基因毒性測試的制作方法

專利名稱：基因毒性測試的制作方法
基因毒性測試本發明涉及用于檢測導致或加劇基因組損傷的試劑的方法，且涉及可應用于此類方法的分子和轉染的細胞系。具體而言，本發明涉及用于在人細胞培養物和其他哺乳動物細胞系中檢測基因組損傷的生物傳感器。基因組損傷可通過DNA損傷發生，DNA損傷由多種試劑(agent)如紫外光、X射線、 自由基、甲基化劑和其他誘變化合物所誘導。基因組中染色體的數量亦可由稱作非整倍體誘發劑(aneugen)的化合物所改變。DNA損傷/或非整倍體誘發作用(aneugenesis)亦可間接地由影響與DNA相互作用的酶和蛋白質(包括聚合酶和拓撲異構酶)的試劑或通過前誘變劑(promutagen)(可代謝稱為誘變劑的試劑)所導致。任何這些試劑可導致對包含生物遺傳密碼的DNA的損傷，并導致基因中的突變。在動物中，此類染色體數量的突變或改變可導致致癌作用或可損傷配子以導致后代中的先天性缺陷。此類DNA損傷劑可統稱為基因毒素(genotoxin)。這些DNA損傷劑可化學地修飾組成DNA的核苷酸，打斷連接核苷酸的磷酸二酯鍵， 或破壞堿基之間的聯系(T-A或G-C)。其他基因組損傷劑可對DNA的結構組分(例如組蛋白)，核和細胞分裂的機制(例如紡錘體形成)，或基因組維持系統如拓撲異構酶和聚合酶有作用。為了對抗這些DNA損傷劑的作用，細胞進化出了大量機制。舉例而言，大腸桿菌中的SOS應答是充分表征的(well-characterized)的由DNA損傷誘導的細胞應答，其中表達了一系列蛋白質，包括DNA修復酶，該酶修復損傷的DNA。在哺乳動物中，系統如核苷酸切除修復和堿基切除修復機制在DNA損傷修復中起突出作用，并且是用于去除大量DNA加成物 (adduct)和修飾的堿基的主要機制，而非同源末端連接和同源重組在鏈斷裂的修復中是重要的。這些系統的大多數亦導致細胞周期停滯以允許細胞在進行細胞分裂之前進行修復。在許多情況下，鑒定何種試劑可導致或加劇基因組損傷是重要的。檢測導致基因組損傷的試劑在當評估將個體暴露于這些試劑是否安全時是特別重要的。舉例而言，檢測這些試劑的方法可用作基因毒性測定以供篩選作為候選的藥物、食物添加劑或化妝品的化合物以評估目標化合物是否誘導基因組損傷。或者，檢測基因組損傷劑的方法可用于監測包含誘變化合物的污染物對水源的污染。多種用于確定試劑的基因毒性方法，如Ame s測試，體外微核試驗和小鼠淋巴瘤測定(MLA)是已知的，但由于多種原因，是不盡如人意的。舉例而言，樣品的培育 (incubation)可花費許多周，而通常需要在更短的時間框架中獲得基因毒性數據。此外， 許多已知的檢測DNA損傷的方法(包括Ames測試和相關方法)測定的是作為終點的持續 DNA損傷，其為錯誤修復的DNA (突變和重組)的形式，或者為片段化DNA形式的未修復損傷。然而，多數DNA損傷在可測量此種終點之前即已修復，且持續DNA損傷僅在如此惡劣以致使得修復機制飽和的條件下發生。DNA損傷可經正確地修復，或不準確地修復從而創造突變。該突變終點可在DNA修復之后測得。持續DNA損傷如DNA雙鏈斷裂是致死的。在WO 98/44149中公開了改善的基因毒性測試，其涉及包含釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiaie)調節元件可操作地連接于DNA序列的重組DNA分子，所述元件響應DNA損傷激活基因表達，而所述DNA序列編碼發光報道基因如綠色熒光蛋白(GFP)。此類DNA分子可用于轉化酵母細胞以用于供檢測導致或加劇DNA損傷的試劑的存在的基因毒性測試。可對該細胞施以試劑，而來自細胞的發光報道基因(GFP)的表達表明該試劑導致DNA損傷。WO 98/44149中描述的基因毒性測試檢測可防止達到終點的修復活性的誘導。 WO 98/44149中描述的方法可因此用于檢測DNA損傷劑的存在。US 6，344,3 公開了包含倉鼠GADD153上游啟動子區的調節元件連接于編碼GFP 的DNA序列的重組DNA分子，所述元件響應廣泛范圍的細胞應激條件而激活基因表達。該報道系統實現于人頭頸鱗狀細胞癌細胞系中。然而，與該報道系統相關的問題為其需要在導致少于10%的細胞存活的測試劑濃度的至少四日的處理期，然后通過流式細胞計量術分析熒光。此外，用在該毒性水平的試劑測試時任何基因誘導的生物學相關性值得商榷。此外，該發展并未公開特異性監測可導致或加劇DNA損傷的試劑的存在的手段，且GADD153誘導的機制依舊不明。因此，該系統作為人DNA損傷生物傳感器的作用非常有限。PCT/GB2005/001913公開了包含人GADD45a基因的調節元件連接于發光蛋白質的重組DNA分子。該報道系統允許基因毒性測定在正常毒性范圍內迅速高通量地檢測基因
ο本發明實施方案的一個目標是解決與現有技術相關的問題，并提供改善的生物傳感器以供在人細胞培養物中檢測基因組損傷。根據本發明的第一個方面，提供了包含編碼Gaussia螢光素酶(GLuc)報道基因及其衍生物的DNA序列的表達盒，該DNA序列可操作地連接于人GADD45 α基因啟動子和人 GADD45 α基因調節元件，其配置為響應基因組損傷激活所述編碼Gaussia螢光素酶(GLuc) 報道基因的DNA序列的表達。術語“調節元件”意指調節與其相聯系的基因，即編碼Gaussia螢光素酶(GLuc)報道蛋白的DNA序列的轉錄的DNA序列。術語“可操作地連接”意指該調節元件能夠誘導GLuc報道蛋白的表達。根據本發明的第二個方面，提供了包含根據第一個方面的表達盒的重組載體。根據本發明的第三個方面，提供了包含依照本發明第二個方面的重組載體的細胞。根據本發明的第四個方面，提供了檢測導致或加劇基因組損傷的試劑的存在的方法，包括對依照本發明的第三個方面的細胞施以試劑；和監測來自該細胞的GLuc報道蛋白的表達。本發明第四個方面的方法代表了新穎的經濟合算的基因毒性篩選，其可用于提供調節前(pre-regulatory)篩選測定，以供由醫藥產業和在其他需要測試大量試劑或化合物的應用中使用。其比現存的體外和體內哺乳動物基因毒性測定提供了更高通量和更低化合物消耗，并且對于廣泛范圍的基因毒素是靈敏的。本發明的第四個方面的方法適用于評估試劑是否可能導致基因組損傷。“基因組損傷”包括影響DNA結構組分(例如組蛋白)的試劑，包括組蛋白脫乙酰化抑制劑，影響核和細胞分裂機制(例如紡錘體形成)的試劑，或影響基因組維護系統如拓撲異構酶和聚合酶和DNA修復系統的試劑。還包括DNA損傷，如核苷酸的化學修飾或核苷酸的插入/缺失 /取代；以及染色體數量和DNA合成的改變。優選地，“基因組損傷”意指DNA損傷。檢測導致基因組損傷的試劑在當評估將個體暴露于基因組損傷試劑是否安全時
4是特別重要的。舉例而言，該方法可用作基因毒性測定以供篩選已知試劑，如候選的藥物、 醫藥和工業化學品、農藥、殺真菌劑、食物或化妝品，是否誘導基因組損傷。或者，本發明的方法可用于監測含基因組損傷劑的污染物對水源、浸出液和流出物的污染。描述于PCT/GB2005/001913的現存的基因毒性測定，使用包含連接于發光蛋白 GFP的人GADD45ci基因的調節元件的重組DNA分子。該系統允許使用熒光光譜的基因毒性測定在正常毒性范圍內高通量檢測基因毒素。本發明人決定開發其他的基因毒性測定，其中可通過生物發光檢測報道蛋白。使用生物發光而非熒光以測定報道蛋白表達具有許多優勢。首先，本身具熒光的測試化合物可影響熒光報道蛋白的表達的檢測。如果使用生物發光報道蛋白，這不會是問題，因為測試化合物很少或幾乎不可能是生物發光的。因此生物發光報道蛋白的使用會限制測定中由熒光蛋白和試劑導致的任何干擾，這表明可測定更大范圍的測試化合物。同樣，因為用于該測定的測試化合物為非常罕見地生物發光的，這表明在使用發光報道蛋白的基因毒性測定中需要包括的對照反應較少。因此，可平行測定更多數量的測試化合物。同樣，無需包括使用破壞的或突變的發光報道蛋白的對照反應。螢光素酶是一系列在生活的生物中催化光產生化學反應的酶。它們是生物發光報道蛋白的實例。它們的表達可使用能夠進行發光讀數的合適的微板讀數器來監測。它們可用于基于生物發光的測定。生物發光是在多種生物中進化出的化學發光的形式。通過不同的進化歷史，衍生出了許多不同類型的生物發光。這些類型在其化學性質上具有廣泛分歧，但它們均進行類似的化學反應，即二氧雜環丁烷(dioxetane)的生成和破壞。該類型完全基于螢光素酶與發光底物螢光素的相互作用。已從廣泛范圍的不同生物包括細菌、甲蟲(例如螢火蟲和叩頭蟲(click beetle))、Reni 1 la、Aequorea、Vargula 和 Gonyaulax ( 一種甲藻)和甲殼類克隆了螢光素酶。目前有許多種不同的螢光素酶可供用于生物發光測定。發明人決定將兩種不同的螢光素酶的性質與GFP在基因毒性測定中進行比較。他們希望確定何種螢光素酶會最適合在基因毒性測定中用作生物發光報道蛋白。他們選擇螢火蟲螢光素酶(FLuc)進行研究，其為目前最常用的生物發光報道蛋白。他們還選擇研究Gaussia螢光素酶(GLuc)的性質，該酶分離自Gaussia，一種哲水蚤撓足類(calanoid cop印od)，并不常作為報道蛋白用于生物發光測定。出乎他們意料之外，發明人鑒定了 Gaussia螢光素酶(GLuc)當用于基因毒性測定時的多種有利特性。當連接于GADD45ci基因元件時，GLuc作為基因組修復活性的信號在細胞中累積，且甚至在細胞死亡之后仍存留。同樣GLuc在基因組修復完成時作為可測量的報道蛋白存留。與之相對，FLuc作為報道信號無法與GLuc存留一樣長。這些差異表明使用 GLuc的基因毒性測定可用單個取樣時間點進行以獲得測試化合物的基因毒性的量度，而這對于FLuc是不可能的。該優勢主要是因為下述事實FLuc是不穩定的蛋白，具有較短的半衰期。在基因毒性測定中使用GLuc而非FLuc作為報道蛋白的這些優勢是未知的，且在發明人進行的研究之前是無法預測的。事實上，直至本發明，GLuc尚未作為報道蛋白用于基因毒性測定。此外，GLuc蛋白從細胞分泌，而FLuc則不。因此，當在基因毒性測定中使用FLuc作為報道蛋白時，必須裂解具有FLuc的細胞以準確測量FLuc表達水平。與之相對，GLuc 蛋白從細胞分泌，這表明當在下述基因毒性測定方法中用作報道蛋白時，通常無須裂解具有GLuc的細胞以測定GLuc表達水平。因此，使用GLuc而非FLuc作為報道蛋白意味著無須裂解細胞，從測定方法中省去了試劑添加步驟和溫育步驟。基于這些發現，發明人開發了基因毒性測定，其中Gaussia螢光素酶(GLuc)表達由GADD45ci基因元件調節。該測定相對現存的基于FLuc的基因毒性測定和生物發光測定具有改進該測定可用于測量熒光測試化合物的基因毒性；在該測定中熒光化合物和試劑幾乎不導致干擾；GLuc的使用意味著該測定可用單個取樣時點進行以獲得測試化合物的
基因毒性的量度。此外，當用于本發明的方法的基因毒性測定中時，GLuc介導的生物發光具有令人意想不到的高“信噪”比，如所附實施例中所述。這種改善的比例允許發明人開發出使用比對于基于熒光的測定而言容易使用的測定液更少體積的測定液的基于生物發光的基因毒性測定。作為直接結果，使用GLuc介導的生物發光的基因毒性測定可使用384孔微滴定板進行。與之相對，使用384孔微滴定板用于類似的基于熒光的報道測定是困難的，因為測定液體積的減少意味著細胞數量的減少，而因此意味著不良的“信噪”比。因此，本發明方法的基于生物發光的基因毒性測定可比用基于熒光的測定更方便地用于更高通量的篩選系統。這可使得測定能夠用較少量的測試化合物進行，并可允許每測定微板測試更多化合物。術語“Gaussia螢光素酶(GLuc)報道蛋白及其衍生物”包括來源于海生撓足類 Gaussia princeps的蛋白，其當表達時可由螢光素酶測定所檢測。編碼GLuc蛋白的核酸序列可從許多不同公司商業獲得；例如，Nanolight (www. nanolight, com)。其目前并未在測定方法中廣泛用作報道蛋白。優選地，Gaussia螢光素酶(GLuc)報道蛋白在生物發光反應中催化腔腸熒光素 (coelenterazine)的氧化。腔腸熒光素+ — coe Ienteramide+ 光導致大量和可測量的發光的發射。編碼此種蛋白的核苷酸序列可從多種不同來源獲得；例如GenBank登錄號 AY015993。GLuc的衍生物包括編碼保留發光活性的GLuc多肽類似物或多肽片段的DNA序列。編碼“人源化”Gaussia螢光素酶(GLuc)報道基因的核酸可從可得自 Nanolight (www. nano light, com)的質粒獲得。該“人源化” GLuc基因的核酸序列已針對在人細胞系中的表達進行了優化。編碼Gaussia螢光素酶(GLuc)的DNA序列的實例在本說明書的實施例部分末尾示于SEQ ID N0:1的沈41-3198位。因此本發明一個優選的實施方案是其中Gaussia螢光素酶(GLuc)報道蛋白是由SEQ ID NO 1的沈41_3198位所示的核苷酸序列編碼的。GLuc產生高量子產率的光，不需要ATP，并可容易地通過商業上可獲得的發光計檢測。根據本發明第三個方面的包含編碼GLuc報道蛋白的DNA分子的細胞，可根據本發明第四個方面的方法使用。令人驚訝的是，根據本發明第一個方面在表達盒中除了人GADD45 α基因啟動子
6之外使用人GADD45ci基因調節元件從根本上增強了該盒對基因毒性應激的響應，并因此增強了對根據第三個方面的細胞中的基因組損傷的響應。有利地，可簡單地通過在測試培養中測定該報道蛋白的活性在僅48小時之內或僅48小時之后就該報道蛋白的表達來分析該盒。可對細胞施以測試劑或化合物，且細胞中報道蛋白的表達表明該測試劑是否導致基因組損傷。發明人發現編碼人GADD45a基因啟動子和人GADD45 α基因調節元件的DNA可以可操作地連接于報道蛋白以形成根據本發明第一個方面的盒，然后有利地用于根據本發明第四個方面的基因毒性測試。此類盒可包含整個GADD45ci基因(包括編碼序列)，只要其可操作地連接于編碼GLuc報道蛋白的DNA。舉例而言，可根據本發明第一個方面使盒包含整個，或基本上全部GADD45ci基因(包含調節元件和啟動子)，其中編碼GLuc報道子的DNA 插入GADD45 α啟動子的3’(例如，在GADD45 α編碼序列之內或在該編碼序列的3’)并配置為響應基因組損傷激活所述編碼GLuc報道蛋白的DNA序列的表達。優選地，人GADD45 α基因啟動子序列誘導RNA聚合酶結合于DNA分子并起始轉錄所述編碼GLuc報道蛋白的DNA。優選該啟動子序列包含人GADD45ci基因啟動子序列和5’ 非翻譯區。啟動子序列可從示于

圖1的PHG45-HC質粒獲得。GADD45ci基因啟動子的核苷酸序列顯示為實施例末尾的SEQ ID NO 1的核苷酸97至沈40。應理解的是，啟動子可包含堿基97-2640中的每一個，或者可為其功能衍生物或功能片段。功能衍生物和功能片段可方便地通過評估轉錄酶是否結合于推定的啟動子區并會隨后導致標志物蛋白的轉錄來加以鑒定。或者，此類功能衍生物和片段可通過當GADD45 α啟動子與GADD45a基因天然結合時，在GADD45ci啟動子上進行誘變并評估是否發生GADD45 α表達來進行檢查。根據本發明的表達盒中的調節元件可包含GADD45 α基因啟動子序列下游的序列。該調節元件可包含功能性DNA序列如那些編碼供核糖體結合的翻譯起始序列或結合在基因組損傷之后促進基因表達的轉錄因子的DNA序列。優選地，術語“調節元件”并不包括GADD45ci基因啟動子序列。“調節元件”包括 GADD45 α基因的基因內序列。根據本發明的表達盒中的調節元件可包含GADD45 α基因的至少一個外顯子。舉例而言，所述調節元件可包含GADD45 α基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3和/或外顯子 4，或至少其部分區，或其任意組合。因此，調節元件可包含GADD45ci基因四個外顯子的任意組合，或至少其部分區。在一個優選實施方案中，所述調節元件包含GADD45 α基因外顯子1的至少部分區，和優選地GADD45a基因外顯子3的至少部分區，和更優選地GADD45 α基因外顯子4 的至少部分區。特別優選所述調節元件包含GADD45ci基因外顯子1的全部，和優選地 GADD45 α基因外顯子3的至少部分區，和更優選地GADD45 α基因外顯子4的全部。GADD45 α基因外顯子3的核苷酸序列示為SEQ ID NO 1中的堿基3325-3562。 GADD45 α基因外顯子4的核苷酸序列在序列表中示為SEQ ID NO :1的堿基4636-5311。替代地，或額外地，所述調節元件可包含非編碼DNA序列，例如，GADD45 α基因的至少一個內含子。舉例而言，所述調節元件可包含GADD45ci基因的內含子1、內含子2和/ 或內含子3，或至少其部分區，或其任意組合。因此，所述調節元件可包含GADD45ci基因的三個內含子的任意組合，或至少其部分區。
在一個優選實施方案中，根據本發明的表達盒中的調節元件包含GADD45 α基因的內含子3的至少部分區。GADD45ci基因的內含子3的核苷酸序列示為序列表中SEQ ID NO 1 中的堿基；3563-46；35。在一個優選實施方案中，依照本發明的表達盒包含GADD45 α基因的啟動子序列并且還包含見于基因組GADD45ci基因序列自身的內含子3內的基因調節元件。盡管發明人不愿拘于任何假說，但認為GADD45 α基因的內含子3包含推定的ρ53結合基序，且正是該Ρ53基序令人驚訝地增強了該表達盒對基因毒性應激的應答。該推定的ρ53結合基序在序列表中示為SEQ ID NO :1中的3746-3765。發明人還認為GADD45a基因的內含子3可包含推定的TRE基序，其可編碼AP_1 結合位點。該推定的TRE基序在序列表中示為SEQ ID NO :1中的核苷酸堿基3795-3801。 因此，盡管發明人不愿拘于任何假說，但推測該推定的AP-I結合位點亦可貢獻于對基因毒性劑的改善的應答。優選所述表達盒至少包含來自GADD45 α基因內含子3的p53結合基序和/或AP_1
結合基序。所述調節元件可包含GADD45 α基因的3’非翻譯(UTR)區，其核苷酸序列示為SEQ ID NO 1中的堿基4750-5311。盡管發明人不愿拘于任何假說，但認為該3，UTR可涉及mRNA 盒的穩定化，并因此當與其余的調節元件如內含子3 —同使用時，可令人驚訝地為重要的。因此，根據本發明第一個方面的優選的表達盒包含人GADD45 α基因調節元件和人GADD45a基因啟動子可操作地連接于編碼Gaussia螢光素酶(GLuc)報道蛋白的DNA序列。最優選的表達盒包含人GADD45ci基因啟動子可操作地連接于編碼Gaussia螢光素酶 (GLuc)的DNA序列，禾口 GADD45 α基因的內含子3。在進一步的實施方案中，根據第一個方面的表達盒優選為如圖2中所示的 ⑶532-GLuc。表達盒⑶532-GLuc的核苷酸序列在SEQ ID NO :2中給出，并對應于SEQ ID NO 1的97至5311位核苷酸。根據本發明第二個方面的重組載體可例如為質粒、粘粒或噬菌體。此類重組載體在復制表達盒時具有極大用途。此外，重組載體對于用表達盒轉染細胞非常有用，且亦可促進報道蛋白的表達。重組載體可設計為使得載體會在細胞的胞質溶膠中自主復制，或可用于整合入基因組。在此情況下，在重組載體中可能需要誘導DNA復制的元件。合適的元件在本領域是公知的，且例如可來源于 pCEP4(Invitrogen,3Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley，PA49RF，UK)、pEGFP-Nl (BD Biosciences Clontech UK,21 In Between Towns Road, Cowley, Oxford, 0X4 LY, United Kingdom)或 pCI 禾口 pSI (Promega UK ltd, Delta house, chilworth Science Park, Southampton S016 7NS, UK)。此類復制載體可導致DNA分子在轉化體中的多重拷貝，并因此在需要GLuc報道蛋白的過表達(和由此所致的增加的發光)時是有用的。此外，優選該載體能夠在人、靈長類和/或犬類細胞中復制。優選該載體包含復制起點，并優選地，包含至少一個可選擇標志物。該可選擇標志物可賦予針對抗生素例如潮霉素或新霉素的抗性。合適的元件來源于 pCEP4質粒(Invitrogen, 3Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley, PA4 9RF, UK)。
在第一個實施方案中，根據第二個方面的重組載體優選為如示于圖2中并在SEQ ID NO 1 中提供的 pEP-GD532-GLuc。根據本發明的第三個方面，將本發明的表達盒或重組載體并入細胞。優選該細胞為真核的。此類宿主細胞可為哺乳動物來源的細胞和細胞系。優選的哺乳動物細胞包括人、 靈長類、鼠類或犬類細胞。所述宿主細胞可為淋巴瘤細胞或細胞系，如小鼠淋巴瘤細胞。宿主細胞可為永生化的(immortalised)，例如，淋巴細胞。優選的宿主細胞為人細胞系。優選地，所述宿主細胞為具有完整功能性P53的人細胞系，例如ML-I (具有野生型p53的人髓性白血病細胞系；ECACC登錄號88113007)， TK6(具有野生型p53的人類淋巴母細胞系；ECACC登錄號95111725)。然而，亦涵蓋宿主細胞系 WI-L2-NS(ECACC 登錄號 90112121)和 WTKl (兩者均為 TK6 的姊妹系(sister line) 并具有突變p53蛋白)。亦可使用H印G2(ECACC登錄號85011430) ^P HepaRG(BioPredic ； http //pagesperso-orange. fr/biopredic/index. html)，月干·: !白勺 (ECACC General Office, CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, United Kingdom).發明人發現TK6人細胞對于根據本發明方法的用途是特別優選的細胞系。盡管發明人不愿拘于任何假說，但認為TK6細胞是最有用的，因為其具有完整功能性p53。用于表達由DNA分子編碼的蛋白的宿主細胞理想地為穩定轉染的，盡管并未排除對非穩定轉染的(瞬時的)細胞的使用。根據本發明的第三個方面的轉染的細胞可通過實施例中所述的下述步驟來制成。 該細胞理想地為人細胞系，例如TK6。此類轉染細胞可根據本發明的第四個方面的方法來使用以評估試劑是否誘導或加劇DNA損傷。GLuc響應DNA損傷而受誘導，且由GLuc發射的光可容易地使用已知的適當技術進行測量。根據本發明的第三個方面最優選的細胞是用載體pEP-GD532-GLuc轉化的TK6細胞。這些細胞在本文中稱作GLuc-TOl。亦涵蓋了根據本發明的表達盒可整合入宿主細胞的基因組。本領域技術人員會知道用于將該盒整合入基因組的合適方法。舉例而言，可使表達盒攜帶于逆轉錄病毒載體上，該載體與包裝細胞系的組合可產生無輔助病毒(helper-free)重組逆轉錄病毒，然后可將該病毒導入宿主細胞。然后可將該盒自身整合入基因組。合適的無輔助病毒逆轉錄病毒載體系統的實例包括具有BING逆轉錄病毒包裝細胞系的pBabePuro質粒[Kinsella和 Nolan,1996. Episomal Vectors Rapidly and Stably Produce High-Titer Recombinant Retroviruses. Human Gene Therapy. 7 1405-1413.]。本發明的第四個方面的方法對于檢測在低濃度誘導基因組特別是DNA損傷的試劑是特別有用的。該方法可用于篩選化合物，如候選的藥物、食物添加劑或化妝品，以評估將生活生物，特別是人，暴露于此類化合物是否安全。或者，本發明第四個方面的方法可用于檢測水源是否受基因組損傷劑或加劇基因組損傷的試劑所污染。舉例而言，該方法可用于就可導致暴露于污染的人或其他生物中增加的基因組損傷的污染物的存在來監測工業流出物。本發明的方法優選通過培養用根據本發明第二個方面的重組載體(如 pEP-GD532-GLuc)轉染的細胞，將該細胞用推定導致基因組損傷的試劑溫育預定時間，并監測直接來自細胞樣品的GLuc報道蛋白的表達來進行。發光檢測和定量的合適方法對于本領域技術人員會是已知的，且該方法描述于實施例中。根據本發明的方法的一種優選實施方案，可從用pEP-GD532-GLuc轉染的TK6細胞，例如，來自微板孔中的細胞記錄發光讀數。合適的微板的實例為96孔、白色、透明底 (clear-bottom)無菌微板(為了最優性能，推薦Matrix Technologies ScreenMates 目錄號 4925)。同樣，如上所討論由于預料不到的高“信噪”比，本發明的基于發光的基因毒性測定方法可使用比對于基于熒光的測定容易使用的測定液較少的測定液進行(并因此使用較少的細胞和較少測試化合物)。作為直接后果，本發明方法可使用384孔微滴定板進行。因此合適的微板的進一步實例為384孔，黑色，無菌微板；合適的板亦可從Matrix Technologies ScreenMates 獲得。可使用合適的微板讀數器，例如具有注入器的Tecan Infinite F500來記錄發光和吸光度測量。用于進行本發明第四個方面的方法的最優選的實驗方案描述于所附實施例。可能存在來自GADD45 α -GLuc構建體的GLuc的背景(組成型)表達，因此細胞密度越高，培養物發光越多。為了校正任何來自生長的發光增加，將發光數據除以吸光度數據 (細胞密度)以給出‘亮度單位’，即每細胞的平均發光的量度。這獨立于培養密度。相應地，吸光度的測量可主要用于標準化發光信號而非測量測試劑的基因毒性。相應地，涵蓋了可與吸光度測量一同使用次級測定以通過細胞存活和細胞凋亡來確定毒性。舉例而言，使用 Biovision Bioluminescence Cytotoxicity Assay(Biovision Incorporated,2455-D Old Middlefield Way, Mountain View, California 94043, USA) Vybrant Apoptosis Assay Kit(Molecular Probes Inc.,29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402，USA)。根據本發明第四個方面的優選方法會使用根據本發明第三個方面的細胞(例如 GLuc-TOl)。應理解的是，一些非基因毒性化合物可通過細胞代謝而化學地改變。在哺乳動物中，該過程常常稱作代謝活化(MA)。MA可將某些非基因毒性化合物(例如前誘變劑)轉化為基因毒性化合物。最經常地，MA發生于肝臟。為此原因，通常優選調適基因毒性測試使得測試化合物的測定是在能夠代謝化合物的肝臟提取物的存在或不存在下實施，正如其在體內受代謝一般。實施例4描述了根據本發明第四個方面的優選方法，其利用稱作S9的肝臟提取物(對本領域技術人員是已知的)。此種提取物的納入允許測定法檢測僅在經過肝臟之后具有基因毒性的化合物。當在本發明的方法中使用S9肝臟提取物時，優選使用細胞染色確定細胞在群體中的密度。這是因為發明人如在實施例4中進一步所述，確定了發現用于估計細胞密度的光吸收測量的相對不靈敏度在S9代謝活化研究中導致測定對于前基因毒素 (pro-genotoxin)的降低的靈敏度。如下文實施例2中更加具體討論，清楚定義來自常規測定的陽性和陰性結果是有用的，且此類定義來源于考慮到系統中的最大噪音和來自對其基因毒性和作用機制有明確共識的化合物的數據。
10
當該測定包括S9肝臟提取物時，基因毒性閾值設為1. 5的相對GLuc誘導(即50% 增加)。因此若測試化合物產生大于該1. 5閾值的相對GLuc誘導則斷定為陽性基因毒性結果⑴。當該測定不包括S9肝臟提取物時，基因毒性閾值設為1. 8的相對GLuc誘導(即 80%增加)。因此若測試化合物產生大于該1. 8閾值的相對GLuc誘導則斷定為陽性基因毒性結果⑴。同樣，在遺傳毒理學領域，有時需要以承認不同化合物之間基因毒性作用效力的差異的方式來評估測定結果。因此，亦可使用下述標準評估GLuc誘導若一種或多種測試化合物濃度產生大于該1. 5或1. 8閾值的發光誘導，則斷定為陽性(+)基因毒性結果。當
化合物稀釋無一產生高于該1. 5或1. 8閾值的相對GLuc誘導時，斷定為陰性基因毒性結果 ㈠。發明人接著發現了可使用熒光細胞染色來替代光吸收測量。這是因為這兩種方法事實上是估計相同事物的不同的方式。令人驚訝的是，使用細胞染色的方法改善了細胞數估計的靈敏度，并因此改善了對前基因毒素的檢測。優選地，用于經調適的實驗方案中的細胞染料為花青染料，更優選為三唑橙 (triazole orange, TO)，其為結合于DNA和RNA的花青染料。TO對DNA的結合極大地增強了其熒光強度，允許無需洗去背景未結合的TO而對其進行檢測。優選地，在本發明的第四個方面的方法中，在暴露于測試化合物起46至50小時之后監測GLuc報道蛋白的表達；最優選在48小時之后。在本發明第四個方面的一些實施方案中，檢測導致或加劇基因組損傷的試劑的存在的方法包括監測來自細胞的GLuc報道蛋白的表達的步驟。GLuc報道蛋白在發光反應中催化底物腔腸熒光素的氧化。發明人確定在一些反應條件中(特別是當順序進行多個反應時)，腔腸熒光素可為不穩定的，使得向發光信號引入差異程度，其可影響測定的靈敏度和魯棒性(robustness)。在進一步的調查中，發明人確定腔腸熒光素可由氧化劑如抗壞血酸(維生素C)的存在而穩定化。或者，腔腸熒光素可由三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)(優選在pH 7.4和終濃度IOOmM)的存在而穩定化。而且，腔腸熒光素可進一步由β-環糊精的存在而穩定化。因此本發明的優選方法是其中腔腸熒光素作為5mM儲液在酸化甲醇中制備。制備發光緩沖液(400mM Tris-HCl ；5πιΜβ -環糊精；去離子水；用ION NaOH緩沖至pH 7. 4)。然后將該腔腸熒光素儲液在發光緩沖液中稀釋2000倍以得到2. 5 μ M腔腸熒光素溶液(通過 TRIS緩沖至pH 7.4)。其為注入溶液，將其添加至反應測定(導致腔腸熒光素進一步的4 倍稀釋)。所有本文中所述的特征(包括任何所附權利要求、摘要和附圖)和/或如此公開的任何方法或過程的所有步驟，可與任何上述方面以任意組合合并，但其中至少一些此類特征和/或步驟相互排斥的組合例外。現在進一步僅通過實例的方式描述本發明的實施方案，其中引用下述實施例和附圖圖 1 顯示載體(A)pEP-GD532 ； (B)pHG45_HC 質粒；和(C)pCMV-GLuc-l 的限制圖。圖2 (A)顯示載體pEP-GD532-GLuc的質粒圖和(B)表達盒GD532_GLuc的概略圖。
圖3顯示FLuc、GLuc和GFP報道蛋白活性的甲基亞硝基脲(MNU)誘導。圖4顯示來自終點時間過程實驗的4種測試化合物對于具有GADD45 α -FLuc表達盒的細胞的實例數據。圖5顯示兩種測試化合物對于具有⑶532-GLuc表達盒的實例數據；㈧非基因毒素；(B)基因毒素。圖6顯示來自利用GFP報道蛋白的使用高度熒光性測試化合物的測定的數據；(A) 用吖啶橙的GFP數據；⑶用吖啶橙的GLuc數據。圖7顯示來自在S9提取物存在下用GLuc報道蛋白的前基因毒素的測定的結果； (A)用細胞數校正三唑橙(TO) ； (B)當將TO細胞數整合入該測定時，來自用6-氨基草屈的 S9測定的數據。對于+S9提取物，陽性判定閾值為1.5，而對于-S9提取物的陽性判定閾值為1.8 ；兩者均示于圖上。圖8顯示來自使用384孔微滴定板對于基因毒素4_硝基喹啉氧化物(NQO) 的基于GLuc的基因毒性測定的數據；(A)使用實施例4內描述的熒光細胞染色(TO)方法測得的對于NQO的相對毒性曲線；⑶對于NQO的相對GLuc發光誘導。實施例1 克隆 pEP-GD532_GLuc為了在GADD45 α報道構建體中用GFP ORF交換Gaussia螢光素酶(GLuc) 0RF。實驗方案使用PCR 從質粒 pCMV-GLuc-I(Nanolight)克隆 Gaussia 螢光素酶 0RF。 pCMV-GLuc-Ι質粒由NEB作為pCMV-GLuc商業出售。pCMV_GLuc_l的質粒圖提供于圖1。使用PWO高保真聚合酶(Roche)以最小化PCR誘導的突變的產生。正向和反向引物包含分別編碼限制性內切核酸酶XhoI和NotI的識別位點的8個附加的(非互補的)核苷酸。PCR 反應的實驗方案如下所示。引物
名稱序列5’ -3，TmSEQ ID No.GLuc-Fgggtcgagagtcaaagttctgtttgccctg50. 4"C (69. 9"C )3GLuc-Rgcggccgcattagtcaccaccggcccc50. 2"C (77. 9"C )4 反應混合物
試劑VolumedNTP混合物(每種1 OmM)Ιμ pGLuc-F (ΙΟμΜ)3μ1pGLuc-R (ΙΟμΜ)3μ1
1權利要求
1.一種表達盒，包含編碼Gaussia螢光素酶(GLuc)報道蛋白及其衍生物的DNA序列， 該DNA序列可操作地連接于人GADD45 α基因啟動子和人GADD45 α基因調節元件，其配置為響應基因組損傷激活所述編碼Gaussia螢光素酶(GLuc)報道蛋白的DNA序列的表達。
2.權利要求1的表達盒，其中所述調節元件包含GADD45ci基因的外顯子1、外顯子2、 外顯子3和/或外顯子4，或至少其部分區，或其任意組合。
3.權利要求2的表達盒，其中所述調節元件包含GADD45ci基因的外顯子1的至少部分區，GADD45 α基因的外顯子3的至少部分區和GADD45 α基因的外顯子4的至少部分區。
4.前述任一項權利要求的表達盒，其中所述調節元件包含GADD45α基因的內含子1、 內含子2和/或內含子3，或至少其部分區，或其任意組合。
5.權利要求4的表達盒，其中所述調節元件包含GADD45α基因的內含子3的至少部分區。
6.權利要求5的表達盒，其中所述調節元件包含推定的ρ53結合基序。
7.權利要求5或權利要求6的表達盒，其中所述調節元件包含推定的AP-I基序。
8.前述任一項權利要求的表達盒，其中所述基因組損傷是DNA損傷。
9.前述任一項權利要求的表達盒，其中編碼Gaussia螢光素酶(GLuc)的DNA序列示于 SEQ ID NO 1 的 2641-3198 位。
10.一種表達盒⑶532-GLuc，其基本上如圖2所示并提供于SEQ ID NO :2。
11.一種重組載體，其包含權利要求1-10任一項所述的表達盒。
12.一種重組載體pEP-GD532-GLuc，基本上如圖2所示并提供于SEQ ID NO :1。
13.一種細胞，包含權利要求1-10任一項所述的表達盒或權利要求11或12任一項所述的重組載體。
14.權利要求13的細胞，其中所述細胞為人細胞。
15.權利要求14的細胞，其中所述細胞為具有完整功能性p53的人細胞。
16.權利要求15的細胞，其中所述細胞為TK6人細胞系。
17.—種檢測導致或加劇基因組損傷的試劑的存在的方法，包括對權利要求13-16任一項所述的細胞施以試劑；和監測來自該細胞的GLuc報道蛋白的表達。
18.權利要求17的方法，其中進一步篩選所述試劑以評估將活生物暴露于該試劑是否安全。
19.權利要求17或權利要求18的方法，其中所述試劑是候選的藥物、食物添加劑或化妝品。
20.權利要求17-19任一項所述的方法，包括制備權利要求13-16的細胞的群體，或用權利要求11或12的重組載體轉染的細胞，將所述細胞與所述試劑溫育預定的時間，并直接從所述細胞的樣品監測GLuc報道蛋白的表達。
21.權利要求20的方法，其中所述方法是在S9肝臟提取物存在下進行的。
22.權利要求21的方法，其中所述群體中的細胞的密度是使用細胞染料確定的。
23.權利要求22的方法，其中所述細胞染料是花青染料。
24.權利要求23的方法，其中所述花青染料是噻唑橙。
25.權利要求17-M任一項所述的方法，其中GLuc報道蛋白的表達是從暴露于測試化合物起46至50小時之后進行監測的。
全文摘要
本發明涉及檢測推定導致或加劇DNA損傷的試劑的存在的方法，包括對細胞(其包含編碼Gaussia螢光素酶(GLuc)報道蛋白的DNA序列，該DNA序列可操作地連接于人GADD45α基因啟動子和人GADD45α基因調節元件，其配置為響應DNA損傷激活該DNA序列的表達)施以試劑；和監測來自該細胞的GLuc報道蛋白的表達。本發明還涉及可根據此種方法使用的表達盒、載體和細胞，以及可應用于本發明的方法的優選實施方案和測定中的修飾的介質。
文檔編號G01N33/50GK102449168SQ201080023133
公開日2012年5月9日 申請日期2010年3月26日 優先權日2009年3月28日
發明者A.拉比諾維茨, M.塔特, R.瓦爾姆斯利 申請人:金特羅尼克斯有限公司