可編程電泳凹口過濾器系統及方法

專利名稱：可編程電泳凹口過濾器系統及方法
技術領域：
本發明是關于對溶液中的分析物進行分離、提純和分級有用的可編程電泳凹口過濾器系統及方法。本發明主要涉及分析物分離和提純領域，更具體地涉及在使用例如質譜、 ELISA、表面等離子共振或其他本領域中已知的常規檢測方法進行后續分析之前，對分析物，例如，蛋白質、肽、多肽、蛋白質復合體、抗體、DNA、RNA或其他生物材料進行的可調諧電泳分離、提純和分級。
背景技術：
復雜生物樣本的提純、分離和分級是分子和細胞生物學、藥物研究和開發以及醫學診斷和許多其他領域中所需的核心處理。例如，在基因組學和“下一代”基因組測序的情況中，必須將DNA片段按大小分開，并且將目標大小的片段分離以用于DNA測序DNA文庫的有效構建。在定義為對在生物樣本中發現的全部蛋白質進行全面識別和量化的“發現蛋白質組學”領域中，樣本必須根據已知且可預測的物化特性來可重復地分級，從而減小樣本的動態范圍和復雜性，并使得使用諸如液相色譜質譜聯用(LC-MS/MQ之類的方法的靈敏分析成為可能。例如，已知血漿蛋白質的豐度范圍覆蓋超過10個量級。一并考慮到由翻譯后修飾和轉錄后修飾中引入的不均勻性，在復雜多分析物樣本中的低豐度蛋白質檢測仍然是極大的挑戰，并且限制了可以用作新的生物標記物和/或藥物目標的分析物的發現和確認， 進而限制了細胞和生物路徑的解析(deconvolution)。在目標主要是量化在生物樣本(例如人類血漿)中發現的一個或多個目標蛋白質的“定向蛋白質組學”領域中，相對于樣本中發現的其他蛋白質，必須上百萬倍或更多地顯著富集目標蛋白質，從而提高信噪比，并且可進行靈敏的量化，通常使用LC-MS/MS。其他分析技術，例如，使用諸如抗體的親和分析，需要在親和相互作用之前或者之后進行提純以減少非特異性相互作用并允許更強效、靈敏且可再現的測量。在藥物發現和研發過程中，抗體和其他生物治療藥物必須被分離和提純從而能夠表征其質量、功能、作用機制等方面。此外，在分子生物學和生物治療藥物的表征中，通常希望提純與特異蛋白質、化合物或其他分子實體相互作用的分析物，從而用于例如解析治療目標并且更好地理解生物路徑。在這些例子中，必須將分析物復合體從樣本中的其他組分中提純，從而進行靈敏的分析。對于這些或相關領域中已知的這些和許多其他應用，需要用于分析物的分離、提純和分級的方法。已知有許多用于提純分析物的方法，例如使用親和相互作用、過濾、電泳分離和色譜分離的方法，包括但不限于反相色譜、凝膠滲透色譜、尺寸排阻色譜以及陽離子交換色
譜O當分離、提純和分級分析物時，通常希望所使用的系統具有高負載能力，這樣可以向系統中載入全部的大量分析物。由于許多目標分析物在樣本中存在的濃度比大多數豐富分子的濃度低數百萬倍，因而高負載能力理想地可以允許準備足夠的樣本，從而可以檢測到低豐度分子。其次，通常希望以具有高特異性和高分辨率的方式進行分析物的分離、提純和分級。換句話說，制備系統優選地提供盡可能“純”的樣本進行目標分析物的提取，即，理想地在單個分離(fraction)中只發現一種類型的蛋白質，從而優化信噪比。進一步希用于分離、提純和分級的方法是高度可再現的，這樣相同的系統和方法能夠重復地用于多個樣本而不會引入變化，進而提供清楚而明白的結果。還希望方法和系統提供對經分離、提純和分級的分析物的高回收性和高回收再現性。此外，希望用于分離和提純分析物的方法是通用的，從而使得這些方法可以容易地應用于其他分析物，并且基本有用。例如，諸如隨著針對各目標分析物的一些初始方法發展而來的尺寸排阻色譜之類的方法對于提純大范圍的分析物而言是基本有用的，并且可以用于以順次的方式提純來自單一樣本的多個分析物或片段。然而，這些方法可能受到分析物回收相對較差，以及且特異性/分辨率差的困擾。相反，使用高特異性抗體的親和純化提供了相對高的富集作用，但需要生產針對每種目標分析物的特異抗體以用于純化。由于經常需要多維度的分離/富集，因而進一步希望任意的單分離或提純系統/ 方法均與用于分離、提純和分級的其他方法/系統兼容。最后，希望這種系統和方法易于使用并且易于優化以用于各種樣本和目標分析物。最廣泛地用于分離、提純和離析帶電分析物的方法可能是一維電泳(IDE)，通常使用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。IDE允許基于電泳遷移率分離分析物，例如DNA、 蛋白質、肽、多肽、蛋白質復合體、RNA等。在所施加的電場下，帶電分析物移動穿過聚合物凝膠基質并且被聚合物凝膠基質篩選。這樣，質量-電荷比高的分析物移動得比質量-電荷低的分析物慢，從而使得分析物分離開來。在與十二烷基硫酸鈉(SDQ —并使用時，均勻凈電荷被施加到樣本中的所有蛋白質，這樣，分離是嚴格基于分子量來完成的，而不基于質量-電荷比來完成的。許多其他IDE 方法都是公知的，包括但不限于澄清非變性PAGE、藍綠非變性PAGE、電場反轉電泳、對流電泳、毛細管電泳等。可以按照已充分的公開，以板凝膠形式、管凝膠形式、或者對稱或不對稱形式的一些組合進行IDE。就此而言，IDE是應用最為廣泛并且對于分析物分離、提純和分級普遍有用的技術之一，因為其能夠提供基于電泳遷移率或分子量分離的能力、能夠提供大質量范圍內的分辨能力(resolving power)、易于使用并且具有通用性。在IDE的過程中，通常在連續時間段內施加為恒定電壓的電場，該連續時間段足夠允許在跨越凝膠基質整個長度中完成樣本分析物的分離。電壓只在實驗的結束時，即電泳移動性最大的分析物到達凝膠末端之前一刻，才被中斷。然后，可以使用熒光、染料或其他本領域已知的方法將凝膠成像，并且檢測分離出的分析物“條帶”的位置。檢測后，可以使用刀片或其他類似工具切出凝膠中的一個或多個條帶。已知有許多方法用于隨后從提取出的凝膠帶中回收提純的分析物。最廣泛使用的凝膠塊(plug)提純的方法依賴于將分析物的酶切或其他化學切割成從凝膠塊的孔隙擴散進入周圍液體的較小組分。該方法盡管有用，但其局限性在于必須將大的完整分析物，例如，蛋白質、蛋白質復合體等切割成較小的亞組分(subcomponents)。因此，即使并非不可能，但通常難以對完整分析物進行直接分析。尤其是在某些尤其涉及蛋白質分析的應用中， 這種局限性妨礙了對翻譯后修飾、截短、剪接變體和其他對于樣本中基因產物的完全表征而言必要的特征的簡便分析。此外，該方法人工強度大且單調，而且從凝膠塊的回收率相對較低，估計是在15-60%之間，嚴重地限制了下游分析。這些局限性嚴重地限制了該方法在大范圍的重要應用中的效用。從IDE回收分析物的一種可選方法涉及將分析物從提取出的凝膠塊電洗脫到溶液中或薄膜上。在這種情況下，將切出的凝膠塊置于腔體中，引導電場穿過凝膠塊，從而將目標分析物通過電泳從凝膠中移出并進入液體或捕獲支撐體(例如，捕獲膜、反相表面等) 中。盡管對于某些應用是有用的，然而如同已經廣泛公開的那樣，電洗脫技術通常不足以并且也不能以高回收率地回收大分子。該技術同樣費時費力，這是因為該方法涉及到人工提取凝膠塊、將這些膠塊插入第二裝置中并且運行第二裝置。該方法還常常導致分析物過于稀釋。第三種方法涉及在施加的電場中，將分離的分析物從凝膠末端，通常是管凝膠末端連續洗脫到流動的液體流中。在該模式中，分析物是基于通過凝膠的電泳遷移率來分離的。使得電壓持續以從凝膠基質洗脫出分離的分析物，而不是在高遷移率分析物達到凝膠的末端前中斷電壓并且從凝膠基質切出分離的條帶。就此而言，持續施加電壓直到洗脫的最后，以將分析物從凝膠基質洗脫并流入在凝膠基質末端流動的收集液體中。可以使用自動組分(fraction)收集器來將洗脫物從一個收集瓶移動到另一個中，進而允許樣本的“分級”。相對于用于分析物分離、提純和分級的其他IDE方法而言，該方法具有多個優點， 主要是能夠在溶液中回收分離的完整分析物。然而，連續洗脫凝膠電泳方法的局限性包括可用性、可再現性和稀釋度。由于分析物是從分離介質中洗脫到流動的液體流中，因此，從凝膠中洗脫的速率較慢并因而需要較長時間從凝膠中完全洗脫的分析物被持續稀釋，這是非常不理想的。此外，由于在使用這些系統和方法時必須持續地施加電壓，因而，還沒有以多路復用、高生產的方式捕獲特異的預定分析物片段的有效方法，而這些方法是非常希望的。此外，現有系統都不能使用以一致、可再現的形式制造出的即用型試劑盒，該即用型試劑盒允許在連續運行(rim-to-rim)中獲得一致的結果。由于分析物是從凝膠基質中洗脫出來的，而不是在標準IDE方法中“形成(develop)，，的，因此，如果即將以可再現性方式分離和提純分析物，則連續運行中代表性分析物的遷移時間必須精確相同。因此，本發明的目的是克服上文討論的現有技術的各種局限性，并描述用于改進分析物的分離、提純和分級的系統和方法。

發明內容
請求保護的發明旨在解決上述的一個或多個問題，并且該請求保護的發明易于使用，成本低。特別地，該發明涉及的系統由用戶可編程多通道電泳電源、對于分離分析物有用的預制備的聚合物凝膠基質、以及具有固定液體體積的用于在分析物從凝膠中洗脫出來時保留分離的分析物的收集室組成。該系統合起來獨特地允許分離、提純和分級復合物樣本，并且允許通過電子控制器和/或基于檢測到的分析物遷移的主動反饋，使用基于預編程成為序列的步驟自動暫停施加電勢，來收集預定義液體體積中被分離分級的分析物。提供了一些方法來將復合物生物樣本分成預定的、用戶可選擇的覆蓋廣泛質量范圍的電泳組分，并且捕獲預定義液體體積中的所述組分，或者將一種或多種特定分析物作為進行預編
8程的分離和提純的目標，回收預定義液體體積中的所述分析物。請求保護的發明使用連續管凝膠電泳的概念，但是是首次包含了用戶可編程電泳控制器的發明，該可編程電泳控制器獨特地允許進行預定分析物組分的預編程洗脫和收集。本發明還包含用于將樣本載入水平管凝膠分離通道而不會導致樣本稀釋或分散的特征，以及用于捕集(trap)預定義液體體積中的被洗脫的組分而不會導致分析物組分的稀釋或分散的特征。此外，這些獨特的特征允許容易地使用簡單的移液管從分離通道進行回收而不存在捕集氣泡(氣泡阻止電流流過系統，這是不希望的)的可能。本發明還提供了多路復用(multiplexed)樣本處理，具有高可再現性和高回收率。這些特征合起來提供一種新穎的電泳可編程分析物凹口過濾器及其使用方法。具體地，本發明的一個方面是一種電泳凹口過濾器裝置，包括凝膠盒，包括至少一個樣本通道，每一個樣本通道包括陰極緩沖劑室、樣本引入室、包括與所述樣本引入室相關聯的第一端的管凝膠、與所述管凝膠的第二端相關聯的樣本收集室以及陽極緩沖劑室， 其中所述陰極緩沖劑室、樣本引入室、凝膠管、樣本收集室以及陽極緩沖劑室能夠離子電接觸；電源，與每一個樣本通道的陰極緩沖劑室以及每一個樣本通道的陽極緩沖劑室可接合； 用戶界面，用于將用于樣本通道的一個或多個步驟編程到處理器中，其中，編程的步驟包括編程在編程的步驟期間穿過所述樣本通道施加的電流或電壓中的至少一個，并且編程穿過所述樣本通道的電壓或電流的施加持續時間，其中編程的一個或多個步驟形成編程的序列；以及電泳控制器，包括用于執行所述編程的序列的所述處理器。本發明的另一個方面是一種電泳凹口過濾器裝置，包括凝膠盒，包括至少一個樣本通道，每一個樣本通道包括陰極緩沖劑室、樣本引入室、包括與所述樣本引入室相關聯的第一端的管凝膠、與所述管凝膠的第二端相關聯的樣本收集室以及陽極緩沖劑室，其中所述陰極緩沖劑室、樣本引入室、凝膠管、樣本收集室以及陽極緩沖劑室能夠離子電接觸；電源，與每一個樣本通道的陰極緩沖劑室以及每一個樣本通道的陽極緩沖劑室可接合；檢測器，用于檢測所述凝膠盒樣本引入室中放置的樣本的特征；以及電泳控制器，用于執行用于至少一個樣本通道的序列，并且用于在所述檢測器檢測到所述樣本的特征時接收來自所述檢測器的反饋，其中，所述電泳控制器基于來自所述檢測器的反饋而暫停所述序列的執行。本發明的又一個方面是一種用于從生物樣本中回收感興趣的分析物的方法，包括如下步驟形成凝膠盒，所述凝膠盒包括至少一個樣本通道，每一個樣本通道包括陰極緩沖劑室、樣本引入室、包括與所述樣本引入室相關聯的第一端的管凝膠、與所述管凝膠的第二端相關聯的樣本收集室以及陽極緩沖劑室，其中所述陰極緩沖劑室、樣本引入室、凝膠管、 樣本收集室以及陽極緩沖劑室能夠離子電接觸；將電極放入至少一個樣本通道的所述陰極緩沖劑室中的緩沖劑溶液中；將對電極放入相同的至少一個樣本通道的所述陽極緩沖劑室中的緩沖劑溶液中；將用于所述至少一個樣本通道的一個或多個步驟編程到處理器中，其中，編程包括編程在編程的步驟中穿過所述樣本通道施加的電流或電壓中的至少一個，并且編程穿過所述樣本通道施加所述電壓或電流的持續時間，其中編程的一個或多個步驟形成編程的序列；以及使得包括所述處理器的電泳控制器執行所述編程的序列。本發明的再一個方面是一種電泳凹陷濾波器裝置，包括用于保持至少一個樣本通道的殼體，所述樣本通道包括陰極緩沖劑室和陽極緩沖劑室，其中所述陰極緩沖劑室和陽極緩沖劑室是分開的并且能夠離子電接觸；陰極緩沖劑室電極和陽極緩沖劑室對電極；用戶界面，用于將使用至少一個樣本通道進行電泳分離分析物的一個或多個步驟編程到處理器，其中編程的步驟包括編程在編程的步驟中穿過所述樣本通道施加的電流或電壓中的至少一個，并且編程穿過所述樣本通道施加所述電壓或電流的持續時間，其中編程的一個或多個步驟形成編程的序列；以及電泳控制器，包括所述處理器，用于執行所述的編程的序列。


圖1是在本發明凝膠盒實施例中有用的電泳凹口過濾器樣本室實施例的示意圖；圖2A、圖2B和圖2C分別是本發明凝膠盒實施例的透視圖、前視圖和分解圖，圖2D 是本發明凝膠盒實施例的俯視圖；圖3是本發明中蓋部打開的空的電泳控制器實施例的透視圖；圖4A是本發明電泳控制器實施例的透視圖，蓋部是打開的，凝膠盒在凝膠盒插槽中，并且電極陣列與凝膠盒未接合；圖4B是本發明電泳控制器實施例的透視圖，蓋部是打開的，凝膠盒在凝膠盒插槽中，并且電極陣列與凝膠盒接合；圖5是本發明電泳控制器實施例的電子組件(electronics)的示意圖；圖6A和圖6B是本發明電泳凹口過濾器裝置實施例中有用的96井板盒實施例的圖；圖7是本發明使用“中間”質量蛋白質分離的酵母裂解物分級結果實施例的ID凝膠可視結果，覆蓋質量范圍3. 3-150kDa，分辨率在30_150kDa之間；圖8示出來自圖7示出的凝膠的單一組分的峰底色譜(base peak chromatogram)；圖9示出了使用例1的方法分離的單個目標蛋白質的洗脫譜(elution profile) 的圖；圖10是本發明使用“低”質量蛋白質分離的酵母裂解物分級實施例的ID凝膠可視結果，覆蓋質量范圍3. 3-60kDa ；
分級；
圖11是使用本發明實施例分級的經凝膠去除的人類血漿的ID凝膠可視結果； 圖12示出使用本發明的獨特方法進行的單個目標蛋白質的可編程分離、提純和
圖13示出了如例5所描述的分級的NF kappa B p65樣本的ID凝膠分析結果； 圖14示出了本發明每一個通道和盒的再現性； 圖15示出本發明系統和方法的全部8個通道的BSA的回收率再現性； 圖16示出了例8中組分4、6、8和10的結果的ID凝膠可視化結果以及顯示DNA
標記物的對照泳道；圖17是電泳控制器觸摸屏幕界面的‘圖18是電泳控制器觸摸屏幕界面的‘圖19是電泳控制器觸摸屏幕界面的‘圖20是電泳控制器觸摸屏幕界面的‘圖21是電泳控制器觸摸屏幕界面的‘
:主屏幕”的屏幕截圖； :方法屏幕”的屏幕截圖； :取出方法”屏幕的屏幕截圖； :定義新方法”屏幕的屏幕截圖； :開發/編輯新方法”屏幕的屏幕截圖
10
圖22是電泳控制器觸摸屏幕界面的“開發/編輯新方法”屏幕的屏幕截圖；以及圖23是包括“終止實驗”屏幕覆蓋層的電泳控制觸摸屏幕界面的“方法屏幕”的屏幕截圖。
具體實施例方式本發明涉及一種對于溶液中分析物的分離、提純和分級有用的可編程電泳凹口過濾器。本發明大致涉及分析物分離和提純領域，尤其涉及使用例如質譜分析法、ELISA、表面等離子共振或其他本領域中已知的通用檢測方法而進行后續分析之前，對蛋白質、肽、多肽、蛋白質復合體、抗體、DNA、RNA或其他生物材料的電泳可調諧分離、提純和分級。本發明的電泳凹口過濾器系統包括三個主要組件(1)可編程電泳控制器200， (2)預制備聚合分離凝膠，以及C3)對于添加樣本或移除組分有用而不會擴散或稀釋分析物的樣本引入及樣本收集室。在一個實施例中，分離凝膠和樣本引入及收集室組合在單一用途、多通道凝膠盒100中。電泳控制器200通過使用集成檢測器，為穿過凝膠盒通道中的每一個通道的恒定電壓或電流的控制應用提供預編程組分收集暫停或動態組分收集控制。 該凝膠盒100包括多個樣本通道110，每一個樣本通道均能夠從包括多種分析物的樣本溶液中分離、提純和/或分級一種或多種感興趣的分析物。該系統合起來獨特地允許分離、提純和分級復合物樣本，并且允許通過電子控制器和/或基于檢測到的分析物遷移的主動反饋，使用基于預編程成為序列的步驟自動暫停施加電勢來收集預定義液體體積中被分離的或分級的分析物。提供了一些方法來將復合物生物樣本分成預定的、用戶可選擇的覆蓋廣泛質量范圍的電泳組分，并且捕獲預定義液體體積中的所述組分，或者將一種或多種特定分析物作為進行預編程的分離和提純的目標， 回收預定義液體體積中的所述分析物。請求保護的發明使用連續管凝膠電泳的概念結合用戶可編程電泳控制器，獨特地允許進行預定分析物組分的預編程洗脫和收集。本發明還包含用于將樣本載入水平管凝膠分離通道而不會導致樣本稀釋或分散的特征，以及用于捕集預定義液體體積中的被洗脫的組分而不會導致分析物組分的稀釋或分散的特征。此外，該設計允許容易地使用簡單的移液管從分離通道進行回收而不存在捕集氣泡(氣泡阻止電流流過系統，這是不希望的)的可能。本發明提供了多路復用(multiplexed)樣本處理，具有高可再現性和高回收率。圖1中示出了凝膠盒樣本通道110的截面。每一個樣本通道110包括幾個分離組件陰極緩沖劑室112、樣本引入室114、管凝膠116、樣本收集室118以及陽極緩沖劑室 120。管凝膠116大致是中空管狀結構，包括預制備的多孔聚合凝膠基質，例如聚丙烯酰胺、 瓊脂糖或本領域中熟知的其他材料及其混合物。優選的是，凝膠基質連附到管凝膠管的側壁以防止凝膠在操作之前或操作期間移動，進而允許高可再現性以及耐用性。容納凝膠的管不一定必須是圓形。實際上，根據本發明該“管”可以是矩形、圓形、 方形或任意其他幾何形狀。實際上，本文使用的術語“管凝膠”包含管中的凝膠，該管具有無論是否是圓形的任意截面幾何形狀，包括前述語句中討論的幾何形狀。然而，系統的負載容量依賴于凝膠的截面面積。此外，在電泳處理期間產生的熱可能使得分離變差，并且可能區別地影響整個凝膠的粘度。因此，基本上圓形管凝膠是優選的，從而可以最大化負載容量和熱散逸。截面可以在0. Inm到50cm之間，盡管在優選實施例中直徑將在0. Imm到IOmm
11之間。管本身可以由最為熟知的材料來構建，包括但不限于塑料、玻璃、陶瓷或其他材料。由于其熱傳遞能力、透光性以及容易進行表面化學改性(surface chemistry modification)，玻璃通常是優選的。重要的是，不同管的管內部直徑(ID)和外部直徑(OD) 必須是不會顯著變化的，以最大化分離結果的再現性，因為例如ID的小浮動可能導致給定施加電壓下管中所產生的電流的顯著變化，并且對分離和洗脫時間的再現性帶來負面影響。在管中制備的聚合基質(凝膠基質)可以包括貫穿整個管的單一孔隙率、多個離散的孔隙率或者貫穿管長度呈梯度的孔隙率。凝膠基質還可以包括嵌入的抗體、酶、納米顆粒、染料或對于特殊應用有用的其他反應或非反應種類。該凝膠可以由本領域熟知的一系列緩沖劑和導電物(conductivities)。在一個優選實施例中，凝膠基質由低孔隙率(例如3% )的“堆疊(stacking) ”凝膠和較高孔隙率(例如12% )的分離凝膠(resolving gel)組成。該實施例中的堆疊凝膠有助于將樣本塊(sample plug)富集成尖帶。一旦該帶到達分離凝膠，則穿過凝膠的分析物的遷移被較小的孔隙阻止，并且分析物將根據它們各自的電泳遷移率而分離。這樣， 較高電泳遷移率的分析物將會在較低電泳遷移率的分析物之前到達分離凝膠(separating gel)的末端并且從凝膠中洗脫出來。通過這種方式，能夠將樣本中分析物的子集合與樣本中的其他分析物分離、提純或分級。在一個實施例中，凝膠管116包括制備在I. D.(內徑)為6. 3mm的硼硅酸鹽玻璃毛細管內的聚丙烯酰胺凝膠基質。聚丙烯酰胺凝膠被制備為兩層——堆疊層和分離層。堆疊層由3. 2% T5% C交聯聚丙烯酰胺組成，并且分離層由8% T5% C交聯聚丙烯酰胺組成， 二者都是使用三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽(Tris-Acetate)作為ρΗ為7的凝膠緩沖劑而制備的。重要的是，凝膠的頂部、堆疊層和分離層之間的接觸面(interface)以及凝膠的底部都具有光滑、平坦的垂直于電泳電流方向延伸的接觸面，從而使得分析物分離分辨率得以最大化，并且各帶不會扭曲、向側面分離等。這樣，在其聚合形成為平面接觸面之前在凝膠的頂部放置丁醇或類似制劑是有用的。而且也重要的是，貫穿每一層的截面，凝膠濃度是均勻的，這樣給定比例的層中孔隙尺寸是一致的。進一步而言，關鍵的是，每一聚集(aggregate) 凝膠的長度被精確地控制，從而根據本發明提供洗脫的可再現性。陰極緩沖劑室112和樣本引入室114之間的邊界、以及樣本收集室118和陽極緩沖劑室120之間的邊界是膜122和124，該膜122和IM允許電泳電流從陰極緩沖劑室112 流到陽極緩沖劑室120，但是阻止被引入到樣本引入室144中的感興趣的分子進入陰極緩沖劑室114或陽極緩沖劑室120。優選的是，膜122和124都是500Da到3. 5kDa分子量截斷膜，從而在允許緩沖劑中的鹽離子穿過進而承載電泳電流的同時捕獲樣本收集室中基本上全部的分子。然而，也可以使用阻止樣本中的感興趣的分子進入陰極或陽極緩沖劑室中的任意分子量截斷膜。可替代地，大孔隙尺寸的分子量截斷膜可以用于允許某一預先選擇尺寸的分子通過而避免在樣本收集室中捕獲，但是保留較大尺寸的分子。這種選擇不需要收集電泳遷移率恰好高于(immediately above)目標組分的分析物的組分，但不利的是，需要使用不同的膜來進行具有不同電泳遷移率的分析物的提純。
在另一實施例中，膜被輕微充電以排斥來自膜表面的分子并阻止非特異結合 (non-specific binding)。本發明不限于分子量截斷膜，而是可以有效地應用離子交換、疏水的(hydrophobic)、親水的(hydrophilic)、親和捕獲(affinity capture)以及本領域技術人員熟知的所有其他膜。圖2A-圖2D是本發明實施例的凝膠盒的各種視圖。示出的凝膠盒100包括8個各自獨立的樣本通道110，這些樣本通道110實質上與圖1所示的單個通道110的設計相同， 這些樣本通道一起形成了單一凝膠盒，該單一凝膠盒包含管凝膠和用于將樣本弓I入凝膠以及從凝膠收集組分的裝置(means)。如圖2A-圖2D所示，凝膠盒100包括陰極緩沖劑殼體 130，陰極緩沖劑殼體130包括多個分離的陰極緩沖劑室112。每一陰極緩沖劑室112均被密封，只是在陰極緩沖劑殼體130的邊緣留了孔口 136，該孔口 136與樣本引入殼體134相關聯。樣本引入殼體134包括多個樣本引入室114，每一個樣本引入室均包括穿過樣本引入室114并且與陰極緩沖劑室112的孔口 136的一端相關聯的孔口 137。膜122與墊圈123 相關聯，墊圈123依次設置在陰極緩沖劑殼體130和樣本引入殼體134之間，這樣，孔口 136 中的膜122在阻止感興趣的分析物遷移進入陰極緩沖劑室112的同時允許每一個陰極緩沖劑室112和陽極緩沖劑室120之間的電泳互通。孔口 137保持打開，從而使得引入到樣本引入室114中的樣本與管凝膠116保持流體接觸。上述大致描述了管凝膠116，該管凝膠116包括管狀元件140，該管狀元件140包括單體凝膠或凝膠基質。管狀元件140包括與樣本引入室孔口 137相關聯的第一開口 141 以及與樣本收集殼體144中的孔口 143相關聯的第二開口 142。樣本收集殼體144包括用于每一通道110的樣本收集室118。每一個樣本收集室118均具有一打開的頂部145，該打開的頂部145提供例如通過使用移液管或其他液體取樣設備將感興趣的分析物手動地或自動地取出的位置。每一個樣本收集室118均具有定義的體積，從而保證取出的樣本的體積再現性。樣本收集殼體144包括與陽極緩沖劑室130中的孔口 148相關聯的孔口 143。膜 1 與位于孔口 143和148之間的墊圈125相關聯，從而物理地而不是電性地將每一個樣本收集室118與它的鄰近的陽極殼體152中的陽極緩沖劑室120隔開。附加墊圈131和133 輔助分別在中央管凝膠殼體135和樣本引入殼體134和樣本收集殼體144之間形成液體密封。盒部件可以由具有低蛋白質結合特性的生物可相容聚合物機械加工而成或模壓而成。例如，該盒部件可以由任意可加工或可模壓材料(陶瓷等)制成，優選的是塑料，更優選的是用于低分析物結合而沒有雜質(例如模壓分離劑)的塑料。盒可以形成為容納多個膜以及管凝膠116的單個單體。或者盒能夠由如上所描述的分離的殼體形成。此外，盒和/或盒組件(緩沖劑室)可以具有單一用途或多用途。在多用途盒中，凝膠管在單次使用之后可以被再填充或者可用新的凝膠管代替。管凝膠116包括優選地由直徑內部尺寸為I-IOmm的硼硅酸鹽玻璃或薄塑料形成的管。在優選實施例中，位于管中的凝膠將在它們集成為盒之前被制備至凝膠管中，然而用于容納根據本發明沒有被預先制備的管的盒對于本領域技術人員而言將是明顯的。一旦安裝好，盒組件被組合以保證使用組合裝置(例如，允許組件擠壓安裝在一起以永久性密封盒的可插入槽的定位銷154)進行密封。可替代地，可以使用螺旋銷或其他連接設備來非永久性地密封盒。一旦安裝好，則用具有所需PH的貯存緩沖劑和導電物填充盒，并應用板密封件 (例如粘性麥拉(Mylar)片)來覆蓋盒的整個打開的頂部，以保持凝膠含水直到使用。該貯存緩沖劑將在盒投入使用之前由用戶替換掉。為了將凝膠盒100投入使用，移除板密封條以暴露出各種貯存器和腔室，并且將貯存緩沖劑從盒中的一個或多個通道排出。接下來，一個或多個樣本通道的陽極和陰極緩沖劑室排液，并且被適當的電泳緩沖劑重新填充。最后，將包括一種或多種感興趣的分析物的液體樣本載入一個或多個樣本引入室，如同下文將更詳細描述的那樣將盒置于電泳控制器中并被處理。通過使用單通道或多通道移液管或者借由自動液體處理臺來幫助進行樣本引入和組分收集。通道間隔設計為能夠使用標準液體處理自動設備載入并操作盒緩沖劑。有種類廣泛的凝膠和緩沖劑系統適用于在本發明的凝膠盒中使用。大致來講，凝膠和緩沖劑系統的選擇將依賴于感興趣的分析物的分子量范圍以及進行希望的分離、提純或分級所需的質量分辨率(mass resolution)。例如，對于分離分子量在IkDa和300kDa之間的蛋白質而言三羥甲基氨基甲烷-N三(羥甲基)甲基甘氨酸(tris-tricine)緩沖劑系統是有用的。可以使用的緩沖劑和/或凝膠的其他非限制性的例子包括三羥甲基氨基甲烷 /甘氨酸(tris/glycine)和三羥甲基氨基甲烷-醋酸鹽/HEPES (tris-acetate/HEPES)、甲叉雙丙烯酰胺-三羥甲基氨基甲烷/M0PS(bis-tris/M0PS)等。跨越多種pH范圍的非變性凝膠系統(native gel systems)可用于非變性條件下的蛋白質和蛋白質復合物分離。帶有TBE或TAE或其他普通電泳緩沖劑的瓊脂糖凝膠對于DNA和RNA分離是有用的。應當理解，本發明不限于使用任意單一凝膠/緩沖劑系統，而是可以與任意已知電泳凝膠/緩沖劑系統一起使用。這些系統中的每一個均可以通過改變凝膠比例、通過使用梯度凝膠、通過使用合成凝膠或通過使用多層不同凝膠來進一步優化。可以基于如下標準中的一個或多個來選擇凝膠和緩沖劑所選擇應用的適宜性、再現性、制備容易性以及保質期(shelf life)。一種有用的凝膠緩沖劑系統包含單一緩沖劑系統，而不是在堆疊和分離凝膠中具有不同PH的緩沖劑。這將最小化隨時間推移的性能變化，進而最大化再現性。 此外，還優選的是，凝膠化學物的選擇允許使用可能的最低功率進行有效分離。如果焦耳加熱顯著，則凝膠分辨率(resolution in the gel)變差，并且可能需要主動冷卻。如果沒有主動冷卻，則保持每一通道的總功率消耗最大到3瓦，優選的是少于2瓦，這對于保持使用本發明的系統進行的分離的質量而言是重要的。本發明的某些實施例包含通過例如帕爾貼冷卻器(peltier cooler)或循環冷卻水浴的凝膠管主動冷卻，在這種情況下每個通道的瓦數可以顯著地更高。緩沖劑導電率(conductance)、凝膠長度和凝膠直徑與孔隙率是能夠影響樣本通道功率需求管理的其他因素。凝膠盒100的另一重要組件是膜122和124，膜122和IM用作邊界，用于保留樣本室和收集室中的樣本。一類有用的膜是透析膜。透析膜是可用的，具有許多特性。選擇膜的一個因素包括但不限于選擇合適分子量切割值以捕獲具有最小分析物結合的感興趣的分析物。一種優選膜材料是醋酸纖維素，它是一種用于透析的廣泛可用的膜，其顯示出在電泳條件下具有高穩定性和低分析物結合能力(binding affinity)。對于本發明的優選操作而言重要的一種附加膜特性是極化或充電。優選的是，在本發明實施例中使用的膜不是固有地充電的，而且在施加的電泳電勢之下不會變為充電。否則，將誘發穿過膜的電滲透(electro-osmosis)，導致例如樣本引入或樣本收集室中發現的分析物的富集或稀釋。本發明的另一方面是盒系統，該盒系統在高生產(throughput)應用中是有用的， 例如專用于大規模生物標記物發現項目(其中，提高組分生產量可能是必要的)的nLC/MS/ MS系統。圖6A和圖6B是實現高生產量需求的96通道盒400的視圖。圖6A和圖6B中示出的盒使用與8通道設備中展示的元件大致相同的元件。然而，在這種情況下，管凝膠410 被垂直扭轉并且被規格化為8 X 12的形式，間距9mm。這種形式直接與液體處理自動設備集成，使得可以完全自動地準備更多的樣本。在圖6A和圖6B示出的盒中，沒有足夠的物理空間來為每一通道設置獨立的對電極(counter electrodes)。相反，這種設計包含位于分子量截斷膜下方的公共區域420來完成電路。該設計節省了空間，并且允許有與現有實驗室設備交互的必要形式。該盒是由模壓的生物可相容塑料構建的，具有四個主要組件基底402，包括多個樣本收集井(well) 406的樣本收集盤404，以及樣本井框架408。管凝膠410被制備直接進入樣本井框架408的孔口 412中。每一個管凝膠410的體積和長度彼此相同，并且優選的是與8通道設備的相同。這允許至少100 μ L的樣本加載容量。樣本收集盤404具有跨越樣本井框架408底部的膜414。在載入包含分析物的樣本之前，用戶用緩沖劑填充樣本收集盤以達到希望的體積。每一樣本收集井可以容納35-200 μ L的緩沖劑。當樣本井框架408 置于樣本收集盤404上時，管凝膠410浸入緩沖劑中，完成了電路。一旦安裝好，則將樣本載入井框架中，直接位于管凝膠頂部。樣本上方的區域填充有緩沖劑以控制分離的ΡΗ。隨著電壓的施加，分析物遷移穿過管凝膠并且洗脫進入下方的樣本收集井。一旦已經收集了希望的分子組分，則單獨地關斷每一井的電壓或者一致地關斷整個盒的電壓，移除該井框架408，并且將樣本從樣本井406轉移到干凈的96井板用以分析。主要通過修改向電泳單元提供電流的電極陣列，本文描述的電泳控制器可以修改為適應96井盒的設計。在96井設計中，將優選地有96個獨立電極(每一個電極均與樣本井中的樣本接觸)以及插入到盒外邊緣上的公共回位井425中的4個公共電極。本發明提供的分離、提純或分級的程度是由施加的電泳電流、篩選基質的長度、篩選基質的孔隙率、凝膠和電泳緩沖劑的PH和導電性、操作溫度、以及在單個收集間隔期間電場暫停之前允許經過的時間來控制的。將所有其他變量保持恒定，收集間隔提供了所收集組分在電泳遷移率寬度的用戶可選擇性。本發明的電泳控制器提供恒定或變化電壓或電流的控制應用，具有預編程的收集間隔暫停、或者基于遷移或洗脫的分析物的檢測而進行的反饋誘發的收集間隔暫停。圖3、圖4Α和圖4Β示出了本發明實施例的可編程電泳凹口過濾器的各方面。該電泳控制器200是8樣本通道控制器，它尺寸上是臺式(bench top)的，并且能夠向凝膠盒 100的8個樣本通道110中的每一個同步地提供恒定電流或電壓，持續預編程的時間長度。電泳控制器200包括具有可移動蓋部204的殼體202。蓋部204優選地是由保護對光敏感的分析物的UV(紫外線)阻擋材料制成。蓋部204位于設備的頂部并且依靠鉸接部206運轉。一旦蓋部204打開，則凝膠盒100將被插入到“巢” 208中，從而用圖4A所示的電極陣列210和212之間位于左邊的陰極緩沖劑室來合適地定位盒的方向。重要的是， 每次運行的緩沖劑室內電極的位置要相同，從而使得每一個樣本室中電極和對電極之間的距離一直保持相同。隨著盒插入，電極210和對電極212的陣列(盒的每側有8個)被手
15動地或自動地降低進入盒中，這樣，單個電極211位于每一個陽離子緩沖劑室112中，單個對電極213位于每一個陰離子緩沖劑室120中，如圖4B所示。蓋部204被閉合并且互聯鎖合上，該互聯鎖允許只要蓋部是閉合的就向每一個獨立的電極/對電極組合施加電流/電壓。觸摸屏幕界面220位于設備的前部，并且允許用戶如同下文更詳細闡述的那樣對控制器編程。重要的是，用戶能夠為每一個樣本通道編程一個或多個步驟，以定義收集間隔的序列。每一個步驟將用戶定義的或預編程的電壓/電流施加穿過每一個獨立樣本單元 110，并且具有用于每一個編程的電壓/電流間隔的時間長度。編程的收集間隔或步驟定義了必要的序列，來實現根據本發明的分離、提純和分級。施加的電壓可以是從1到300V，時間間隔可以達到14400秒或更長。為給定分離而編程的多個間隔一起將稱為序列。該系統將允許η個間隔，其中η大于或等于1，允許實驗/樣本針對的分級工藝的定制。為了使用該系統，用戶將編程該序列，或者將從用于8個電泳單元中的每一個的預編程序列的菜單中選擇，并且將使用觸摸屏幕界面220開始實驗。該設備被編程以自動暫停向樣本通道110施加電壓，無論該步驟的時間間隔是否屆滿。這允許用戶或機械臂 (robot)從合適樣本通道的樣本收集室118中提取感興趣的樣本組分。本發明的系統是通用的，體現在用于每一樣本通道的編程序列均是獨立編程的，從而使得所有樣本通道均可以同步地執行相同或不同的序列。在可替代的實施例中，控制器包括檢測裝置(means)，該檢測裝置用于在分析物洗脫穿過和/或從分離凝膠中洗脫出來時檢測分析物或與感興趣的分析物相關的特征。檢測裝置和方法包括但不限于UV、IR (紅外線)、吸收法(absorbance)、電容差分等。在一個實施例中，檢測到的特征可以是一種或多種分子量標記物(molecular weight markers)，所述一種或多種分子量標記物被添加到樣本中從而調整并測量來自樣本通道的分析物的遷移和/或洗脫。檢測器300可以用于向控制器提供反饋，以進行用戶選擇的目標分析物的分離。例如，用戶可以選擇對應于一種或多種用于分離的分析物的一種或多種電泳收集間隔。由于所述分析物從凝膠管中洗脫和/或遷移，它們的位置借由檢測器300被檢測到，并且在合適的時間電泳電流被中斷，這樣，可以從樣本收集室118中收集一種或多種分析物， 可以使用移液管人工收集或者借由控制器控制的自動設備收集。測量信息包括施加的電流和電壓以及用于8個通道的指定電泳遷移窗口 (electrophoretic mobility window)檢測到的洗脫，其中所述測量信息可以在序列期間在顯示器(例如屏幕或觸摸屏幕界面)中以圖表形式顯示給用戶。此外，序列信息可以使用串行線纜或位于電泳控制器背部的USB端口以文本分隔形式(text delimited format) 輸出。電泳控制器電子組件如圖5所示。該電子組件包括與電插頭402相關聯的低壓電源400。高壓電源404與低壓電源402電關聯，并且與處理器406電關聯。處理器406是可編程的，并且被預編程以允許電泳控制器200接收使用輸入以及如本文所討論的那樣來操作。處理器406與顯示控制器412交互以驅動觸摸屏幕圖形用戶界面220，并且它借由電力控制408獨立地控制被引導穿過每一個樣本通道的電極的電壓和/或電流的量和/或持續時間。使用位于設備后部的一個或多個冷卻風扇412，設備產生的熱被散逸掉。本發明中可以使用任意樣本類型，包括但不限于原血、血清、血漿、尿液、唾液、組織均勻漿、細胞裂解物(cell lysates)、食物提取物、土壤、植物、水、生物加工組分、油等。為了操作，將樣本通過樣本引入室引入到設備中。樣本與樣本緩沖劑混合，調整體積以填充樣本弓I入室達到指定體積并且緩沖樣本PH。樣本緩沖劑可以包含反應劑(DTT等) 和/或清潔劑以幫助電泳分離。剩下的3個室，陰極室、陽極室以及樣本收集室填充有電泳緩沖劑。在分離期間，樣本中包含的分析物被電泳地從盒的陰極側的樣本引入室朝向陽極驅動。在一個實施例中，分離是在兩相聚合基質中執行的。為了補償引入到樣本室內的大體積樣本并最大化分辨率，采用堆疊凝膠。在這個區域中，樣本在遷移進入凝膠分離區域之前集中到一窄帶。在分離凝膠中完成樣本到離散分子量組分的分離。隨著樣本從分離凝膠的末端洗脫出來，它們流入(empty into)固定體積的樣本收集室，樣本收集室一側與管凝膠結合，另一側與離子可滲透膜結合，其中所述離子可滲透膜結合是經過特別選擇以允許緩沖劑離子通過但是不允許感興趣的分析物通過。捕獲的樣本通過使用移液管從收集室移出，并且樣本組分被存儲以用于后續的分析。打開蓋部204允許進入盒箱格208，以便載入或取下盒100并且用于在實驗期間收集組分。盒被如圖4A和圖4B所示那樣被載入，這樣，操作者可以讀取盒中印刻的井的數量，并且盒上印刻的箭頭指向右。盒定位鍵205防止用戶以錯誤的方向載入盒100。載入后的盒應當完全擱置在盒箱格207底部上。盒就位之后，將電極陣列210和212降低就位。電泳分離設備200由處理器406使用任意接口(例如鍵盤)來控制，但是優選地使用觸摸屏幕界面220來控制。主要操作模式是(1)方法開發/編輯；(2)方法執行；以及 (3)監控。一旦設備上電，則主要的中央導航和操作屏幕將顯示在觸摸屏幕界面220上。圖 17所示的“主屏幕”包括對于用戶導航控制軟件和開發/編輯、執行和監控分離方法而言必要的按鍵特征。在一個實施例中，序列開發/編輯是依照如下方式完成的。在主屏幕上，觸摸圖17 中右手側上方顯示的“方法”按鈕。這將用戶導航至圖18所示的方法屏幕。用戶然后觸摸或激活“取出”按鈕。這使得處理器導航至請求方法編號的對話屏幕(圖19)。用戶通過按下數字鍵盤上的“C”按鈕來清除已有輸入。接下來，用戶輸入還沒有被使用的方法編號并按下0K。這將使得處理器顯示圖20所示的屏幕。用戶然后觸摸待修改的步驟編號。這使得處理器顯示圖21所示的輸入屏幕。激活單元高亮，例如顏色是綠色。用戶然后可以添加或修改電壓、電流或時間的值，可以通過以下方式進行添加或修改a、使用數字鍵盤上的C刪去單元中的值。b、輸入希望的值。c、觸摸非激活單元以激活它，然后重復步驟b。d、“下一步”和“上一步”按鈕分別允許用戶編輯下一個步驟或上一個步驟。在任一單個方法中最多可以包括30個步驟。e、當完成輸入/編輯時，觸摸OK按鈕。接下來，用戶審閱新定義的方法中每一步的電壓、電流和時間配置(profile)。如果配置是可接受的，則用戶按下方法屏幕(圖20)上的“保存”。為了導航至主屏幕，用戶按下相同屏幕上的“應用”。為了編輯已有的序列步驟，用戶遵循如上列出的步驟，如下是例外情況。不是使用用于新方法的編號，而是用戶輸入多個已有序列。已有方法被按照如上所討論的進行編輯然后被保存。—旦用于在一個或多個樣本通道中執行的處理的一個或多個步驟被輸入并保存， 則由一個或多個步驟組成的方法可以由用戶執行。如前述所描述的那樣用戶通過按下主屏幕(圖18)上的“方法”按鈕來執行這些方法。一旦選擇了方法，則用戶按下“應用”來應用該方法并返回主屏幕(圖17)。接下來，用戶通過按下主屏幕上的“通道”按鈕來選擇在盒中運行的通道。這將帶來通道屏幕(圖21)。從通道屏幕上，用戶通過按下對應的通道按鈕 (例如“通道”)來選擇一個或多個在實驗期間運行的通道(通道編號)，或者按下“選擇所有”以將該方法一次應用于所有8個通道。一旦希望的通道組合選定，則用戶按下“完成” 按鈕返回到主屏幕。最后，用戶按下主屏幕(圖17)上的極性按鈕來設置場的極性。對于所有使用SDS的實驗，極性設置為“負”。一旦應用了序列并且選擇了通道，則用戶按下“開始”按鈕來開始運行。一旦運行，則“開始”按鈕變為允許用戶暫停運行的“暫停”按鈕。一旦實驗已經開始，為了完全停止實驗，則用戶按下“終止”按鈕。確認屏幕(圖21)將出現。為了終止，用戶觸摸“是”按鈕。如果用戶觸摸“否”按鈕，則處理器顯示主屏幕并且處理繼續。觸摸屏幕界面220還可以用于監控序列。首先，觸摸屏幕界面220可以用于顯示通道狀態。圖17所示的屏幕左側方框顯示的圓圈描述每一個通道的狀態。通道編號周圍的圓圈(優選是綠色)指示通道是激活的。所施加的電壓和電流顯示在通道狀態圓圈的右側。當方法暫停時，圓圈將轉為不同的顏色，例如黃色。如果方法啟動失敗或者在運行期間失敗，則圓圈轉為又一種不同顏色，例如紅色。當圓圈是黃色或者紅色時，電壓讀出為0。時間是通過觸摸圖17中數字計時器上方的“經過時間”按鈕來監控的。用戶可以使用觸摸屏幕界面來在選定“經過時間”、“剩余時間”或“暫停時間”。圖17中位于數字計時器下方的進度條提供所有時間度量的可視化指示。在主屏幕(圖17)的左下方，顯示當前選擇的序列。在主屏幕(圖17)的下方中心顯示激活序列中的當前步驟(例如，“步驟 i/12(85V，5分鐘)”)。蓋部的狀態也可以顯示。圓圈(優選是綠色)指示蓋部是閉合的 (準備好操作/對操作而言是安全的)并且不同顏色的圓圈(例如紅色)指示蓋部是打開的(將不操作)。通過如下的大致步驟來準備插入到電泳控制器200中的盒準備樣本；準備用于樣本的盒；以及將樣本載入一個或多個樣本引入室114。通過從樣本中移除鹽和已知雜質 (例如清潔劑)來大致地準備樣本。然后可以將樣本置入樣本引入室114或者可以通過諸如添加緩沖劑、稀釋、添加DTT等之類的步驟進一步處理樣本。在一種方法中，通過將樣本與樣本緩沖劑、水和DTT結合來進一步處理樣本。然后將樣本添加到樣本引入室114，或可以通過包括加熱(加熱之后進行冷卻)的步驟來進一步處理樣本，以給出準備好的包括一種或多種感興趣的分析物的樣本。接下來，準備凝膠盒100用以進行樣本添加。通過從盒頂部移除板密封件來開始凝膠盒的準備。如果在一次實驗中將使用盒中的全部8個通道，則用戶移除位于每一盒室中的貯存緩沖劑。如果將使用的通道少于全部8個，則可以使用轉移移液管或一些其他設備來從只與處理期間將被激活的樣本通道110相關聯的箱格移除貯存緩沖劑。接下來，將電泳緩沖劑添加到用于激活樣本通道的陽極緩沖劑室112。將電泳緩沖劑也添加到每一個激活樣本通道110的樣本收集室118中。然后對所有激活通道用電泳緩沖劑填充陰極緩沖
18劑室112。用戶然后使用尖頭轉移移液管移除并棄去從陰極緩沖劑室112中流入到樣本上樣室114中的任意緩沖劑。最后，將準備好的150 μ L樣本立即載入樣本上樣室114或相同的通道。對其他激活通道重復上述步驟。然后如上所描述的那樣將凝膠盒100載入電泳控制器200。接下來，將電極陣列布置為與位于陽極和陰極緩沖劑室中的緩沖劑相接觸。閉合蓋部。如同上述所描述的那樣由用戶通過觸摸主屏幕中的“開始”來啟動編程的電泳分離。例子例1-酵母裂解物的寬質量分級為了證實本發明的可編程電泳凹口過濾器對于寬質量范圍蛋白質分級的獨特性能，將酵母裂解物分成為12種不同分子量的組分，并且使用ID凝膠電泳和銀染使酵母裂解物可視化，并進行液相色譜-質譜(LC-MS)。為了制備酵母裂解物，通過在3000x g離心10分鐘沉淀酵母細胞。在每克酵母細胞沉淀中加入2. 5mL Cellytic Y(Sigma#C4482_50mL)、25 μ L 的 IM DDT(Sigma#43816)以及 25 μ L的蛋白酶抑制劑混合物(Sigma#P-82M)。在室溫下輕輕振蕩該混合物30分鐘。通過在14，OOOx g離心10分鐘除去不溶性的碎片，隨后通過5 μ m針式過濾器0^11#4650)。 測量蛋白質濃度[DC蛋白質化驗(BiOrad#500-0112)]并且將混合物等分并存儲備用。在使用之前，用去離子H2O將200 μ g的樣本等份稀釋至體積112 μ L。向該樣本添加8 μ L的 IM DDT以及30 μ L包含1 % SDS和25mM Tris的樣本緩沖劑(pH = 8. 5)，從而使終體積為 150 μ L。根據本發明，通過將8%Τ 5% C聚丙烯酰胺凝膠、將Tris醋酸鹽制備成I. D.為 6.3mm、0.D.為8mm的管凝膠且完全聚合來制備電泳凹口過濾器。將該管凝膠置入帶有截斷分子量為3. 5kDa的兩片膜的盒中并將盒粘附，這樣將通道密封在電氣和液體隔離的狀態中。使用包括聚丙酰胺凝膠緩沖劑的貯存緩沖劑填充盒的所有腔室，并且應用板密封件。在使用前，移除板密封件并且從電泳凹口過濾器通道中移除貯存緩沖劑。將8. OmL 的Tris-HEPES SDS電泳緩沖劑、0. 05M Tris,0. 1 % SDS，pH7. 9加入到所需通道的陽極和陰極緩沖劑容器。將150 μ L等份的電泳緩沖劑加入到樣本收集室。隨后，將150yL制備好的樣本轉移到對應通道的上樣室內。為了進行電泳，將盒置入設備中并且降低電極。然后按照如下表1所列出的步驟創建電泳凹口過濾器的序列。表1
權利要求
1.一種電泳凹口過濾器裝置，包括a.凝膠盒，包括至少一個樣本通道，每一個樣本通道包括陰極緩沖劑室、樣本引入室、 包括與所述樣本引入室相關聯的第一端的管凝膠、與所述管凝膠的第二端相關聯的樣本收集室以及陽極緩沖劑室，其中所述陰極緩沖劑室、樣本引入室、凝膠管、樣本收集室以及陽極緩沖劑室能夠離子電接觸；b.電源，與每一個樣本通道的陰極緩沖劑室以及每一個樣本通道的陽極緩沖劑室可接合；c.用戶界面，用于將用于樣本通道的一個或多個步驟編程到處理器中，其中，編程步驟包括編程在編程的步驟期間穿過所述樣本通道施加的電流或電壓中的至少一個，并且編程穿過所述樣本通道的電壓或電流的施加持續時間，其中編程的一個或多個步驟形成編程的序列；以及d.電泳控制器，包括用于執行所述編程的序列的所述處理器。
2.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述用戶界面用于編程用于多個樣本通道的序列，其中所述電泳控制器同步地執行多個所述編程的序列。
3.根據權利要求2所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所有多個所述編程的序列都是相同的。
4.根據權利要求2所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，兩個或兩個以上所述編程的序列是不同的。
5.根據權利要求2所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述多個所述編程的序列中沒有一個是相同的。
6.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述電泳控制器使得在每一個編程的序列步驟期間所述電流或電壓保持恒定。
7.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，每一個編程的步驟包括恒定電壓或電流設置以及電壓或電流持續時間設置這二者。
8.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，至少一個所編程的序列具有多個編程的步驟，其中所述電泳控制器在完成一個步驟之后暫停所述序列。
9.根據權利要求8所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述電泳控制器在每一步驟完成之后暫停所述序列。
10.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述電泳控制器通過控制供應到所述電極的電力來執行所述編程的序列。
11.根據權利要求2所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述電泳控制器基于編程的序列獨立地控制供應到多個電極中的每個電極的電力。
12.根據權利要求8所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述電泳控制器通過中斷供應到所述電極上的電來暫停所述序列。
13.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述用戶界面是觸摸屏幕顯示ο
14.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，不同的陰極緩沖劑貯存器和不同的陽極緩沖劑貯存器與每一個樣本通道相關聯。
15.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，相同的陽極緩沖劑室與兩個或兩個以上樣本通道相關聯。
16.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述盒包括位于所述陰極緩沖劑室和每一個樣本弓I入室之間的分子量截斷膜。
17.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，包括電極陣列和對電極陣列， 其中，所述電極陣列和對電解陣列中的每一個均保持在可移動臂上。
18.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，包括檢測器，用于檢測位于所述樣本引入室中的樣本的特征，其中，所述電泳控制器基于來自所述檢測器的反饋來暫停編程的序列的執行。
19.根據權利要求18所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述檢測器與所述凝膠管相關聯或者與樣本通道的所述樣本收集室相關聯。
20.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，包括自動液體處理臂，用于從一個或多個樣本收集室中回收分析物組分。
21.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，包括與一個或多個樣本收集室相關聯的管，用于從一個或多個樣本收集室回收分析物組分。
22.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，包括冷卻裝置，用于冷卻所述凝膠品.ο
23.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述凝膠盒包括可重復使用的一個或多個樣本收集室以及一個或多個樣本引入室。
24.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述凝膠盒包括可拋棄的一個或多個樣本收集室以及一個或多個樣本引入室。
25.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述凝膠盒包括可移除密封件。
26.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述凝膠盒是可重密封的。
27.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述管凝膠包括用凝膠填充的管狀元件。
28.根據權利要求27所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述凝膠是從由如下物質組成的組中選擇出的瓊脂糖、聚丙烯酰胺以及它們的復合混合物。
29.根據權利要求27所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述凝膠是從如下物質組成的組中選擇出的單一孔隙率凝膠、多孔隙率凝膠、單一 PH凝膠、多pH凝膠及其組合物。
30.根據權利要求27所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述凝膠還包括從如下物質組成的組中選擇的成分染料、熒光體、清潔劑、親和配合基及其組合物。
31.根據權利要求27所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述凝膠被化學地關聯到所述管狀元件的內壁。
32.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述陽極緩沖劑室和陰極緩沖劑室中的每一個均被從三羥甲基氨基甲烷、HCL、Tricine、醋酸鹽、HEPES, TBE、TAE和MOPS 中的一個或多個中選擇出的緩沖劑填充。
33.根據權利要求27所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述管狀元件的直徑是從 0. Imm到10MM，并且所述管狀元件是由從如下材料組成的組中選擇出的材料構建的玻璃、 塑料、石墨、陶瓷及其復合物。
34.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，固定體積樣本能夠被水平地載入所述樣本引入室中而不會存在稀釋、擴散或捕集氣泡。
35.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述凝膠盒包括可插入槽的銷以允許相鄰室對齊。
36.根據權利要求1所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，多個電源為多個通道供電，或單一電源。
37.一種電泳凹口過濾器裝置，包括a.凝膠盒，包括至少一個樣本通道，每一個樣本通道包括陰極緩沖劑室、樣本引入室、 包括與所述樣本引入室相關聯的第一端的管凝膠、與所述管凝膠的第二端相關聯的樣本收集室以及陽極緩沖劑室，其中所述陰極緩沖劑室、樣本引入室、凝膠管、樣本收集室以及陽極緩沖劑室能夠離子電接觸；b.電源，與每一個樣本通道的陰極緩沖劑室以及每一個樣本通道的陽極緩沖劑室可接合；c.檢測器，用于檢測所述凝膠盒樣本引入室中放置的樣本的特征；以及d.電泳控制器，用于執行用于至少一個樣本通道的序列，并且用于在所述檢測器檢測到所述樣本的特征時接收來自所述檢測器的反饋，其中，所述電泳控制器基于來自所述檢測器的反饋而暫停所述序列的執行。
38.根據權利要求37所述的電泳凹口過濾器裝置，其中，所述檢測器與所述凝膠管相關聯或者與樣本通道的所述樣本收集室相關聯。
39.一種用于從生物樣本中回收感興趣的分析物的方法，包括如下步驟形成凝膠盒，所述凝膠盒包括至少一個樣本通道，每一個樣本通道包括陰極緩沖劑室、 樣本引入室、包括與所述樣本引入室相關聯的第一端的管凝膠、與所述管凝膠的第二端相關聯的樣本收集室以及陽極緩沖劑室，其中所述陰極緩沖劑室、樣本引入室、凝膠管、樣本收集室以及陽極緩沖劑室能夠離子電接觸；將電極放入至少一個樣本通道的所述陰極緩沖劑室中的緩沖劑溶液中； 將對電極放入相同的至少一個樣本通道的所述陽極緩沖劑室中的緩沖劑溶液中； 將用于至少一個樣本通道的一個或多個步驟編程到處理器中，其中，編程包括編程在編程的步驟中穿過所述樣本通道施加的電流或電壓中的至少一個，并且編程穿過所述樣本通道施加所述電壓或電流的持續時間，其中編程的一個或多個步驟形成編程的序列；以及使得包括所述處理器的電泳控制器執行所述編程的序列。
40.根據權利要求39所述的方法，其中，用用于多個樣本通道中的每一個的序列編程所述處理器，并且其中所述電泳控制器同步地執行多個所述編程的序列。
41.根據權利要求40所述的方法，其中，多個所述編程的序列是從如下序列組成的組中選擇出的相同序列、不相同序列及其組合。
42.根據權利要求39所述的方法，其中，步驟的編程需要恒定電壓或電流設置以及電壓或電流持續時間設置這二者的編程。
43.根據權利要求39所述的方法，其中，所述裝置用于分離和提純剪切的DNA。
44.根據權利要求39所述的方法，其中，所述裝置用于分離和提純蛋白質、肽以及多肽。
45.根據權利要求39所述的方法，其中，所述裝置用于分離和提純RNA、siRNA和mRNA。
46.根據權利要求39所述的方法，其中，所述裝置用于分離和提純DNA和剪切的DNA。
47.根據權利要求39所述的方法，其中，所述裝置用于分離和提純蛋白質復合體。
48.根據權利要求39所述的方法，其中，所述裝置用于分離和提存來自免疫或共免疫沉淀物中的組分。
49.根據權利要求39所述的方法，其中，所述裝置用于分級血清、血漿、近端流體、尿液、唾液、脊髓液、組織、組織均勻漿、細胞裂解物、細菌、植物均勻漿以及制造過程反應組分及生成物。
全文摘要
一種電泳凹口過濾器裝置，包括凝膠盒，具有至少一個樣本通道；電極和對電極，每一個均與樣本通道相接合；用戶界面，用于將用于樣本通道的一個或多個步驟編程到處理器以形成編程的序列；以及電泳控制器，用于執行編程的序列。
文檔編號G01J3/18GK102439398SQ201080018845
公開日2012年5月2日 申請日期2010年4月27日 優先權日2009年4月27日
發明者H·李·馬丁, 彼得·奧蘇哈, 杰里米·諾里斯, 查爾斯·E·維特科夫斯基 申請人:蛋白質發現公司