳液和懸浮液增稠和穩定的物質。它們作為膠體混合物溶解在液相中，該膠體混合物形成賦予所得的從高粘度流體到凝膠的特性范圍內的載體介質特性的內部結構。凝膠型載體介質具有固體外觀，但是主要由液體組成。增稠劑的實例包括凝膠形成聚合物，例如聚丙烯酰胺和聚異丁烯；多糖，例如纖維素、淀粉、獲自褐藻的藻酸鹽、瓊脂、角叉菜膠、果膠；天然膠，例如槐樹豆膠和瓜爾豆膠；蛋白質，例如膠原、白蛋白和明膠。信號前體分子這是當與一種或多種其他試劑反應時產牛可檢測信號的分子。存在來自不同化學類別的非常多的不同物質，它們通過開始的反應產生可檢測信號，例如熒光團及其衍生物、發光團及其衍生物、發色團及其衍生物、輔基或選自氧化還原介體、電極活性物質的氧化還原活性物質、生物發光蛋白和熒光蛋白、染色滲透液、熒光染料、生物發光物質或化學發光物質、電化學活性物質或磁性物質。信號前體分子為非催化性標記。可檢測信號可基于-熒光測定法-發光測定法-在紫外、可見和近紅外范圍內的顏色變化-氧化還原電勢的變化-由復合物形成或沉淀所致的質量變化-放射性衰變產物檢測-磁場檢測it^i在上下文并未要求它們具體為信號前體狀態或信號產生狀態之一時， 本說明書中使用的術語信號分子表示信號前體分子和/或信號產生分子兩者。它也用于信號前體分子和信號產生分子二者可同時并存的情況。信號顯示劑信號顯示布丨(如果存在)是使信號前體分子能夠產生可檢測信號的物質。信號顯示劑可適于活化選自以下的熒光團熒光素及其衍生物，包括熒光素二乙酸酯(FDA)、熒光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)、熒光素二乙酸酯馬來酰亞胺 (FDA-馬來酰亞胺)、花青、碳花青、若丹明、咕噸、基于重氮染料的熒光物質以及小的熒光芳香和雜芳香分子。備選地，信號顯示劑可活化選自以下的發色團花青、吡唑啉酮、蒽醌、 碳花青、若丹明、咕噸(xanthen)、類胡蘿卜素和基于重氮及單偶氮、噁嗪、靛類或核黃素的染料物質。測試裝置本文件中使用的術語測試裝置用于表示包含固相基質的裝置。固相基質可選自膜、微量滴定板、珠(磁性和非磁性的)、管和玻片。測試裝置可適用于不用測定形式，包括側流、垂流、試管、微量滴定板、花瓣盤(petal)等。固相基質的材料和形式可為 多孔膜，例如硝酸纖維素、尼龍；非多孔的平坦表面，例如玻璃、聚苯乙烯、金屬、碳；試管或微量滴定板內壁；球體，例如磁珠或非磁性珠。檢測膜檢測膜由反應膜組成，例如附著有不同塾(例如綴合墊、樣品墊、吸收墊) 的硝酸纖維素條，有些墊帶有試劑。帶抗體或抗原的反應部位(檢測部位、對照部位)包被在反應膜上界限明確的位置。反應部位的包衣可被動地吸附到反應膜上，它們可共價結合， 或它們可免疫化學結合，例如通過鏈霉親和素(鏈霉親和素包被的一生物素化抗體)或通過物種特異性抗體(山羊抗小鼠抗體一小鼠抗體)。親和分子親和分子可為誅自以下組物質的生物識別分子(a)肽或蛋白質，選自抗體、遺傳修飾抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、受體、抗原、 凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和變應原或其部分；(b)核酸，選自DNA、RNA、寡核苷酸、適配體及其部分；(c)碳水化合物，選自單糖、寡糖和多糖、糖脂、蛋白多糖及其部分；或(d)低分子量配體，選自生物素、生物素衍生物、類固醇、激素、輔因子、活化劑、抑制劑、藥物、變應原或半抗原。本說明書中使用的術語“靶標”意指在夾心型測定中的分析物或競爭型測定中的競爭劑二者。發明詳述本發明提供一種用于在固相基質檢測系統中產生和定位信號的方法，所述方法包括將靶物質的溶液施用于固相基質；將所述靶物質與用于該靶物質的特異性親和分子結合，所述親和分子連接有非催化性標記，所述非催化性標記包含多個信號前體分子；將載體介質施用于所述固相基質；和處理所述標記以將所述多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子，其中，載體介質包含用于溶解非催化性標記的溶劑，和用于引起由指示所述靶標的存在情況和/或量的多個可檢測的信號產生分子所產生的信號的定位的增稠劑。在一些實施方案中，載體介質也可包含信號顯示劑，其為將信號前體分子轉變為產生可測信號的狀態的物質。在這些實施方案中，信號產生和信號定位同時發生。在其他實施方案中，信號顯示劑并不是必需的，因為多個信號前體分子通過物理方法轉變為多個可檢測的信號產生分子，物理方法例如溫度變化、PH變化、聲處理、光輻射或微波加熱。優選地，將載體介質施用于固相基質的步驟和處理非催化性標記以將多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子的步驟基本上同時進行。在實踐中，可存在處理步驟的短暫中斷，以將載體介質施用于固相基質，或者在施用載體介質后開始處理步驟可有少許的延遲。載體介質可以許多不同的方法施用于固相基質。它可為基質凝膠的形式，其可直接作為薄膜施用。備選地，基質凝膠可通過保護層與固相基質分離，當需要時，可除去該保護層以使固相基質與基質凝膠接觸。如果載體介質是液體，其可通過噴涂施用。另一種備選方法是將固相基質浸入載體介質中或將載體介質滴于固相基質上。又一種備選方法是在容器中將固相基質浸沒到高粘度液體或基質凝膠中。在第二個方面，本發明提供一種用于檢測流體樣品中靶物質的測試裝置，所述裝置包括固相基質檢測系統，其包括用于將流體樣品從樣品施用部位轉運至檢測部位的部件；設置在遠離所述檢測部位的位置的該靶物質的特異性親和分子，該親和分子連接有非催化性標記，所述非催化性標記包含多個信號前體分子，所述信號前體分子可轉變為多個可檢測的信號產生分子；載體介質，其包含用于溶解非催化性標記的溶劑，和用于引起由指示所述靶物質的存在情況和/或量的所述多個可檢測的信號產生分子在所述檢測部位所產生的信號的定位的增稠劑；和用于將所述多個信號前體分子轉變為所述多個可檢測的信號產生分子的部件；其中，所述載體介質適于使其至少在所述檢測部位與所述可檢測物質接觸。在一些實施方案中，載體介質也可包含信號顯示劑，其為將多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子的物質，信號產生分子產生可檢測信號。在其他實施方案中，信號顯示劑并不是必需的，因為多個信號前體分子可通過物理方法轉變為多個可檢測的信號產生分子，物理方法例如溫度變化、PH變化、聲處理、光輻射或微波加熱。本發明還提供一種用于測定流體樣品中靶物質存在情況的部件的試劑盒，所述試劑盒包括固相基質檢測系統，其包括將流體樣品從樣品施用部位轉運至檢測部位的部件；設置在遠離所述檢測部位的位置的該靶物質的特異性親和分子，該親和分子連接有非催化性標記，所述非催化性標記包含多個信號前體分子，所述信號前體分子可轉變為多個可檢測的信號產生分子；和用于將所述多個信號前體分子轉變為所述多個可檢測的信號產生分子的部件。試劑盒可進一步包括用于形成載體介質的成分，載體介質包含用于溶解非催化性標記的溶劑和用于引起由多個可檢測的信號產生分子在所述檢測部位所產生的信號的定位的增稠劑。用于將多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子的部件可以是包含在載體介質內的信號顯示劑。試劑盒中的信號前體物質可包括熒光團及其衍生物、發光團及其衍生物、發色團及其衍生物、輔基或選自氧化還原介體、電極活性物質的氧化還原活性物質、生物發光蛋白和熒光蛋白、染色滲透液、熒光染料、生物發光物質或化學發光物質或者磁性物質。為避免疑問，詞語非催化性的也包括非酶的，本發明基于包含可轉變為多個可檢測的信號產生分子的多個信號前體分子的信號前體物質的使用。因此，當靶物質與連接有非催化性標記的該靶物質的特異性親和分子結合時，該非催化性標記包含多個信號前體分子，由于每個靶標分子與多個信號前體分子關聯，所以存在可檢測信號的固有或潛在的放大。換句話說，當測定反應已發生時，信號前體物質能夠被活化并且轉變為多個可檢測的信號產生分子。例如，考慮這樣的情形其中靶物質是抗原，且與特異性結合靶物質的親和分子綴合的非催化性標記是與包含熒光素二乙酸酯晶體(FDA，即信號前體分子晶體)的微膠囊結合的檢測抗體。當抗原/檢測抗體在檢測部位被捕獲時(例如，通過在固相支持體上的捕獲抗體)，溶劑溶解FDA晶體和將FDA轉變為熒光素(例如，通過用KOH處理)為每個靶抗原釋放千百萬個熒光分子。本發明提供在檢測部位線、點、斑點或區域擴大的問題的技術解決方案，并且帶來了特別是在PoC測試裝置中測試線和對照線的可讀性的提高。擴大通常因將所需的釋放劑加入水溶液中而引起或開始。檢測部位不是清晰的反應線，且通過溶液中物質的擴散而變得模糊、擴散和不明確。通過本發明，在其形成位置定位信號的需要現在得到滿足。下面僅通過實施例并非限制性地參照附圖描述本發明，附圖中

圖1為顯示已知側流測試條結構的示意圖；圖2概略性顯示在使用中的現有技術側流測試條的兩個視圖；視圖(a)顯示使用直接(即，未放大)標記的測試條，而視圖(b)顯示使用現有技術的溶液技術以放大標記的測試條；圖3為顯示本發明施用載體介質薄膜以定位信號的測試條的另一示意圖；圖4顯示使用常規釋放溶液產生的信號(左側條)和使用本發明的基質凝膠定位的信號(右側條)在不同時間間隔的熒光信號變化；圖5為多重檢測平臺的示意圖；和圖6為具有負載有基質凝膠的光學透明蓋子的測試條的示意圖，蓋子用于在測定反應完成后置于測試條上以進行可見信號的定位。在以下的描述中，相關空間術語(例如“背面”、“左”、“右”等)用于方便熟練的閱讀者，是指附圖中所示測試裝置及其組成部分的方向。在本發明的使用中，在其制造、運輸、 保管或出售過程中，或在其組成部分的裝配過程中，或在并入其他設備或與其他設備結合時，使用這些術語并非意在造成限制。圖1為以平面圖(視圖(a))和側視圖(視圖(b))顯示常規側流測試條的示意圖。 標號10表示用于將多孔組分保持在一起的背面層壓板。在它的頂部放置有加樣墊12，在使用時將樣品施用于此。與之相鄰的是綴合墊14，其包含當靶標在硝酸纖維素膜16攜帶的流體樣品中沿測試條而經過時與靶標反應的檢測物質或探針。在如圖中描述的從左向右的流動方向上，檢測部位18為跨越測試條寬度施用的捕獲探針線，在該處捕獲靶標/檢測劑復合物，而對照部位20為檢測部位18下游的跨越測試條寬度施用的另一條物質線。對照部位不檢測樣品中的任何物質，但是指示條已正確地濕潤且所有的測試組分都是有功能的。對照部位應總是產生可見信號以證實測試已經正確進行，甚至對于未包含任何可檢測的靶標并因此在檢測部位不產生信號的樣品也是如此。過量流體由吸收墊22吸收。現在轉到圖2，其顯示在使用中的兩個側流測試條的示意圖。在視圖(a)中，使用直接標記顯示測試條，其中不需要將信號前體分子轉變為信號產生分子；在檢測部位和對照部位的檢測線都是清晰的和界限明確的。視圖(b)為測試條的圖示，其中在測定反應發生后，加入信號顯示劑的溶液體以開始將信號前體分子轉變為可檢測的信號產生分子。在此，在檢測部位和對照部位的檢測線不是界限明確的；由于信號產生分子通過用于施用信號顯示劑的溶液的擴散，檢測線擴散開來。在本發明中，阻止了這樣的擴散。其使信號前體分子轉變為可檢測的信號產生分子能夠進行，同時維持檢測部位和對照部位界限明確的檢測線。這是通過使用最小化信號分子擴散和分布的載體介質而達成。在一些實施方案中，載體介質可包含將信號前體分子轉變為可檢測的信號產生分子的信號顯示劑，但載體介質不是允許快速擴散通過檢測膜的形式。載體介質是基于具有“基質結合水”的增稠劑的發展，其中溶劑和在一些實施方案中的信號顯示劑在凝膠狀態形成前已經溶解在溶膠狀態中。在凝膠狀態下，基質使支持在檢測膜上的多個可檢測的信號產生分子的擴散最小化。圖3為類似圖1中所示條的測試條的另一示意圖，其中視圖(b)顯示依據本發明將載體介質M的薄層施用在檢測膜16的上表面，以便引起通過將多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子而產生信號和定位多個可檢測的信號產生分子。合宜地，載體介質可為切成薄條膜的基質凝膠，該薄條膜優選地與檢測膜暴露的上表面尺寸相匹配。圖4為顯示使用常規釋放溶液產生的信號(左側條)和使用基質凝膠形式的包含信號顯示劑的載體介質產生的信號(右側條)在不同的時間間隔熒光信號變化的照片。緊接著在施用常規釋放溶液以從熒光素二乙酸酯信號前體分子釋放熒光素之后或緊接著在施用本發明基質凝膠之后，對成對的條進行拍照。然后在以下連續的時間間隔1、2、3、4、5、 7、9、12和15分鐘再次對相同的條對拍照。使用基質凝膠產生信號的條甚至在15分鐘后仍維持界限明確的線，而常規使用釋放溶液產生信號的條甚至在第一個間隔就開始顯示擴散的跡象。在15分鐘后，這些常規條顯示非常擴散的線，這些線在實際中是幾乎不可能可重復地解讀的。現在轉到圖5，這是如何將基質凝膠實施方案施用于多重檢測平臺的示意圖。在視圖(a)中，顯示具有不同的捕獲探針包被在預定位置的光學透明的容器；不同的捕獲探針對特定靶標特異。在視圖(b)中，將捕獲探針暴露于包含多種與具體一種的捕獲探針所結合的靶標的樣品。在視圖(c)中，捕獲的靶標進一步與靶物質的特異性親和抗體結合，抗體具有連接的非催化性標記，所述非催化性標記由作為信號前體分子的FDA組成。在視圖 (d)中，將具有用于FDA的信號顯示劑的基質凝膠加入容器中，并且在靶標與各自的捕獲探針結合的部位產生定位的熒光信號。圖6為具有負載有基質凝膠M的光學透明的蓋子沈的測試條的示意圖，該蓋子 26用于在測定反應完成后放置于測試條上用于進行可見信號的定位。蓋子可為分離的部件，但在此處顯示其通過活動的鉸鏈觀連接到支持多孔組分的背面層壓板10。本發明解決現有方法的以下問題和限制 熒光、發光或吸光度因為信號產生分子的擴散不能可靠地被測定，意味著測量不能集中于測量區域。 發生分析靈敏度的下降。擴散意味著熒光、發光或吸光度不固定于界限明確的區域，反而分布越過不打算作為檢測部位的膜的部分。這導致可檢測的信號產生分子由于從其形成位置流出而損失，及因此發生分析靈敏度的下降。 如果側流裝置設計為半定量裝置，那么在膜上提供若干抗體( 線。因為可檢測的信號產生分子在線之間及之后模糊/分布，故結果不能被理解。本發明解決這些問題是基于改變菲克的著名的處理擴散流量的第一和第二定律的擴散系數的粘度項。菲克假定流量從高濃度區域進入低濃度區域，其大小與濃度梯度 (dc/dx)成比例。在一個空間維度上，該公式為J = -D* (dc/dx)其中
· J是擴散流量，其是在短時間間隔期間流經小區域的物質的量的量度。在本發明中，期望J為最小值。· D是取決于孔徑、其分布和尤其“液體”粘度的“結合”凝膠-水中的擴散系數。· C為濃度；在此，例如，形成的熒光素的濃度。· X是距離形成位置的位置或距離；在此是與檢測部位的距離。擴散系數(D)與擴散顆粒的速度平方成比例，該速度取決于溫度、液體粘度和顆粒的尺寸。在稀釋的水溶液中，大多數離子的擴散系數是相似的，并具有范圍通常為 0.6Xl(T9-hl0-9m7S的值。對于生物分子，擴散系數的范圍一般為ΙΟ-^-ΙΟ,πι2/^。本發明使用包含信號分子的定位所必需的試劑的載體介質。如前所討論，在一些實施方案中，載體介質也可包含用以將信號前體分子轉變為可檢測的信號產生分子的信號顯示劑。在其他實施方案中，該轉變通過物理方法完成，物理方法如溫度變化、PH變化、聲處理、光輻射或微波加熱。在水凝膠的情況中，在已從其溶膠狀態形成凝膠狀態后，水緊緊地結合/固定在凝膠的基質中。因為凝膠中的液體(水)或多或少是“固化的”，擴散變得明顯受阻。在具有高剪切模量的液體的情形下，溶劑阻止信號分子的擴散。包含關鍵試劑的凝膠可通過將試劑溶解于凝膠形成復合物的溶膠狀態中容易地產生。在試劑包含到溶膠中后，在特定量的時間后溶膠轉化為凝膠狀態，或可通過溫度引起轉化(例如瓊脂在較高溫度為液體(溶膠狀態)，而在較低溫度為固體(凝膠狀態)。有許多物質以溶膠和凝膠狀態存在。帶水的凝膠和溶膠狀態可表征為在溶膠狀態，凝膠形成物質增稠劑以膠態分散于水中，然而，在凝膠狀態，水分散于增稠劑的凝膠形成網絡中。在一個特別的優選實施方案中，本發明使用在歐洲專利號EP1309867中公開的原理，其中一個反應伙伴的標記是包含數百萬的非熒光FDA分子的FDA晶體。在反應區域，它們水解為數百萬的熒光素分子。由于包含在載體介質中的增稠劑，故阻止了由此形成的熒光素分子從反應部位擴散離開。在此過程中，DMSO和NaOH是包含于載體介質中的溶劑和信號顯示劑。信號定位作用通過DMSO和NaOH部分擴散出載體介質(即從高濃度的DMSO和NaOH溶液的區域流出到較低濃度區域)至檢測膜表面而說明。FDA晶體溶解在DMSO中并被NaOH水解為發熒光的熒光素。因為水強烈地結合在載體介質中，載體介質由于增稠劑的作用而可視為交聯的三維網絡，所以小分子量的物質僅僅擴散通過具結合液態水的載體介質并迅速與檢測膜接觸。該過程不花費超過約30秒。因為未加入具有非結合水的水溶液，所以熒光素分子不會發生由檢測膜的吸收墊協助的擴散和分布。因此，定位熒光素分子，并可在不損失分析靈敏度的條件下測量。如果在半定量測定中存在更多的檢測線，也不會有可讀性的消減。對于特定的檢測平臺，載體介質可為作為大的薄片產生的基質凝膠形式，其然后被切成合適尺寸的部分以放置在檢測膜上。在可行性研究中，利用鑷子進行這一放置。另一方法是將載體介質整合至單獨的透明蓋裝置中，當在測定反應完成后將其關閉時，該裝置適于使載體介質與檢測膜接觸。在這種情況下，測試裝置由兩個盒子形式的部分組成。打開檢測裝置(盒子)，在帶檢測膜的盒子的下部進行檢測反應。隨后，用其中整合有載體介質的蓋子關閉盒子。為避免由于蓋子過早關閉而引起信號前體分子與載體介質之間的疏忽接觸，載體介質可有可釋放薄膜的薄片的保護蓋，在檢測反應完成后將其移除。 之后載體介質才能與檢測膜上的檢測部位接觸。制備/產牛載體介質載體介質的形成一般可通過混合溶劑、信號顯示劑(如果存在)和增稠劑來進行。 取決于選擇的增稠劑，可能需要加熱和冷卻。不同的增稠劑或增稠劑混合物可用于載體介質的形成過程。對于每種類型的增稠齊U，必須考慮結合水含量、凝膠的剪切特性、固化過程中的收縮、整合的反應伙伴的擴散常數、稠化、光學透明度、穩定性和對于溫度變化的穩健性，優化用于實現可檢測的信號產生分子的定位的增稠劑的合適濃度。當為基質凝膠形式時，載體介質的粘度可與用于SDS-PAGE中的聚丙烯酰胺凝膠的粘度相比。低百分比的凝膠，可能不是非常粘稠，可以通過噴涂施用于檢測膜的表面。高百分比的粘稠的凝膠更適合特定的多重檢測平臺，其中包被的花瓣盤浸沒到凝膠中以顯示定位的信號。凝膠百分比的范圍可為基于介質總重量的0.05% -50%重量；更優選的范圍為0. 1% -20%。在其他實施方案中，凝膠比例的下限可為以下任一值0.05%、0. 1%, 0. 2%,0. 3%、0.4%和0. 5%;凝膠比例的上限可為以下任一值3%、4%、5%、10%、20%和 50%。因此，凝膠比例的范圍可為任一上述下限與任一上述上限的組合。載體介質的剪切模量可通過改變加入的增稠劑的量而調整。當然，高粘度的溶液也可減緩擴散，但信號保留時間將比使用固化形式所獲得的時間短。如果優化基質凝膠，那么得到在檢測部位的位置的定位的反應線(信號線)，如基于實驗結果的圖4中所示。圖4再次顯示如果使用基質凝膠而非水溶液用于信號產生和定位，那么檢測部位的形狀顯著不同。
實施例下面參照不同實施例詳細描述本發明，但是應理解這些實施例并非限制性的。實施例1 ffeH^M^g^ FDA言號系統前基于DMSO的jH本介J1!用于FDA的載體介質由DMSO、NaOH和聚山梨醇酯20組成，其中DMSO的用途是溶解FDA，而NaOH用于水解溶解的FDA。聚山梨醇酯20是用于凝膠形成的活性組分。具體而言，將這些成分一起混合(例如，混合Iml的DMSO+lml的IM Na0H+50 μ 1的聚山梨醇酯20) 并室溫靜置持續5-10分鐘以固化。表1顯示基質凝膠形式的特定載體介質的組合物和外觀的優化。實施例2 ffen^M^g^FDA ikim^MM^^wm (iPA) 用于FDA的基于IPA的載體介質由IPA、NaOH和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)組成，其中 IPA的用途是溶解FDA，而NaOH是用于水解溶解的FDA。PVP用于增加載體介質的粘度。具體而言，將這些成分一起混合(例如，混合Iml的IPA+lml的IM Na0H+0. 2g的PVP)。
權利要求
1.一種用于在固相基質檢測系統中產生和定位信號的方法，所述方法包括(a)將靶物質的溶液施用于固相基質；(b)將所述靶物質與該靶物質的特異性親和分子結合，所述親和分子連接有非催化性標記，所述非催化性標記包含多個信號前體分子；(c)將載體介質施用于所述固相基質；和(d)處理所述標記以將所述多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子；其中，所述載體介質包含用于溶解所述非催化性標記的溶劑，及用于引起由指示所述靶標的存在情況和/或量的所述多個可檢測的信號產生分子所產生的信號的定位的增稠劑。
2.權利要求1的方法，其中，所述步驟(c)的將載體介質施用于所述固相基質和所述步驟(d)的處理所述標記以將所述多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子，包括施用包含信號顯示劑的載體介質，所述信號顯示劑用于將所述多個信號前體分子轉變為所述多個可檢測的信號產生分子。
3.權利要求2的方法，其中，所述信號顯示劑適于活化選自以下的熒光團熒光素及其衍生物、熒光素二乙酸酯(FDA)、熒光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)、熒光素二乙酸酯馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)、花青、碳花青、若丹明、咕噸、基于重氮染料的熒光物質以及小的熒光芳香和雜芳香分子。
4.權利要求2的方法，其中，所述信號顯示劑適于活化選自以下的發色團花青、吡唑啉酮、蒽醌、碳花青、若丹明、咕噸、類胡蘿卜素和基于重氮及單偶氮、噁嗪、靛類或核黃素的染料物質。
5.權利要求2或3的方法，其中，所述信號顯示劑為堿或酯酶。
6.權利要求1的方法，其中，所述步驟(d)的處理所述標記以將所述多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子通過物理方法完成。
7.權利要求6的方法，所述物理方法選自溫度變化、pH變化、聲處理、光輻射或微波加熱。
8.前述權利要求中任一項的方法，其中，所述信號前體分子選自熒光團及其衍生物、 發光團及其衍生物、發色團及其衍生物、輔基或選自氧化還原介體、電極活性物質的氧化還原活性物質、生物發光蛋白和熒光蛋白、染色滲透液、熒光染料、生物發光物質或化學發光物質、電化學活性物質或磁性物質。
9.權利要求8的方法，其中，所述信號前體分子為非催化性標記。
10.權利要求8或9的方法，其中，所述信號前體分子選自熒光素二乙酸酯(FDA)、熒光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)和熒光素二乙酸酯馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)。
11.前述權利要求中任一項的方法，其中，所述親和分子選自(a)選自以下的肽或蛋白質抗體、遺傳修飾抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、受體、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和變應原或其部分；(b)選自以下的核酸DNA、RNA、寡核苷酸、適配體及其部分；(c)選自以下的碳水化合物單糖、寡糖和多糖、糖脂、蛋白多糖及其部分；或(d)選自以下的低分子量配體生物素、生物素衍生物、類固醇、激素、輔因子、活化劑、抑制劑、藥物、變應原或半抗原。
12.前述權利要求中任一項的方法，其中，所述增稠劑選自凝膠形成聚合物、多糖、蛋白質、天然膠、表面活性劑、淀粉、果膠、瓊脂、瓊脂糖和明膠。
13.前述權利要求中任一項的方法，其中，所述載體介質以薄膜形式施用于所述固相基質。
14.權利要求13的方法，其中，所述薄膜通過可移除的保護層與所述固相基質分離，所述方法包括移除所述保護層以使所述固相基質與載體介質接觸的步驟。
15.權利要求1-12中任一項的方法，所述方法包括通過噴涂將所述載體介質施用于所述固相基質。
16.權利要求1-12中任一項的方法，其中，通過將所述固相基質浸入所述載體基質來將所述載體介質施用于所述固相基質。
17.權利要求1-12中任一項的方法，其中，通過在容器中將所述固相基質浸沒到高粘度液體或基質凝膠中來將所述載體介質施用于所述固相基質。
18.權利要求1-12中任一項的方法，其中，通過滴加將所述載體介質施用于所述固相基質。
19.前述權利要求中任一項的方法，所述方法包括活化選自以下的信號前體分子熒光團及其衍生物、發光團及其衍生物、發色團及其衍生物、輔基或選自氧化還原介體、電極活性物質的氧化還原活性物質、生物發光蛋白和熒光蛋白、染色滲透液、熒光染料、生物發光物質或化學發光物質、電化學活性物質或磁性物質。
20.權利要求19的方法，所述方法包括使用信號顯示劑活化熒光團。
21.權利要求20的方法，其中，所述熒光團選自熒光素及其衍生物、熒光素二乙酸酯 (FDA)、熒光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)、熒光素二乙酸酯馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)、花青、碳花青、若丹明、咕噸、基于重氮染料的熒光物質以及小的熒光芳香和雜芳香分子。
22.權利要求20的方法，所述方法包括使用信號顯示劑水解熒光素二乙酸酯(FDA)、熒光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)或熒光素二乙酸酯馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)。
23.權利要求22的方法，其中，所述顯示劑為堿或酯酶。
24.權利要求19的方法，所述方法包括使用信號顯示劑活化發色團。
25.權利要求對的方法，其中，所述發色團選自花青、吡唑啉酮、蒽醌、碳花青、若丹明、咕噸、類胡蘿卜素和基于重氮及單偶氮、噁嗪、靛類或核黃素的染料物質。
26.權利要求2的方法，用于從熒光素二乙酸酯(FDA)晶體中釋放熒光素分子，包括使用載體介質，所述載體介質包含用于FDA的溶劑、信號顯示劑和增稠劑。
27.權利要求沈的方法，其中，所述載體介質包含二甲基亞砜、氫氧化鈉水溶液和聚山梨醇酯20。
28.前述權利要求中任一項的方法，所述方法包括在所述載體介質中使用比例為基于所述介質總重量的0. 05% -50%重量的增稠劑。
29.權利要求觀的方法，其中，所述載體介質中的增稠劑的比例范圍為基于所述介質總重量的0. -20%重量。
30.一種用于檢測流體樣品中的靶物質的測試裝置，所述裝置包括固相基質檢測系統，其包括將流體樣品從樣品施用部位轉運至檢測部位的部件；設置在遠離所述檢測部位的位置的與該靶物質的特異性親和分子綴合的非催化性標記，所述非催化性標記包含多個信號前體分子，所述信號前體分子可轉變為多個可檢測的信號產生分子；載體介質，其包含用于溶解所述非催化性標記的溶劑，及用于引起由指示所述靶物質的存在情況和/或量的所述多個可檢測的信號產生分子在所述檢測部位所產生的信號的定位的增稠劑；和用于將所述多個信號前體分子轉變為所述多個可檢測的信號產生分子的部件；其中，所述載體介質適于使其至少在所述檢測部位與所述信號分子接觸。
31.權利要求30的測試裝置，其中，所述用于將所述多個信號前體分子轉變為所述多個可檢測的信號產生分子的部件包括所述載體介質中包含的信號顯示劑。
32.權利要求31的測試裝置，其中，所述信號顯示劑適于活化選自以下的熒光團熒光素及其衍生物、熒光素二乙酸酯(FDA)、熒光素二乙酸異硫氰酸酯(FDA-異硫氰酸酯)、熒光素二乙酸酯馬來酰亞胺(FDA-馬來酰亞胺)、花青、碳花青、若丹明、咕噸、基于重氮染料的熒光物質以及小的熒光芳香和雜芳香分子。
33.權利要求31的測試裝置，其中，所述信號顯示劑適于活化選自以下的發色團花青、吡唑啉酮、蒽醌、碳花青、若丹明、咕噸、類胡蘿卜素和基于重氮及單偶氮、噁嗪、靛類或核黃素的染料物質。
34.權利要求31的測試裝置，其中，所述信號顯示劑為堿或酯酶。
35.權利要求30的測試裝置，其中，所述用于將所述多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子的部件為物理部件。
36.權利要求35的測試裝置，其中，所述物理部件適于引起溫度變化、pH變化、聲處理、 光輻射或微波加熱。
37.權利要求30-36中任一項的測試裝置，所述裝置選自側流測試裝置、垂流測試裝置、試管或多重檢測平臺。
38.權利要求30-37中任一項的測試裝置，其中，所述固相基質選自多孔膜，包括硝酸纖維素、尼龍；非多孔的平坦表面，包括玻璃、聚苯乙烯、金屬、碳；試管或微量滴定板的內壁；球體，包括磁珠或非磁性珠。
39.權利要求30-38中任一項的測試裝置，其中，所述載體介質為具有固體外觀的基質凝膠。
40.權利要求37-39中任一項的測試裝置，其中，所述測試裝置為還包括負載有所述載體介質的光學透明蓋子的側流測試條，所述光學透明蓋子用于在所述測定反應完成后放置于所述測試條上。
41.權利要求40的測試裝置，其中，所述光學透明蓋子與用于將所述裝置的多孔組分保持在一起的背面層壓板鉸接。
42.一種用于測定流體樣品中靶物質存在情況的部件的試劑盒，所述試劑盒包含固相基質檢測系統，其包括將流體樣品從樣品施用部位轉運至檢測部位的部件；設置在遠離所述檢測部位的位置的與該靶物質的特異性親和分子綴合的非催化性標記，所述非催化性標記包含多個信號前體分子，所述信號前體分子可轉變為多個可檢測的信號產生分子；和用于將所述多個信號前體分子轉變為所述多個可檢測的信號產生分子的部件。
43.權利要求42的試劑盒，所述試劑盒還包括用于形成載體介質的成分，所述載體介質包含用于溶解所述非催化性標記的溶劑，及用于引起由所述多個可檢測的信號產生分子在所述檢測部位所產生的信號的定位的增稠劑。
44.權利要求43的試劑盒，其中，所述用于將所述多個信號前體分子轉變為所述多個可檢測的信號產生分子的部件包括所述載體介質中包含的信號顯示劑。
45.權利要求42-44中任一項的試劑盒，其中，所述信號前體分子包括熒光染料、染色滲透液、生物發光物質或化學發光物質、電化學活性物質或磁性物質。
全文摘要
本發明提供一種用于在固相基質檢測系統中產生和定位信號的方法，包括將靶物質的溶液施用于固相基質；將所述靶物質與該靶物質的特異性親和分子結合，所述親和分子連接有非催化性標記，所述非催化性標記包含多個信號前體分子；將載體介質施用于所述固相基質；及處理所述標記以將所述多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子；其中，所述載體介質包含用于溶解所述非催化性標記的溶劑，及用于引起由指示所述靶標的存在情況和/或量的所述多個可檢測的信號產生分子所產生的信號的定位的增稠劑。在一些實施方案中，載體介質也可包含將多個信號前體分子轉變為多個可檢測的信號產生分子的信號顯示劑。在其他實施方案中，信號顯示劑并不是必需的，因為多個信號前體分子可通過物理方法轉變為多個可檢測的信號前體分子，物理方法例如溫度變化、pH變化、聲處理、光輻射或微波加熱。還公開了一種用于檢測流體樣品中靶標的測試裝置，及一種用于測定流體樣品中靶標存在情況的部件的試劑盒。
文檔編號G01N33/543GK102460169SQ201080027080
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月14日 優先權日2009年6月12日
發明者P·Y·C·陳, R·任能博, 冼敬強, 王礽慧, 麥永昌 申請人:超新星診斷公司