用于分析的含細胞流體薄層的制備的制作方法

專利名稱：用于分析的含細胞流體薄層的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及制備流體薄層以供分析的設備和方法，且涉及分析這種薄層的系統和方法，特別地涉及用于自動分析盒中的樣品的方法和設備。本發明特定而言涉及制備細胞薄層(特別是諸如紅細胞這樣的細胞單層，例如不存在重疊的紅細胞)以供分析的設備和方法，且涉及分析這種細胞薄層或單層的系統和方法，特別地，涉及用于自動分析盒中的樣品的方法和設備。
背景技術：
可利用具體試劑對細胞染色且在顯微鏡中檢查細胞群來進行基于細胞的分析。對于基于成像的細胞診斷(例如使用顯微鏡，照相機和用于圖像分析和診斷的軟件應用)而言，重要的是形成分離細胞的單層以避免由于細胞重疊所致的錯誤解析。多年來，已知這樣一種方法，其涉及用手(涂片)在載玻片上刮出一定體積的相關流體(例如血液)。對于集成的閉合盒，不能使用這個過程。替代地可使用窄通道的毛細填充。從美國專利6，599，475-B1獲知來提供一種塑料光學器皿來形成紅細胞的薄單層以供顯微鏡分析。提供多個串聯起來且由分隔壁分開的隔室。這些壁分別僅允許紅細胞中的某些流動，以實現紅細胞稀釋，使得在這些隔室中的最后隔室中獲得所隔離的紅細胞的單層。為了實現在整個器皿上恒定的厚度，分隔壁具有焊接特征且透明蓋被焊接到頂部。隔室可具有600X600X3微米的尺寸。對于如分析血液樣品的瘧疾寄生物這樣的應用而言，需要分析大量血液以實現所需檢測限度。對于大約為紅細胞尺寸(5ym)的層厚度而言，這意味著需要檢查較大表面積 (平方厘米)。US6, 165，739-A1描述了一種用于激光細胞測量的載玻片或塑料載片，其具有多個毛細間隙腔室。流體樣品可從儲集器同時進入所有腔室。在每個腔室中提供不同反應物以使得能進行多個同時反應。

發明內容
本發明的目的在于，提供用于制備流體薄層以供分析的替代設備和方法，和/或提供用于分析這種薄層的系統和方法，特別地涉及自動分析盒中樣品的設備。本發明的一單獨目的在于，提供從具有細胞的流體來制備層以供分析的設備和方法，其中層具有諸如紅血胞這樣的細胞的單層，例如不具有重疊的細胞(諸如紅血胞)，且涉及分析這種細胞單層的系統和方法，特別地涉及自動分析盒中的樣品的方法和設備。根據第一方面，本發明提供
一種產生流體樣品薄層或者產生含細胞(特別是紅細胞)的流體層以供分析的設備， 每一層具有單層細胞(特別是紅細胞)，該設備具有分析腔室的二維陣列和進入通道的分支圖案，進入通道的分支圖案耦接到陣列中的分析腔室中的每一個以能并行填充這些分析腔室，分析腔室分別具有大致平面形狀，該平面形狀具有小于進入通道高度的高度以便產生流體樣品薄層或者產生含細胞(特別是紅細胞)的流體層，當腔室被填充流體樣品時，每一層具有細胞單層。通過提供分析腔室的二維陣列和并行地耦接腔室的進入通道的圖案，可在給定面積中提供各腔室之間更多的間隔件，從而可減小腔室高度變化，同時仍能快速地填充腔室。實施例可具有任何額外特征且某些這樣的額外特征在下文中更詳細地描述。根據本發明的設備優選地還包括在進入通道0 與分析腔室0 之間的額外區域(55)，其中此區域高度小于進入通道05)且大于分析腔室05)。在一更優選的實施例中，額外區域(55)的高度小于6微米。此額外區域(55)的優點在于，具有成熟寄生物的紅細胞將富集在此區。這將會防止白細胞集中在掃描區邊緣從而阻礙正確分析。腔室和/或通道可具有適合于由規定流體樣品(例如含細胞的流體，特別是血液) 進行毛細填充的尺寸。在本發明的實施例中，適合于毛細填充的尺寸可由用標準水溶液(諸如PBS或純水)進行的毛細填充來限定。這意味著適合于根據本發明進行毛細填充且能夠根據本發明進行毛細填充的通道例如在標準溫度和壓力下，使用PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)作為標準，或者可選地在標準溫度和壓力下例如利用純水通過毛細作用來填充。本發明的裝置優選地具有多個腔室，其與梳狀或分形(fractal)填充通道和通風通道的使用相結合。在一優選實施例中，總表面將為20mm2且視場為0. 2X0. 2=0. 04mm2，這表示500個反應腔室。用于本發明的實施例中任何實施例的腔室的數量可在1個腔室與 1000個腔室之間。優選地，分析腔室中每一個的總面積在IOOmm2與2000mm2之間和/或分析腔室的高度在1 μ m與10 μ m之間。該設備具有排出通道的圖案，其中一個或多個排出通道耦接到分析腔室中的每一個。進入通道和排出通道的圖案可分別包括梳狀圖案，梳狀圖案的指狀件相交叉，且分析腔室布置于梳狀圖案的相交叉的指狀件之間。本發明的另一方面為，在排出通道或通風口處或鄰近處引入流體擋止件。通過在通道壁中引入急劇的過渡部，諸如在所有方向改變通道寬度，液體與壁的接觸線被破壞，這是因為該角度不能突然變化。這導致在所謂的接觸線阻塞(pinning)之后的流體阻滯。彎月面在該表面處被凍結。如果通道為方形的且具有4個壁，那么加寬在相同點位在所有4個壁處進行，阻塞可為很穩定的。壁過渡部優選地增加角計數(angle count)，即，它們可優選地逐步擴展。對于如血液的流體，水蒸發可通過彎月面處液體的玻璃化而導致永久阻塞。該設備可具有適合于接收諸如含細胞的流體樣品(例如血液)這樣的流體樣品的單個樣品端口，樣品端口流體地連接到進入通道的分支圖案使得它們通過毛細作用而進行填充。進入管的優選最小高度為17微米，因為此將防止由較大白細胞、單核細胞所致的堵塞。包括進入通道但不包括排出通道的通道和/或腔室優選地具有親水性表面。這種親水性表面可具有制造它們的材料的性質或者可為通過其它手段引起的性質，例如，通過電暈放電，通過等離子體放電或者通過涂覆親水性涂層所引起的性質。通風通道優選地被布置為提供用于液體的流體擋止件，但允許氣體通過，例如，通過使它們具有疏水性表面或者在一個點位處改變通風通道的寬度以在寬度變化點位使液體阻塞。在腔室上方或下方表面中的至少一個優選地是透明的或光通透的(optically clear)使得允許光學檢查和測量。分析腔室的二維陣列和可選地耦接到陣列中的分析腔室以使得該分析腔室能被并行填充的進入通道的分支圖案優選地由聚合材料(特別是塑料材料)制成。在優選實施例中，分別具有大致平面形狀的分析腔室具有由其內已形成腔室的下部件和形成腔室頂部的覆蓋部件所限定的高度。覆蓋部件優選地比下部件柔性更強，使得例如通過膠合，焊接(特別是聲波焊接)、溶劑結合、熔化等將覆蓋部件附連到下部件并不改變尺寸，特別是不改變形成于下部件中的腔室底壁的平面度。個別分析腔室的大小可在0. 02mm2與500mm2之間。分析腔室的高度可在1 μ m與 ΙΟμπι之間。分析腔室的高度取決于待分析的細胞或寄生物。對于紅細胞，優選高度在2微米與4微米之間，且更優選地為3微米。更小的間隙高度將移除所有正常血細胞且得到純血漿。更大間隙高度將得到紅細胞與例如寄生物的混合物。進入通道和排出通道可具有10 μ m至200 μ m的深度和50至1000 μ m的寬度。本發明的另一方面提供一種制備流體樣品薄層或制備含細胞(特別是紅細胞)的流體層以供分析的方法，其中每一層具有細胞(特別是紅細胞)單層，該方法使用具有分析腔室的二維陣列和進入通道的分支圖案的設備，進入通道的分支圖案耦接到陣列中的分析腔室中的每一個以能并行填充分析腔室，分析腔室中的每一個具有大致平面形狀，該平面形狀具有小于進入通道高度的高度以便在腔室被填充流體樣品時產生含細胞(特別是紅細胞)的流體薄層或層，每一層具有細胞(特別是紅細胞)單層，該方法具有以下步驟提供流體樣品，以及將流體樣品供應到進入通道的圖案以使得流體樣品填充分析腔室。該填充優選地是通過毛細作用進行的。在本發明的實施例中，通過毛細作用進行的填充可由用標準水溶液，諸如PBS或可選地純水進行的毛細填充來限定。這表示根據本發明通過毛細作用的填充意味著例如在標準溫度和壓力下使用PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水)作為標準(或可選地純水)的毛細作用進行填充。PBS為包含氯化鈉、磷酸鈉和(在某些配方中)氯化鉀和磷酸鉀的鹽緩沖溶液。溶液的滲量(osmolarity)和離子濃度通常匹配人體的滲量和濃度。制作 PBS 的一種方式包括將 800g NaCl、20g KCl、144g Na2HPO4 · 12H20 和 Mg KH2PO4 溶解于8升蒸餾水中且加水直至10L。pH為大約6. 8，但當稀釋到IXPBS時，pH將變為7. 4。 在稀釋時，所得到的IXPBS將具有137mM NaCl，IOmM磷酸鹽，2. 7mM KCl的最終濃度且pH為 7.4。另一種制備由 Sambrook、Fritsch 和 Maniatis，(1989)在 Molecular Cloning 中描述 A Laboratory Manual，第二版，紐約冷泉港，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)，第 3卷，附錄B. 12 :將8g NaCl>0. 2g KCl、1. 44g Na2HPO4 · 12H20 和 0. 24g KH2PO4 溶解于 800ml 的蒸餾水中。利用 HCL 調整 pH 為 7. 4且添加H2O至1升。根據本發明的某些方法的毛細作用使用這樣的腔室和/或通道，即，該腔室和/或通道具有能例如在標準溫度和壓力下利用上文所述的PBS制備中的任一種或者可選地在標準溫度和壓力下利用純水來填充的尺寸。本發明的方法優選地使用大量腔室，其與梳狀或分形填充通道和通風通道的使用相結合。根據本發明的實施例的裝置可具有大量腔室。在一優選實施例中，總表面將為 20mm2且視場為0.2X0. 2=0.04 mm2，這意味著500個反應腔室。用于本發明的實施例中任何實施例的腔室數量可在100個腔室與1000個腔室之間。本發明的方法可結合具有排出通道圖案的設備使用，其中一個或多個排出通道耦接到分析腔室中的每一個。進入通道和排出通道的圖案可分別包括梳狀圖案，梳狀圖案的指狀件相交叉，且分析腔室布置于梳狀圖案的相交叉的指狀件之間。本發明的另一方面為在排出通道或通風口處或鄰近處對樣品流體進行流體阻止的方法步驟。通過在通道壁中引入急劇的過渡部以便在所有方向改變通道寬度，液體與壁的接觸線被破壞，這是因為該角度不能突然變化。這導致在所謂的接觸線阻塞之后的流體阻滯。彎月面在該表面處被凍結。 如果通道為方形的且具有4個壁，那么加寬在相同點位在所有4個壁處進行，阻塞可為很穩定的。壁過渡部優選地增加角計數，它們可優選地逐步擴展。對于如血液的流體，水蒸發可通過彎月面處液體的玻璃化而導致永久阻塞。本發明的另一方面提供一種制造這種設備的相對應方法。本發明的另一方面提供一種分析系統，包括光學檢測器，其用于分析流體樣品薄層或者分析含細胞(特別是紅細胞)的流體層，每一層具有細胞單層；和用于產生流體樣品薄層或者產生含細胞(特別是紅細胞)的流體層的設備，每一層具有細胞單層，該設備具有分析腔室的二維陣列和進入通道的分支圖案，進入通道的分支圖案耦接到該陣列中的分析腔室中的每一個以能并行填充分析腔室，分析腔室分別具有大致平面形狀，該平面形狀具有小于進入通道高度的高度以便當腔室被填充流體樣品時產生含細胞(特別是紅細胞)的流體薄層或層，每一層具有細胞單層。本發明的另一方面提供一種分析流體樣品薄層或分析含細胞(特別是紅細胞)的流體層的方法，每一層具有細胞單層，使用具有分析腔室的二維陣列和進入通道的分支圖案的設備來制備，進入通道的分支圖案耦接到陣列中的分析腔室中的每一個以使得能并行填充分析腔室，分析腔室分別具有大致平面形狀，該平面形狀具有小于進入通道高度的高度以便當腔室被填充流體樣品時產生含細胞(特別是紅細胞)的流體的薄層或層，每一層具有細胞單層，該方法具有以下步驟提供光學檢測器，且在分析腔室中使用光學檢測器來分析含細胞(特別是紅細胞)的流體的薄層或層，每一層具有細胞單層。額外特征中的任何特征可組合在一起，且與這些方面中的任何方面組合。其它優點，特別是優于現有技術的優點對于本領域技術人員將是顯然的。舉例而言，本發明并不使用單個腔室，而是使用并行地耦接的腔室陣列。該陣列可為二維陣列，因此允許緊湊設計。 腔室的二維陣列流體地耦接以能使它們被并行地填充。特別地，本發明的裝置具有多個分析腔室，腔室具有小于(例如顯著地小于)進入通道高度的高度。在不偏離本發明的權利要求的情況下可做出許多變型和修改。因此，應清楚地理解到，本發明的形式只是說明性的且并不旨在限制本發明的范圍。


現將參看附圖以舉例說明的方式來描述如何來實行本發明，在附圖中 圖1是盒的部分的平面圖，示出分析區的陣列和重復的相交叉的通道結構。圖2是盒的截面圖。圖3是根據本發明的一實施例的分析區與通風通道之間過渡部的透視放大圖。圖4示出包括盒的分析系統的示意圖。圖5示出根據本發明的盒的部分的平面圖，其示出包括額外分析區以用于被成熟寄生物所感染的紅細胞。圖6是根據圖5的盒的截面圖。
具體實施例方式現將針對特定實施例且參看特定附圖來描述本發明，但本發明并不限于此而是僅受權利要求限制。所描述的附圖只是示意性的而不是限制性的。在附圖中，出于說明目的， 某些元件的大小可被夸大且并未按照比例繪制。在本說明書和權利要求中使用術語“包括”，其并不排除其它元件或步驟。當提及單數名詞時使用不定冠詞或定冠詞，例如“一”，或 “該”時，其也包括這些名詞的復數，除非具體地規定為其它情況。在權利要求中所用的術語“包括”不應被理解為限于后面所列出的器件；其并不排除其它元件或步驟。因此，表達“包括器件A與B的裝置”的范圍應不限于僅由構件A與B 組成的裝置。對于本發明這意味著，裝置的僅相關構件是A與B。而且在說明書和權利要求中的術語第一、第二、第三和類似用語用于區分類似元件且未必描述順序或時間次序。應了解如此使用的術語可在適當情況下互換且本文所描述的本發明的實施例能夠以本文所描述或圖示的順序之外的其它順序來操作。此外，在說明書和權利要求中使用術語頂部、底部、上、下和類似術語是出于描述目的且未必描述相對位置。應了解如此使用的術語可在適當情況下互換且本文所描述的本發明的實施例能以本文所描述或圖示方位之外的其它方位來操作。本發明涉及用于對例如盒中的樣品進行自動分析的設備和方法。為了對盒中的樣品進行自動分析，對流體樣品的層厚度進行準確控制可為重要的。這些實施例中的至少某些涉及薄細胞涂片制備和由塑料制成的新盒的設計。細胞涂片制備優選地表示形成含細胞 (特別是紅細胞)的流體層，每一層具有單層細胞。細胞優選地為非重疊的。細胞優選地為紅細胞。其可有利地用于分析系統以進行血液引發的疾病(諸如寄生物)的醫療診斷，瘧疾顯微鏡檢查診斷為其一實例。由于紅細胞并不包含DNA，在血液中外來細胞的存在可由任何方法來確定，例如由任何光學方法來確定，例如，驗證DNA存在的任何染色方法。舉例而言，本發明的一優點可為，對于給定性能而言具有更低的成本和/或更快操作和/或提供更大面積用于分析。低成本構件(諸如由模制塑料制成的構件)通常缺少在較大面積上實現恒定的通道高度所需的平面度。如將在下文中更詳細地描述，可用塑料以低成本制成微結構，該微結構可提供微米范疇內的更精確的層厚度，且很少受使用者影響。在本發明的某些實施例中， 形成具有窄間隙的區陣列，其由具有較大間隙的通道連接。在某些情況下，可根據圖像分析要求來調整面積大小和縱橫比。個別面積顯著小于待分析的總面積。以此方式能快速且良好地控制細胞單層的生成。將以介紹實施例的方式來簡要描述由本發明的某些實施例所解決的某些問題或缺點
為了生成血液的薄涂片(例如，細胞單層，特別是紅細胞單層，特別是非重疊紅細胞層)，需要在較大表面積上鋪展樣品。但在此情形下，設計閉合盒而且是塑料盒(以保持成本較低)帶來不同的技術挑戰。盒可為一次性盒。盒為可裝配到測量設備內(例如通過狹縫接合到測量設備內)以允許分析盒的內含物的裝置。舉例而言，由小間隙(在盒中底部至頂部的距離，大約為涂片的薄高度)帶來的流動阻力使得更難利用流體樣品在大面積上迅速填充分析區。而且，當在大表面積上在塑料中制造這種薄間隙時，可存在較大過程變化，造成間隙大小變化，這將在下文中更詳細地解釋。·由通道內流體的流動阻力來限制具有窄間隙的大面積的毛細填充(
權利要求
1.一種用于產生含細胞的流體層的設備，每一流體層具有單層細胞以供分析，所述設備具有分析腔室(45)的二維陣列和耦接到所述陣列中的分析腔室中的每一個以能并行填充所述分析腔室的進入通道(25)的分支圖案，所述分析腔室分別具有大致平面形狀，該平面形狀具有小于進入通道高度的高度以便當所述腔室被填充流體樣品時產生含細胞的流體層，每一流體層具有單層細胞。
2.根據權利要求1所述的設備，還包括在所述進入通道(25)與分析腔室(45)之間的額外區域(55)，其中此區域高度小于所述進入通道(25)且大于所述分析腔室(45)。
3.根據權利要求2所述的設備，其中所述額外區域(55)的高度小于6微米。
4.根據權利要求1或2所述的設備，具有耦接到分析腔室陣列的排出通道(35)的圖案。
5.根據權利要求3所述的設備，還包括液體擋止件，其阻止液體通過所述排出通道流動但允許氣體通過。
6.根據權利要求3或4所述的設備，所述引入通道和排出通道的圖案分別包括梳狀圖案，所述梳狀圖案的指狀件相交叉，且所述分析腔室布置于所述梳狀圖案的相交叉的指狀件之間。
7.根據前述權利要求中任一項所述的設備，所述分析腔室中每一個的總面積在IOOmm2 與2000mm2之間，和/或所述分析腔室的高度在1 μ m與10 μ m之間。
8.根據前述權利要求中任一項所述的設備，所述進入通道具有10μ m至200 μ m的深度和50μπι至1000 μ m的寬度。
9.一種用于制備含細胞的流體層以供分析的方法，每一流體層具有單層細胞，該方法使用具有分析腔室(45)的二維陣列和進入通道(25)的分支圖案的設備，所述進入通道 (25)的分支圖案耦接到所述陣列中的所述分析腔室中的每一個以能并行填充所述分析腔室，所述分析腔室分別具有大致平面形狀，該平面形狀具有小于進入通道高度的高度以便當所述腔室被填充流體樣品時產生含細胞的流體層，每一流體層具有單層細胞，所述方法具有以下步驟提供所述流體樣品，以及將所述流體樣品供應到所述進入通道的圖案以使得所述流體樣品填充所述分析腔室。
10.一種用于產生含細胞的流體層以供分析的設備的制造方法，每一流體層具有單層細胞，所述方法具有以下步驟形成分析腔室(45)的二維陣列；和形成耦接到所述陣列中的所述分析腔室中的每一個以能并行填充所述分析腔室的進入通道(25)的分支圖案，所述分析腔室被形成為具有大致平面形狀，該平面形狀具有小于所述進入通道高度的高度。
11.一種分析系統，其包括用于分析含細胞的流體層的光學檢測器(10，100，40)， 每一流體層具有單層細胞；和用于產生含細胞的流體層的設備(110)，每一流體層具有單層細胞，所述設備具有分析腔室(45)的二維陣列和進入通道(25)的分支圖案，所述進入通道的分支圖案耦接到所述陣列中的分析腔室中的每一個以使得能并行填充所述分析腔室， 所述分析腔室分別具有大致平面形狀，該平面形狀具有小于進入通道高度的高度以便當所述腔室被填充流體樣品時產生含細胞的流體層，每一流體層具有單層細胞。
12.根據權利要求11所述的系統，具有耦接到所述分析腔室的陣列的排出通道(35)的圖案。
13.根據權利要求12所述的系統，所述進入通道和排出通道的圖案各包括梳狀圖案，所述梳狀圖案的指狀件相交叉，且所述分析腔室布置于所述梳狀圖案的相交叉的指狀件之間。
14.根據前述權利要求10至12中任一項所述的系統，其中所述分析腔室中每一個的面積在0. 02mm2與Imm2之間，和/或所述分析腔室的高度在1 μ m與10 μ m之間，和/或所述進入通道具有10 μ m至200 μ m的深度和50 μ m至1000 μ m的寬度。
15.一種分析含細胞的流體層的方法，每一流體層具有單層細胞，使用具有分析腔室 (45)的二維陣列和進入通道(25)的分支圖案的設備來制備該流體層，所述進入通道的分支圖案耦接到所述陣列中的分析腔室中的每一個以能并行填充所述分析腔室，所述分析腔室分別具有大致平面形狀，該平面形狀具有小于進入通道高度的高度以便當所述腔室被填充流體樣品時產生含細胞的流體層，每一流體層具有單層細胞，所述方法具有以下步驟提供光學檢測器(10，100, 40)，且在所述分析腔室中使用所述光學檢測器來分析所述含細胞的流體層，每一流體層具有細胞單層。
全文摘要
一種用于產生流體樣品薄層以供分析的設備，該設備具有分析腔室(45)的二維陣列和耦接到該陣列以能并行填充分析腔室的進入通道(25)的分支圖案。分析腔室為平面的，且具有小于進入通道高度的高度以便在填充流體樣品時產生薄層。該陣列能在給定面積中在各腔室之間具有更多間隔件，從而可減小腔室高度變化，同時仍能快速地填充腔室。分析腔室可適合于由諸如血液的規定流體樣品進行毛細填充。排出通道(35)的圖案可耦接到該陣列。進入通道和排出通道可形成梳狀圖案，梳狀圖案的指狀件相交叉，且該分析腔室布置于梳狀圖案的相交叉的指狀件之間。
文檔編號G01N33/487GK102387864SQ201080016081
公開日2012年3月21日 申請日期2010年4月9日 優先權日2009年4月9日
發明者彼得斯 E., G. J. 坎普斯 I., 勞布舍爾 M., P. 威拉德 N., 皮邱 O., 維姆伯格-弗里德爾 R. 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司