專利名稱：用于甘油三酯合成途徑的基于細胞的測定的制作方法
技術領域：
提供了一種同時檢測用穩定同位素標記的脂肪酸孵育的細胞中脂類和磷脂酸酯中間體的方法。該方法可用于以高通量形式篩選調節甘油三酯生物合成的化合物。相關技術說明甘油三酯或三酰甘油是真核生物主要的轉運源和能量貯存。甘油三酯從一個甘油分子和三個脂肪酸分子合成而來。每個脂肪酸分子通過酯鍵連接到甘油分子三個羥基中的每一個。像很多中性脂類一樣，甘油三酯含有各種鏈長的脂肪酸分子，通常長度為16、18或 20個碳。甘油三酯的兩種主要生物合成途徑是甘油-3-磷酸途徑(主要存在于肝臟和脂肪組織中)和單酰甘油途徑(主要存在于腸中)。肝臟中產生超過90%的甘油三酯的甘油-3-磷酸途徑如下所示
CH2OHCH2OOCRCH2OOCR
^HOH _Ι3^Τ ^ 0HOH _AGPAT , 0HOOCR. ιFA-CoAιFA-CoA_
CH2OPO3HCH2OPO3HCH2OPO3H
甘油-3-騎酸溶血磷脂酸4脂酸
PAPCH2OOCR 0HOOCR· CH2OH 二酰甘油
DGAT FA-CoA
ir
CH2OOCR CHOOCR' CH2OOCR" 三酰甘油其中FA-CoA是脂肪酸輔酶A，GPAT是甘油_3_磷酸酰基轉移酶，AGPAT是1_酰基甘油-3-磷酸-O-酰基轉移酶，PAP是磷脂酸磷酸酶，DGAT是酰基輔酶A: 二酰基甘油酰基轉移酶。甘油-3-磷酸的生物合成途徑的最后步驟可由DGATl或DGAT2催化(Cases等 1998，Proc Natl Acad Sci USA 95 13018 ;Cases 等 2001 J Biol Chem 276:38870)。雖然DGATl和DGAT2兩者均能將甘油二酯轉化成甘油三酯，但它們在核苷酸或氨基酸序列方面沒有相似性。已有報道指出缺少DGATl的敲除小鼠(Dgatl+)肝臟沒有顯示明顯的甘油三酯代謝變化(Smith等2000，Nat Genet 25 :87)。此夕卜，缺少DGAT2 (Dgat2+)的敲除小鼠肝臟顯示甘油三酯的含量嚴重減少(Stone等2004，J Biol Chem 279:11767)。而且，研究
3已表明用反義寡核苷酸抑制DGAT2降低嚙齒類的肝臟甘油三酯含量(Choi等2007，J Biol Chem 沘2 :2洸78 ;Liu 等 2008，Biochim Biophy Acta 1781 :97)，并且逆轉大鼠中飲食誘導的肝臟脂肪變性和胰島素抗性(Choi等2007，J Biol Chem 282 :22678) 0這些研究表明 DGATl和DGAT2在甘油三酯生物合成中功能不同。因此，特異性靶向DGATl或DGAT2可在有限毒性下提供調節甘油三酯益處。甘油三酯代謝的紊亂或失調與肥胖癥、代謝綜合征、II型糖尿病、非酒精性脂肪肝病和冠心病的發病機理及增加的風險相關(Lewis等2002，Endocrine Reviews 23 :201 ； Malloy and Kane 2001,Adv Intern Med 47 :111)。因此，在甘油三酯生物合成途徑中調節酶活性的化合物，包括DGATl和DGAT2，可用作針對代謝疾病的潛在治療靶標。放射性底物和薄層層析法已廣泛應用于監測甘油三酯合成(Stone等2004，J Biol Chem 279 :11767 ；Zhu 等 2002，Atherosclerosis 164 :221)。Stone 等在原代肝細胞中用 3H-甘油標記甘油三酯，并用薄層層析法和放射成像分析檢測放射性同位素標記的甘油三酯(Stone等2004，J Biol Chem 279 :11767)。同樣地，Zhu等在人肝癌細胞中用3H-油酸標記甘油三酯，并用薄層層析法檢測標記的甘油三酯(Zhu等2002，AtherOSClerOSiS 164 221)。最近，Magkos等用質譜技術檢測中性脂類(Magkos等2007，J Lipid Research 48 :1204)。Magkos等在體內給予1，1，2，3，3- -甘油和2，2- -棕櫚酸酯，并通過氯仿/ 甲醇和超速離心從血漿中提取極低密度脂蛋白甘油三脂。Magkos等用氣相層析-質譜系統檢測從甘油三酯釋放的標記的甘油和甲基化棕櫚酸酯(Magkos等2007，J Lipid Research 48 :1204)。Magkos等未檢測完整的甘油三酯(如特定的甘油三酯分子)，也未檢測甘油三酯途徑中的不同中間體。據申請人所知，現有測定法不監測或檢測在甘油三酯生物合成期間生成的包括溶血磷脂酸、磷脂酸和二酰基甘油在內的中間體。此外，現有測定法需要額外的提取程序以及繁瑣的檢測技術。另外，這些方法的通量有限并難以適用于篩選大量化合物的高通量形式。 因此，仍需要開發一種以高通量形式分析甘油三酯生物合成和鑒定調節甘油三酯途徑的化合物的方法。發明概述本申請的一個目標是提供一種用于鑒定抑制酰基輔酶A 二酰基甘油酰基轉移酶 (DGAT)活性的化合物的方法。該方法包括如下步驟在化合物存在或不存在情況下，使穩定同位素標記的脂肪酸與細胞接觸，用異丙醇提取細胞，在化合物存在的情況下測定穩定同位素標記的甘油三酯的水平，以及在化合物不存在的情況下測定穩定同位素標記的甘油三酯的水平；其中所述穩定同位素標記的甘油三酯的水平變化表明所述化合物抑制DGAT 活性。本申請的另一個目標是提供一種測定參與甘油三酯合成的酶活性的方法。該方法包括如下步驟使穩定同位素標記的脂肪酸分子與細胞接觸，用異丙醇提取細胞，并檢測穩定同位素標記的溶血磷脂酸、磷脂酸、二酰甘油或甘油三酯的存在情況。依據本申請，穩定同位素標記的脂肪酸可為13C18-油酸。此外，依據本申請，穩定同位素標記的甘油三酯可通過液相層析-質譜分光光度計系統檢測。根據下文詳述并結合附圖，本發明的其他目標和特征將顯而易見。然而，應理解的是，附圖的設計僅為說明的目的而非作為限定限制本發明，為此，應參考所附權利要求。還應理解的是，附圖不一定是按比例繪制的，除非另有說明，附圖僅意在概念上說明本文描述的結構和步驟。附圖簡述
圖1具有3個油酰基-13C18側鏈的13C標記的三油酸甘油酯的提取的離子層析圖， 顯示在0分鐘(A)、30分鐘⑶、60分鐘(C)、120分鐘⑶和180分鐘(E)時FU5AH細胞中游離的13C18-油酸全部摻入甘油三酯。圖2使用LC-MS陽離子和陰離子切換同時監測三油酸甘油酯合成的中間體和最終產物㈧油酰基溶血磷脂酸酯、⑶單-油酰基甘油、(C) 二油酰基磷脂酸酯、⑶二油酰基甘油和(E)三油酰基甘油。圖3 DGATl和DGAT2抑制劑對HUH7肝細胞中新合成的具有三個油酰基-13C18鏈的三油酸甘油酯的作用的評價。圖4 DGATl抑制劑對3T3-L1分化的脂肪細胞中新合成的具有三個油酰基」％8鏈的三油酸甘油酯的作用的評價。圖5 HUH7肝細胞中DGATl抑制時具有2個油酰基-13C18鏈的甘油二酯的瞬時增加。圖6 DGAT2抑制劑對MCF7細胞中新合成的具有三個油酰基」％8鏈的三油酸甘油酯的作用的評價。圖7在與油-1Vw酸培養60分鐘后的FU5AH細胞中，同時檢測具有1、2和3個油酰基-13Cw側鏈的三油酸甘油酯㈧在m/z 903.0檢測內源性三油酸甘油酯，⑶在m/z 921. 0檢測13C18-三油酸甘油酯，(C)在m/z 939. 0檢測13C36-三油酸甘油酯和(D)在m/z 957. 0檢測13C54-三油酸甘油酯。圖8在用或不用13C18-油酸孵育120分鐘的THP-I單核細胞中，同時檢測具有1、 2和3個油酰基-13C18側鏈的三油酸甘油酯㈧13C18-油酸不存在下，在m/z 921. 0未檢測到13C18-三油酸甘油酯、⑶13C18-油酸存在下，觀察到13C18-三油酸甘油酯、(C)13C18-油酸不存在下，在m/z 939. 0未檢測到"C36-油酸、(D) 13C18-油酸存在下，觀察到13C36-三油酸甘油酯、(E) 13C18-油酸不存在下，在m/z 957. 0未檢測到13C54-三油酸甘油酯和(F) 13C18-油酸存在下，觀察到"C54-三油酸甘油酯。優選實施方案詳述本申請提供了一種克服用于分析甘油三酯合成的現有測定法限制的方法。本文所描述的方法在反應混合物中使用穩定同位素標記的脂肪酸，使得反應混合物包含細胞、生長培養基和穩定同位素標記的脂肪酸。本文所描述的方法還可用于篩選調節參與甘油三酯合成的酶的化合物。為篩選目的，反應混合物還可以包括參與甘油三酯的酶的調節劑，如甘油-3-磷酸途徑中的DGAT。任何原核和真核細胞可用于本發明。優選為脂肪細胞、肝癌細胞、癌細胞或白血病細胞，例如 3T3-L1、HUH7、FU5AH、THP-U H印G2、C3HT101/2、McA_RH7777、MCF7、A549 和 RA擬64. 7。細胞可通過市售來源獲得或通過公知方法分離。例如，分離肝細胞的方法可參見 Berry 和 Friend，1969，J Cell Biol 43 :506，分離脂肪細胞的方法可參見 Green 等 1990， J Biol Chem 265 :5206。白細胞可分離自取自個體的生物樣品，例如任何體液或組織樣品。任何體液包括但不限于血清、血漿、淋巴、囊液(cystic fluid)、尿、糞便、腦脊液(csf)和腹水。合適的組織樣品包括全血、精液、唾液、眼淚、尿、糞便材料、汗液、頰膜涂片、皮膚、特定器官組織例如肌肉或神經組織的活檢和毛發。生物樣品中甘油-3-磷酸途徑活性的分析可用作監測患者對用于代謝疾病藥物治療的應答的生物標記物。可將細胞保持于常規的生長培養基，如Dulbecco改進的fegle培養基、極限必需培養基、RPMI等。有些細胞可在分析之前被誘導或分化。本領域技術人員會意識到需要合適的培養基和條件來保持和/或誘導特定細胞系。例如3T3-L1前脂肪細胞可保持在Dulbecco 改進的fegle培養基，并在誘導培養基的誘導下變成成熟的脂肪細胞。用穩定同位素標記的任何脂肪酸分子可用于本文所描述的方法。本文所用術語 “穩定同位素”通常意指不具放射性的同位素分子，包括1V或咕。穩定同位素標記的脂肪酸可自制合成或通過市售獲得。優選的脂肪酸分子包含Cltl-C2tl的鏈長度，例如單去飽和C16 和ci8。脂肪酸分子可通過1V或2H —致或部分標記；例如，一致標記的13c-14:0、"c-16:1、 13C-16 0、13C-18 2、13C-18 1 和 13C-18 0、2H29_16 1、2H31_16 0、2H33_18 U2H35-18 0 或質量漂移(mass shift)至少4amu的部分標記的2H。在一個實施方案中，標記的分子為13C18-油酸。穩定同位素標記的脂肪酸可摻入生成新合成中間體或穩定同位素標記產物的途徑的每 “■步 ο反應混合物還可以包括多種其他試劑。這些試劑包括可用來促進酶活性的如鹽、 緩沖劑、中性蛋白(例如白蛋白)、去污劑等試劑。這類試劑也可降低反應組分的非特異性或背景相互作用。也可用其他提高測定效率的試劑如抑制劑、抗微生物劑等。在用于分析甘油三酯生物合成的方法開始之前，通過用活性炭-處理的血清或無血清培養基培養細胞適當的時間，耗盡內源性脂肪酸。接著，將穩定同位素標記的脂肪酸例如"C18-油酸加入反應物中。然后用磷酸緩沖鹽水洗滌細胞并用異丙醇提取脂類分子。還可用其他溶劑系統包括己烷、氯仿、庚烷、丙酮、二甲基亞砜和丁醇提取脂類分子。可通過任何適用于檢測同位素存在情況或測定同位素分子分子量的方法來檢測新合成的標記的脂類中間體或產物。例如，可用薄層層析和質譜。在一個實施方案中，液相層析-質譜(LC-MQ系統用來檢測和定量含有穩定同位素標記的酰基鏈的新合成脂類分子。此外，可同時檢測多種標記的脂類分子。在一個實施方案中，修改質譜系統用于同時分析多種中性脂類，包括甘油-3-磷酸途徑中的單、二和三-酰甘油和磷脂酸酯中間體。修改包括在質譜系統中無需柱前衍生化以正負切換電噴霧離子化的運行。同時檢測多種脂類也可在一次分析運行中完成。—旦檢測到標記的脂類分子，可通過標準化濃度方法測定它們的近似水平。作為實例，標準化濃度通過1，3_ 二棕櫚酰-2-硬脂酰-甘油-d5(PSP_d5)內標準確定。獲得樣品中三油酸甘油酯或新合成的脂類分子對內標準的相對響應并用于定量。本文發現約 μΜ 的PSP-d5異丙醇溶液可直接用于提取脂類分子。此外，m/z 858. 0的PSP_d5銨加合離子可用于離子提取和整合(integration)。本領域技術人員可通過其他常用的方法確定所檢測分子的特定水平。為評價一種化合物是否能夠調節甘油三酯合成，將該化合物加入到含穩定同位素標記的脂肪酸、生長培養基和細胞的反應化合物中。將反應物孵育適當的時間，例如約10 分鐘至約24小時。用異丙醇從反應物提取脂類分子并用LC-MS系統分析。當含有化合物的反應中標記的甘油三酯水平與不含化合物的反應中標記的甘油三酯水平有顯著差異時， 該化合物可能調節參與甘油三酯合成的酶。本文所用術語“顯著差異”意指該差異使本領域技術人員認為甘油三酯合成被調節。標記甘油三酯水平的差異可為至少10%，優選至少 25%。盡管化合物通常為有機化合物，但化合物涵蓋眾多化學種類。此外，化合物包含與多肽結構上相互作用所需的化學官能團，且通常包括至少胺基、羰基、羥基或羧基，優選至少兩種化學官能團，且更優選至少三種化學官能團。化合物可包含由一個或多個上述官能團取代的碳環結構或雜環結構和/或芳族結構或多芳族結構。化合物也可為生物分子例如肽、糖類、脂肪酸、固醇、類異戊二烯、嘌呤、嘧啶、上述物質的衍生物或結構類似物、或其組合等。當化合物為核酸時，盡管還考慮具有非天然鍵或亞基的經修飾的核酸，但化合物通常為DNA或RNA分子。化合物可獲自多種來源，包括合成或天然化合物文庫。例如可用眾多手段隨機和直接合成多種有機化合物和生物分子，包括隨機化寡核苷酸的表達、合成的有機組合文庫、隨機肽的噬菌體展示文庫等。也可使用本領域已知的組合文庫法中眾多手段中的任一種獲得化合物，包括生物文庫、空間可尋址的平行固相或溶液相文庫、需要去褶合 (deconvolution)的合成文庫法、“一珠一化合物”文庫法以及用親和層析選擇的合成文庫法(Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12 :145)。或者，也可獲得或容易產生細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫。此外，可通過常規化學的、物理的和生化手段容易地修飾天然和合成產生的文庫和化合物。此外，已知的藥理學藥劑可經過定向或隨機的化學修飾如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，從而產生這些藥劑的結構類似物。化合物可隨機選擇或可基于結合到和/或調節 DGAT活性的現有化合物選擇。因此，候選藥劑的來源為基于已知DGAT調節劑的分子文庫， 其中在分子的一個或多個位置將化合物結構改變為包含更多或更少化學部分或不同化學部分。在創建類似物激活劑/抑制劑文庫中對分子所作的結構改變可定向、隨機或定向與隨機兩者結合的取代和/或添加。本領域普通技術人員在制備組合文庫中能容易地制備基于現有DGAT調節劑的這樣的文庫。本文所用術語“調節劑”、“調節”等意指增加或降低酶活性的化合物。當在化合物存在下，酶活性降低時，該化合物被稱為抑制劑。當在化合物存在下，酶活性升高時，該化合物被稱為激活劑。作為實例，使用本文所述方法評價DGAT調節劑化合物1和2對甘油三酯合成的作用。W02008148868和W02004069809公開了化合物1和2，均通過引用以其整體結合到本文中。化合物1即DGAT 1抑制劑是N-[2，6-二氯-4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基]-4-{[(4-甲氧基苯基)乙酰基]氨基}苯基)哌嗪-1-甲酰氨。化合物1分子量為596. 55且結構為
化合物2即DGAT 2抑制劑是1_[環己基(3，4_ 二氯苯基)甲基]_2_硫代_2， 3- 二氫-IH-咪唑_4，5- 二甲酸二甲酯。化合物2分子量為457. 38且結構為當LC-MS系統用于檢測標記的甘油三酯分子時，需要合適的溶液用于從反應混合物中提取脂類分子。一些有機溶劑例如己烷、氯仿/甲醇、DMSO等可能與反相LC-MS檢測系統不相容。因此，當己烷、氯仿/甲醇、DMSO等用于提取時，需要額外的步驟來去除有機溶劑，并在用LC-MS系統檢測之前，用相容的溶劑系統重構提取的反應混合物。本文發現異丙醇的使用是與LC-MS系統相容的；因此它不需要額外的步驟便可用于提取和遞送脂類分子。一步提取提高了效率而且使高通量形式得以實現，這是用于篩選大量化合物和鑒定調節甘油三酯合成的化合物所需要的。術語“高通量”意指能同時簡易篩選多個樣品并具有機器操作能力的測定設計。高通量測定的另一個所需特征是經過優化以降低試劑使用或使操作數最少從而實現所需分析的測定設計。測定形式的實例包括96-孔板或384-孔板、漂浮小滴和用于液態處理實驗的〃芯片實驗室(lab on a chip)"微通道芯片。本領域熟知的是，隨著塑料模具的微型化和液態處理設備的改進，或隨著設計的測定設備的改進，可使用本發明的設計處理更大量的樣品。在一個實施方案中，將細胞在含有多個孔的微量滴定板(例如96-孔板或384-孔板)中培養并分析。將板裝入檢測系統例如LC-MS等，該系統讀取每個板的每個孔的反應從而生成數值數據。本文所描述的方法也可用于評價參與甘油三酯合成的酶的細胞活性， 包括DGAT、GPAT、AGPAT和PAP。該方法也可用于以高通量形式篩選甘油三酯生物合成中調節酶活性的化合物。此外，本申請的方法可用作確定人受試者分離的細胞中甘油三酯合成的代謝活性的診斷性測定。實施例1.細胞系制備將3T3-L1小鼠前脂肪細胞保持在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改進的 fegle培養基(DMEM)中。將細胞接種在96-孔板中。匯合后兩天，將培養基更換為含有 IBMX、胰島素和地塞米松的誘導培養基(Adipolysis kit,Cayman Chemical Company)。誘導三天之后，培養基更換為姨島素培養基(Adipolysis kit, Cayman Chemical Company)。 誘導5天后，培養基用新鮮的胰島素培養基替換兩天。將人肝癌細胞系HUH7保持在含有 10% FBS,4. 5g/L D-葡萄糖的DMEM中。大鼠肝癌細胞系FU5AH保持在含5% FBS的極限必需培養基fegle(MEM)中。將肝癌細胞鋪到96孔板并在80%匯合時使用。將人乳腺癌細胞系MCF7細胞保持在含有10%FBS、4. 5g/L D-葡萄糖的DMEM中。將人單核細胞白血病細胞系THP-I保持在含10% FBS的RPMI培養基中并以切IO5細胞/ml使用。實施例2.穩定同位素標記甘油三酯合成途徑
在5% (X)2和37°C條件下用含10%活性炭處理的FBS(Gibco)的DMEM過夜孵育 HUH7細胞或分化的3T3-L1細胞。在5% (X)2和37°C條件下用含5%活性炭處理的FBS的 MEM過夜孵育FU5AH細胞。在5% CO2和37°C條件下，將與0. 5%無脂肪酸的BSA(SIGMA)預混合(precomplex)的約 100 μ 1 300 μ M13C18-油酸(SIGMA)加入細胞懸液中 0、30、60、120 和180分鐘。然后將細胞用磷酸緩沖鹽水洗滌一次并用100 μ 1異丙醇提取。在室溫下孵育10分鐘后，將提取物轉移到小玻璃瓶并用LC-MS系統檢測標記的脂類分子。LC-MS 檢測通過 Z-噴霧電噴射離子源(ESI)用 Micromass triple-quadrupole Quattro Micro 質譜分光光度計(Waters，Milford，MA)接口連接的 Agilent 1100 Liquid Chromatographic system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)。代謝產物的分離在 Eclipse XDB-C5柱(2. Ix 50mm，粒度=3. 5um)上進行。流動相Α、含50mM甲酸銨的異丙醇-水(3 7)，和流動相B、含IOmM甲酸銨的異丙醇-水(9 1)用于如下的梯度洗脫 20-100%流動相B lmin，保持100%流動相B 4min，返回到20%流動相B 0. lmin，然后運行時間后4. 5min。流速為0. 5ml/min。以0. 25ml/min的流速用1 2裂縫(split)將所得 LC洗脫液引入到質譜儀。質譜儀以陽離子和陰離子切換模式運行。氮氣用作噴霧氣體、去溶劑化氣體和錐孔簾氣(cone curtain gas)。MS系統的源參數為毛細管電壓，3. IkV ；錐孔電壓，20V (ESI+)和15V (ESF)；提取錐孔電壓(extractor)，2V ；RF透鏡電壓，0. IV ；源溫度， 1200C ；去溶劑化溫度，300°C ；LM1、HM1、LM2或HM2分辨率15;離子能1、1.0;入口和出口 ； 15。MassLynx軟件4. 1版本用于系統控制和數據處理。在FU5AH細胞中，13C18-油酸摻入到甘油_3_磷酸途徑通過13C18-三油酸甘油酯的存在情況來確定(圖1)。通過比較在30分鐘、60分鐘、120分鐘和180分鐘時曲線下面積，13C18-三油酸甘油酯的水平隨著孵育時間增加(圖1)。此外，本文新開發了一種使用陽離子和陰離子切換用于同時檢測油酰基溶血磷脂酸酯、2-單-油酰基甘油、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酸酯、1，2- 二油酰基-sn-甘油中間體以及三油酰基-sn-甘油最終產物的LC-MS法(圖2)。這表明穩定同位素標記結合LC-MS系統檢測可用于同時檢測細胞中甘油三酯生物合成的多個步驟。實施例3.評價調節DGAT活性的化合物為評價調節DGATl或DGAT2活性的化合物，在37°C下將HUH7或3T3-L1細胞在 100μ 1含0. 05% DMSO的無血清培養基中用約0、0. 03,0. 1,0. 3、1、3或10 μ M化合物1或 2預孵育約10分鐘。對照為在37°C下在不存在任何化合物的情況下用100μ 1含0. 05% DMSO的無血清培養基孵育約10分鐘的細胞。將與1. 0%無脂肪酸的BSA預混合的約100 μ 1 600 μ M13C18-油酸加入細胞懸液中。在37°C下孵育約90分鐘后，按實施例2所描述的提取并檢測細胞。圖3-6顯示化合物1和2對甘油三酯生物合成的作用。在化合物1存在的情況下， HUH7和分化的3T3-L1細胞系具有降低的新合成的13C18-三油酸甘油酯水平。在HUH7細胞系中，用10μΜ化合物1孵育的細胞中"C18-三油酸甘油酯的水平約為對照水平的30%，而用10 μ M化合物2孵育的細胞中13C18-三油酸甘油酯的水平約為對照水平的75% (圖3)。 此外，在用化合物1孵育的HUH7細胞中檢測到13C18-油酰基-甘油二酯的瞬時增加(圖5)。 這些結果表明HUH7細胞具有將13C18- 二油酸甘油酯轉化為13C18-三油酸甘油酯的功能性 DGATl 禾口 DGAT2 酶。
在分化的3T3-L1細胞系中，用約10 μ M化合物1孵育的細胞中13C18-三油酸甘油酯的水平約為對照水平的33% (圖4)。該結果表明在分化的3T3-L1細胞中，大部分13C18-三油酸甘油酯是通過DGATl合成的。然后，評價化合物2在MCF7細胞中的作用。將MCF7細胞接種到96-孔培養板中的含有10% FBS,4. 5g/L D-葡萄糖的DMEM中培養M小時。將匯合或接近匯合的細胞用約 150μ 1含0. 15%無脂肪酸BSA的無血清DMEM孵育1小時。接著將含3 % DMSO的DMEM中的約3 μ 1化合物2加至終濃度為約0、0. 1、0. 3、1、3、10 μ Μ。在37°C下孵育15分鐘后，將板排干。然后在37°C下將細胞用150μ1與0. 15%無脂肪酸的BSA預混合的ΙΟΟμΜ 13C18-油酸和約3 μ 1含3% DMSO的DMEM中的化合物2孵育約3小時。細胞用約100 μ 1異丙醇提取， 接著進行如上所述的LC-MS檢測。如圖6所示，用化合物2孵育的細胞中"C18-三油酸甘油酯的水平約為對照水平的80%。該結果表明在此處所用的MCF7細胞中，大部分的13C18-三油酸甘油酯是通過DGAT2合成的。由于具有三個標記的脂肪酸鏈的"C18-三油酸甘油酯的生成涉及甘油-3-磷酸途徑中的其他酶，因此進行了額外的實驗來檢測標記的中間體的存在情況。將FU5AH細胞用 13C18-油酸孵育60分鐘，并用實施例2所描述的同時檢測進行分析。如圖7所示，具有1、 2和3個13C18-油酰基側鏈的三油酸甘油酯呈現為標記分子，其分子量分別為m/z 921. 0、 939. 0 和 957. 0。實施例3的結果表明分化的脂肪細胞和HUH7細胞可用于篩選調節DGATl活性的化合物。在另一方面，MCF7細胞可用于篩選調節DGAT2活性的化合物。此外，MCF7、脂肪細胞和肝癌細胞可用于篩選調節其它酶的化合物，這些酶包括GPAT、AGPAT或PAP，其均參與甘油三酯生物合成例如甘油-3-磷酸途徑。實施例4.檢測白細胞中的甘油三酯生物合成為檢查白細胞是否存在甘油三酯生物合成，將THP-I細胞與無血清RPMI孵育并在37°C下孵育2小時。將約200，000個細胞在500Xg下離心5分鐘。將約300 μ 1與含 0. 5%無脂肪酸BSA(SIGM)的RPMI預混合的300 μ M13C18-油酸(SIGMA)加入細胞沉淀中。 在37°C下將細胞與標記的分子孵育2小時，如上所述用異丙醇提取細胞。如圖8所示，在用標記的油酸培養的THP-I細胞中檢測到新合成的13C18-三油酸甘油酯，而未用標記的油酸培養的對照細胞沒有檢測到新合成的13C18-三油酸甘油酯。當用 13C18-油酸培養THP-I細胞約120分鐘時，作為標記分子檢測帶有1或2個13C18-油酰基側鏈的三油酸甘油酯，其分子量分別為m/z 921. 0和939. 0。檢測到部分標記的三油酸甘油酯表明本申請的方法可用來檢測AGPAT、PAP或 DGAT的細胞活性。此外，本文所述方法可用來檢測分離細胞中新合成的甘油三酯，因此可用作確定甘油三酯生物合成代謝活性的診斷測定。本部分引用的所有參考文獻均通過引用以其整體結合到本文中。因此，雖然已顯示、描述并指出如應用于本發明優選實施方案中的基本的新特征， 但應理解的是，本領域技術人員可對所闡述的設備及其操作做出形式上和細節上的各種省略、替換和改變，而不違背本發明的精神。例如，意在很清楚地表明所有那些以基本同樣的方式執行基本相同的功能以達到相同結果的要素和/或方法步驟的組合，都在本發明的范圍內。此外，應意識到，與本發明公開的任何形式或實施方案相關的所顯示和/或描述的結構和/或元素和/或方法步驟可作為一種設計選擇的一般情況摻入任何其它公開的或描述的或暗示的形式或實施方案。因此，意在僅受限于所附權利要求所表明的范圍。
權利要求
1.一種用于鑒定抑制酰基輔酶A: 二酰基甘油酰基轉移酶(DGAT)活性的化合物的方法，其包括如下步驟a.在所述化合物存在和不存在的情況下，使穩定同位素標記的脂肪酸與細胞接觸；b.用異丙醇提取所述細胞；c.在所述化合物存在的情況下，測定穩定同位素標記的甘油三酯水平；和d.在所述化合物不存在的情況下，測定穩定同位素標記的甘油三酯水平； 由此，穩定同位素標記的甘油三酯水平的變化表明所述化合物抑制DGAT活性。
2.權利要求1的方法，其中所述穩定同位素為13C。
3.權利要求1的方法，其中所述穩定同位素標記的脂肪酸為13C18-油酸。
4.權利要求1的方法，其中所述穩定同位素標記的甘油三酯通過液相層析-質譜分光光度計系統檢測。
5.一種測定參與甘油三酯合成的酶的活性的方法，其包括如下步驟a.使穩定同位素標記的脂肪酸與細胞接觸；b.用異丙醇提取所述細胞；和c.檢測穩定同位素標記的溶血磷脂酸、磷脂酸或二酰基甘油或甘油三酯的存在情況。
6.權利要求5的方法，其中所述酶為酰基輔酶A:二酰基甘油酰基轉移酶(DGAT)。
7.權利要求5的方法，其中所述酶為甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)。
8.權利要求5的方法，其中所述酶為1-酰基甘油-3-磷酸-0-酰基轉移酶(AGPAT)。
9.權利要求5的方法，其中所述酶為磷脂酸磷酸酶(PAP)。
10.權利要求5的方法，其中所述穩定同位素為"C。
11.權利要求5的方法，其中所述穩定同位素標記的脂肪酸為13C18-油酸。
全文摘要
一種用于鑒定調節酰基輔酶A二酰基甘油酰基轉移酶活性的化合物的方法，包括如下步驟在該化合物存在或不存在的情況下，使穩定同位素標記的脂肪酸與細胞接觸，用異丙醇提取細胞，并在該化合物存在或不存在的情況下測定穩定同位素標記的甘油三酯的水平；其中所述穩定同位素標記的甘油三酯的水平變化表明所述化合物調節DGAT活性。
文檔編號G01N33/50GK102378816SQ201080015824
公開日2012年3月14日 申請日期2010年2月3日 優先權日2009年2月4日
發明者J-S·齊, M·A·康奈利, W·朗 申請人:詹森藥業有限公司