專利名稱：使用多功能生物素類似物的生物分子標記的制作方法
使用多功能生物素類似物的生物分子標記本發明涉及生物素類似物，以及使用其標記靶結構和生物分子，例如體內或體外的肽和蛋白的方法對細胞信號通路中蛋白表達、定位和/或構象變化的追蹤需要創造在體內用對具有熒光基團或其他有用的探針的蛋白進行位點特異性標記的通用工具。傳統的化學方法依賴于半胱氨酸或賴氨酸側鏈的親核性，但對于體內應用太過混雜。基因方法，例如與綠色熒光蛋白(GFP)融合，攜帶了大量負荷(GFP含有238個氨基酸)，并且在變色范圍和分光鏡讀出的性質上很有限。最近幾年，引進了許多用于把小分子探針位點特異性地加到具有特定的肽序列的蛋白上的方法，包括 TetraCys/FlAsH 體系(B. A. Griffin, S. R. dams, R. Y. Tsien, Science, 1998，281，269-272)，HexaHis 標記(S. Lata, Μ. Gavutis, R. Tampe, J. Piehler, JACS，2006， 128,2365-2372),以及 polyAsp 標簽(H. Nonaka，S. Tsukiji, A. Ojida, I. Hamachi, JACS, 2007，129，15777-157779)。多種酶介導的標記體系也被報道，包括那些使用分選酶A/ SorTag 的(M. W. Popp, J. M. Antos, G. M. Grotenbreg, E. Spooner, H. L. Ploegh, Nature Chem. Biol. 2007,3, 707-708 ；Τ.Tanaka,Τ. Yamamoo,S. Tsukiji,Τ. Nagmune,CemBioChem, 2008,9, 802-807)，使用轉谷氨酰胺酶 /Q-tag 的(C. W. Lin, Α. Y. Ting, JACS, 2006，128，4542-4543)， 使用生物素連接酶的(I. Chen，Μ. Howarth, W. Lin, Α. Y. Ting, Nature Methods，2005，2， 99-104 ；M. Howarth, K. Takao, Y. Hyashi, A. Y. Ting, PNAS，2005，102,7583-7588 ；M. Howarth et al. Nature Methods，2006，3，267-273)以及使用硫辛酸連接酶的(M. Fernandez-Suarez et al. Nature Biotech. 2007,25,1483-1487 ；H.Baruh, S.Puthebveeti1, Y.A.Choi, S. Shah, Α. Y. Ting, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008，47，7018—7021)。許多天然酶演變了底物特異性標記以實現其生物學功能。一個實例是大腸桿菌酶生物素連接酶(BirA)，其參與將來源于重碳酸鹽的CO2轉化為有機酸以形成多種細胞代謝物(Chapman-Smith et al. J. Nutr. 129 :477S_484S，1999)。其在細菌中只有一種天然底物生物素羧基載體蛋白(BCCP)，其使賴氨酸122生物素化以使其準備被重碳酸鹽羧化。 Schatz等使用肽篩選確定了能夠被識別并且被BirA酶促生物素化的最小的，15個氨基酸的月太·歹IJ (Schatz et al. Biotechnology 11 1138-1143,1993 ；Beckett et al. Protein Sci. 8 921-929,1999.)。上述 15 個氨基酸的序列 TTNWVAQAFKMTFDP (SEQ. ID No. 19)是最有效的從噬菌體展示文庫中發酵生物素連接酶的15個氨基酸受體肽序列(I. Chen，Y.-Α. Choi and A. Y. Ting，J. Am. Chem. Soc. 2007，129，6619)。將這個被稱為〃 Avi_Tag 〃 的改性序列引入感興趣的蛋白從而在體外或活菌中進行位點特異性生物素化的純化的BirA和克隆載體是有售的。(Avidity，Boulder, Colo. USA)是一個源自肺炎克雷伯菌BCCP的72 個氨基酸的序列，由Irwitrogen以商品名BioEase 提供。BioEase 表達體系提供了一種表達、純化以及檢測生物素化重組蛋白的方法。BioEase 載體包括一個源自肺炎克雷伯菌草酰乙酸脫羧酶的72個氨基酸的序列，其能夠在體外指導特定賴氨酸殘基的生物素化。載體上制得的蛋白被表達為帶有這個序列的融合蛋白。生物素(維生素H或B7)以及其類似物在以前也被描述涉及在體內或體外標記肽和蛋白。已知BirA能高選擇性地連接酮生物素到包括在特定的15個氨基酸序列中的賴氨酸的 α-氨基上(Chen et al Nature Meth. 2005,2,99-104 ；McNeill et al. Organic Lett. 2006 8，4593-4595)。使用酮生物素的問題在于在缺乏酶BirA時，酮基也相對活潑， 導致其與生物素連接酶或反應體系中的其它蛋白上的賴氨酸側鏈反應。而且，該化合物被發現產生一個抑制BirA連接產率到 50%的產物。其它的生物素類似物也被制備出來。除其他外，Ting還等制備了，特別是脫硫生物素疊氮化物、順-N-炔丙基生物素、以及反-N-炔丙基生物素，并且將這些作為來源于多 f ·禾中白勺白勺(Human, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis,Pyrococcus horikoshii,Trypanosoma cruzi,Glardia Iambiia,Methanococcus jannaschii 禾口 Escherichia coli (BirA)(Slavoff et al.J.Am. Chem. Soc. ,2008,130, 1160)。據證明，釀酒酵母酶可以使用順-N-炔丙基生物素，而超嗜熱古菌酶可以使用脫硫生物素和順-N-炔丙基生物素作為底物。然而，這些類似物沒有以與天然生物素同樣的水平加成到15-氨基酸受體肽上。此外，由于生物素上的正交基團的位置，可以預料這些生物素類似物對抗生物素蛋白、鏈霉親和素、抗生物素標記抗體或其它與抗生物素連接的蛋白僅具有低親合力。一旦與適合的反應物反應，這些分子可能表現出對這些蛋白更低的親合力。本發明的一個目的是提供一種新的生物素類似物，其為生物素連接酶的底物，并且以可接受的，理想的與天然生物素接近的效率水平，加成到特定的肽上。本發明進一步的目的在于提供一種新的生物素類似物，其具有可接受的，優選可逆的，與抗生物素蛋白、鏈霉親和素、或它們的其它突變體或同系物的結合親合力。本發明更進一步的目的在于提供一種新的生物素類似物，其與到目前為止制備的生物素類似物相比通過更少的步驟和/或更高的產率更容易地合成。本發明的另一個目的在于提供一種采用新的生物素類似物作為親和標簽或進一步連接分子探針的共價連接特異性位點標記靶生物分子結構，例如蛋白質和肽的方法。因此，本發明的第一方面提供了一種生物素類似物，其包含天然生物素的脲環，以及至少一個經修飾的噻吩環或一個經修飾的側鏈，其具有功能性端基以及位于側鏈其它位置的至少一個生物正交性化學反應基團。優選地，所述生物素類似物具有天然生物素未經修飾的噻吩環，僅具有一個經修飾的側鏈，其具有功能性端基以及位于側鏈其它位置的至少一個生物正交性化學反應基團。然而，可以意識到，噻吩環的硫可以被選自CH2、O、NH和C = O的其它基團所取代，例如， 當經修飾的戊酸側鏈中的功能性基團與存在于噻吩環的硫原子不穩定時。作為選擇的，所述類似物可以包含具有經修飾的戊酸側鏈的脫硫生物素。優選地，所述功能性端基選自包括羧酸、醇、醛、胺、硫醇和鹵素的組。天然生物素的結構如下
權利要求
1.一種新的生物素類似物，包含天然生物素的脲環、任選地包含被修飾的噻吩環以及一個被修飾的側鏈，其具有一個功能性端基和位于側鏈其它位置的至少一個生物正交性化學反應基團。
2.如權利要求1所述的新的生物素類似物，其中功能性端基選自由羧酸、醛、醇、胺、硫醇和鹵素組成的組。
3.如權利要求1或權利要求2所述的生物素類似物，其中至少一個生物正交性化學反應基團選自由疊氮化物、炔、烯、雜環基團、二烯基團和/或一個或多個選自S、N、Se、P和0 的雜原子組成的組。
4.如權利要求1、權利要求2或權利要求3所述的生物素類似物，其中反應基團位于生物素類似物戊酸側鏈上，或是戊酸側鏈的一部分，或取代了戊酸側鏈。
5.如前述權利要求之一所述的生物素類似物，其中生物素類似物中噻吩環的硫環被其它基團所取代，其它基團選自由CH2、0、NH和C = 0的組。
6.如權利要求1至4任一項所述的生物素類似物，其中所述生物素類似物為具有被修飾側鏈的去硫生物素。
7.如權利要求3所述的生物素類似物，其具有如下通式
8.如權利要求7所述的生物素類似物，其中功能性端基選自由羧酸、醛、醇、胺、硫醇和鹵素組成的組。
9.如權利要求7或權利要求8所述的生物素類似物，其中生物正交反應基團位于戊酸側鏈1至5的任一位點。
10.如權利要求9所述的生物素類似物，其中生物正交反應基團在生物素類似物戊酸側鏈的2位點上提供。
11.如權利要求7、8或9所述的生物素類似物，其中R選自以下側鏈
12.如權利要求7至10任一項所述的生物素類似物，其中保留了所述類似物戊酸側鏈的5-碳骨架。
13.如權利要求7至10任一項所述的生物素類似物，其中戊酸側鏈的骨架含有1至10 個碳原子。
14.如權利要求12或13所述的生物素類似物，其中戊酸側鏈的骨架包括ー個或多個雜 原子，雜原子選自由硫、氮、硒、磷或氧組成的組。
15.一種新的生物素類似物，具有結構
16.一種新的生物素類似物，具有結構
17.一種新的生物素類似物，具有結構
18.一種新的生物素類似物，具有結構
19.一種新的生物素類似物，具有結構
20.一種新的生物素類似物，具有結構
21.如前述任一項權利要求所述的生物素類似物，進一步地被修飾，在端基結合活性酯形成中間體化合物。
22.如權利要求21所述的生物素類似物，具有以下通式
23.如前述任一項權利要求所述的生物素類似物，其以中等至高的親合力與抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、或它們的同族體，和/或抗生物素抗體和/或合成的生物素受體結I=I ο
24.如權利要求23所述的生物素類似物，其中所述類似物可以通過環境的變化或被更緊密的結合配體取代而從其與抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素或抗生物素抗體中釋放。
25.如權利要求4至24中任一項所述的生物素類似物，其中所述生物素類似物的戊酸側鏈包括在生物素類似物的雙環核心和端基以及生物正交基團之間具有可斷裂的連接體。
26.被如前任一項權利要求所述的生物素類似物標記的特定的靶結構。
27.如權利要求26所述的特定的靶結構，其中所述靶結構通過標準耦合化學連接到生物素類似物上。
28.如權利要求26所述的特定的靶結構，其中所述靶結構為蛋白或肽，并且包括作為生物素類似物連接到蛋白或肽的底物的受體肽。
29.如權利要求28所述的特定的靶結構，其中所述受體肽為源自大腸桿菌或其突變體或同族體之一的生物素連接酶的底物。
30.如權利要求28或權利要求29所述的特定的靶結構，其中所述受體肽通過肽鍵或可斷開的鍵或連接體融合到靶蛋白上。
31.如權利要求4至25中任一項所述的生物素類似物，或當依賴于權利要求4至25 時，如權利要求26至30中任一項的特定的靶結構，其中所述類似物被修飾的戊酸側鏈上的生物正交功能基與反應性基團反應，從而進一步將所述類似物或靶結構功能化。
32.如權利要求31所述的生物素類似物或特定的靶結構，其中所述生物素類似物具有被直接檢測的方法，包括熒光試劑、冷光試劑、核磁共振造影劑、正電子發射成像試劑、磷光試劑的活化或催化取代。
33.如權利要求31所述的生物素類似物或特定的靶結構，其中所述生物素類似物被間接檢測的標簽標記，所述標簽選自由酶、酶的底物、抗體、抗體片段、抗原、半抗原、配體、親和分子、發色體底物、蛋白、肽、核酸、碳水化合物和脂質組成的組。
34.標記靶結構的方法，包括通過作為生物素連接酶底物的受體肽連接根據權利要求 1至25之一的生物素類似物與靶結構的步驟。
35.如權利要求34所述的方法，進一步包含所述類似物的戊酸側鏈上的生物正交功能基與反應基團的反應，以進一步將所述類似物或靶結構功能化，所述反應發生在靶蛋白與受體肽和/或生物素類似物連接之前或之后。
36.如權利要求34或35所述的方法，其發生在體外或體內。
37.如權利要求34、35或36所述的方法，其中所述靶結構為細胞表面蛋白。
38.如權利要求34至37任一項所述的方法，其中靶蛋白在細胞內表達生物素連接酶。
39.如權利要求37或權利要求38所述的方法，其中所述細胞為原核的或真核的細胞。
全文摘要
新的生物素類似物，例如2-疊氮生物素，包含天然生物素的脲環和任選地包含被修飾的噻吩環，一個被修飾的側鏈，其具有功能性端基，優選選自由羧酸、胺、醇、硫醇、醛和鹵素組成的組，以及位于側鏈其它位置的至少一個生物正交性化學反應基團。所述類似物被用于標記靶結構和生物分子，例如體內或體外的肽和蛋白。
文檔編號G01N33/50GK102439014SQ201080022171
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月22日 優先權日2009年3月20日
發明者威廉·C·德魯, 尼爾·R·托馬斯, 楊·永青 申請人:諾丁漢大學