液相均相測定的制作方法

專利名稱：液相均相測定的制作方法
液相均相測定
背景技術：
特異性結合測定是用于檢測物質存在或含量的測試方法，并且是以特異性識別和與特異性結合伴侶結合一起為基礎的。免疫測定是特異性結合測定的實例，其中抗體可結合于特定的蛋白質或化合物。在這些實例中，抗體是特異性結合配對成員中的成員。核酸結合性測定是另一種類型，其中互補核酸鏈是特異性結合配對。特異性結合測定構成了較寬的和正在發展的技術領域，其能夠精確地檢測疾病狀態、傳染性生物體和非監管藥物。在過去的幾十年中，一直進行這些工作，以便設計出具有所要求的靈敏度、動態范圍、實用性、 廣泛適用性和適合自動化的分析和測定方法。這些方法能夠被大體分組為兩個類型。均相的方法利用特異性結合分析物的反應來調節或者產生可檢測信號，無需要求在對分析物特異的反應物和非分析物特異性的反應物之間的分離步驟。異相的形式則依賴于被分析物結合的和游離的(未被結合于分析物)的可檢測地標記的特異性結合伴侶之間的物理分離。分離典型地要求關鍵的反應物被固定化到一些類型的固體基材上，以使得一些類型的物理過程例如過濾、沉積、聚結或者磁力分離可以被采用；并且典型地還要求洗滌步驟，以便除去游離的可檢測地標記的特異性結合伴侶。依賴于產生化學發光信號并且與分析物含量相關聯的測定方法已經經歷提高的應用。這些方法能夠使用相對簡單的儀器進行，仍然可顯示良好的分析特性。特別地，使用酶標記的用于分析物的特異性結合伴侶和化學發光的檢測用酶底物的方法已經得到了廣泛應用。普通的標記酶包括堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶。美國專利6，911，305公開了一種方法，用于在第一薄膜上檢測結合于敏化劑、或用敏化劑標記的探針的多聚核苷酸分析物。該薄膜和攜帶有固定化化學發光前體的第二薄膜相接觸。激發在夾心薄膜中的敏化劑可產生單線態氧，單線態氧可與化學發光前體反應從而在第二薄膜上產生可引發的化學發光化合物。該可引發的化學發光化合物可與試劑起反應從而在第二薄膜上產生化學發光，用于檢測分析物。這些方法并不依賴于用于使反應物進行接觸的特異性結合反應；相反，第二薄膜用作試劑輸送裝置。美國專利6，406，913公開的測定方法包括在一定條件下處理懷疑含有分析物的介質，使得該分析物可以引起光敏劑和化學發光化合物獲得密切接近。該光敏劑當用光源輻照時可產生單線態氧；單線態氧可通過溶液擴散至化學發光化合物，并且當密切接近化學發光化合物時，單線態氧可激活該化學發光化合物。被激活的化學發光化合物隨后產生光。產生的光量與介質中的分析物含量有關。在一種實施方式中，至少一種光敏劑或化學發光化合物與懸浮的顆粒相關聯，并且特異結合性配對成員被與其相結合。美國專利申請公開US2007(^64664和US2007(^64665公開了用于進行特異性結合配對分析的測定方法，涉及固定化化學發光化合物與活化劑化合物的反應，所述活化劑化合物借助于特異性結合反應而進入反應性構造中。其不要求分離或者除去過量的未結合的化學發光化合物或者活化劑。與現有測定技術相比，這些測定形式提供了優良的操作便利性和在自動化中的靈活性。盡管具有這些優點，在測定方法設計和性能中附加的改進始終是分析方法開發人員的目標。本發明公開的測定方法通過提供簡單的靈敏度改進的測定法而滿足了這些需要。

發明內容
本發明公開了用于檢測懷疑含有反應物的樣品中反應物的方法、試劑、試劑盒和系統， 其中所有的試劑皆可溶于水溶液。一種測定方法包括在反應物存在的條件下，處理懷疑含有反應物的樣品，使活化劑達到反應構型，化學發光化合物將其激活。樣品還被處理以減少與分析物不相關的信號。最后，用引發劑溶液處理該樣品，借此由被激發的化學發光化合物產生光。沒有試劑與某一表面或其他固相相連接。
具體實施例方式
定義烷基一含有1-20個碳的支鏈、直鏈或者環烷基團，其可以用1個以上除H之外的取代基取代。在此使用的低級烷基是指含有8個以下碳原子的那些烷基。分析物一測定中在待檢測樣品中的物質。一種以上具有對分析物的特異性結合親合力的物質將被用于檢測分析物。該分析物可以是蛋白質、肽、抗體、或半抗原，與這些分析物結合的抗體可以被制備。該分析物可以是核酸或低聚核苷酸，其可以被互補的核酸或低聚核苷酸結合。該分析物可以是任何其他可形成特異性結合配對成員的物質。其他示例性的分析物類型包括藥物比如留族化合物、激素、蛋白質、糖蛋白、粘蛋白、核蛋白、磷蛋白、非監管藥物、維生素、抗菌藥物、抗真菌藥物、抗病毒藥物、嘌呤、抗腫瘤藥試劑、安非他明、氮雜化合物、核苷酸、和前列腺素、以及所有這些藥物的代謝產物、殺蟲劑和殺蟲劑的代謝產物、以及受體。分析物還包括細胞、病毒、細菌和真菌。活化劑一一種化合物，還可被認為是標記，其具有活化化學發光化合物的功能以使得在存在的條件下產生化學發光。被活化劑標記sbm或者活化劑特異性的結合成員共軛物--在測定混合物中的反應物，該混合物至少包括連接構造中的下述物質a)用于分析物的特異性結合成員；和b) 具有活化化學發光化合物效果的活化劑化合物或標記。
抗體包括全長免疫球蛋白及天然或基因工程化的片段。芳烷基--用芳基取代的烷基。例子包括苯甲基、二苯甲基、三苯甲基、和苯乙基。芳基一含有芳香環的基團，該基團含有1至5個碳環的芳香環，其可以用1個以上除H之外的取代基取代。生物材料一包括，例如全血、抗凝血的全血、血漿、血清、組織、動植物細胞、細胞內容物、病毒、以及真菌。化學發光化合物一一種化合物，其還可以被稱為標記，其可例如通過被轉化為另一種在電子激發態下形成的化合物而參與引起光輻射的反應。該激發態可以是單線激態或三重激態。該激發態可以剛一衰減成基態就直接發光，或者可以將激發能傳遞至發射能受體，借此返回到基態。在該過程中，能量受體躍遷至激發態并發光。化學發光標記的固定化sbm-在測定混合物中的反應物，該混合物至少包括連接構造中的下述物質a)用于分析物的特異性結合成員；b)化學發光化合物或標記；和c)固相。
連接一在此使用的該術語是指兩個以上化學物種或者支持材料被通過化學法連接，例如通過一個以上共價鍵，或者被動地附著例如通過吸附、離子吸引，或者特異性結合過程比如親合性結合。當這些物種或者材料彼此相連接時，能夠涉及一種以上連接類型。劑量反應一信號比如測定反應所產生的化學發光，其與樣品中分析物的含量相關。雜烷基一一種烷基，其上至少一個環或非末端鏈中的碳原子被選自N、0、或S的雜原子取代。雜芳基一一種芳基，其上1至3個的環中碳原子被選自N、0、或S的雜原子取代。 例舉的基團包括批啶基、批咯基、噻吩基、呋喃基、喹啉基和吖啶基。樣品一在測定中含有或者懷疑含有待測分析物的混合物。分析物包括，例如蛋白質、肽、核酸、激素、抗體、藥物、和甾族化合物。可以在本公開的方法中使用的典型樣品包括身體的液體，比如血液，其可以是當收集血液標本時通常見到的抗凝血的血液、血漿、血清、尿液、精液、唾液、細胞培養物、組織提取液等等。其他類型的樣品包括溶劑、海水、工業用水樣品、食品樣品和環境樣品比如土壤或水、植物材料、真核生物、細菌、質粒、病毒、真菌、以及源于原核生物的細胞。sbp (特異性結合伴侶)一特異性結合配對成員或特異性結合伴侶是包括生物分子在內的一種分子，具有針對另一種物質(比如分析物)的特異性結合親合性。用于分析物的兩個特異性結合伴侶，最好是在分析物上具有不同的結合位點，可以稱為特異性結合配對。SSIA (Selective Signal Inhibiting Agent，選擇性信號抑制劑)一一種在本公開的測定反應混合物中提供的化合物，其使得非專一性信號或者背景信號與從測定反應混合物的化學發光產生反應所產生的對分析物特異的信號相比會以更大量降低。固體支持物一一種大小至少為1微米的材料，具有一個其上能固定測定成分的表面。材料可以呈如下形式顆粒、微粒、納米顆粒、金屬膠體、纖維、紙張、珠子、膜片、濾紙及其他支撐物比如試管、微孔板、芯片、載玻片、和微陣列。可溶性的、溶解性、增溶一一種物質與另一種物質均勻混合的能力或者趨勢。在本公開中，溶解性和相關術語一般指的是固體在液體中的特性，例如在緩沖水溶液中的 SSIA。固體的可溶性是指它們在溶劑(例如液體)中喪失它們的結晶形狀并變成呈分子狀態或呈離子狀態溶解或者分散、從而形成真溶液的程度。相反二相系統，其中一個相由分布在整個一體物質內的小顆粒(包括微粒或者膠體大小的顆粒)組成，不論是否被穩定化以阻止沉淀、還是未被穩定化。取代一是指基團上至少一個氫原子被非氫基團置換。應該注意，關于被取代基團，本文中指的是可以存在多個置換位點，除非另有明確說明。反應容器一一種容納樣品和其他根據本發明測定法的成分的容器或裝置。包括例如，不同大小和形狀的試管、微孔滴定板。
公開本發明公開提供了均相測定方法，特別是在分析物結合化學發光標記特異性結合伴侶和活化劑標記的特異性結合伴侶共軛物(conjugate)結合后，使用分析物化學發光檢測的均相測定方法。均相測定及其方法的進行可以不需要使游離的特異性結合伴侶與復合體中已被結合的特異性結合伴侶相分離的步驟。本發明公開提供了快速簡單的均相測定法，其利用特異性結合配對反應來檢測物質的存在、位置和含量。該測定要求使用在液相中的連接于第一個特異性結合伴侶的化學發光化合物(化學發光標記(的)sbp，化學發光標記(的)特異性結合伴侶)、共軛于第二個特異性結合配體的活化劑化合物(活化劑標記(的)特異性結合伴侶)、選擇性信號抑制劑(SSIA)、增強劑、以及引發劑溶液。與其他均相測定相比，本公開的基本實施方式，包括活化劑標記特異性結合伴侶和化學發光標記特異性結合伴侶在內的所有反應物皆可溶于水溶液。實際上，本發明的測定不需要或不使用固相。本測定方法與其他均相測定法不同的另一點是，不需要特殊化的構造物一也就是設計成帶有可檢測成分的被標記的特異性結合配對成員，該配對成員不被活化或者只有在與另一成分在一個復合體中結合后才能產生某種可檢測信號。與本發明公開的測定系統相比，其他均相測定系統的制備是復雜、困難或昂貴的，因為那些方法需要這種特殊化的成分。而本發明的測定法提供了一種使測定設計與開發更簡單、更靈活的方法，并更容易應用于較寬范圍的分析物。不同于常規的異相或基于分離的測定方法，本發明的測定方法不采用分離步驟或工藝將游離的特異性結合伴侶與已結合在復合體中的特異性結合伴侶區分開來。通過使用避免分離步驟的本測定方法，使得測定的控制簡化了，測定時間得以縮短，自動化變得更容易。在本發明公開的測定方法中，化學發光標記的特異性結合伴侶、活化劑標記的特異性結合伴侶和選擇性信號抑制劑(SSIA)被一同加入到含有樣品的水溶液中。在一個實施方式中，當可被特異性結合伴侶成員識別的分析物存在于樣品中時，化學發光標記的特異性結合伴侶、活化劑標記的特異性結合伴侶各自結合于分析物上的不同區域。產生與分析物相關的特異性信號，在剛一加入引發劑溶液就開始檢測。在另一個實施方式中，提供分析物的化學發光標記類似物比便應用于競爭測定模式中。分析物和化學發光標記的類似物競爭性地結合于活化劑標記的特異性結合伴侶。在競爭性結合測定的一個實施方式中，化學發光標記的類似物和活化劑標記的特異性結合伴侶的復合體可以被預先形成，加入分析物以取代被標記的類似物。在另一個實施方式中，化學發光標記的類似物、分析物、活化劑標記的特異性結合伴侶在未預先形成結合性復合體的情況下被混合一起。產生與分析物相關的特異性信號，在剛一加入引發劑溶液就開始檢測。信號與測定模式中的分析物濃度逆向相關。作為特異性結合伴侶與分析物結合的結果，使活化劑與化學發光化合物呈可操作地接近，這樣活化劑可有效地地活化反應，在剛一加入引發劑溶液時就產生化學發光。活化劑與化學發光化合物的反應可活化或改變化學發光化合物，使得用引發劑溶液處理導致進一步生成光的反應。術語“可操作地接近”是指，化學發光化合物和活化劑足夠接近，包括并且直至物理接觸，這樣它們能夠進行反應。相對于檢測分析物濃度所需的量，可以向系統中提供過量的活化劑標記的特異性結合伴侶和/或化學發光標記的特異性結合伴侶。在加入引發劑溶液和檢測之前不除去多余的未結合的活化劑標記的特異性結合伴侶、未結合的化學發光共軛物，因為它們的存在和測定系統中固相的缺乏并不會抑制化學發光檢測信號與分析物的量之間精確地建立關聯。因為未結合的被標記的特異性結合伴侶能夠經受相同的化學發光檢測反應，并且反應物不與固相連接(沒有有用的相關性，即使最好的情況)，所以信號與反應物的相關性也非常有限，這是期望的。按照經驗，這個特點通常將導致測定失敗。令人驚訝的是，這個問題已經通過在這本發明的方法中使用選擇性信號抑制劑而被克服。在本方法中，溶液中不與固相連接的反應物、未被去除的多余活化劑的存在、多余化學發光化合物的存在并不喪失進行靈敏的、特異性的、分析物濃度依賴性的結合測定的能力。這個發現是不可預知的或預料不到的。特別是當活化劑是催化劑比如酶時(當分子在溶液中游離反應時，酶通常每秒可以誘導數百數千倍的反應)，預料不到的是已被結合的活化劑可以有效地區別排除于游離的活化劑反應，以便在整個較寬的分析物濃度范圍內產生劑量反應信號。而且，發明者還發現，極好的區別性源于特定的SSIA化合物的加入。通過使用SSIA，在化學發光標記與活化劑標記(兩者通過被標記的特異性結合配對成員與分析物的復合體而呈反應構型)之間的反應所產生的信號與來自存在的(但并不存在于該復合體中)標記物的信號的比率被戲劇化地提高。參考示意

圖1，可以理解SSIA在改進的測定靈敏度中的功能。游離(未與分析物結合)的和被復合的化學發光標記(的)特異性結合伴侶(CLsbp)與活化劑標記(的)特異性結合配對(ALsbp)有多種不同的組合方式，當加入引發劑溶液時，這些方式都可能對所觀察的化學發光信號有貢獻。四種建議的反應圖列于如下
1被結合的ALsbp+被結合的CLsbp —特異性信號 2被結合的ALsbp+游離的CLsbp —非特異性信號 3游離的ALsbp+被結合的CLsbp —非特異性信號 4游離的ALsbp+游離的CLsbp —非特異性信號如上所示，四種不同類型的化學發光化合物與活化劑的配對能在混合反應中反應；但只有第一種類型產生了與測定中分析物的含量相關的信號。SSIA取得了令人驚訝的作用，相對于1反應所產生信號，它選擇性地抑制2-4反應所產生的信號量。在一些實施方式中，四種反應都會減弱，但2-4反應的信號相應地減少更多，即SSIA取得了同樣的作用。在本發明的實施方式中，提供了通過分析物與用于分析物的特異性結合伴侶之間的特異性結合反應來分析所樣品中所關注的分析物的方法，其中，一個特異性結合伴侶被用活化劑化合物標記，該活化劑可以催化劑比如酶、尤其是過氧化氫酶。另一個用于分析物的特異性結合伴侶被化學發光化合物標記。標記的Sbp與分析物的結合生成帶標記的復合體。化學發光化合物經受被活化劑誘導的在加入引發劑溶液后引起的化學發光反應。化學發光的結果與樣品中分析物的含量有關。特異性結合配對反應和化學發光反應由所有溶解在溶液中的成分完成，典型的溶液是水溶液。顯著地，提供的被標記的特異性結合伴侶的含量相對于樣品中分析物的量是過量的，從而使得不是所有的標記Sbp都與分析物生成復合體。即使多余的標記Sbp能參與化學發光反應，但并不從反應溶液中去除。未在復合體中、 也未被按常規除去的標記Sbp的反應性會阻止這種均相測定的進行，因為會產生不可接受的高信號，這種高信號不是由于存在分析物介導的復合體形成而產生的。在許多情況下，這種如此多的“背景”信號的產生使得無法得到有用的劑量反應關系。為了能夠進行均相的非分離式測定，當所有為化學信號產生所必需的反應成分呈結合性復合物形式和游離或未結合形式這兩種形式存在時，必須提供除物理分離之外的某種手段來區分已被結合的和未被結合的標記sbp。針對這個問題，本發明提供了一種長期被追求的溶液，提供了所有成分都在溶液中的測定方法，不進行分離。不同于已知的均相測定方法，本方法不需要或不使用特別設計的標記結合伴侶，這些結合性伴侶能夠不經受產生信號的反應，除非它們被帶入在結合性復合體中。在發明實施的測定方法中，被結合于具有分析物的復合體中的標記sbp成員與游離的標記Sbp成員的必要區分是通過向反應溶液中提供選擇性信號抑制劑(SSIA)而實現的。向反應溶液中加入有效量的SSIA可導致來自已結合的標記sbp成員的信號超過包括來自任何未結合的標記sbp成員的信號在內的背景信號，相比未使用SSIA的情況超過程度極其明顯。當信號對背景關系的這一改進被實現時，測定的效用得以增強，包括更高程度的檢測靈敏度。在一個實施方式中，提供的測定方法尤其是特異性測定方法中，由于分析物的存在，使得化學發光標記的sbp和活化劑標記的sbp經由至少一個特異性結合反應而得以可操作地接近，其中已結合的活化劑標記的sbp可激活一旦加入引發劑溶液就產生化學發光的反應，該反應用以檢測分析物的存在、位置和量。在另一個實施方式中，本發明的測定方法還與傳統測定方法不同的是，不去除存在的未結合的活化劑標記的sbp，這些未結合的活化劑標記的Sbp在測定中相對于與分析物特異結合的量大量剩余，不要求洗滌或分離多余的未結合的活化劑標記的sbp。在另一個實施方式中，本發明的方法也不用除去相對于與分析物特異結合的量有剩余的未結合的化學發光共軛物，不需要洗滌或分離未結合的化學發光共軛物的步驟。測定組成，即含有分析物的樣品、活化劑標記的sbp，化學發光標記的sbp，選擇性信號抑制劑及引發劑溶液可以被陸續加入試管，不需要洗滌或分離，并且讀取發光。除了最后加入的引發劑溶液之外的測定組成可以以任何次序或組合加入試管中。在一個實施方式中，在注入引發劑溶液前，樣品和活化劑標記Sbp可以被預先混合并加入含有化學發光標記Sbp的試管中。使用化學發光底物和酶標記的結合物的常規測定法要提供大大過量于標簽酶的量的化學發光底物。通常，底物/酶的摩爾比率可以超過十的九次冪，即，過量十億倍。據相信，在常規的測定中有必要供應這樣極大過量的化學發光化合物，以便確保充分的底物供應，用于連續的酶法轉化，并且該過程確保在測定中足夠的檢測靈敏度。申請人發現，有可能設計出高靈敏度的測定方法，其將化學發光化合物對活化劑的比率減小了幾個數量級。 就這點來說，在此描述的這些方法本質上不同于已知的酶聯測定方法。通過省去如上所述和如下所述示例性測定法顯示的洗滌和分離步驟，提供了使測定方案設計簡單化的機會。操作步驟數量的減少可以降低測定次數、由不完全的洗滌帶來的內測定變化性、以及成本。同時，增強了自動化和小型化測定性能的能力，具有自動化和小型化伴隨的所有固有優點。按本發明方法進行的測定法包括提供特異性結合伴侶(sbp)來特異性地結合或捕捉所關注的分析物。特異性結合伴侶能直接或間接地結合待檢測的分析物。隨后進一步向特異性結合伴侶提供直接或間接地附著于其上的化學發光標記化合物。化學發光標記可以由如下所詳述的不同途徑得到。各個情況下，化學發光標記穩定地、或不可逆地被直接或間接地以可維持“化學發光標記sbp”水溶性的方式與特異性結合伴侶相連接。術語“不可逆地”是指在待進行的測定中的使用條件下，基本上不從化學發光標記Sbp中除去化學發光標記。倘若在使用條件下標記被穩定附著、且仍保持在化學發光標記sbp上，則被動或非共價附著也是可以考慮的。該測定法進一步包括提供具有分析物的活化劑標記sbp和與化學發光標記sbp連接的用于分析物的特異性結合伴侶，并且允許這些組成形成特異性結合復合體。樣品、化學發光標記sbp、催化劑標記Sbp可以被以任意次序分別加入、或者以組合形式陸續或同時加入，也可以提前混合作為組合物加入。分析物與標記的Sbp成員的結合一般要求一段時間。 在一些實施方式中，可以如此進行為使結合反應發生，結合成分經可選的延遲時間被陸續加入。當結合性復合體形成后，加入引發劑溶液以產生用來檢測分析物的化學發光，并且檢測化學發光。典型地，光強度水平的峰值或光強度以固定的時間間隔積分，或測量所有積分的光強度。所產生光的量與反應試管中樣品含有的分析物的量相關。通過按通常已知方法建立校準曲線，光的量可以被用來確定反應物的數量。當光的發射在繼引發劑溶液加入后迅速發生時，期望的是，或者用機械方法測量開始用合適的注射器添加的時間、或者用已經置于檢測中的反應試管進行添加步驟。反應物的適宜量、容積、稀釋度、特異性結合配對反應的溫育時間、反應物濃度等，可以由常規測定法事先確定，參考進行特異性結合測定方法的標準論述，之后詳述的實施例可以作為指南。本測定和方法中所用sbp成員的濃度和含量將取決于如下這些因素分析物濃度、所期望的結合速度/測定時間、共軛物的成本和可用性、Sbp成員的非特異性結合度等。 通常Sbp成員以至少等于最低的預期分析物的濃度存在，更常見的是，以等于至少最高的期望的分析物濃度存在。并且，對于非競爭性測定，濃度可以是分析物最高濃度的10倍到 IO6倍。通常sbp成員的濃度小于10_4M，更多的情況是小于10_6M，經常是在10_"到1(ΓΜ之間。與sbp成員連接的活化劑或化學發光化合物的含量通常是至少1個分子/每sbp成員，可以高到IO2或更高。在許多實施方式中，與sbp成員連接的活化劑或化學發光化合物的量是1-20個分子。例舉的活化劑對化學發光化合物的比率被提供于工作實施例中。
化學發光標記(的)sbp本方法需要使用與第一個特異性結合伴侶相連接的化學發光化合物(化學發光標記sbp)，在本發明公開的測定和方法中，化學標記sbp可溶于水溶液。在本公開的測定和方法中，不同于在其他親合性測定和方法中看到的那樣，化學發光標記化合物未被固定在諸如微粒、多孔板膜片、濾紙、試管、試紙、移液吸頭等固體表面。化學發光標記sbp包括化學發光標記化合物和特異性結合配對中的一個成員。在一些實施方式中，化學發光標記sbp包括一個以上化學發光標記化合物。在一些實施方式中，化學發光標記sbp包括特異性結合配對中一個成員的一個以上拷貝。在一些實施方式中，化學發光標記化合物直接與特異性結合配對中一個成員的一個以上拷貝連接。在另一些實施方式中，一個以上化學發光標記化合物被直接地連接于特異性結合配對中一個成員的一個拷貝。直接連接，也稱為直接標記，包括共價結合作用、離子結合作用、以及疏水作用。在一種實施方式中，化學發光標記與分析物特異性結合伴侶共價連接。在一些實施方式中，化學發光標記化合物被間接地連接于特異性結合配對中一個成員的一個以上拷貝。在另一些實施方式中，一個以上化學發光標記化合物被間接地連接于特異性結合配對中一個成員的一個拷貝。間接連接除化學發光標記化合物和特異性結合配對成員之外還可包括一種或多種輔助物。輔助物可溶于水溶液，含有一種以上輔助物的化學發光標記sbp可溶于水溶液。在不同的實施方式中，輔助物包括可溶性蛋白質(例如鏈霉親合素、親合素、中性親合素、生物素、陽離子化牛血清白蛋白、fos蛋白、jun蛋白、匙孔血藍蛋白“KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片斷或部分)、可溶性的合成樹狀聚體(如PAMAM)、可溶的合成聚合物(如聚丙烯酸“PAA”)，可溶性的天然聚合物(如功能化的右旋糖苷、氨基右旋糖苷的多糖、低聚核苷酸、蛋白質、及其組合物)、脂質體、膠束、泡囊、及一種以上可溶合成聚合物、 可溶天然聚合物和可溶性蛋白質的組合物(如免疫球蛋白G/生物素/鏈霉親合素/PAA)。 其他可溶于水溶液、并能使一個以上化學發光標記化合物sbp附著的輔助物，預想可以應用在本發明和方法中。在一些的實施方式中，化學發光標記共價連接的輔助物是蛋白質或肽。例舉的可溶蛋白質包括白蛋白、親合素、鏈霉親合素、α螺旋蛋白、fos蛋白、jun蛋白、匙孔血藍蛋白 “KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片段或部分、及它們的任意組合物。在一種實施方式中，輔助物是通用抗體比如IgG，其中化學發光標記與通用抗體通過可維持分析物特異性捕捉抗體的結合親合力的方式共價連接。在另一個化學發光標記sbp實施方式中，化學發光化合物經由生物素-鏈霉親合素或生物素-中性親合素的結合而連接一個以上sbp。當化學發光化合物處于鏈霉親合素共軛時，化學發光標記sbp與鏈霉親合素-生物素的結合或相當的連接例如可以使特異性結合伴侶成為一個生物素共軛物。生物素-鏈霉親合素的選擇性排列(arrangement)及類似的連接已為人所知。作為選擇，化學發光標記sbp與鏈霉親合素-生物素的結合或相當的連接可以利用用于sbp或化學發光化合物與一個以上附加的輔助物之間附著的連接。在另一種實施方式中，與化學發光標記共價連接的輔助物質是合成聚合物。。使用聚合物輔助物用于連接化學發光化合物的測定形式能夠通過共價鍵比如生物素-親合素共軛物而連接于分析物特異性結合伴侶，，或者通過使用通用捕捉成分比如種類特異性免疫球蛋白的間接附著來連接。在優選的實施方式中，化學發光標記sbp包括輔助物，該輔助物選自多糖或可溶性自組裝(self-assembling)蛋白質。在一些實施方式中，化學發光標記sbp包括多糖，比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在一些實施方式中，多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷有IOkDa到500kDa的平均分子量。在另外一些實施方式中，有25 150kDa的平均分子量。在進一步的實施方式中，化學發光標記sbp包括平均分子量為50-100kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在更進一步的實施方式中，化學發光標記sbp包括平均分子量為70kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。
在許多實施方式中，化學發光標記sbp的平均直徑在5nM到SOOnM的區間內。在優選的實施方式中，包含可溶性蛋白質、或其他可溶性自然或合成聚合物、或它們的組合物，化學發光標記sbp的平均直徑在200nM到600nM的區間內；在進一步的實施方式中，在300nM 到500nM的區間內。
活化劑標記(的)sbp
本發明的方法要求使用連接于第一個特異性結合伴侶的活化劑化合物(活化劑標記sbp) ο在本發明公開的測定和方法中，活化劑標記的sbp可溶于水溶液。在本公開的測定和方法中，不同于在其他親合性測定和方法中看到的那樣，活化劑化合物不固定在諸如微粒、多微孔板、膜片、濾紙、試管、試紙、移液吸頭等固體表面。活化劑標記sbp包括一個活化劑標記化合物和一個特異性結合配對。在一些實施方式中，一個活化劑標記sbp中含有一個以上活化劑化合物。在一些實施方式中，一個活化劑標記sbp中含有一個以上特異性結合配對成員的拷貝。在一些實施方式中，一個活化劑化合物直接連接一個以上特異性結合配對的拷貝。在一些實施方式中，一個以上活化劑標記化合物直接連接一個特異性結合配對成員的拷貝。直接連接，也稱為直接標記，包括共價結合作用，離子結合作用，疏水作用。在一種實施方式中，活化劑標記與分析物特異性結合伴侶共價連接
在一些實施方式中，活化劑標記化合物間接連接一個以上特異性結合配對成員的拷貝。在另一些實施方式中，一個以上活化劑標記化合物間接連接特異性結合配對成員的一個拷貝。間接連接在活化劑標記化合物和特異性結合配對成員之外包括輔助物。輔助物通常可溶于水溶液。含有一個以上輔助物的活化劑標記sbp可溶于水溶液。在不同的實施方式中，輔助物包括可溶性蛋白質，例如鏈霉親合素，親合素，中性親合素，生物素，陽離子化BSA，fos蛋白，jim蛋白，匙孔血藍蛋白〃 KLH"，合成或天然的免疫球蛋白及其片斷或部分，可溶的合成樹狀聚體(如PAMAM)，可溶的合成聚合物(如聚丙烯酸“PAA”)，可溶的天然聚合物，如功能化右旋糖苷，氨基右旋糖苷的多糖，低聚核苷酸，蛋白質，及其組合物，脂質體，膠束，泡囊，及一個以上可溶合成聚合物，可溶天然聚合物和可溶性蛋白質的組合物(如免疫球蛋白G/生物素/鏈霉親合素/PAA)。其他可溶于水溶液并能使一個以上化學發光標記化合物，特異性結合伴侶附著的輔助物，預想可以應用在本發明和方法中。在一些的實施方式中，活化劑標記共價連接的輔助物是蛋白質或肽。例舉的可溶蛋白質包括白蛋白、親合素、鏈霉親合素、α螺旋蛋白、fos蛋白、jim蛋白、匙孔血藍蛋白“KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片段或部分、及它們的任意組合物。在一種實施方式中，輔助物是通用抗體比如IgG，其中活化劑標記與通用抗體通過可維持分析物特異性捕捉抗體的結合親合力的方式共價連接。在另一個活化劑標記sbp實施方式中，活化劑經由生物素-鏈霉親合素或生物素-中性親合素的結合而連接一個以上sbp。當活化劑處于鏈霉親合素共軛時，活化劑標記sbp與鏈霉親合素-生物素的結合或相當的連接例活化劑如可以使特異性結合伴侶成為一個生物素共軛物。生物素-鏈霉親合素的選擇性排列 (arrangement)及類似的連接已為人所知。作為選擇，活化劑標記sbp與鏈霉親合素-生物素的結合或相當的連接可以利用用于sbp或活化劑與一個以上附加的輔助物之間附著的連接。在另一種實施方式中，與活化劑標記共價連接的輔助物質是合成聚合物。。使用聚合物輔助物用于連接活化劑化合物的測定形式能夠通過共價鍵比如生物素-親合素共軛物而連接于分析物特異性結合伴侶，，或者通過使用通用捕捉成分比如種類特異性免疫球蛋白的間接附著來連接。在優選的實施方式中，活化劑標記sbp包括輔助物，該輔助物選自多糖或可溶性自組裝(self-assembling)蛋白質。在一些實施方式中，活化劑標記sbp包括多糖，比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在一些實施方式中，多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷有 IOkDa到500kDa的平均分子量。在另外一些實施方式中，有25 150kDa的平均分子量。在進一步的實施方式中，活化劑標記sbp包括平均分子量為50-100kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在更進一步的實施方式中，活化劑標記sbp包括平均分子量為70kDa 的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。平均分子量在70kDa。
在大部分實施方式中，活化劑標記sbp的平均直徑在200kDa到3000kDa的范圍內。在一些的實施方式中，活化劑標記sbp的平均分子量在350kDa到1500kDa。 活化劑標記活化劑化合物形成了被活化劑標記的sbp的一部分，其還可以被認為是活化劑特異性結合成員共軛物。被活化劑標記的Sbp具有雙重作用1)在測定中，通過特異性結合伴侶部分直接地或者通過中間的特異性結合伴侶而特異性地經受與分析物含量成比例的特異性結合反應，和2~)通過活化劑部分激活化學發光化合物。被活化劑標記的sbp的活化劑部分是具有活化化學發光化合物的效果的化合物，使得當存在引發劑溶液時產生化學發光。能夠用作活化劑標記的化合物包括具有過氧化物酶類活性的含有過渡金屬鹽和復合物以及酶的化合物，尤其是含有過渡金屬的酶，更尤其是過氧化物酶。在活化劑化合物中有用的過渡金屬包括周期表中第3-12族的那些過渡金屬，尤其是鐵、銅、鈷、鋅、錳、鉻、以及釩。可以經受化學發光反應的過氧化物酶包括，例如乳過氧化物酶、微小過氧化物酶、髓過氧化物酶、商素過氧化物酶、釩溴過氧化物酶、辣根過氧化物酶、真菌的過氧化物酶、木質素過氧化物酶和來源于Arthromyces ramosus的過氧化物酶、以及在白腐真菌中產生的Mn依賴性過氧化物酶、以及大豆過氧化物酶。其他已知并不是酶、但是具有過氧化物酶狀活性的仿過氧化物酶的化合物包括鐵復合物，比如亞鐵原卟啉、以及 Mn-TPPS4 (Y. -X. Ci, et al. , Mikrochem. J. ,52 :257-62 (1995))。上述這些物質可催化底物的化學發光氧化，并且應明確地認為包含于在此使用的過氧化物酶含義的范圍內。在一些實施方式中，在用于產生化學發光的方法中，被活化劑標記的sbp可以包括過氧化物酶和生物分子的共軛物或復合物，唯一的附帶條件是該共軛物可顯示出過氧化物酶活性或過氧化物酶狀活性。可以結合于一種以上過氧化物酶分子的生物分子包括 DNA、RNA、低聚核苷酸、抗體、抗體片段、抗體-DNA嵌合體、抗原、半抗原、蛋白質、肽、凝集素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和生物素。還可以在本發明公開的方法中使用包含或者結合過氧化物酶的復合物，比如脂質體、膠束、泡囊和因連接生物分子而具功能化的聚合物。
選擇性信號抑制劑(SSIA)本發明的選擇性信號抑制劑是這樣的化合物當其被包括在包含游離的和/或被分析物結合的化學發光標記的sbp、游離的和/或被分析物結合的被活化劑標記的sbp、增強劑和引發劑溶液的測定反應混合物中時，從被分析物結合的標記Sbp成員得到的信號超過背景信號的程度顯著地大于沒有SSIA時發生的超出程度。反應方法中存在的一種以上選擇性信號抑制劑的濃度在10_6M和IO4M之間、常常在lO—M和IOl之間、經常在IOl和之間、有時在IOl和IO4M之間。在一些實施方式中，在根據本發明方法的反應中選擇性信號抑制劑存在的濃度在和切10_%之間。在更進一步的實施方式中，在根據本發明方法的反應中選擇性信號抑制劑存在的濃度在 5x1 (T5M 禾口 5x104M 之間。選擇性信號抑制劑能夠被作為單獨的試劑或者濃度比在待進入的反應溶液中更高的溶液提供。本實施方式中，實測量的工作溶液被定量加入反應溶液中，以達到期望的反應濃度。在另一個實施方式中，選擇性信號抑制劑被合并進入含有一種或多種被標記的sbp 成員的溶液中。在另一個實施方式中，選擇性信號抑制劑被作為引發劑溶液的組分提供。選擇性信號抑制劑提高信噪比的程度將依據化合物的一致性和使用時的濃度、連同其它因素而改變。該程度能夠被作為提高倍數的術語，其中該倍數為在特定的分析物濃度下通過使用選擇性信號抑制劑而進行的測定中的信噪比與在相同的分析物濃度下在不含選擇性信號抑制劑情況下進行的測定中的信噪比相比較的倍數。提高倍數> 1是改進的測定方法的量規和選擇性信號抑制劑的有益效果的證據。在本發明的實施方式中，可取得至少2比如至少5、并包括至少10、或至少50的提高倍數。參照下述實施例，將可看到，提高倍數能夠在測定范圍內作為分析物濃度的函數而改變。例如，提高倍數可以隨著分析物濃度增加而提高。在另一個實施方式中，提高倍數隨濃度的變化可以導致較為線性的校準曲線，即化學發光強度對分析物濃度的曲線。下面的表中列出了，但不限于，能夠有效地具有選擇性信號抑制劑功能的化合物。 利用本發明的公開教導，包括測定法的常規應用和在實施例中描述的篩選試驗方法，能夠找到未明確敘述的另外的化合物。
表1.選擇性信號抑制劑
權利要求
1.一種測定樣品中分析物的方法，該測定方法包括通過以任何次序或同時加入下列物質，在水溶液中形成反應混合物樣品，化學發光標記的特異性結合伴侶，活化劑標記的特異性結合伴侶，和選擇性信號抑制劑，其中所有成分皆可溶于水溶液，其中所述化學發光標記的特異性結合伴侶和所述活化劑標記的特異性結合伴侶可與樣品中的分析物相結合，形成結合性復合體。在反應混合物中加入引發劑溶液，其中引發劑溶液可釋放出一種可檢測的化學發光信號，該信號與反應混合物中與分析物結合的化學發光標記的特異性結合伴侶及活化劑標記的特異性結合伴侶的量相關。
2.如權利要求1所述的測定樣品中分析物的方法，其特征在于，以任何次序或同時加入從而形成反應混合物的物質進一步包括增強劑。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述選擇性信號抑制劑可引起，在具有分析物的復合體中化學發光標記與活化劑標記之間的反應所產生的信號比率，超過不在這樣的復合體中時化學發光標記與活化劑標記之間的反應所產生的信號比率。
4.如權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述選擇性信號抑制劑選自下組在鄰位或對位有至少兩個羥基的芳香化合物，在鄰位或對位有至少一個羥基和一個氨基的芳香化合物，在C-C雙鍵上有至少兩個取代的羥基的化合物，以及氮雜環化合物。
5.如權利要求1到4中任一項所述的方法，其特征在于，所述選擇性信號抑制劑選自下組抗壞血酸，異抗壞血酸，Trolox, L-抗壞血酸6-棕櫚酸酯，5,6-異亞丙基-L-抗壞血酸，BHT,谷胱甘肽，尿酸，生育酚，兒茶酚。
6.如權利要求1到5中任一項所述的方法，其特征在于，所述化學發光標記的特異性結合伴侶包含直接或間接地連接于特異性結合配對成員的化學發光標記化合物，其中所述化學發光標記選自下組芳香環二酰基胼，三羥基芳香化合物，9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫代縮醛化合物，9，10- 二氫化吖啶酯，9，10- 二氫化吖啶硫酯，9，10- 二氫化吖啶磺胺，9， 10- 二氫化吖啶硫醇衍生物，以及下述化學式VI所示的化合物，其中R1選自烷基，鏈烯基，炔基，具有1到20個碳原子的芳烷基，其中任意一個碳可以被選自下組的1-3個基團取代羰基，羧基，三(C1-C8烷基)甲硅烷基，SO3-基團，0S03_2 基團，糖基，PO3-基團，OPCV2基團，鹵素原子，羥基，硫醇基，氨基，季銨基，或季鱗基；X選自 C1-C8烷基，芳基，芳烷基，具有1-20個碳原子的烷基或芳基羧基，三(C1-C8燒基)甲硅烷基， SO3-基團，糖基，三烷基甲硅烷基，堿金屬陽離子，堿土金屬陽離子，銨基，三烷基鱗陽離子和由式P0(0R' ) (OR")所示的磷酰基，其中R'和R〃獨立地選自=C1-C8烷基，氰烷基，芳基和芳烷基；Z1和Z2分別選自0或S原子；R2和R3獨立地選自氫和C1-C8烷基。
7.如權利要求1到6中任一項所述的方法，其特征在于，所述化學發光標記的固定化特異性結合成員包含直接或間接地連接于特異性結合成員的化學發光標記化合物，其中所述化學發光標記是下式所示的化合物，
8.如權利要求1到7中任一項所述的方法，其特征在于，所述活化劑標記的特異性結合伴侶包含直接或間接連接于特異性結合配對成員的活化劑標記，其中活化劑標記選自下組過渡金屬鹽，過渡金屬絡合物和酶，所述活化劑標記具有過氧化物酶活性。
9.如權利要求1到8中任一項所述的方法，其特征在于，所述活化劑標記化合物是過氧化物酶。
10.如權利要求1到9中任一項所述的方法，其特征在于，所述化學發光標記的特異性結合伴侶和活化劑標記的特異性結伴侶中的至少一個包含選自下組的輔助物質可溶性蛋白質，鏈霉親合素，親合素，中性親合素，生物素，陽離子化牛血清白蛋白，fos蛋白，jim蛋白，可溶性合成樹狀聚合物，可溶性合成聚合物，可溶性天然聚合物，多糖，右旋糖苷，寡核苷酸，脂質體，膠束，以及泡囊。
11.如權利要求1到10中任一項所述的方法，其特征在于，增強劑是促進具有過氧化物酶活性的活化劑的催化周轉的一種化合物或多種化合物的混合物。
12.如權利要求11中任一項所述的方法，其特征在于，所述增強劑選自下組酚類化合物，芳族胺，苯丙唑，羥基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它們的混合物。
13.如權利要求1-12中任一項所述的方法中，其特征在于，所述引發劑溶液包含過氧化物化合物。
14.如權利要求1-13中任一項所述的方法中，其特征在于，所述引發劑溶液包含選自下組的增強劑酚類化合物，芳族胺，苯丙唑，羥基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它們的混合物。
15.如權利要求1-14中任一項所述的方法中，其特征在于，所述化學發光標記的特異性結合伴侶和活化劑標記的特異性結合伴侶分別與樣品中的分析物結合。
16.如權利要求1-15中任一項所述的方法，其特征在于，所述化學發光標記的特異性結合伴侶包括連接于分析物類似物的化學發光標記，并且所述分析物和所述化學發光標記的類似物競相與活化劑標記的特異性結合伴侶結合。
17.如權利要求1-16中任一項所述的方法，其特征在于，所有成分皆可溶于水溶液。
18.如權利要求1-17中任一項所述的方法，其特征在于，沒有成分直接或間接地共軛于微粒或其他固相。
19.一種用于檢測樣品中分析物的試劑盒，其包括分析物的第一個特異性結合伴侶，共軛于所述第一個特異性結合伴侶的化學發光化合物，分析物的第二個特異性結合伴侶，和共軛于所述第二個特異性結合伴侶的活化劑化合物，選擇性信號抑制劑，以及引發劑溶液。
20.如權利要求19所述的試劑盒中，其特征在于，所有的成分皆可溶于水溶液。
21.如權利要求19-20中任一項所述的試劑盒，其特征在于，沒有成分直接或間接地共軛于微粒或其他固相。
22.如權利要求19-21中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述選擇性信號抑制劑選自下組在鄰位或對位有至少兩個羥基的芳香化合物，在鄰位或對位有至少一個羥基和一個氨基的芳香化合物，在C-C雙鍵上至少有兩個取代的羥基的化合物，以及氮雜環化合物。
23.如權利要求19-22中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發光化合物選自下組芳香環二酰基胼，三羥基芳香化合物，9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫代縮醛化合物， 9，10- 二氫化吖啶酯，9，10- 二氫化吖啶硫酯，9，10- 二氫化吖啶磺胺，9，10- 二氫化吖啶硫醇衍生物，下式VI所示的化合物，
24.如權利要求19到23中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述活化劑化合物選自過渡金屬鹽、過渡金屬絡合物和酶，所述活化劑標記具有過氧化物酶活性。
25.如權利要求19-24中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述引發劑溶液包含選自下組的過氧化物過氧化氫，過氧化脲，過硼酸鹽。
26.如權利要求19-25中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述引發劑溶液包含選自下組的增強劑酚類化合物，芳族胺，苯丙唑，羥基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它們的混合物。
27. 一種用于進行權利要求1所述測定方法的系統，其包括 將樣品輸送到反應混合物中的液體處理系統，將化學標記的特異性結合伴侶、活化劑標記的特異性結合伴侶、選擇性信號抑制劑輸送到反應混合物中的液體處理系統，將引發劑溶液輸送到反應混合物中以便釋放化學發光信號的液體處理系統，以及用以檢測化學發光信號的檢測系統，其中，用以輸送引發劑溶液的所述液體處理系統與所述檢測系統協調作用，以便在注入引發劑溶液時或注入后測量化學發光信號釋放。
全文摘要
本發明公開了用于檢測懷疑含有反應物的樣品中反應物的方法、試劑、試劑盒和系統，其中所有的試劑皆可溶于水溶液。一種測定方法包括在反應物存在的條件下，處理懷疑含有反應物的樣品，使活化劑達到反應構型，化學發光化合物將其激活。樣品還被處理以減少與分析物不相關的信號。最后，用引發劑溶液處理該樣品，借此由被激發的化學發光化合物產生光。沒有試劑與某一表面或其他固相相連接。
文檔編號G01N33/58GK102333886SQ201080009871
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月26日 優先權日2009年2月27日
發明者B·厄德戈德, D·賓格, H·阿哈萬·塔夫狄, J·門多薩, M·薩爾瓦蒂, N·沙皮爾, R·德席爾瓦, T·麥克勒農, 謝文華, 陳英 申請人:貝克曼考爾特公司