專利名稱：子宮內膜異位癥的判定方法以及子宮內膜異位癥的診斷用試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于判定子宮內膜異位癥的有無的方法、用于診斷子宮內膜異位癥的試劑盒以及抗突觸融合蛋白自身抗體等的使用方法。
背景技術：
子宮內膜異位癥是子宮內膜樣上皮細胞、間質細胞在卵巢、輸卵管及腹腔內、直腸表面等子宮腔內表面以外的組織、內臟器官中隨月經周期而重復增殖、出血、再生，從而對組織帶來障礙的疾病。子宮內膜異位癥具有子宮內膜樣組織在異位增殖等與惡性腫瘤類似的特征，但是其始終為良性的疾病。然而，子宮內膜異位癥的原因尚未闡明，認為月經應激為原因之一，由于晚婚、生育年齡延遲、生育次數減少等，近年來這種患者數目有所增加。此外有數據表明，子宮內膜異位癥引起炎癥、疼痛、組織粘連等，并以高比率并發不孕癥。由此，在早期階段檢出子宮內膜異位癥并對其進行處理是重要的。對于子宮內膜異位癥，推薦通過腹腔鏡檢查、剖腹術進行視診和通過組織學診斷進行明確診斷。但是，由于這些診斷方法對患者造成痛苦和負擔，一般首先進行更簡便的內診、超聲波檢查、血液檢查等。該血液檢查中，使用CA125、CA19-9等標記物。而這些CA125和CA19-9本來為卵巢癌等的腫瘤標記物，因此對于子宮內膜異位癥并無特異性。此外，在使用這些標記物的診斷中，存在真陽性率低、且假陽性率高的缺點。因此，要求可以替代CA125等的新型子宮內膜異位癥診斷用標記物。作為除CA125等之外的子宮內膜異位癥診斷用標記物，例如專利文獻1中公開了 NADH脫氫酶等的基因，專利文獻2中公開了組胺釋放因子，專利文獻3中公開了稱為組織因子途徑抑制物(TFPI-幻的蛋白質等。現有技術文獻專利文獻
專利文獻1 日本特表2003-531580號公報專利文獻2 日本特開2005-49343號公報專利文獻3 日本特表2007-506965號公報。
發明內容
如上所述，除了實用化的CA125和CA19-9之外，也對子宮內膜異位癥的診斷用標記物進行了各種研究。但是，對于專利文獻1 2中記載的標記物，必須測定子宮內膜細胞樣品中的表達水平，因此存在在采取樣品時對受檢者造成痛苦等問題。此外，對于專利文獻3的標記物，以實驗示出其與卵巢中產生的子宮內膜異位癥性囊腫(巧克力囊腫)的相關性，但是其與卵巢外產生的子宮內膜異位癥、未發展至巧克力囊腫的輕度子宮內膜異位癥的相關性不明。
因此，本發明的目的在于，提供可以使用受檢者的血液樣品、并且與僅使用作為子宮內膜異位癥標記物的CA125等的以往方法相比可以高靈敏度且高精度地判定子宮內膜異位癥的判定方法，用于實施該本發明方法的診斷用試劑盒，以及應用抗突觸融合蛋白自身抗體等判定子宮內膜異位癥和制備子宮內膜異位癥的診斷用試劑盒的方法。本發明人為了解決上述課題而進行精心研究，由血液中含有的成分搜索可以用作子宮內膜異位癥的診斷用標記物的成分。結果發現，對于特定蛋白質的自身抗體表現出與子宮內膜異位癥顯著的相關性，因此用作比以往的子宮內膜異位癥標記物更準確的標記物，從而完成本發明。本發明涉及的子宮內膜異位癥的判定方法的特征在于含有進行選自血液樣品中抗突觸融合蛋白自身抗體、抗PDIKlL自身抗體和抗烯醇化酶自身抗體中至少1種的表達分析的步驟，和通過上述表達分析結果判定子宮內膜異位癥發病的有無的步驟。本發明涉及的子宮內膜異位癥的診斷用試劑盒的特征在于含有選自突觸融合蛋白、PDIK1L、烯醇化酶、它們的片段肽、它們的變性物、它們的修飾物中的至少一種肽，以及可以和與上述肽特異性地結合的自身抗體結合且具有標記基團的二次抗體。本發明涉及的選自抗突觸融合蛋白自身抗體、抗PDIKlL自身抗體和抗烯醇化酶自身抗體中的至少一種可以用于子宮內膜異位癥的判定和子宮內膜異位癥的診斷用試劑盒的制備。
[圖1]為表示基于本發明方法，測定由子宮內膜異位癥患者、其它疾病的患者和健康者得到的血清樣品中的抗α-烯醇化酶自身抗體的相對活性的結果的圖。[圖2]為表示基于本發明方法，測定由子宮內膜異位癥患者、其它疾病的患者和健康者得到的血清樣品中的抗PDIKlL自身抗體的相對活性的結果的圖。[圖3]為表示基于本發明方法，測定由子宮內膜異位癥患者、其它疾病的患者和健康者得到的血清樣品中的抗突觸融合蛋白5自身抗體的相對活性的結果的圖。
具體實施例方式在本發明涉及的子宮內膜異位癥的判定方法中，進行選自受檢者的血液樣品中的抗突觸融合蛋白自身抗體、抗PDIKlL自身抗體和抗烯醇化酶自身抗體中的至少1種的表達分析。子宮內膜異位癥是子宮內膜樣上皮細胞、間質細胞在卵巢、輸卵管及腹腔內、直腸表面等子宮腔內表面以外的組織、內臟器官中隨月經周期而重復增殖、出血、再生，從而對組織帶來障礙的疾病，根據其嚴重程度分為I期 IV期的4個階段。本發明中，子宮內膜異位癥的嚴重程度越高，則可以以越高的靈敏度和精度判定子宮內膜異位癥的有無。由于作為實用化的子宮內膜異位癥標記物的CA125和CA19-9也為卵巢癌等的腫瘤標記物，因此假陽性率高。與此相對地，對于本發明涉及的子宮內膜異位癥標記物，根據本發明人進行的實驗去除異常值，健康者、其它疾病患者的假陽性率比以往標記物低。對本發明方法中使用的血液樣品的種類不特別限定，其含有血液自身、血漿、血清中的任意一種。但是由于作為表達分析的對象的自身抗體包含在血清中，因此優選使用血漿或血清，更優選使用血清。作為得到血漿、血清的方法，可以適用常規方法，更具體地，可以使用離心分離、過濾。認為本發明方法不僅對于人、而且對于其它的恒溫動物也是有效的，因此，作為血液樣品，不僅可以使用來源于人的血液樣品，還可以使用來源于其它恒溫動物的血液樣品。由于本發明方法使用血液樣品，因此沒有必要從患者切除例如子宮組織等作為樣品，采取血液即可。由此，利用本發明方法時，進一步降低對患者造成的痛苦。突觸融合蛋白為形成與細胞的胞吐關聯的SNARE復合體的細胞膜結合性蛋白質的一種。PDIKlL為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其與同樣地為激酶的CLIKl表現出69%的同一性。PDIKlL 的氨基酸序列記載于 LINGCHEN GUO 等人，Journal of Genetics, vol. 82, nos. 1 & 2，pp. 27-32Q003)(該文獻在本說明書中引入作為參考)中。烯醇化酶為與糖酵解系統關聯的酶之一，作為其同工酶，有主要存在于細胞質中的α型、主要存在于肌肉細胞中的β型、主要存在于神經元中的Y型。在本發明中，進行受檢者血液樣品中上述蛋白質的自身抗體的表達分析。在子宮內膜異位癥患者的血液樣品中，上述蛋白質的自身抗體的表達量增加的原因尚未闡明，但是通過這些自身抗體的表達分析，可以比以往的標記物更準確地判定子宮內膜異位癥的有無。在本發明涉及的判定方法中，除了選自抗突觸融合蛋白自身抗體、抗PDIKlL自身抗體和抗烯醇化酶自身抗體中的至少1種的表達分析之外，優選還進行CA125或CA19-9的表達分析。通過與抗突觸融合蛋白自身抗體等一起進行CA125或CA19-9的表達分析，可以靈敏度更高地檢出子宮內膜異位癥。作為表達分析對象的抗突觸融合蛋白自身抗體優選抗突觸融合蛋白5自身抗體， 抗烯醇化酶自身抗體優選抗α-烯醇化酶自身抗體。在本發明涉及的判定方法中，對于針對突觸融合蛋白等的自身抗體和CA125等的表達分析法不作特別限定。例如，不限于測定血液樣品中這些自身抗體的絕對量或濃度，也可以測定相對的量或濃度。更具體地說，例如可以測定上述自身抗體等在血液樣品中的量、 濃度或活性。作為具體的表達分析方法，可以舉出例如ELISA、使用蛋白質芯片的方法、免疫比濁法、蛋白質印跡法、RIA法、化學發光酶免疫測定法(CLEIA法)、膠乳凝聚法、電化學發光免疫測定法(ECLIA法)、紅細胞凝集反應(HA法)等免疫測定法。在這些方法中，作為用于進行上述表達分析的方法，優選免疫測定法。免疫測定法的靈敏度和精度高，即使血中的自身抗體濃度稍微變化也可以檢出。通過ELISA進行本發明涉及的自身抗體的表達分析時，可以合適地使用本發明涉及的子宮內膜異位癥的診斷用試劑盒。本發明的診斷用試劑盒含有選自突觸融合蛋白、PDIK1L、烯醇化酶、它們的片段肽、它們的變性物、它們的修飾物中的至少一種肽，以及可以和與上述肽特異性地結合的自身抗體結合且具有標記基團的二次抗體。作為上述診斷用試劑盒，其適當地進一步含有抗CA125抗體或抗CA19-9抗體、以及可以和與上述抗CA125抗體或抗CA19-9抗體特異性結合的CA125或CA19-9結合且具有
5標記基團的二次抗體。若使用這種試劑盒，則除了進行抗突觸融合蛋白自身抗體等的表達分析之外，還可以進行CA125或CA19-9的表達分析，通過將這些分析結果組合，可以進一步準確地判定子宮內膜異位癥。突觸融合蛋白等的片段肽指的是可以與上述自身抗體特異性地結合的突觸融合蛋白等的一部分。作為這些片段肽，可以舉出例如，突觸融合蛋白等的自身抗體的表位本身、含有表位的肽等。本發明涉及的與自身抗體結合的表位可以通過ELI斑點測定、細胞內細胞因子染色法、流式細胞術、T細胞增殖測定等公知方法來確定。突觸融合蛋白等的變性物指的是通過實施加熱、冷凍、紫外線等物理性處理或應用表面活性劑、變性劑等化學性處理而得到的、可以與上述自身抗體特異性地結合的變性物。例如，可以舉出通過SDS、DTT處理而得到的變性物。突觸融合蛋白等的修飾物指的是對1個以上氨基酸進行修飾而得到的、可以與上述自身抗體特異性地結合的修飾物。例如，可以舉出用戊二醛處理而得到的修飾物。在本發明中，作為上述肽，可以使用為突觸融合蛋白等的片段肽且經變性處理的肽、為變性物且為化學修飾物的突觸融合蛋白等。上述肽可以具有1個或幾個氨基酸殘基的突變、置換、缺失和/或添加，只要可以與上述自身抗體特異性地結合。在本發明涉及的診斷用試劑盒中，可將上述肽、抗CA125抗體等固定在載體上。通過使用載體，產生易于將這些肽等從樣品分離等優點。適于將上述肽等固定的載體為診斷用試劑盒中一般使用的載體即可，對其不作特別限定。例如，作為載體的材料，可以舉出聚苯乙烯、聚酰胺、聚丙烯酰胺等樹脂，硅膠、玻璃、棉等，作為載體的形狀，可以舉出珠、膜、 絲、無紡布、無定形凝膠等。在使用上述診斷用試劑盒時，使受檢者的血液樣品作用于上述肽等。結果，若血液樣品中含有針對本發明涉及的肽等的自身抗體、CA125等，則其與肽等特異性地結合。接著， 用緩沖液等將與肽等非特異性地結合的蛋白質等洗滌除去后，使上述二次抗體進行作用。 二次抗體和與上述肽等結合的上述自身抗體等結合。上述二次抗體用對應于標記基團的方法檢出。作為上述標記基團，可以使用生物化學領域中一般使用的標記基團。例如，可以舉出熒光顯色基團，過氧化物酶、堿性磷酸酶、螢光素酶等酶。這些酶可以通過與檢出試劑作用而發光等。例如，在使用過氧化物酶作為標記基團時，可以通過利用過氧化物酶的氧化而顯色的顯色試劑、對應于通過過氧化物酶的作用由過氧化物鹽產生的O22 —而顯色的顯色試劑等來檢出。血液樣品中含有的自身抗體的濃度或量是通過顯色強度等間接得到的。可以通過校準曲線等將得到的測定值換算為相對或絕對濃度、量、活性等。作為本發明的診斷用試劑盒，其優選含有正常對照樣品、子宮內膜異位癥對照樣品。若試劑盒附帶這些樣品，則對這些樣品進行同樣的實驗，將其測定值和受檢樣品的結果進行比較，由此可以更客觀地判定受檢者的子宮內膜異位癥的有無。在使用蛋白質芯片的方法中，使用負載有上述肽等的蛋白質芯片。若使血液樣品作用于上述蛋白質芯片，則本發明涉及的自身抗體與其特異性地結合。接著，用緩沖液等將非特異性地結合的蛋白質等洗滌除去后，可以通過常規方法檢出所結合的自身抗體。
作為上述檢出方法，可以舉出例如基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 (MALDI-T0F-MASS)、表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-T0F-MASS)等飛行時間質譜(T0F-MASS)。由TOF-MASS圖，通過分子量峰、其它的片段峰、它們的強度等，可以掌握自身抗體的濃度或量。此外，與ELISA的情況同樣地，也可以使用具有標記基團且可以與各自身抗體結合的二次抗體來檢出與蛋白質芯片選擇性地結合的自身抗體。在利用免疫比濁法時，使特異性抗原與血液樣品中的本發明涉及的自身抗體結合后，照射特定的光，測定與所產生的不溶性復合體的量對應的濁度，由此求出自身抗體的濃度或量。由此，自身抗體的濃度或量作為對應于濁度的相對值得到，也可以通過使用事先制作的校準曲線求出絕對的量或濃度。在化學發光酶免疫測定法(CLEDUi)的情況下，可以將血液樣品中的各自身抗體夾在固定于鐵氧體粒子等上的上述肽等和標記抗體之間，形成抗原抗體反應復合體。然后， 添加發光底物等對應于標記基團的檢出用化合物等，由此可測定發光量。在使用鐵氧體粒子時，通過使用磁鐵等，可以純化必要的復合體。在本發明方法中，接著由所得到的表達分析結果判定子宮內膜異位癥發病的有無。即，若子宮內膜異位癥發病、或其癥狀越重，則血液中的本發明涉及的自身抗體的濃度或量越高。由此，基于本發明涉及的自身抗體的表達分析結果，若其表達量多則可以判斷為陽性，若其表達量少則可以判斷為陰性。實際上，根據子宮內膜異位癥的定義、嚴重程度、本發明涉及的自身抗體的表達分析方法，可以改變陽性與陰性的邊界，即截斷值(cutoff value) 0因此，在沒有一般基準的階段，本發明方法的實施者有必要在通過預實驗等事先確定表達分析方法和截斷值后進行測定。進一步地，在本發明方法中，在進行抗突觸融合蛋白自身抗體等的表達分析的同時，進行作為以往的標記物的CA125或CA19-9的表達分析，在抗突觸融合蛋白自身抗體等和CA125等中的任一個超過各自的截斷值時判斷為子宮內膜異位癥陽性，由此則可以以更高的靈敏度檢出子宮內膜異位癥。
實施例以下舉出實施例對本發明進行更具體的說明，但本發明決不受下述實施例所限定，本發明可以在適合上述、后述的宗旨的范圍內適當地進行變更而實施是不言而喻的，這些變更都在本發明的技術范圍內。實施例1:子宮內膜異位癥標記物的搜索 (1)血清樣品的采取
由51位20 50歲的子宮內膜異位癥患者(平均年齡34. 7士7. 6 (平均值士標準偏差)歲)、18位22 34歲女性健康者(平均年齡26. 4士 3. 7)、18位17 48歲的患有子宮內膜異位癥以外的疾病的患者(平均年齡32. 8士9. 采取血液。子宮內膜異位癥以外的患者的疾病如表1所示。[表 1]
權利要求
1.子宮內膜異位癥的判定方法，其特征在于包含進行選自血液樣品中抗突觸融合蛋白自身抗體、抗PDIKlL自身抗體和抗烯醇化酶自身抗體中至少1種的表達分析的步驟，以及通過所述表達分析結果判定子宮內膜異位癥發病的有無的步驟。
2.如權利要求1所述的子宮內膜異位癥的判定方法，其中，除了進行選自抗突觸融合蛋白自身抗體、抗PDIKlL自身抗體和抗烯醇化酶自身抗體中至少1種的表達分析之外，還進行CA125或CA19-9的表達分析。
3.如權利要求1或2所述的判定方法，其中，所述表達分析通過免疫測定法進行。
4.子宮內膜異位癥的診斷用試劑盒，其特征在于含有選自突觸融合蛋白、PDIK1L、烯醇化酶、它們的片段肽、它們的變性物、它們的修飾物中的至少一種肽，以及可以和與所述肽特異性地結合的自身抗體結合且具有標記基團的二次抗體。
5.如權利要求4所述的子宮內膜異位癥的診斷用試劑盒，其中，將所述肽固定在載體上。
6.如權利要求4或5所述的子宮內膜異位癥的診斷用試劑盒，其進一步含有抗CA125 抗體或抗CA19-9抗體、以及可以和與所述抗CA125抗體或抗CA19-9抗體特異性地結合的 CA125或CA19-9結合且具有標記基團的二次抗體。
7.如權利要求6所述的子宮內膜異位癥的診斷用試劑盒，其中，將所述抗CA125抗體或抗CA19-9抗體固定在載體上。
8.如權利要求4 7中任意一項所述的診斷用試劑盒，其進一步含有所述標記基團的檢出試劑、正常對照樣品或子宮內膜異位癥對照樣品中的任一種以上。
9.選自抗突觸融合蛋白自身抗體、抗PDIKlL自身抗體和抗烯醇化酶自身抗體中的至少一種在判定子宮內膜異位癥中的應用。
10.選自抗突觸融合蛋白自身抗體、抗PDIKlL自身抗體和抗烯醇化酶自身抗體中的至少一種在制備子宮內膜異位癥的診斷用試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明的目的在于，提供可以使用受檢者的血液樣品、并且與僅使用以往作為子宮內膜異位癥標記物的CA125等的以往方法相比可以高靈敏度且高精度地判定子宮內膜異位癥的判定方法，和用于實施該本發明方法的診斷用試劑盒。本發明涉及的子宮內膜異位癥的判定方法的特征在于含有進行選自血液樣品中抗突觸融合蛋白自身抗體、抗PDIK1L自身抗體和抗烯醇化酶自身抗體中至少1種的表達分析的步驟，和通過上述表達分析結果判定子宮內膜異位癥發病的有無的步驟。
文檔編號G01N33/53GK102341704SQ201080010289
公開日2012年2月1日 申請日期2010年2月23日 優先權日2009年3月6日
發明者伊藤昌春, 鍋田基生, 阿部康人 申請人:持田制藥株式會社