專利名稱：具有增強的免疫球蛋白重鏈類別轉(zhuǎn)換至Cε的高IgE動物模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及重組小鼠和檢驗過敏反應治療的方法。背景哮喘是一種令人虛弱的疾病，其影響發(fā)達國家人口的1/5。重度哮喘是住院治療和醫(yī)療保健費用的主要原因。在臨床實踐中，根據(jù)通過皮膚點刺試驗(prick test, SPT)或體外技術(shù)(RAST或ELISA)檢測的針對局部空氣變應原的循環(huán)IgE的存在或缺乏，將哮喘劃分為特應性或非特應性。這些IgE抗體與肥大細胞上的高親和力IgE受體(FceRI)相互作用，這可導致在變應原觸發(fā)下的速發(fā)型超敏反應和疾病的急性惡化。大約1/3的成年哮喘患者被劃分為非特應性的。他們傾向于具有更嚴重的疾病， 經(jīng)常伴隨慢性鼻竇炎，但除了他們?nèi)狈ψ儜募毙苑磻砸酝?，他們的疾病在臨床上是類似的。過敏反應是一種免疫反應，通常是對特定類型的抗原(被稱為變應原)的速發(fā)型超敏反應類型。這些反應引起過敏癥、變應性鼻炎(枯草熱)、蕁麻疹和變應性哮喘的攻擊，并可被普通的變應原例如豚草、花粉、蜜蜂或黃蜂毒、動物皮屑、霉菌或室內(nèi)塵埃的成分 (例如螨蟲)所觸發(fā)。在哮喘、變應性鼻炎和特應性皮炎之間具有緊密的一致性；這些疾病中的一種的存在在受試者的一生中增加3至30倍另外2種疾病的相對風險。所有3種這些疾病與高水平的非特異性和抗原特異性血清免疫球蛋白E(IgE)相關(guān)。在人中，速發(fā)型超敏反應(IH)由在皮膚和別處的肥大細胞和嗜堿粒細胞表面所錨定的IgE同種型抗體介導?？乖瓦@些結(jié)合在細胞上的IgE分子的結(jié)合觸發(fā)介體例如組胺從細胞中釋放，這些介體引起代表過敏反應的臨床現(xiàn)象例如組織腫脹、發(fā)癢或支氣管平滑肌收縮。特異性針對給定變應原的IgE抗體通過B淋巴細胞在接觸了該變應原后產(chǎn)生和分泌。最初，B淋巴細胞(或B細胞)表達IgM同種型抗體，其中每個B細胞固定產(chǎn)生特異性針對特定抗原決定簇的抗體。與具有該抗原決定簇的變應原和T淋巴細胞產(chǎn)生的某些因子二者的接觸將誘發(fā)B細胞經(jīng)歷所謂的抗體重鏈類別轉(zhuǎn)換，其中由B細胞產(chǎn)生的抗體的抗原特異性部分保持不變，但其連接至重鏈(以產(chǎn)生IgE抗體)而不是IgM同種型的μ-重鏈。這樣的類別轉(zhuǎn)換對給定的B細胞顯然是永久的，之后其無論何時被刺激以進行分泌時，將分泌特異性針對所述變應原的IgE抗體。在小鼠中的卵清蛋白(OVA)誘發(fā)的哮喘是最常使用的人哮喘模型。認為Th2型細胞在OVA誘發(fā)的哮喘的發(fā)病機理中是關(guān)鍵的。盡管我們知道Th2淋巴細胞在變應性哮喘的開始、發(fā)展和持續(xù)中發(fā)揮重要作用，但有關(guān)免疫調(diào)節(jié)機制仍有許多有待了解。此模型不能模擬和高IgEQiyper IgE)相關(guān)的人疾病。已在大動物模型例如貓、狗、豬、綿羊和猴中描述了變應性哮喘模型。在這些物種中，貓科動物是特別引起關(guān)注的因為貓自發(fā)地產(chǎn)生特發(fā)性哮喘。然而，大動物模型很昂貴且費時并僅可使用有限的免疫學和/或分子工具。US 6118044(2000)提供了轉(zhuǎn)基因小鼠，其組成型地表達由轉(zhuǎn)基因編碼的抗體類型分子，并且該分子具有IgE重鏈恒定區(qū)并特異性針對預定義的抗原(即TNP)。其對未知或非特異性抗原不提供多克隆應答。目前沒有慢性氣道疾病的理想模型，因為小鼠缺乏人哮喘的許多關(guān)鍵病理學特征，例如平滑肌的肥大細胞浸潤。此外，幾乎在所有小鼠中哮喘均在一段時間后自發(fā)消退， 因為小鼠不會患哮喘。因此，希望具有允許產(chǎn)生相對天然非人動物的提高的IgE應答的非人動物模型，其中抗體譜是多克隆的。目前，過敏反應的普通治療包括回避可疑變應原；注射變應原作為免疫療法以刺激一定的保護性機制并由此最終使宿主對變應原脫敏；藥物例如皮質(zhì)類固醇，其干擾過敏反應介體從肥大細胞釋放；和藥物例如抗組胺，其阻止釋放的介體的生物學作用。然而，沒有用于檢測過敏反應治療的理想動物模型，特別是對阻斷B細胞中的IgE同種型轉(zhuǎn)換、同時沒有不良反應的治療劑。因此，希望具有能夠產(chǎn)生提高的IgE應答的細胞和/或動物。換句話說，希望選擇性增強用于IgE產(chǎn)生的鏈轉(zhuǎn)換重組率。發(fā)明概述盡管目前正在進行研究，仍然需要IgE參與哮喘、過敏反應和其他免疫病理學的體內(nèi)模型，并且所述模型對非特異性抗原(即抗原不是預定義的)提供多克隆應答。也缺乏用于高IgE產(chǎn)生的體內(nèi)動物模型，其中具有提高的血清IgE應答。本文提供了重組非人動物和使用其的方法，所述動物可用作用于尋找和/或評估抗變應性藥物的可靠模型。在免疫球蛋白基因座內(nèi)具有和野生型(即天然或未修飾的)免疫球蛋白基本上類似、并保留提供響應抗原攻擊的免疫球蛋白完整組成成分潛能的基因組結(jié)構(gòu)的動物模型將允許尋找和/或評估抗變應性藥物，所述藥物抑制B細胞中的IgE同種型轉(zhuǎn)換。本公開提供了用于檢測過敏反應治療的動物模型。所述動物模型提供響應抗原攻擊的廣泛多樣性的抗體產(chǎn)生，產(chǎn)生全部多樣性的抗體同種型和具有針對抗原上的表位特異性的全部補體。所述動物模型還提供了進一步理解IgE對過敏反應和哮喘的生理學重要性的手段。在第一個實施方案中提供了靶向載體，其包含a)與待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)5’端同源的DNA片段(5’臂/受體)，其選自對應NCBI登錄號NT_166318(小家鼠(Mus musculus)染色體12基因組重疊群，品系C57BL/6J)的第 25470628至25468161位核苷酸(SEQ ID NO 5)的至少1500個核苷酸、至少1800個核苷酸、至少2000個核苷酸、至少2200個核苷酸和至少MOO個核苷酸；b)可選擇的基因標記；c)期望的/供體DNA序列，其編碼供體轉(zhuǎn)換區(qū)；和d)與待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)3’端同源的第二個DNA片段(3’臂/受體)，其選自對應 NCBI登錄號NT_166318(小家鼠染色體12基因組重疊群，品系C57BL/6J 1)的第254706 至2546816位核苷酸(SEQ ID NO 8)的至少1500個核苷酸、至少1800個核苷酸、至少2000 個核苷酸、至少2200個核苷酸、至少MOO個核苷酸和至少觀00個核苷酸。在一個方面靶向載體具有包含SEQ ID NO :4或5的5，臂。在一個實施方案中，5， 臂包含SEQ ID NO :4的第25-2471位殘基(包含端點)。在另一個方面，5，臂與內(nèi)源I ε的 3’和內(nèi)源Se的5’區(qū)同源。在第二個方面，靶向載體具有包含SEQ ID Ν0:7或8的3’臂。 在一個實施方案中，3，臂包含SEQ ID Ν0:7的第2-Μ95位殘基(包含端點)。在第三個方面，靶向載體具有可選擇的基因標記，其選自新霉素和胸苷激酶。在另一個方面，可選擇的基因標記是新霉素。在第四個方面，靶向載體具有兩側(cè)為Ioxp位點的可選擇的基因標記。 在第五個方面，靶向載體具有選自人和小鼠的期望的轉(zhuǎn)換區(qū)。在第六個方面，期望的轉(zhuǎn)換區(qū)選自Sy，Sy1，SY^I，SY^*SY3。在第七個方面，期望的轉(zhuǎn)換區(qū)是含有小鼠Sμ區(qū)的大部分的Hindlll/Nhel片段。在第八個方面，期望的轉(zhuǎn)換區(qū)包含NCBI登錄號NT_166318 (小家鼠染色體12基因組重疊群，品系C57BL/6J 1)的第25617172至25615761位核苷酸(SEQ ID NO :6)。在第九個方面Sy區(qū)包含4. 9 kb NheI-HindIII片段，所述片段從含有分離自 BAC克隆RP23-3ML16的基因組片段的質(zhì)粒上經(jīng)亞克隆得到。在第二個實施方案中提供了體外產(chǎn)生改變的胚胎干細胞的方法，其包括以下步驟a)在所述細胞中改變基因組DNA以增強類別轉(zhuǎn)換重組(CSR)的可能性，以表達選自的C εb)通過添加與內(nèi)源S ε區(qū)串聯(lián)的至少一個另外的S ε拷貝增加S ε長度；c)Se區(qū)取代；和d)選擇具有正確改變的基因組DNA的細胞。在一個方面，改變是用選自Sy，SY l，SY^i，SY2b和SY3的轉(zhuǎn)換區(qū)取代S ε區(qū)。 在另一個方面，改變是用Sy區(qū)取代S ε區(qū)。在另一個方面，改變是用Sm取代任意受體S 區(qū)(S γ 1，S γ 2a，S γ 2b 禾口 S γ 3，Sa)或反之亦然。在第三個實施方案中提供了體外產(chǎn)生改變的胚胎干細胞(ESC)的方法，其包括以下步驟a)使用根據(jù)權(quán)利要求1的載體用Sy交換S ε區(qū)b)選擇具有正確改變的基因組DNA的細胞。在一個方面，所述方法提供了這樣的改變，即用選自Sy，Sy 1，SY 2a，SY 2b禾口 SY3的轉(zhuǎn)換區(qū)取代Se區(qū)。在另一個方面，所述方法提供了這樣的改變，即用Sy區(qū)取代 Se區(qū)。在另一個方面，所述方法提供了來自選自BALB/c或C57BL/6的小鼠品系的ESC。在第四個實施方案中提供了非人動物，其中a) IgH基因座的至少一個等位基因已被改變，以提高相對未改變的等位基因的 IgE表達/產(chǎn)生/分泌率；和
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b)具有選自下述的I gE譜i.所有血清抗體的IgE部分大于0. 04% ；ii. IgE 血清濃度大于 4，000ng/ml ；iii. IgG/IgE 比例低于 10。在第一個方面，非人哺乳動物具有大于4，000ng/ml，大于10，000ng/ml，大于 15，000ng/ml,大于 30，000ng/ml,大于 90，000ng/ml,大于 10 μ g/ml,大于 20 μ g/ml,大于 30μ g/ml，大于 40 μ g/ml，大于 50 μ g/ml，大于 60 μ g/ml，大于 70 μ g/ml，大于 80 μ g/ml， 大于90 μ g/ml或大于100 μ g/ml的IgE血清水平。在第二個方面，非人哺乳動物具有0. 1 和10之間的IgG/IgE比例。在第三個方面，非人哺乳動物具有100ng/mL和10000ng/mL之間的未攻擊的(即靜息)IgE血清濃度。在第四個方面，非人哺乳動物具有l(wèi)OOOng/mL和 lOOOOOOng/mL之間的攻擊后的(即激活的或刺激的)IgE血清濃度。在第五個方面，動物模型是非人脊椎動物。在第六個方面，動物模型是小鼠、大鼠、豚鼠、兔或靈長類。在第七個方面，本文描述的非人動物的基因組具有經(jīng)改變以表達/產(chǎn)生更多IgE的IgH基因座的 Se區(qū)。在第八個方面，非人動物/哺乳動物模型具有通過基因打靶實現(xiàn)的改變。在第九個方面，非人哺乳動物具有至少 0. 04%, 0. 1 %, 0. 2%, 0. 3%, 0. 4%, 0. 5%, 0. 6%, 0. 7%, 0. 8%,0. 9%或 1. 0%的 IgE 部分。在第五個實施方案中提供了使用所述動物模型檢測過敏反應治療的方法，其包括在施用所述方法治療變應性疾病以前、同時或之后使所述動物接觸變應原，并評估IgE應答。在所述方法的第一個方面響應抗原攻擊的IgE水平低于未經(jīng)過敏反應治療的水平。在第二個方面，檢測的動物和對照動物是同窩出生仔畜。在第六個實施方案中提供了通過檢測過敏反應治療的方法鑒定的化合物作為藥物治療過敏反應的用途。在第七個實施方案中提供了可從本文描述的動物模型中得到的細胞系。在第八個實施方案中提供了從本文描述的動物模型中分離的細胞。在第九個實施方案中提供了產(chǎn)生非人動物模型的方法，所述方法包括a)將編碼SEQ ID N0:6(Sy)的質(zhì)粒的線性化片段顯微注射至小鼠的受精卵中從而使所述片段摻入C ε -編碼區(qū)的上游基因組DNA并與C ε -編碼區(qū)有效連接，b)將所述受精卵轉(zhuǎn)移至之前已經(jīng)處理以誘發(fā)假孕的雌性小鼠的輸卵管，和c)允許所述卵在所述雌性小鼠的子宮中發(fā)育。在第十個實施方案中提供了重組小鼠，在其種系中包含經(jīng)改造的基因組，其中所述改造包含經(jīng)改變以提高IgE產(chǎn)生率的IgH基因座的至少一個等位基因。在第一個方面， 重組小鼠具有這樣的改變，即其包含用Sy區(qū)或其功能性部分替換Se。在第二個方面，S μ 功能性部分的長度在至少11Λ和101Λ之間。通過以下詳細說明本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)勢將變得顯而易見。然而應當理解，詳細說明和特定實施例盡管指示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅以說明的方式提供，因為通過此詳細描述，在本發(fā)明范圍和精神內(nèi)的多種改變和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。附圖簡述
圖1是小鼠IgH基因座遺傳改變的示意圖。㈧在種系構(gòu)型中直至Cm的可變區(qū)的基因組組織結(jié)構(gòu)。(B)V(D) J重組組裝功能性編碼可變區(qū)生成產(chǎn)生低親和力IgM的B細胞大型庫。(C)B細胞活化伴隨誘發(fā)AID和種系轉(zhuǎn)錄導致SHM，其中引入點突變至組裝的V區(qū) (星號)。連接在Sm和下游S區(qū)(例如Sgl)中AID介導的DSB (閃電符號)以產(chǎn)生新同種型(例如IgGl)的轉(zhuǎn)錄物。此外，通過連接間插序列產(chǎn)生被切除的環(huán)狀片段。圖2A展示了用于改造小鼠S ε區(qū)的基因打靶策略和重組位點的示意圖。在底部顯示了 Cre_l0XP重組后靶向的等位基因的結(jié)構(gòu)。指示了限制性酶的切割位點。Rl表示EcoRI 的剪接位點。所有其他限制酶具有其全名。圖2B是靶向載體pSW312的示意圖。見實施例3。圖3是用供體轉(zhuǎn)換區(qū)替換S ε區(qū)之前和之后的小鼠IgH基因座的總示意圖。在此圖表中供體轉(zhuǎn)換區(qū)是Sy。在上圖中是未改造的IgH基因座；下圖說明了如本文描述的經(jīng)改造的IgE基因座。圖4Α是未改造的(即野生型)基因組基因座的示意圖，并說明了限制位點、探針和轉(zhuǎn)換區(qū)的相對位置。黑色框代表5’同源臂。灰色框代表3’同源臂。圖4Β是經(jīng)改造的基因組基因座的示意圖并說明了限制位點、探針和用Sm替換k 的轉(zhuǎn)換區(qū)的相對位置。黑色框代表5’同源臂?；疑虼?’同源臂。圖4C是證明用S μ替換S ε的Southern印跡。野生型B6樣品僅顯示了相關(guān)大小的一條條帶，表明存在單個基因組I ε區(qū)時，而靶向的胚胎干細胞樣品顯示了野生型和靶向的Se區(qū)(其中用Sy替換S O，顯示為2條具有明顯不同的大小的帶。這表明成功的打靶和期望轉(zhuǎn)換區(qū)的替換。圖4D是證明用S μ替換S ε的Southern印跡。當野生型B6樣品僅顯示了相關(guān)大小的一條條帶，表明存在單個基因組I ε區(qū)時，靶向的胚胎干細胞樣品顯示了野生型和靶向的S ε區(qū)(其中用Sy替換S O，顯示為2條具有明顯大小差異的帶。這表明成功的打靶和期望轉(zhuǎn)換區(qū)的替換。圖5-11顯示了本文描述的核苷酸。核苷酸堿基編碼為Α或a是腺嘌呤；C或c是胞嘧啶；G或g是鳥嘌呤；T或t是胸腺嘧啶；M或m是腺嘌呤或胞嘧啶；S或s是胞嘧啶或鳥嘌呤；和N或η是腺嘌呤或胞嘧啶或鳥嘌呤或胸腺嘧啶。圖5顯示了來自小鼠的2條核苷酸序列。在Sm和k中發(fā)現(xiàn)基序GGGCTGGGCTG (SEQ ID NO 1，在圖5A中顯示)，第二個基序GAGCTGACT在k區(qū)中被輕微改造成GAGCTGAGCT (相比Sm基序具有一個添加的G) (SEQ ID NO :2，在圖5B中顯示)。圖6顯示了從IgH基因座的BamHI/PVuI片段中缺失的2055bp (SEQ ID NO :3)。圖 7 顯示了對應 NCBI NT_166318 的第 254706 至 25468161 位核苷酸的 A) SEQ ID NO :4,2471 bp 5，臂(129 小鼠)和 B) SEQ ID N0:5，2467bp 5，臂(C57B1/6J 品系)。圖8顯示了對應NCBI NT_166318 (小家鼠染色體12基因組重疊群，品系 C57BL/6J)的第25617172至25615761位核苷酸的SEQ ID NO :6 (以大寫字母表示) (1141bp)。圖 9 顯示了對應 NCBI NT_166318 的第 25466106 至 25463273 位核苷酸的 A) SEQ ID NO 7, 3'臂(129 小鼠序列)和 B) SEQ ID NO 8,3'臂(C57B1/6J 序列)。圖10 顯示了 A) BamHI 上游的 3. 7kb (用于設(shè)計 5，探針)(SEQ ID NO 9)和 B) PVUI 至ECORI片段(用于3，探針的設(shè)計)(SEQ ID NO 10)。
圖11顯示了在實施例2中使用的探針。A)SEQ ID NO :11，Ι-mu正向-lQlbp)； 和 B)SEQ ID NO :12, C- ε 反向-1 (30bp) ； C) SEQ ID NO 13，E_mu 正向-2 (20bp) ；D) SEQ ID NO 14, C- ε 反向-2 (30bp) ；Ε) SEQ ID NO 15，正向SM5，(20bp) ；F) SEQ ID NO :16， 9225F(19bp) ；G) SEQ ID NO 17,9518F (26bp)；和 H) SEQ ID NO: 18，反向(30bp)。圖12 是從 BAC RP23_i;35L12 Qnvitrogen)恢復的 IgE C57BL/6 基因組序列(用粗體、下劃線字體顯示待缺失的SE區(qū))(SEQ ID NO 19)。圖13A-D總結(jié)了在免疫刺激后在野生型(WT)和雜合子(HET)脾細胞中各種免疫球蛋白的細胞內(nèi)水平的FACS數(shù)據(jù)。圖13A是柱狀圖，顯示對WT和HET動物二者在脂多糖(LPQ刺激后的IgM水平是相同的。圖1 是柱狀圖，顯示對WT和HET動物二者在脂多糖(LPQ刺激后的IgG3水平是相同的。圖13C是柱狀圖，顯示相比WT，在IL-4組合抗-⑶4(K4/40)刺激后在HET動物中的IgGl水平減少。圖13D是柱狀圖，顯示相比WT，在 IL-4組合抗-CD40 (4/40)刺激后在HET動物中的IgE水平增加。圖14A-D總結(jié)了用于生成在圖13中展示的數(shù)據(jù)的相同的脾細胞的ELISA數(shù)據(jù)。在刺激后第6天，在ELISA測定中使用用于FACS分析的相同的受激脾細胞(3只Het和3只 WT小鼠)的上清。和我們在FACS分析中觀察到的一致，當用IL4/抗-⑶40刺激時，我們也觀察到相比WT，在Het中IgE表達水平的增加和IgGl表達水平的減少。這提示在SmKI位點存在更頻繁的斷裂，其與至IgGl的轉(zhuǎn)換競爭，并增加IgE轉(zhuǎn)換的水平。LPS刺激作為對照，并顯示W(wǎng)T和Het 二者具有類似的IgM和IgG3水平，提示當其他轉(zhuǎn)換序列可用于類別轉(zhuǎn)換時，所述基因座是完整的且正常發(fā)揮功能。發(fā)明詳述現(xiàn)在將使用以下定義和實施例僅通過參考的方式詳細描述本發(fā)明。明確引入本文提及的所有專利和出版物，包括在這些專利和出版物中公開的所有序列作為參考。除非在本文中另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與此發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的具有相同的含義。Singleton，等人，Dictiqnaky OF Miceobiology AND Moleculae Biology，第二版，John Wiley and Sons, New York (1994),禾P Hale & Marham, THE Haepee Collins Dict1Omey of Biology,Harper Perennial,NY(1991)為技術(shù)人員提供了在此發(fā)明中使用的許多術(shù)語的一般字典。盡管可使用與本文描述的方法和材料類似或等同的任意方法和材料實踐或檢驗本發(fā)明，在此描述了優(yōu)選的方法和材料。數(shù)字范圍包括定義范圍的數(shù)字。除非另外指出，核酸以5’至3’的方向從左到右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基的方向從左到右書寫。 用于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，實踐者可特別參照Sambrook等人，1989，和Ausubel FM等人， 1993。應當理解本發(fā)明不受限于描述的特定方法、實驗方案和試劑，因為這些可以改變。數(shù)字范圍包括定義范圍的數(shù)字。除非另外指出，核酸以5’至3’的方向從左到右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基的方向從左到右書寫，分別地。本文提供的標題不限制本發(fā)明的多個方面或?qū)嵤┓桨福ㄟ^參考說明書整體可領(lǐng)會本發(fā)明的多個方面或?qū)嵤┓桨?。相應地，緊接在下面定義的術(shù)語可通過參考說明書整體被更充分地定義。定義提供了新的重組非人宿主，特別是哺乳動物宿主，通常是鼠科動物，其中所述宿主能夠?qū)γ庖咴?又稱抗原)發(fā)動免疫應答。產(chǎn)生的免疫應答是抗體的完整庫，盡管總血清Ig濃度具有提高的IgE成分或部分。“重組的”指動物或細胞的DNA含有基因工程改造。因此，例如，“重組的動物”可為這樣的動物，其中至少一部分其細胞含有如本文描述的基因改造。類似地，“重組的細胞” 可為這樣的細胞，其中其基因組具有如本文描述的基因改造?！胺翘禺愋钥乖敝笇ι眢w而言是外源的任意物質(zhì)(如免疫原或半抗原)，其單獨引起免疫應答或在與較大的分子(如蛋白質(zhì))形成復合物后引起免疫應答，并且能夠與免疫應答的產(chǎn)物(如抗體或T細胞)結(jié)合。如本文使用的，“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類型(例如IgM或 IgG1)。如本文使用的，“同種型轉(zhuǎn)換”指這樣的現(xiàn)象，通過這種現(xiàn)象抗體的類型或同種型從一種Ig類型變?yōu)榱硪环NIg類型。如本文使用的，“非轉(zhuǎn)換同種型”指當沒有發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換時產(chǎn)生的重鏈同種型類型；編碼非轉(zhuǎn)換同種型的Ch基因通常是緊鄰經(jīng)功能性重排的VDJ基因下游的第一個Ch基因。如本文使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)換序列”指負責轉(zhuǎn)換重組的那些DNA序列。在類別轉(zhuǎn)換重組(CSR)中，“轉(zhuǎn)換供體”序列，通常是μ轉(zhuǎn)換區(qū)將位于在轉(zhuǎn)換重組中缺失的區(qū)域的5’(即上游)?！稗D(zhuǎn)換受體”區(qū)將位于待缺失區(qū)和替換恒定區(qū)(例如Y、ε，等等)之間。因為沒有特定的總是發(fā)生重組的位點，最終的基因序列通常是不可預測的。本文中轉(zhuǎn)換序列可與轉(zhuǎn)換區(qū)互換使用。在本文描述的基因改造的(即重組的)動物中改造轉(zhuǎn)換受體區(qū)以增加CSR從而提高血清IgE水平。S區(qū)是長度變化很大的大量、重復的內(nèi)含子序列(在小鼠中從2.0至6. 51Λ范圍的重復區(qū))。哺乳動物S區(qū)在非模板鏈上通常富含G并主要由串聯(lián)重復單元組成，其中某些基序占優(yōu)勢，例如 TGGGG，GGGGT, GGGCT, GAGCT 和 AGCT。如本文使用的術(shù)語“重排的”指一種重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型，其中在基本上編碼完整Vh或\結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象中，V區(qū)段的位置分別緊鄰D-J或J區(qū)段。可通過與種系DNA的比較鑒定重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座將具有至少一個重組的七聚體/九聚體同源元件。當涉及V區(qū)段時如本文使用的術(shù)語“未重排的”或“種系構(gòu)型”指這樣的構(gòu)型，其中V區(qū)段沒有經(jīng)過重組以緊鄰D或J區(qū)段。參見圖1。用于核酸，術(shù)語“基本同源”表示2種核酸或其指定序列，在最佳比對和比較時， 在合適的核苷酸插入或缺失的情況下，至少約80%的核苷酸，通常至少約90%至95%，和更優(yōu)選至少約98至99. 5%的核苷酸相同。可選地，當區(qū)段在選擇性雜交條件下與互補鏈雜交時為基本同源。核酸可在全細胞中、在細胞裂解物中或以部分純化或基本純化的形式存在。當通過標準技術(shù)，包括堿/SDS處理、CsCl顯帶(banding)、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域熟知的其他方法將核酸從其他細胞成分或其它污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質(zhì)中純化出來時，核酸是“分離的”或“處于基本純化的”。見F. Ausubel，等人，編Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York (1987)。
盡管經(jīng)常是天然序列(除了改造的限制位點等等)，來自cDNA、基因組或混合物的本發(fā)明的核酸組合物可被突變，其中依照標準技術(shù)提供基因序列。對編碼序列，這些突變可如期望地影響氨基酸序列。特別是，考慮與天然V、D、J、恒定、轉(zhuǎn)換序列和其他本文描述的這些序列基本同源的或從其來源的DNA序列(其中“來源的”表示一條序列和另一條序列同一或是從另一條序列改造而來)。當核酸被置于與另一個核酸序列有功能性關(guān)系時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子或增強子和編碼序列是有效連接的。就轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列而言，有效連接指被連接的DNA序列是連續(xù)的，并且當必須連接2個蛋白質(zhì)編碼區(qū)時，被連接的DNA序列是連續(xù)的且符合讀框的。對轉(zhuǎn)換序列，有效連接表示所述序列能夠影響轉(zhuǎn)換重組。用抗體庫響應外源抗原刺激的非人動物的設(shè)計需要動物體內(nèi)含有的免疫球蛋白基因在整個B細胞發(fā)育途徑中正確發(fā)揮功能。重鏈基因的正確功能包括同種型轉(zhuǎn)換。因此， 構(gòu)建本發(fā)明的基因以產(chǎn)生同種型轉(zhuǎn)換和以下一種或多種(1)高水平和細胞類型特異性表達，( 功能性基因重排，( 激活和應答等位基因排斥，(4)表達足夠的初級庫，( 信號轉(zhuǎn)導，(6)體細胞超變，和(7)在免疫應答期間顯性化IgE抗體基因座。在小鼠中，以5，-V(D) J-Cμ -C δ -C y 3~C y I-C γ 2b_C γ 2a_C ε -Ca -3'的順序排列CH基因。CSR在轉(zhuǎn)換⑶區(qū)發(fā)生，其是在每個CH基因5’的1-至10-千堿基(kb)重復 DNA元件。CSR由Cm上游的S區(qū)(Sm)和下游S區(qū)之間的重組產(chǎn)生，伴隨間插序列的缺失。免疫球蛋白免疫系統(tǒng)通過產(chǎn)生抗體響應外源侵入者(抗原)。抗體是蛋白質(zhì)分子，其將自身附著至入侵的微生物并將其標記，以將其破壞或阻止其感染細胞?？贵w是抗原特異性的。也就是說應答抗原接觸而產(chǎn)生的抗體對該抗原是特異性的。哺乳動物產(chǎn)生4種同種型(或類型)的Ig =IgM, IgG，IgE和IgA，分別由μ , Y , ε和α恒定區(qū)編碼。相關(guān)IgG亞型由不同的C Y區(qū)編碼。每種Ig同種型專門用于抗原去除的特定模式。IgM，由B細胞合成的第一種同種型，激活補體。IgG，在血清中最多的同種型，結(jié)合吞噬細胞上的受體。IgG抗體穿過胎盤以提供對胎兒的母體保護。IgA抗體在分泌物中富含，例如眼淚和唾液；其包被入侵的病原體以阻止其增殖。IgE抗體可提供對抗寄生線蟲類的保護，但在發(fā)達國家它們是壞人它們結(jié)合嗜堿粒細胞和肥大細胞，激活組胺釋放并導致變應性應答。免疫原(或抗原)可觸發(fā)抗體應答。對許多不同類型抗原的成功識別和根除需要抗體間的多樣性；其氨基酸組成的多變允許其與許多不同抗原相互作用。據(jù)預測人產(chǎn)生約 100億不同的抗體，每種能夠結(jié)合不同的抗原表位。盡管在單個個體中產(chǎn)生巨大的不同抗體庫，但產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)可利用的基因數(shù)是有限的。已進化出一些復雜的遺傳機制以允許脊椎動物B細胞從相對少數(shù)的抗體基因產(chǎn)生多種多樣的抗體庫。B細胞發(fā)育B細胞在其變?yōu)槌墒斓墓δ芗毎霸诠撬韬推⒅薪?jīng)歷了一系列分化關(guān)卡。在這些關(guān)卡發(fā)生例如是否繼續(xù)分化或經(jīng)歷細胞死亡的決策，并主要圍繞免疫球蛋白B細胞受體 (BCR)和其作為抗原結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導分子發(fā)揮功能的能力。最開始的2個這樣的關(guān)卡是骨髓中的pro-B至pre-B的轉(zhuǎn)變，其中新合成的重(H)鏈聯(lián)合替代輕(L)鏈以形成pre-BCR， 在pre-B至未成熟B細胞的階段中，H鏈聯(lián)合傳統(tǒng)L鏈以形成BCR。不能形成pre-BCR或 BCR的細胞經(jīng)歷凋亡(程序性細胞死亡)，而那些可以形成BCR的細胞繼續(xù)分化。移動至外周的成熟B細胞可被抗原激活并變成分泌抗體的漿細胞或記憶B細胞，記憶B細胞可更快速地響應第二次抗原接觸。當抗原激活的B細胞停止增殖時它們可分化為成熟漿細胞。漿細胞本質(zhì)上是“抗體工廠(見 Hardy & Hayakawa，B Cell Development Pathways, Annu Rev Immunol. (2001) 19 :595-621.)最初，所有B細胞產(chǎn)生IgM抗體。編碼m重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的V、D和J元件的位置和免疫球蛋白重鏈(IgH)基因座5’末端的編碼IgMC區(qū)的Cm外顯子毗連。在適當?shù)拇碳ず?，B細胞可通過類別轉(zhuǎn)換改變其產(chǎn)生的抗體的同種型，同時保留其抗原特異性。類別轉(zhuǎn)換通過名為類別轉(zhuǎn)換重組(CSR)的機制在重鏈基因座內(nèi)發(fā)生。此機制依賴在每個恒定區(qū)基因(除了 S-鏈中)上游的DNA中發(fā)現(xiàn)的名為轉(zhuǎn)換(S)區(qū)的保守核苷酸基序。在此過程中， 基因組DNA被剪接并重新連接以將VDJ元件并置于分別編碼IgG、IgE和IgA同種型的、， ε和α鏈的C區(qū)外顯子中。此過程導致編碼不同同種型抗體的免疫球蛋白基因。S 區(qū)在活化的B細胞中表達CY，Ce，和Ca基因的抗體類別轉(zhuǎn)換的分子基礎(chǔ)是重組，其將新的Ch基因置于VDJ基因的3’端旁。Ig類別轉(zhuǎn)換重組的表觀位點位于S區(qū)內(nèi)，在每個 Ch基因(除了 CJ5’存在的高度重復的DNA序列中。至少部分測序了所有鼠科動物和大部分人的S區(qū)。它們的長度是1-101Λ，高度重復和富含GC。鼠科動物和人Sli幾乎相同地由2個五聚體序列GAGCT和GGGGT和七聚體序列 (C/T)AGGTTG組成。所有其他S區(qū)也含有多拷貝的五聚體序列。除了 Sli,所有鼠科動物S區(qū)由序列和長度均不同的串聯(lián)重復組成，在SyI，Sy 3和Sy 2b中為49bp的重復，在SJa中為 52bp的重復，在Sa中為80bp的重復和在Se中為40bp的重復。在人和鼠科動物中，Sij與Se
區(qū)的同源性比Sli與\區(qū)更高,SpSe 區(qū)彼此間具有相當大的同源性。S區(qū)在人和小鼠間足夠保守，以致能夠使用人S區(qū)作為底物用于鼠科動物細胞中的轉(zhuǎn)換重組。在2種物種間SU、SE和Sa區(qū)比Sy區(qū)更同源。事實上，在k中發(fā)現(xiàn)小鼠Sm基序GGGCTGGGCTG(SEQ ID NO 1),第二個基序GAGCTGACT在％區(qū)中被輕微改造成GAGCTGAGCT (相比Sm基序具有一個添加的G) (SEQ ID NO 2)。S區(qū)的長度經(jīng)歷相當大的等位基因變化(長度多態(tài)性)，指示對給定S區(qū)的特定大小沒有功能上的要求。IgE和血清IgE水平免疫球蛋白E(IgE)是僅在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的抗體類型(或免疫球蛋白“同種型”)。其在過敏反應中發(fā)揮重要作用，并特別與1型超敏有聯(lián)系。IgE也與針對大多數(shù)寄生蟲例如曼森氏裂體吸蟲(Schistosoma mansoni)、旋毛蟲(Trichinella spiralis)和肝片吸蟲(Fasciola hepatica)的免疫系統(tǒng)應答有關(guān)，并可能在對抗某些原生動物寄生蟲例如惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的免疫防御中很重要。盡管IgE通常是最少的同種型——在正常(“非特應性”)個體中，相比10mg/ml 的IgG(在大多數(shù)經(jīng)典適應性免疫應答中起作用的同種型)，血清IgE水平僅為IgE濃度的 0. 05%——其能夠觸發(fā)最強烈的免疫反應。特應性個體在其血液中可具有高達普通IgE水平10倍的IgE (如在高IgE綜合征患者中)?？商禺愋宰R別“變應原”(通常是蛋白質(zhì)，例如塵螨DerPlJg i^elDl，草或豚草花粉，等等)的I gE與其高親和力受體Fc ε RI具有獨特的長期相互作用，使能夠介導炎癥反應的嗜堿粒細胞和肥大細胞變得“待發(fā)”，易于釋放例如組胺、白三烯和某些白介素的化學物質(zhì)，這導致許多與過敏反應相關(guān)的癥狀，例如哮喘中的氣道收縮，濕疹中的局部炎癥，變應性鼻炎中增加的粘液分泌和增加的血管滲透性，表面上這允許其他免疫細胞可以進入組織，但這可導致血壓的潛在致命下降，如在過敏反應中。盡管已相當好地了解了每種應答的機制，目前仍不太了解為什么一些變應性患者產(chǎn)生如此劇烈的敏感反應而其他人則僅僅是流鼻涕?？傃錓gE濃度檢測允許測量在血清樣品中的總IgE水平。提高的IgE水平和過敏反應的存在相關(guān)。一種檢測總血清IgE的方法是raisT(試紙放射免疫吸附試驗)。此檢測涉及使血清樣品與已用放射性碘標記的IgE反應。在試驗程序結(jié)束時計算的結(jié)合的放射性碘，其與血清樣品中的總IgE量成比例。在臨床免疫學中，通過濁度測定法(或比濁法)測量單個類型免疫球蛋白的水平以表征患者的抗體譜。測量I gE水平的其他方法是ELISA、 免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡、免疫擴散和免疫電泳。認為使用UniCAP 250 系統(tǒng)(Pharmacia， Uppsala, Sweden)測量的總血清IgE濃度大于100kU/L的是提高的。在一例研究中，使用靈敏的雙抗體放射免疫測定測量IgE，沒有明顯變應性癥狀的正常受試者的血清IgE范圍從6至lOOOng/ml變化超過130倍。在患有變應性呼吸疾病的患者中IgE濃度的范圍和正常受試者的具有相當程度的重疊，但大約35%的未治療變應性個體具有高于正常受試者 97百分位的IgE濃度，51%的未治療變應性個體具有高于正常受試者95百分位的IgE濃度。(見G. J. Gleich, A. K. Averbach禾口H. A. Swedlund,Measurement of IgE in normal and allergic serum by radioimmunoassay. J. Lab. Clin. Med. 77(1971)，p.690.)在另一例研究中，正常成人的IgE水平的幾何平均數(shù)是105ng/ml并具有5至 2045的95%區(qū)間。據(jù)報導成人中的IgE正常水平為約100至400ng/ml，是IgG正常水平的 1/400，000。(見 Waldmann 等人，The Journal of Immunology, 1972，109 :304-310 ；又見 Medical Immunology-第十版(2001) TG Parslow, DP Stites, AI Terr 禾口 JB Imboden, 編，表7-2)。用于比較在年輕人04-43歲)、老年人(66-96)和百歲老人(99-108)中的血清 Ig 水平，見 Listi 等人，A Study of Serum Immunoglobulin Levels in Elderly Persons That Provides New Insights into B Celllmmunosenescence. Ann. N. Y. Acad, ki (2006) 1089 :487-495。特別地，正常個體的年齡和性別相關(guān)免疫球蛋白血清濃度見 Listi等人(見上)的表2。盡管IgE通常僅占有所有血清抗體的極小部分(0.004% )，從臨床觀點來看免疫球蛋白E(IgE)極其重要，因為其在變應性疾病的關(guān)鍵地位。在變應性應答中參與2種特化的炎癥細胞類型肥大細胞和嗜堿粒細胞攜帶特異性針對IgE抗體的獨特的高親和力Fc受體。因此，盡管IgE在血液和組織液中具有極低的濃度(約I(T7M)，這些細胞的表面始終具有從血液中吸附的、擔當抗原受體的IgE抗體。當肥大細胞或嗜堿粒細胞被動結(jié)合的IgE 分子接觸抗原時，肥大細胞或嗜堿粒細胞施放引起許多變應性疾病的急性臨床表現(xiàn)的炎癥介體物質(zhì)。提高的血清IgE水平也可表示蠕蟲或某些其他類型的多細胞寄生蟲的感染。和 IgG和IgD—樣，IgE僅以單體形式存在。Fc受體似乎主要識別ε鏈的CH3結(jié)構(gòu)域。見
13Medical Immunology-第十版(2001 ；見上)。盡管在人中免疫球蛋白E的血清濃度多變，但超過約2500ng/ml的血清IgE水平明確地和多種疾病相關(guān)。在小鼠中報導了類似的低水平IgE (見Pinaud等人，Localization of the 3' IgH locus Elements that Effect Long-Distance Regulation of Class Switch Recombination, Immunity(2001) 15(2) :187-199) 基因打靶和質(zhì)?；虼虬惺且环N利用改造的外源DNA片段和小鼠胚胎干(ES)細胞基因組之間的同源重組的技術(shù)。在引入的DNA片段和天然染色體內(nèi)含有的相同區(qū)域之間的重組將導致染色體的部分被改造的DNA所替換。然后將這些改造的ES細胞注射至胚泡，在那里它們可摻入并和來自ICM(內(nèi)細胞團)的分裂球一起促進胎兒發(fā)育。簡單地說，設(shè)計基因靶向載體，其通過同源重組將給定基因的野生型等位基因替換為突變形式。然后將靶向的ES細胞植入2-4天的胚泡并轉(zhuǎn)移至假孕母親(見下)。本文使用的靶向載體具有4種成分a. 5’臂(又稱為5’側(cè)翼區(qū))；b.選擇標記；c.編碼供體轉(zhuǎn)換區(qū)的DNA序列；和d.3，臂(又稱為3，側(cè)翼區(qū))。5’臂是和待替換的轉(zhuǎn)換區(qū)5’末端同源的DNA片段。選擇標記在同源重組后賦予可選擇的表型。選擇標記兩側(cè)可為Ioxp位點。供體轉(zhuǎn)換區(qū)可在選擇標記之前或之后。3’ 臂是和待替換的轉(zhuǎn)換區(qū)3’末端同源的DNA片段。5’和3’側(cè)翼區(qū)可為任意長度，但取決于同源性的程度。如本文使用的在2個DNA 序列部分之間的“基本同源”指所述序列部分足夠同源，從而當DNA片段被共同引入重組感受態(tài)細胞中時易于進行可檢測的重組。如果2個序列部分的核苷酸序列彼此至少40%，優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少80%和最優(yōu)選100%同一，則2個序列部分基本同源。這是因為同源性量的減少導致成功同源重組的頻率的相應減少。可將序列同源性的實用下限功能性地定義為這樣的同源性量，即如果進一步減少則不能在重組感受態(tài)哺乳動物細胞中介導可檢測的DNA片段同源重組。5’和3’側(cè)翼區(qū)的各自同源序列部分為優(yōu)選至少500bp，更優(yōu)選 lOOObp，次最優(yōu)選約1800bp和最優(yōu)選大于1800bp。理想地，在打靶構(gòu)建體中使用標記基因替換缺失序列?？墒褂枚喾N標記，特別是允許正選擇的標記。特別引人關(guān)注地是使用G418抗性，其來自新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 ("neo")的表達。在基因組中標記基因的存在指示已發(fā)生過整合。當S ε區(qū)是待替換的區(qū)域時，供體轉(zhuǎn)換區(qū)可為Sy，S γ 1，S γ h，S γ 2b或S γ 3區(qū)。 供體區(qū)應當是在受激的未重組條件下(即轉(zhuǎn)換區(qū)未被改變)導致其相關(guān)的重鏈以高于Cε 的水平表達的區(qū)域。在大多數(shù)情況下，將使用通過Southern印跡雜交的DNA分析確定整合的位置。通過使用針對插入物和同源整合將發(fā)生的區(qū)域兩側(cè)的5’和3’區(qū)的探針，可以證明同源打靶已發(fā)生。也可有利地使用PCR檢測同源重組的存在?？墒褂门c打靶構(gòu)建體內(nèi)的序列互補的和與位于構(gòu)建體外且在靶基因座上的序列互補的PCR引物。這樣，只有發(fā)生了同源重組才可以得到在互補鏈上存在2條引物的DNA分子。通過證明期望大小的片段，例如使用 Southern印跡分析，支持同源重組的存在。一旦制備了打靶構(gòu)建體和去除了任意不想要的序列，例如原核序列，現(xiàn)在可將構(gòu)建體引入靶細胞，例如ES細胞(見下)?？墒褂萌我鈱NA引入靶細胞的方便的技術(shù)。技術(shù)包括原生質(zhì)體融合，例如酵母原生質(zhì)球細胞融合，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，電穿孔，磷酸鈣介導的DNA 轉(zhuǎn)移或直接顯微注射。在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了靶細胞后，可通過正和/或負標記的方式選擇靶細胞，如上面所示的新霉素抗性和阿昔洛韋或更昔洛韋抗性。然后通過限制性分析、電泳、Southern分析、 PCR等等進一步分析顯示期望表型的那些細胞。通過鑒定在靶基因座上顯示存在期望改變的片段，可以鑒定已發(fā)生同源重組從而以增強至C ε的轉(zhuǎn)換的方式改變IgH的細胞。胚胎干(ES)細胞方法a)引入cDNA至ES細胞在 Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, E.J. Robertson編，(IRL Press 1987)中詳細描述了培養(yǎng)ES細胞和之后產(chǎn)生重組動物的方法，將DNA引入ES細胞的多種方法例如電穿孔、磷酸鈣/DNA沉淀和直接注射，在此處引入其中的教導。通過幾種方法之一完成重組ES細胞期望克隆的選擇。在涉及序列特異性基因整合的情況下，共沉淀用于重組的具有目的基因的核酸序列或控制其表達的序列和編碼標記例如新霉素抗性的基因。通過在Lovell-BadRe,Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, E. J. Robertson 編，(IRL Press 1987)或在 Potter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,7161(1984)中詳細描述的幾種方法之一進行轉(zhuǎn)染。磷酸鈣/DNA沉淀、直接注射和電穿孔是優(yōu)選的方法。在這些程序中，將若干ES細胞，例如 0. 5X106置于組織培養(yǎng)皿中并用線性化的核酸序列和Img pSV2neo DNA(Southern和Berg， J. Mo 1. Appl. Gen. 1 :327-341(1982))的混合物轉(zhuǎn)染，所述混合物在50mg脂轉(zhuǎn)染試劑存在下在100 μ 1終體積中沉淀。用補充了抗生素例如G418 (在200至500 μ g/ml之間)的在DMEM 中含有10%胎牛血清的選擇培養(yǎng)基飼養(yǎng)細胞。使用克隆環(huán)(cloning ring)分離抗G418的細胞集落并擴增。從抗藥克隆中提取DNA并使用Southern印跡實驗(使用核酸序列作為探針)鑒定攜帶期望核酸序列的那些克隆。在一些實驗中，使用PCR方法鑒定目的克隆。引入ES細胞的DNA分子也可通過同源重組的方法整合進染色體，如Capecchi， (1989) Science 244 :1觀8_1292所述。直接注射導致高效率的整合。通過從注射的ES細胞庫制備的DNA的PCR鑒定期望的克隆。在細胞克隆之后通過PCR鑒定庫中的陽性細胞 (Zimmer和Bruss，Nature 338,150-153 (1989)) 通過電穿孔的DNA引入效率較低并需要選擇步驟。Joyner 等人，Nature 338，153-156 (1989)和 Capecchi，(1989)描述了重組事件的陽性選擇(即neo抗性)和雙重陽性-陰性選擇(即neo抗性和更昔洛韋抗性)和之后通過PCR鑒定期望的克隆的方法，在此處引入其中的教導。B.胚胎回收和ES細胞注射使用改自對小鼠使用的標準技術(shù)的方法誘導雌性動物超數(shù)排卵，即注射懷孕母馬血清促性腺激素(PMSG ；Sigma)和48小時后注射人絨毛膜促性腺激素(hCG ；Sigma)。在hCG 注射后立即將雌性動物和雄性動物置于一起。注射hCG約1天后處死交配過的雌性動物并從切除的輸卵管中回收胚胎并置于具有0.5%牛血清白蛋白(BSA;Sigma)的Dulbecco' s磷酸緩沖液中。用透明質(zhì)酸酶(lmg/ml)去除周圍的卵丘細胞。然后洗滌原核胚胎并置于含 0. 5% BSA(EBSS)的Earle平衡鹽溶液中，置于具有5% CO2,95%空氣的濕潤空氣的37. 5°C 培養(yǎng)箱中直到注射時。使用與雄性動物交配的自然周期或超數(shù)排卵的雌性動物收獲胚胎用于ES細胞的注射。在成功交配后回收合適年齡的胚胎。從交配的雌性動物的子宮角中沖洗出胚胎并置于添加10%小牛血清的Dulbecco改良的必需培養(yǎng)基中用于ES細胞的注射。使用內(nèi)徑約 20 μ m的玻璃顯微操作針將約10-20個ES細胞注射進胚泡。C.將胚胎轉(zhuǎn)移至假孕雌性動物隨機周期的成年雌性動物與輸精管被切除的雄性動物交配。這樣交配接收者雌性動物使它們在需要植入含有ES細胞的胚泡時處于交配后的2. 5至3. 5天(用于小鼠，或用于較大的動物的話更久)。在胚胎轉(zhuǎn)移時，麻醉接收者雌性動物。通過在輸卵管正上方的體壁中制造切口暴露卵巢并取出卵巢和子宮。在子宮角用針穿孔，通過此孔轉(zhuǎn)移胚泡。轉(zhuǎn)移后，將卵巢和子宮推回體內(nèi)并通過縫合關(guān)閉切口。如果要進行另外的轉(zhuǎn)移，則在對側(cè)重復此程序。在 Hogan 等人’ Manipulating the mouse embryo, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986)中詳細描述了操作胚胎和DNA顯微注射的方法，在此處弓I入其中的教導。這些技術(shù)可容易地應用與其他動物物種的胚胎，并且盡管成功率較低，認為這些技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常規(guī)操作。D.重組動物的鑒定從幼年動物中取出樣品(l-2cm小鼠尾)。對較大的動物可使用血液或其它組織。 為了檢測在同源重組實驗中的嵌合體，即檢查打靶的ES細胞對動物的貢獻，在小鼠中使用皮毛顏色，盡管在較大動物中可檢查血液。制備DNA并通過Southern印跡和PCR 二者分析以檢測重組建立者(rg動物和其后代(F1和rg。一旦鑒定了重組動物，通過常規(guī)育種建立品系。Southern 分析通過標準酚提取程序或通過銫梯度離心從細胞系中得到DNA。A.酚提取用HBSS緩沖液洗滌燒瓶中的細胞，然后加入2. 5ml/100cm2的裂解溶液(1%十二烷基磺酸鈉/150mM NaCl/10mM EDTA/10mM Tris, pH 7.4)。在所有細胞溶解后，將其轉(zhuǎn)移至50ml圓錐管并加入0. 4mg/ml終濃度的蛋白酶K。將裂解物在65°C孵育10分鐘以失活 DNA酶，然后在37°C孵育過夜。對此裂解物加入已在50mM Tris,pH 8. 0中平衡的等體積新鮮酚，在室溫(約22-24°C)輕輕地顛倒管5分鐘，然后以2000g離心5分鐘，將上(水)層轉(zhuǎn)移至第二個管。然后加入等體積的50%酚/50%氯仿(ν/ν)，重復顛倒離心過程。然后將上清轉(zhuǎn)移至第三個管，加入等體積的氯仿。在第三個顛倒離心循環(huán)后，將上清轉(zhuǎn)移至第四個管，并加入1/10體積的3Μ醋酸鈉，2. 5倍體積的冷乙醇沉淀DNA。在用70%乙醇洗滌得到的沉淀并空氣干燥沉淀后，將其在TE緩沖液(IOmM Tris pH 7. 4/lmM EDTA)中重懸，并加入50% μ g/ml終濃度的RNA酶(通過在70°C加入新鮮懸浮的酶30分鐘將RNA酶制備成無DNA酶的)。然后用等體積的1 ISS-酚氯仿提取溶液。如上通過離心分離相，并用等體積的氯仿提取上清。如上離心后，用等體積的氯仿提取上清。離心后，用12.5ml乙醇沉淀上清中的DNA，然后用70%乙醇洗滌并空氣干燥。然后在TE緩沖液中懸浮沉淀，通過在^OnM處的0. D.讀數(shù)測定DNA產(chǎn)量和通過沈0/觀0比率測定純度。在4°C下在TE中儲存DNA制劑。B.培養(yǎng)細胞的RNA和DNA的氯化銫制備用HBS洗滌燒瓶中的細胞，然后加入2. 5ml/100cm2的異硫氰酸胍(GIT)緩沖液。 異硫氰酸胍緩沖液是4M GIT/25mM醋酸鈉，ρΗ6/0.8% β-巰基乙醇(ν/ν)。在3_5分鐘輕輕搖晃后，將細胞裂解物置于Beckman SW4 IlOml超速離心管中的細1氯化銫緩沖液的上層。用GIT緩沖液裝滿管至接近頂端，然后以32，000rpm(174，OOOxg)在200C過夜旋轉(zhuǎn)。然后移出管上部2/3的GIT溶液并丟棄，將管下部1/3的含有DNA的CsCl溶液轉(zhuǎn)移至第二個管。在200 μ 1的0. 3Μ醋酸鈉，ρΗ 6中重懸管底部的RNA沉淀并轉(zhuǎn)移至1. 5ml微量離心管中。對此管加入750 μ 1乙醇并將管在干冰上放置10分鐘。在微量離心10分鐘后，棄上清， 加入300μ1 70%乙醇并再次微量離心管。棄上清，在真空離心機中干燥沉淀。在200μ1 dH20中重懸沉淀。將RNA制劑以乙醇沉淀的形式儲存在-70°C。用dH20稀釋含有DNA的 4ml CsCl0對此加入30ml冷乙醇?；厥誅NA沉淀，轉(zhuǎn)移至新的50ml管并用70%乙醇漂洗， 然后空氣干燥。然后在I3K緩沖液中重懸沉淀，并加入IOmg蛋白酶K。在65°C孵育15分鐘后，在37°C過夜孵育溶液。然后用1 ISS-酚氯仿和隨后用氯仿提取水解物，乙醇沉淀， 和定量，如上所述。C.限制性消化、電泳和Southern轉(zhuǎn)移限制性內(nèi)切酶消化條件根據(jù)供應商的建議。對基因組DNA，限制性消化為37°C下 4-6小時。對簡單的DNA制劑(克隆的或PCR擴增的)，孵育是在37°C下1-2小時。大體上，在150 μ 1體積中消化10 μ g DNA。通過加入3 μ 15Μ NaCl和375 μ 1 (2. 5倍體積)冷乙醇沉淀消化物，在4°C微量離心10分鐘，用500 μ 1冷70%乙醇洗滌并微量離心。在真空微量離心機中空氣干燥沉淀并在17 μ 1電泳緩沖液(常規(guī)地是TAE緩沖液)和3μ 1凝膠上樣緩沖液(含有50%甘油/1%飽和溴酚藍的TAE緩沖液)中重懸沉淀， 加熱至68°C 10分鐘，并上樣至瓊脂糖凝膠的孔中，同時在單獨的孔中上樣λ-HindIII消化物作為大小標記。凝膠中的瓊脂糖濃度為1.0%。在電泳8-16個小時后，用溴化乙錠染色凝膠，測量和記錄標記條帶的遷移距離并對凝膠拍照。將消化的DNA真空轉(zhuǎn)移至Nytran膜。將凝膠放置在真空裝置上的Nytran膜上，用 500ml 0. 4M Na0H/0. 8M NaCl覆蓋并使用50cm水的真空壓力進行4分鐘。移去NaCl-NaOH 溶液，加入500ml IOX SSC，并使用50cm水壓進行30-60分鐘。然后在80°C烘烤Southern 印跡2小時并在蔬菜冷凍袋中儲存。D. Southern 雜交將Southern印跡置于可熱密封的塑料袋中并和IOml含有IM NaCl, 1% SDS, 10% 硫酸葡聚糖和200 μ g/ml鯡精DNA的預雜交緩沖液孵育，在65°C孵育15分鐘。然后剪掉袋子一角，加入放射性標記的寡核苷酸探針(約107dpm)。重新密封袋并在烘箱或水浴中置于 65°C并輕輕搖晃或搖動12-16小時。然后從袋中移出膜，并在一系列逐漸稀釋和溫度增高 (嚴格度增加的)的SSC緩沖液中洗滌直到背景放射性相對特異性結(jié)合的探針較低。然后在暗室中將膜放進塑料袋中，并將塑料袋置于裝備有增強屏的X射線膠片盒中，加入一張 Kodak XAR-5膠片并根據(jù)信號強度將密封的暗盒置于-70°C下不同時間。通常，在不同的時CN 102333874 A
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期曝光是有效的。在Kodak X-OMAT自動顯影劑中沖洗膠片。膜可被重新雜交數(shù)次?？赏ㄟ^在沸騰的0. IXSSC中加熱2分鐘剝離Nytran膜上標記的探針。B細胞培養(yǎng)可通過負選擇從脾中純化B細胞。簡單來說，用抗體包被單細胞懸浮物中的T細胞并通過補體裂解消耗。將剩余的脾細胞置于不連續(xù)Percoll (GE Healthcare)梯度的上層?？蓮?6%至70%的界面上挑選出靜息B細胞和使用全部B細胞(50-70% Percoll界面)?？稍谟裳a充10%熱失活FBS，100u/ml青霉素和鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺，ImM丙酮酸鈉，IOmM Hepes, IOOmM非必需氨基酸和5xl(TsM 2-巰基乙醇的RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma Aldrich)組成的B細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)B細胞。確認體內(nèi)高IgE的產(chǎn)生將使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)檢測重組動物中提高的IgE血清水平。例如，可使用 ImmunoCAP特異性IgE血液試驗(文獻中也將其描述為CAP RAST、CAP FEIA (熒光酶免疫測定)和 Pharmacia CAP)。其他方法是本領(lǐng)域已知的。這些方法包括例如酶聯(lián)免疫吸附測定和可能的FACS， 使用抗IgE抗體。酶聯(lián)免疫吸附測定，又稱ELISA、酶免疫測定或EIA，是主要在免疫學中使用的生化技術(shù)，用于檢測樣品中抗體或抗原的存在。熒光激活的細胞分選(FACS)是分析單細胞的大混合群體的有力技術(shù)。較高比例的IgE陽性細胞將指示提高的血清IgE水平。雜交瘤的產(chǎn)生使用本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)制備產(chǎn)生IgE的雜交瘤。見例如KOhler &Milstein (1975)Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 :495,禾口K6hler &Milstein (1976)Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. Eur. J. Immunol. 6 :511。
簡單地說，洗滌免疫的脾細胞并在合適條件下與骨髓瘤細胞融合。M小時后使雜交瘤暴露在HAT或其他選擇試劑中，未融合的骨髓瘤細胞將死亡。未融合的脾細胞也具有有限的壽命，然后雜交瘤細胞是培養(yǎng)中留下的唯一增殖的細胞。類別轉(zhuǎn)換的測定測定是本領(lǐng)域已知的并在例如Shinkura, R.等人Nat. Immunol. (2003)4,435 441 和 Zarrin，等人，Nat. Immunol. (2004)5,12751281 中描述。簡單地說，用抗-CD40 和 IL-40刺激脾細胞4天以產(chǎn)生雜交瘤或刺激6天以進行ELISA。可使用單克隆抗-IgE抗體檢測IgE (突變的等位基因)?？赏ㄟ^多克隆抗-I gE抗體(Southern Biotechnology Associates)測量總 IgE0又見例如 Southern 禾口 Berg(Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Appl Genet(1982) 1 :327-341)描述的Southern印跡分析以評估在IgH基因座中的DNA重排和CSR。ε種系轉(zhuǎn)錄標記B細胞承擔IgE合成的第一步。因此，可使用RT-PCR檢查ε 免疫球蛋白重鏈種系的基因轉(zhuǎn)錄物(GLTs ； ε GLTs)，ε環(huán)形轉(zhuǎn)錄物(CTs ；I ε -C μ CT或 I ε C y CT),和編碼IgE重鏈的mRNA( ε mRNA)和激活誘導的胞苷脫氨酶(AID)(見I1aWiar 等人，J Allergy Clin Immunol (2007) 119 (1) :213-218)。
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在下面的實施例公開中，使用以下簡稱eq(當量)；M(摩爾)；μ M(微摩爾)； N(正常)；mol (摩爾)；mmol (毫摩爾)；μ mol (微摩爾)；nmol (納摩爾)；g (克)；mg (毫克)；kg(千克)；yg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μ (微升)；cm(厘米)；mm(毫米)； ym(微米)；nm(納米)；°C .(攝氏度)；h(小時)；min(分鐘)；sec(秒)；msec (毫秒)； Ci (居里)mCi (毫居里)；μ Ci (微居里)；TLC(薄層層析)。
實施例在以下實施例中進一步詳細描述本發(fā)明，實施例無意在任何方面限制本發(fā)明所要求保護的范圍。附圖旨在被認為是本發(fā)明的說明書和描述的組成部分。通過參考其中描述的所有內(nèi)容明確引入本文引用的所有參考。提供以下實施例以說明而不是限制要求保護的本發(fā)明。實施例1基因打靶/突變小鼠的產(chǎn)生此實施例說明了靶向載體的構(gòu)建，胚胎干細胞(ES)的轉(zhuǎn)化和突變小鼠的產(chǎn)生。a) 一般程序a)胚胎干細胞(EQ的轉(zhuǎn)化基于NCBI中可獲得的NT_166318的序列信息設(shè)計打靶構(gòu)建體。(又見Waterston 等人，Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature. (2002)420(6915) :520-62)。從 1 或 C57B6 BAC 克隆上分離并擴增 BamHI/PVuI 片段(7022 bp，具有Se區(qū)(129小鼠)；7355 bp具有Se區(qū)(B6小鼠))。從BamHI/PVuI片段中缺失以下序列(5’ 一 3’ ；SEQ ID NO 3)并用Neo盒和含有小鼠Sm區(qū)大部分的Hindlll/Nhel片段(見圖2和SEQ ID NO 6)替換。tgggttaagcagagctgtgctgggctggtatgagctggtccaagttgggc50
taaacagagctgggccaggctagtatgagctggtctgaactacactaagc100
aggactaggctgggctgagctgagctggactggctggacttggctgagat150
gtgttgagctgggttaagtatggctgggctgggctggcctgggctgggct200
ggactggattggtatgagctggtccaagttgggctaagcagagctgggcc250
aggctggtatgagctggtctaaactgaactaagtagggctgggctaagct300
gagctggtctacactagcctgacctgagctagggtaggctggactgggct350
gagctaagttgcactgggcaggggtgggctggaccgagctgatttgagct400
gggatgggctgagatgggttcagcaggcctaagcaggcctagctgggttt450
agctagatttagctaggcaaggctgagctaggctgggcggggcggggcta500
ggctgggcagggctggactgagctagcttttgtatattcggttgaaatgg550
gttggtctggtctggactgaactgactgagctgggctagcctgagctcga600
tggggggtatactcagctgagatgggctggtctggctagactgaactgga650
ttgggctaggctgagctaggctgacctgaaCtggCCtggtctgggctgga700
ctgggcagggctggtctcagctagactacactgagttaacctgggctgga750
ccatactgggttaaactaggttgcactggctgggttagacttggctgagc800
tgggcttggctgagctgagtcaagatggtctgagttgatttgagttggct850
aagctaagctgagctacactgaactaggcaaggctgggctggaaaggtct900
gggttaagttaggagggacttggcttggcttagctgggccaagctaggct950
gaactgggctgaactgagctgagctgggctgagctgggctgagctgggct1000
gagctgggcaaggctaaactggaatggactgaattggcctaagatgggcc1050
cggctaagctaagtaaggctgccctgaactgagcaggactggcctggcct1100
ggattgacctggcatgagcttaacttgactagactagtctatcttgggtg1150
aactgggctaagcaggactaatctggcctgatctgagctagactgaacta1200
ggctaagctgagctgagtttagcttggctgaactgggctgggctgcactg1250
aactgtattgagctatgtagaactgagctggtcttgtctgaggtgggttg1300
ggctggtctgggctgaaccagattgcactagactgagcttagctggacct1350
ggctgagctggactgcattgtgctaaactggctctctttagaccgagctt1400
agctggactggactgagctaggttgggtgggctgatctaagctgagctag1450
gctggtctcacctgaggaatgctgtgctgtgctgagctgaactaaactga1500
gctcagctaaggaagtgtgagctagactgagctgagctaggctgggttgg1550
gctgaactgagctaccttgggtggactaggctgagctgagctgggttgag1600
ctgagctatagatttggttggactggactggattgggctaaactgaactg1650
gtttggggtaggctgggatgagctggactgagctaggctgtactggtctg1700
agctaaactaagttgagtggggctaagaggagctgagtgaggctgggctg1750
gaatgagctaggctagggttgtgagctagggttgtactggtctaagctga1800
gtttagctgagagaggctgggctagacttccataaggtggctgagtcata1850
ctacagtgcactgagctgtgttgagcttaacttggattaagtggaatggg1900
ttgagctggctgaactgggctgaactgagataaactagactgagctggga1950
cacgctgggacgagctggaacgagctagaattactgttctaatctgatct2000
gggctgaggtaaactgggcctggttgagctctactaggctaagtagagtt2050
gagct2055可構(gòu)建靶向129SvEv ES細胞的類似構(gòu)建體用于提供在IgH基因座中存在的品系等位基因差異。B.胚胎干細胞(EQ的轉(zhuǎn)化使用PvuI限制酶線性化上述質(zhì)粒。在70%乙醇中洗滌DNA，之后沉淀，在50 μ 1 TE中重懸。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(見例如iTempleton等人，Efficient gene targeting in mouse embryonic stem cells, Gene Therapy (1997)4 :700-709)，通過電穿孔用線性化載體轉(zhuǎn)化IO6 ES細胞并用G418 (400 μ g/ml)選擇。然后使用cre/loxP重組系統(tǒng)缺失Neo 基因。通過Southern分析鑒定正確靶向的克隆，使用從鑒定為重組體的構(gòu)建體(在圖2中顯示)的SEQ ID N0:9(用于5，探針)和SEQ ID NO :10(用于3，探針)設(shè)計的2條至少 300bp的探針。C.產(chǎn)生突變小鼠產(chǎn)生種系小鼠以創(chuàng)造具有改造的IgH基因座的小鼠。將顯示Sy/S ε同源重組的 ES細胞克隆注射至C57B6胚泡，然后將得到的雄性嵌合體與C57B6雌性交配。通過皮毛顏色評估在雜合和純合突變小鼠中的種系轉(zhuǎn)移。
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II.詳細程序A.靶向載體構(gòu)建使用重組和標準分子克隆技術(shù)構(gòu)建靶向ES細胞中的C57BL/6 IgE基因座的構(gòu)建體。見例如 Liu等人,Ahighly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Research(2003)vol. 13(3)pp. 476-84。基于NCBI中可獲得的NT_166318的序列信息設(shè)計打靶構(gòu)建體。(又見Waterston 等人，Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature. (2002)420(6915) :520-62)。首先，從含有C57BL/6轉(zhuǎn)換ε (本文中稱為SE、Se或SO區(qū)/序列的小鼠 BAC(RP23-135L12 ；Invitrogen,Carlsbad,CA)中分離6988 bp基因組片段(SEQ ID NO 19 ； 圖13)，并引入含有負選擇標記白喉毒素A(DTA)的名為“pBlight-DTA”的質(zhì)粒(見Warming 等人，Mol. Cell. Biol. (2006)26(18) :6913-22)中，以用于之后的胚胎干(ES)細胞打靶，得到“pBlight-DTA-IgE”。其次，使用同源重組將loxP-PGK-em7-Neo-BGHpA-loxP-HindIIUalI-AscI-NheI 盒插入IgE片段，將內(nèi)源S ε區(qū)替換為兩側(cè)有IoxP位點(floxed)的Neo和多聚接頭以用于之后的轉(zhuǎn)換mu區(qū)(本文中稱為SMu、Sy或Sm)的插入(“pBlight-DTA-IgE-lox-Neo-lo x-MCS，，)。最后，從BAC RP23-135L12 (Invitrogen)分離含有 C57BL/6SMu 的 4. 9kbHindIII-NheI 片段，并使用三向連接(將均來自 pBlight-DTA-IgE-Neo-MCS 的 6. 2kb XhoI-HindIII 片段和 4. Ikb XhoI-NheI 片段連接至 4. 9kbHindIII-NheI Smu 片段)將此片段克隆至 pBlight-DTA-IgE-lox-Neo-lox-MCS。將得到的構(gòu)建體稱為“pSW312”(pBlight_D TA-IgE-lox-neo-lox-Smu)。見圖 2B。B.胚胎干細胞(EQ的轉(zhuǎn)化使用標準方法(G418正選擇和DTA負選擇)打靶C57BL/6ES細胞，使用PCR和 Taqman分析鑒定陽性克隆。通過Southern印跡分析確認正確打靶的克隆，使用HindIII 消化的基因組DNA和外部3’探針(構(gòu)建體3’末端和內(nèi)源IgE HindIII位點之間的序列) (SEQ ID NO 20)taatggacgatcgggagataactgatacacttgcacaaactgttctaatc50
aaggaggaaggcaaactagcctctacctgcagtaaactcaacatcactga100
gcagcaatggatgtctgaaagcaccttcacctgcaaggtcacctcccaag150
gcgtagactatttggcccacactcggagatgcccaggtaggtctacactc200
gcctgatgtccagacctcagagtcctgagggaaaggcaggctctcacaca250
gcccttcctccccgacagatcatgagccacggggtgtgattacctacctg300
atcccacccagccccctggacctgtatcaaaacggtgctcccaagctt348C.產(chǎn)生突變小鼠產(chǎn)生種系小鼠以創(chuàng)造具有改造的IgH基因座的小鼠。將顯示Sy/S ε同源重組的 ES細胞克隆注射至C57B6胚泡，然后將得到的雄性嵌合體與C57B6雌性交配。通過皮毛顏色評估在雜合和純合突變小鼠中的種系轉(zhuǎn)移。實施例2
體外刺激(抗-⑶40/IL4 ；LPS)以誘導同種型轉(zhuǎn)換以下實施例詳細描述了如何收集B細胞和分析B細胞的類別轉(zhuǎn)換重組(CSR)。用抗CD40 (1 μ g/mL ；HM40-3，Pharmingen)和 IL-4 (25ng/mL)，或脂多糖(LPS, 20yg/mL)體外刺激來自6-8周大的野生型或雜合子動物的脾細胞。在6孔板的一個孔中在補充10%胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100單位/mL青霉素-鏈霉素和100 μ M β-巰基乙醇的RPMI培養(yǎng)基中接種1. 5χ106細胞(0. 5xl06/mL)。刺激后，在第4_5天使用活化的B細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生雜交瘤細胞(使用標準方法；見例如Monoclonal Antibodies =Methods and Protocols in Methods in Molecular Biology U007) vol. 378 :1-13)或通過 ELISA (第 6天)測量Ig水平。使用單克隆抗小鼠抗體(Pharmingen)檢測Ig水平，然后用堿性磷酸酶綴合的山羊抗小鼠IgGl (Southern Biotechnology)作為檢測抗體。使用純化的小鼠 Ig(Pharmingen)作為標準物。使用PE抗-小鼠Ig(Pharmingen)抗體在脾細胞上進行表面Ig染色。在刺激后第4天進行FACS分析。在FACS Scan (Becton Dickinson)上收集樣品并使用Flojo分析軟件分析。通過Southern印跡分析評估CSR。簡單地說，使用雜交瘤細胞克隆的基因組DNA 評估IgH基因座中的DNA重排和CSR。用EcoRI (NEB)限制酶過夜消化雜交瘤細胞基因組 DNA(約150ul)并通過在0.7%瓊脂糖凝膠上上樣樣品解析消化物。然后將解析的樣品轉(zhuǎn)移至kta-探針印跡膜(Bio-Rad)，通過紫外線交聯(lián)和/或在80°C真空烘箱中烘烤(20min) 固定，然后用32P標記的I-mu，C-mu, I-ε或C- ε探針根據(jù)標準Southern印跡實驗方案 (Molecular Cloning,第三版Vol. 1，第6. 33-6. 64頁)標記。通過將膜置于X射線膠片 (Kodak)上顯像標記的DNA。為了測序在IgE陽性雜交瘤細胞克隆中的S-mu和S- ε CSR連接，使用巢式PCR擴增和測序此區(qū)域。首先我們使用I-mu正向-1 :5，-CTCTGGCCCTGCTTATTGTTG-3，(SEQ ID NO 11)和 C- ε 反向-1 :5，-CCTGATAGAGGCTGTGAGAAAGGAAGGACC-3，(SEQ ID NO 12)引物用PCR從基因組雜交瘤細胞DNA中擴增此區(qū)域。PCR循環(huán)為94°C 2min ； (94°C IOsec, 60°C 30sec和68°C 150sec) X35個循環(huán)，68°C 7min。將此PCR步驟的產(chǎn)物用作模板(2ul) 用于第二個 PCR 循環(huán)，使用以下引物E-mu 正向-2 :5，-AGACCTGGGAATGTATGGTT-3，(SEQ ID NO 13)禾口 C-ε 反向-2 :5，-TAGGTTAGACTTATTTATATCACTGCATGC-3，(SEQ ID Ν0:14)。 除了退火溫度降至55°C以外，PCR程序同上。然后凝膠純化(Quigen)PCR產(chǎn)物并使用以下引物直接測序正向SM5，5，-GTTGAGAGCCCTAGTAAGCG-3，(SEQ ID NO 15) ；9225F 5，-TTGAGAGCCCTAGTAAGCG-3，(SEQ ID N0:16) ；9518F TGAGCTCAGCTATGCTACGCGTGTTG-3‘( SEQ ID NO 17)；反向5，-GCCCGATTGGCTCTACCTACCCAGTCTGGC-3，(SEQ ID N0:18)。實施例3細胞內(nèi)I gE染色和FACS分析此實施例展示了在暴露于不同刺激后從雜合小鼠和野生型小鼠得到的組織的細胞內(nèi)IgE染色和FACS分析。離心0. 5xl06脾細胞并在FACS緩沖液(PBS+0. 5%胎牛血清)中重懸。Wlyg/ 樣品加入抗-IgE 抗體(e-Bioscience, San Diego, CA ；貨號 14-5992-85)以封閉表面 IgE 分子。細胞在4°C孵育15min，然后用FACS緩沖液洗2次并通過在1700rpm離心3分鐘沉淀。在含胎牛血清的PBS中重懸沉淀的細胞。渦旋細胞并以200μ 1/樣品加入 BD Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences, San Jose，CA ；貨號554722)以固定細胞。在4°C孵育20min。用IXBD Perm/Wash 緩沖液(BD Biosciences, San Diego, CA ；Cat. No. 554723)洗細胞2次，并在250 μ 1含有Fc封閉劑的IX BD Perm/Wash緩沖液中重懸細胞。然后使用細胞等分試樣用于生物素-同種型對照(e-Bioscience，13-4301-82)或抗-IgE-生物素 (e-Bioscience，13-5992-82) —同與 B220-FITC 以 1 200 的最終抗體稀釋染色。在 4°C 孵育30min。用IXBD Perm/Wash緩沖液洗細胞2次。以1 200稀釋加入在IX BD Perm/Wash中的鏈霉抗生物素。在4°C孵育lOmin。用BD Perm/Wash緩沖液洗2次，并在200 μ 1 FACS緩沖液中重懸細胞，然后使用 BD FACS Calibur設(shè)備和CellQuest Pro程序進行FACS分析以分析細胞。結(jié)果在圖13中顯示。在圖13中可見，相比WT，IgE陽性染色的細胞數(shù)增加。FACS 結(jié)果顯示，相比WT動物在Het動物中表達IgE的B細胞百分比增加(約2倍)，而相比WT 在Het中的IgGl水平下降了約一半。這證明具有SmKI (替換Se)增加了至IgE的轉(zhuǎn)換，同時通過競爭此基因座降低了轉(zhuǎn)換至IgGl的機會。實施例4IgE測定/測量此實施例展示了使用ELISA(lumineX或常規(guī)ELISA)測量在未攻擊或攻擊的重組動物中或在體外細胞培養(yǎng)物中的IgE。對體外細胞培養(yǎng)物，可使用LPS或抗CD40/IL4刺激細胞。Luminex小鼠7-plex免疫球蛋白同種型分型測定此測定使用多重測定試劑盒(Millipore Beadlyte小鼠免疫球蛋白同種型分型試劑盒，貨號48-300)在單個孔中用Luminex 儀器系統(tǒng)對小鼠單克隆細胞培養(yǎng)上清或血清樣品(使用Millipore小鼠同種型分型血清稀釋液)進行同種型分型(重鏈IgGl，IgGh， IgG2b，IgG3，IgA, IgE, IgM ；和輕鏈κ 或 λ )。在使用前，應該以14，OOOXg離心細胞培養(yǎng)上清以去除任意顆粒。類似地，應該在測定前離心(SOOOXg)血清和血漿樣品以去除顆粒和脂層。這將避免阻塞洗滌板和樣品針?；谛≈榈亩嘀販y定所使用的材料Millipore Beadlyte小鼠免疫球蛋白同種型分型試劑盒，貨號48-300 (包含 Beadlyte細胞因子測定緩沖液，貨號43-002，Beadlyte小鼠多重免疫球蛋白小珠，貨號 42-045，Beadlyte小鼠免疫球蛋白陽性對照，貨號43-008，Beadlyte抗-小鼠κ輕鏈， PE(100Χ)，貨號 44-(^9，Beadlyte 抗-小鼠 λ 輕鏈，PE(100Χ)，貨號 44-0 )。Millipore Beadlyte小鼠同種型分型血清稀釋液(5X)，貨號43-033，含1 %牛血清白蛋白的磷酸緩沖液。Ig標準曲線試劑=Millipore =Beadlyte小鼠多重免疫球蛋白標準物(IgGl， IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA, IgE, IgM)，凍干的，來自 balb/c 小鼠，貨號 47-300。過濾板MiIlipore多層篩-HA 0. 45um無表面活性劑。
Millipore過濾系統(tǒng)(注意可使用提供ddH20的任意系統(tǒng))?？筛鶕?jù)制造商的說明書進行測定。進行基于小珠的多重測定的一般實驗方案(適當?shù)?離心樣品以在用合適的稀釋液稀釋以前沉淀任意顆粒。將標準物在合適的稀釋液中重懸，并使用2倍連續(xù)稀釋制備8點標準曲線。用每孔50-100 μ 1測定稀釋液潤濕過濾板。板的配備加入50 μ 1標準物或樣品至每個孔。超聲波處理偶聯(lián)的小珠15-20s以產(chǎn)生均勻的懸浮物。充分渦旋小珠至少10s。將小珠稀釋至每孔1500個珠，并加入25 μ 1 稀釋的小珠懸浮物至每孔。黑暗中在室溫孵育15min (孵育時間可變換，通常在15min和池之間。可在4°c過夜進行小珠和樣品的初步孵育以獲得較大的低端靈敏度)。洗滌步驟對過濾板底部應用真空歧管以去除液體并吸干。通過加入75 μ 1測定稀釋液洗滌，抽真空并吸干。重復洗2次。在75 μ 1測定稀釋液中重懸小珠。加入25μ1檢測抗體溶液至各個孔。黑暗中在室溫孵育15min。對過濾板底部應用真空歧管以去除液體并吸干。通過加入125 μ 1測定稀釋液洗滌，抽真空并吸干。重復洗2次。在125 μ 1測定稀釋液中重懸小珠。在平板振動器上孵育lmin。在Luminex 100儀器上讀取結(jié)果。數(shù)據(jù)評估從4-PL或5-PL曲線上外推出樣品濃度。在刺激后第6天，使用在FACS分析中使用的相同的受激脾細胞(3只Het和3只 WT小鼠)上清用于如上所述的ELISA測定。和我們在FACS分析中觀察到的一致，當用IL4/ 抗-⑶40刺激時，我們也觀察到相比WT在Het中IgE表達水平的提高和IgGl表達水平的降低。這提示在SmKI位點中發(fā)生了更頻繁的斷裂，其與至IgGl的轉(zhuǎn)換競爭并增加IgE轉(zhuǎn)換的水平。LPS刺激充當對照并顯示W(wǎng)T和Het 二者具有類似的IgM和IgG3水平，提示當其他轉(zhuǎn)換序列可用于類別轉(zhuǎn)換時所述基因座是完整的且正常發(fā)揮功能。見圖14?？傂∈驣gE結(jié)合ELISA進行此測定以定量未免疫的和免疫動物二者中的小鼠IgE血清水平。i.用捕獲抗體包被在包被緩沖液(0. 05M碳酸鹽/碳酸氫鹽，pH 9. 6)中稀釋純化的抗-小鼠IgE 捕獲 mAb (大鼠抗-mu IgE，克隆 R35-92BD Pharmingen, San Diego, CA，儲存于 4°C。貨號 553416(0. 5mg/ml))至2yg/mla。以每孔100 μ 1加入增強的蛋白質(zhì)結(jié)合ELISA板(例如 Nunc免疫板，貨號464718,384孔)。搖晃板以確保捕獲抗體溶液覆蓋所有孔。將板蓋上蓋子并在4°c孵育過夜。[注意可以在37°c進行ι小時。]用PBS/Tween (PBS+0.05% Tween 20)洗板3次。每次洗滌時，用200 μ 1 PBS/ Tween 充滿孔并在吸去或傾倒前保持至少lmin。在最后一步時將板在紙巾上輕拍以去除多余的緩沖液。ii.封閉用每孔50 μ 1 封閉緩沖液(PBS+0. 5% BSA+IOppm Proclin pH 7. 4)封閉板。將板蓋上蓋子并在室溫孵育ι小時并輕輕振蕩。如上用pbs/ Tween 洗板3次。iii.應用標準物和樣品將第1列留為空白孔(即不加抗原，每孔僅為25 μ 1封閉緩沖液)。使用第2和3列作為標準物的重復，每孔25 μ 1 用500ug/ml儲存標準抗體制備從lOng/ml (1 50，000)起始的標準濃度的標準曲線。進行連續(xù)1 2稀釋(PBS+0. 5% BSA+0. 05% Tween 20+15ppmProclin+0. 2% BgG+0. 25 % CHAPS+5mM EDTA，pH 7.4)。小鼠 IgE 標準曲線10. 0，5· 0， 2. 50,1.25,0. 625,0. 313，0. 156，0ng/ml。測定對照是如下稀釋的小鼠IgEK同種型對照 (BD Bioscience，貨號 557079，主要儲液0. 5mg/ml，在 4°C保存):8ng/ml, 4ng/ml, 0. 5ng/ ml。使用剩余的列加入在封閉緩沖液中不同稀釋的樣品，每孔25μ1。用測定稀釋液 (PBS+0. 5% BSA+0. 05% Tween 20+15ppm Proclin)以 1 25 的最小初始稀釋 1 3 連續(xù)稀釋血清樣品，使用Hamilton稀釋器。將板蓋上蓋子并孵育2小時同時輕輕振蕩。[注意可在室溫進行至少ι小時或4°c過夜]。如上用PBS/ Tween 洗板6次，然后孵育ι小時同時振蕩。IV.與檢測抗體孵育每孔加入25 μ 1生物素化的抗-小鼠IgE (大鼠抗-mu IgE-生物素，克隆R35-118， BD Pharmingen, San Diego, CA,0. 5ug/ml，4°C，貨號 553419)。將板蓋上蓋子并在室溫孵育30分鐘同時輕輕振蕩。如上用PBS/ Tween 洗板6 次。V.加入鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶(SAv-HRP)在封閉緩沖液中以1 20，000稀釋鏈霉抗生物素-HRP(GE Healthcare，以前的 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ，lmg/ml，儲存于 4°C,貨號 RPN4401)至終濃度 50ng/mL·每孔加入25 μ 1然后孵育30分鐘同時振蕩。[注意也可使用抗生物素蛋白-HRP 代替鏈霉抗生物素-HRP，如本領(lǐng)域提到的進行適當修改。]將板蓋上蓋子并在室溫孵育 30min。如此實驗方案上面提到的用pbs/ Tween 洗板6次。VI.加入底物和顯色混合1 份 TMB A 至 1 份 TMB B (TMB 過氧化物酶溶液 A 和 B (KPL, Gaithersburg, MD, 貨號分別是50-76-02和50-65-02)，儲存于4°C )。對每孔加入25 μ 1 TMB底物并搖晃。在室溫孵育15min用于顯色并加入25 μ 1 IM H3PO4淬滅顯色。在450_650nm處讀板。從標準曲線上插補血清樣品IgE水平。實施例5用雜交瘤細胞定量抗體同種型使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)構(gòu)建雜交瘤細胞。使用實施例4的測定表征免疫球蛋白同種型。然后進一步表征抗體的結(jié)合親和力、表位特征和在相關(guān)途徑上的作用模式。實施例6免疫TNP-0VA ；OVA ；Ficol以誘導體內(nèi)同種型轉(zhuǎn)換此實施例說明了如本文描述的重組動物的體內(nèi)免疫。通過腹膜內(nèi)注射在IOOul無菌PBS中的TNP-0VA 50ug/明礬2mg或TNP-Ficoll 50ug腹膜內(nèi)免疫年齡為8周體重約25-30g的8周大性別匹配的Balb/C小鼠，在第28天加強。在第3，7，14，21，28，35和42天經(jīng)尾靜脈收集60ul樣品用于抗體同種型測量，使用在實施例4中描述的測定。ii.抗原誘導的腹膜炎模型和在腹膜液中的組胺測量動物和致敏程序通過皮下(s. c.)注射0. 4ml含有吸附在1. 6mg氫氧化鋁(Andersson &Brattsand, 1982)中IOOgLg卵清蛋白的0. 9% w/v NaCl (鹽水)主動致敏在巴斯德學院 (Pasteur Institute) (Paris, France)飼養(yǎng)的年齡為 8 周體重約 25_30g 的 Balb/C 小鼠。 7天后，動物接受相同劑量的卵清蛋白(在A1(0H)3存在下)并在7天后使用。抗原誘導的腹膜炎通過腹膜內(nèi)(i. p.)注射0. 4ml合有在無菌鹽水中稀釋的2. 5或25gm/ml卵清蛋白溶液(1或IOyg卵清蛋白作為每腔注射的最終劑量)誘導腹膜炎。對照動物接受相同體積的無菌鹽水。在抗原攻擊后的不同時間間隔(30min-164h)，通過過量乙醚使動物安樂死并打開腹腔，然后用3ml肝素化鹽水(10U/ml)洗滌。回收了大約90%的最初體積。在極少的情況下，當在腹腔中發(fā)現(xiàn)出血時，使用動物。 使用本領(lǐng)域已知的方法測量組胺水平。實施例7巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)感染誘導 IgE此實施例說明了對寄生蟲巴西日圓線蟲感染的IgE應答。巴西日圓線蟲在小鼠中的發(fā)育過程已被良好表征(Love，Nippostrongylus brasiliensis infections in mice :the immunological basis of worm expulstion, (1975)Parasitiology 70 :11)。在小鼠中一旦感染性幼蟲(L3)穿透了皮膚，它們經(jīng)淋巴和血管系統(tǒng)被轉(zhuǎn)運至肺。在氣管-食管遷移后，第4階段幼蟲(約15-35%的最初L3劑量) 被運送至小腸腔并成熟。在幼蟲接種后第7天感染明顯。在感染明顯后不久，在糞便卵輸出的快速減少后進行幼蟲排出(約第9天)，在第12天幾乎完成。以前已描述了巴西日圓線蟲在實驗室條件下的維持，感染方法，幼蟲轉(zhuǎn)移和收集幼蟲以計數(shù)(Love & Ogilvie, Nippostrongylus brasiliensis in young rats. Lymphocytes expel larval infections but not adult worms. (1975)Clin.Exp. Immunol. 21 :155)。從蟲載片上純化活蟲。計數(shù)純化的蟲并以2500蟲/ml在磷酸緩沖液 (PBS)中重懸。通過皮下注射以500蟲ΛΟΟιιΙ感染小鼠，如Ogilvie所描述(Reagin-Iike antibodies in animals immune to he lminth parasites Nature (1964) 204 :91)。用正常飲食維持感染的小鼠并無限制地提供含抗生素的水(0. 5g多粘菌素B和IOg硫酸新霉素在5000ml ddH20中)5天。在第9天檢查小鼠的肺炎癥和在第9和15天使用實施例4中提供的方法檢查血清IgE水平。實施例8用一組變應原致敏誘導IgE(氣道，皮膚)此實施例說明了對不同變應原的IgE應答。以不同劑量注射了一組變應原(臨床上使用的)例如塵螨D. farinae, D. pteronyssinus、美國蜚蠊(Cockroach)、細鏈格孢(Alternar ia tenuis)、曲霉混合物、 Cladosporidium herbarum、貓、狗、車前草-酢漿草(Sorrel)混合物、短豚草、西方橡樹混合物、草混合物/百慕大/Johnsonand真菌和其他變應原，并如上述評估血清免疫球蛋白水平。實施例9施用期望治療后血清IgE或記憶IgE陽性B細胞的評估此實施例說明不同治療在不同條件下是如何影響IgE應答的。以類似的方式評估了預防性和治療性干預二者。提到建議的治療劑時旨在包括預防性和治療性干預二者。測量了未免疫動物的血清IgE濃度。將動物隨機分配為7個組之一。第一組將不接受治療性干預或抗原攻擊。第二組僅接受載體(即無抗原)然后接受建議的治療劑。第三組接受抗原攻擊然后接受建議的治療劑。第四組接受建議的治療劑然后僅接受載體。第五組接受建議的治療劑然后接受抗原攻擊。第六組僅接受載體(即無建議的治療劑)。第七組僅接受抗原攻擊(即無建議的治療劑)。抗原攻擊和施用建議的治療劑(或反過來)的時間可變化以測定最佳施用時間。在此期間測量動物IgE水平以評估建議的治療劑調(diào)節(jié)IgE血清水平的能力。在第 3，7，14，21，觀，35和42天(抗原攻擊后)經(jīng)尾靜脈收集60ul樣品用于抗體同種型測量，使用在實施例4中描述的測定。應當理解本文描述的實施例和實施方案僅為了說明的目的，建議本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其進行多種修改或改變，這些修改或改變也被包括在本申請的精神和范圍和隨附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請用于所有目的在此處以其整體引入作為參考。工業(yè)適用性本文提供的胚胎干細胞允許產(chǎn)生體內(nèi)模型的對非特異性變應原的IgE應答。本文描述的體內(nèi)動物模型提供了對非特異性變應原的完整IgE應答。表1:序列總結(jié)
權(quán)利要求
1.一種靶向載體，其包含a)與待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)5’端同源的DNA片段(5’臂/受體)，其選自對應NCBI登錄號 NT_166318 (小家鼠染色體12基因組重疊群，品系C57BL/6J)的第254706 至25468161位核苷酸的至少1500個核苷酸、至少1800個核苷酸、至少2000個核苷酸、至少2200個核苷酸和至少MOO個核苷酸；b)可選擇的基因標記；c)期望的/供體DNA序列，其編碼供體轉(zhuǎn)換區(qū)；和d)與待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)3’端同源的第二個DNA片段(3’臂/受體)，其選自對應NCBI 登錄號NT_166318(小家鼠染色體12基因組重疊群，品系C57BL/6J)的第254706 至 25468161位核苷酸的至少1500個核苷酸、至少1800個核苷酸、至少2000個核苷酸、至少 2200個核苷酸、至少MOO個核苷酸和至少觀00個核苷酸。
2.權(quán)利要求1的靶向載體，其中5，臂包含SEQID NO 4或5。
3.權(quán)利要求1的靶向載體，其中5’臂與內(nèi)源Iε的3’區(qū)和內(nèi)源Se的5’區(qū)同源。
4.權(quán)利要求1的靶向載體，其中3，臂包含SEQID NO 7或8。
5.權(quán)利要求1的靶向載體，其中可選擇的基因標記選自新霉素和胸苷激酶。
6.權(quán)利要求1的靶向載體，其中可選擇的基因標記是新霉素。
7.權(quán)利要求1的靶向載體，其中可選擇的基因標記兩側(cè)是Ioxp位點。
8.權(quán)利要求1的靶向載體，其中期望的轉(zhuǎn)換區(qū)來自小鼠。
9.權(quán)利要求1的靶向載體，其中期望的轉(zhuǎn)換區(qū)選自Sy，Sy1，SY 2a，SY 2b禾口 SY 3。
10.權(quán)利要求1的靶向載體，其中期望的轉(zhuǎn)換區(qū)是含有小鼠Sm區(qū)大部分的HindIII/ NheI片段。
11.權(quán)利要求1的靶向載體，其中期望的轉(zhuǎn)換區(qū)包含對應NCBI登錄號NT_166318(小家鼠染色體12基因組重疊群，品系C57BL/6J 1)的第25617172至25615761位核苷酸。
12.體外產(chǎn)生改變的胚胎干細胞的方法，其包括以下步驟a.在所述細胞中改變基因組DNA以增強CSR的可能性，從而表達選自下述的Cεi.通過添加與內(nèi)源Sε區(qū)串聯(lián)的至少一個另外的S ε拷貝增加S ε長度；ii.Se區(qū)取代；和b.選擇具有正確改變的基因組DNA的細胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述改變是用選自Sy，SYl，SY2a，SY2b禾口Sy3 的轉(zhuǎn)換區(qū)取代S ε區(qū)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述改變是用Sy區(qū)取代Sε區(qū)。
15.體外產(chǎn)生改變的胚胎干細胞的方法，其包括以下步驟a)使用根據(jù)權(quán)利要求1的載體用Sy交換Sε區(qū)b)選擇具有正確改變的基因組DNA的細胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述改變是用選自Sy，Sγ 1，S γ 2a，S γ 2b禾口 S γ 3 的轉(zhuǎn)換區(qū)取代S ε區(qū)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述改變是用Sy區(qū)取代Sε區(qū)。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述ESC來自選自BALB/c或C57BL/6的小鼠品系。
19.一種非人動物，其中a)IgH基因座的至少一個等位基因已被改變，以提高相對未改變的等位基因的IgE表達/產(chǎn)生/分泌率；和b)具有選自下述的IgE譜i.全部血清抗體的IgE部分大于0.04% ；ii.IgE血清濃度大于4，000ng/ml ；iii.IgG/IgE 比例低于 10。
20.一種非人哺乳動物，其具有經(jīng)改變以表達IgE分子大于4000ng/ml的水平的基因組。
21.一種非人哺乳動物，其具有在0. 1和10之間的IgG/IgE比率。
22.—種非人哺乳動物，其具有在lOOng/mL和lOOOOng/mL之間的未攻擊的(即靜息)IgE血清濃度。
23.一種非人哺乳動物，其具有在lOOOng/mL和lOOOOOOng/mL之間的攻擊后的(即活化)IgE血清濃度。
24.權(quán)利要求19的動物模型，其中所述動物模型是非人脊椎動物。
25.權(quán)利要求19的動物模型，其中所述動物模型是小鼠、大鼠、豚鼠、兔或靈長類。
26.權(quán)利要求19的非人動物/哺乳動物模型，其中所述非人動物的基因組具有經(jīng)改變以表達/產(chǎn)生更多IgE的IgH基因座的S ε區(qū)。
27.權(quán)利要求19的非人動物/哺乳動物模型，其中所述改變通過基因打靶實現(xiàn)。
28.使用權(quán)利要求19的動物模型檢測過敏反應治療的方法，其包括在施用所述方法治療變應性疾病以前、同時或之后使所述動物接觸變應原，并評估IgE應答。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中所述IgE應答低于未經(jīng)過敏反應治療的。
30.權(quán)利要求觀的方法，其中所述檢測動物和對照動物是同窩出生仔畜。
31.通過權(quán)利要求觀的方法鑒定的化合物作為藥物在治療過敏反應中的用途。
32.可從權(quán)利要求19的動物模型得到的細胞系。
33.從權(quán)利要求19的動物模型中分離的細胞。
34.產(chǎn)生非人動物模型的方法，所述方法包括a)將編碼SEQID NO :6(Sy)的質(zhì)粒的線性化片段顯微注射至小鼠的受精卵中，從而使所述片段摻入C ε -編碼區(qū)的上游基因組DNA并與C ε -編碼區(qū)有效連接，b)將所述受精卵轉(zhuǎn)移至之前已經(jīng)處理以誘發(fā)假孕的雌性小鼠的輸卵管，和c)允許所述卵在所述雌性小鼠的子宮中發(fā)育。
35.重組小鼠，在其種系中包含經(jīng)改造的基因組，其中所述改造包含改變IgH基因座的至少一個等位基因，以提高IgE產(chǎn)生率。
36.權(quán)利要求35的重組小鼠，其中所述改變包含用Sy區(qū)或其功能性部分替換Sε。
37.權(quán)利要求35的重組小鼠，其中所述Sy功能性部分的長度在至少11Λ和101Λ之間。
全文摘要
本文描述了具有Sε區(qū)改變從而具有提高的IgE水平的重組非人細胞和動物。本文也描述了在IgH基因座中的改變，其允許增強類別轉(zhuǎn)換重組(CSR)從而使期望的重鏈同種型相比未改造細胞以提高的水平表達。
文檔編號G01N33/50GK102333874SQ201080009394
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者A·A·扎林, S·米薩吉 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司