專利名稱：一種檢測血清樣本中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測血清樣本中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統。
背景技術：
鼠疫桿菌(Yersinia pestis)屬于耶爾森氏菌屬(Yersina)，是引起烈性傳染病 鼠疫(Plague)的病原菌。鼠疫是一種病情極為兇險的傳染病，傳染性極強，致死率為30% 至100%，鼠疫的潛伏期大約是2至7天，甚至更短，各型的初期癥狀像有發高燒、劇烈頭痛、 嘔吐、臉部潮紅、眼紅、皮膚有出血點、意識模糊、四肢劇痛、局部淋巴結腫大等等。免疫學方法酶聯免疫實驗(ELISA)中利用抗原與抗體特異性反應來檢測抗原或 抗體主要有由雙抗原夾心測抗體、雙抗體夾心測抗原、競爭法、間接法等。間接法測抗體 的原理是特異性抗原結合到固相載體上，然后和待檢血清中的相應抗體結合形成免疫復合 物，洗滌后再加酶標記抗體與免疫復合物中的抗體結合形成酶標記抗體-抗體-固相抗原 復合物，加底物顯色，判斷抗體含量。懸浮芯片(suspension array)也稱液相芯片，是20世紀70年代美國Luminex公 司研制出的新一代生物芯片技術，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞儀作為檢測平 臺，對核酸、蛋白質等生物分子進行大規模測定。目前，該技術已廣泛應用于免疫分析、核酸 研究、酶學分析、抗體篩選及受體與配體的識別分析等領域。目前發展的懸浮芯片主要是基于實驗室檢測方法的建立和方法評價及優化，以縮 短檢測時間，降低方法的檢測成本。但是懸浮芯片方法是否能夠檢測人血清中的鼠疫抗體， 其定量檢測能力如何，尚缺乏模型和評價。
實用新型內容本實用新型的目的在于提供一種檢測血清中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統，該芯 片系統包括芯片基體、加液系統、懸浮芯片檢測儀和計算機，其中，芯片基體內裝有相關緩 沖溶液和待測抗體，相關緩沖液中設置有043號編碼微球，編碼微球上包被有捕獲抗原，加 液系統依次向芯片基體中加入生物素標記的二抗、熒光信號檢測物，懸浮芯片檢測儀包括 微細管檢測通道和檢測激光，反應后的溶液吸入到微細管檢測通道中，以使得每個編碼微 球依次通過微細管檢測通道，檢測激光激發并識別編碼微球的顏色及其上待測物的熒光信 號，計算機與懸浮芯片檢測儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測儀的測量結果。進一步，所述相關緩沖溶液包括用于所述待測抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述 編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素標記的二抗和/或SPA所用的抗體稀釋液、每 個反應之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋液、檢測緩沖液。進一步，所述捕獲抗原優選為鼠疫Fl蛋白。進一步，所述待測抗體為血清樣品。進一步，所述生物素標記的二抗，優選為Biotin-羊抗兔IgG和/或Biotin-羊抗 AlgGo
3[0011 ] 進一步，所述熒光信號檢測物為鏈親和素-藻紅蛋白。進一步，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。進一步，所述檢測激光包括用激發所述編碼微球基質中的顏色、識別編碼微球分 類編碼以確定檢測項目的紅色激光，用于激發并識別待測分子的顏色信號、記錄信號強弱 以檢測所述待測抗體的含量的綠色激光。經過大量試驗和深入的研究，對鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片制備及其檢測條件作了 實質性的改進和創新，其具有下列優點1、抗原包被量的改進鼠疫Fl抗原的包被量是成功檢測的關鍵，本實用新型對包被微球的抗原包被量 進行實質性優化使血清樣本的檢測效果非常良好，并且包被蛋白懸浮芯片所需的抗原包 被量很低，本實用新型的抗原包被量為0. 1 240μ g/1. 25X106個編碼微球或0. 02 960ng/2500 5000個微球/測試，而傳統免疫學ELISA方法的包被量為1 μ g/測試。2、生物素標記的改進通常，標記抗體需要使用過量的生物素。理論上講，在檢測過程中，過量的生物素 因未標記上抗體而不被微球上結合捕獲抗體的抗體連接，清洗時被抽濾掉，不會與隨后加 入的SA-PE反應，不影響檢測。但在實際檢測過程中，偶爾遇到過檢測信號可能過高的現 象，出現假陽性，因此建議生物素標記抗體后，盡量去除多余的生物素。以標記ang/mL的 IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27 μ L。3、檢測的靈敏度及動態范圍本實用新型的血清樣品鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測方法與經典的免疫學 ELISA檢測方法，結果有著很好的吻合性(相關系數R2 = 0.9994)。同時，蛋白懸浮芯片方 法靈敏度為2. 12ng/mL，其高于ELISA方法的312. 5ng/mL，靈敏度增高100倍以上；并且蛋 白懸浮芯片方法動態檢測范圍為1. 22 20000ng/mL，其高于ELISA方法動態檢測范圍(即 312. 5 20000ng/mL) 2 個數量級。4、方法的特異性本實用新型通過選用鼠疫Fl抗原為包被抗原，以兔抗鼠疫Fl抗體為待測抗體， 以生物素化的羊抗兔為檢測抗體。本研究試驗證明，在存在鼠抗流感NP IgG、兔抗禽流感 H5migG、兔抗結核抗體、兔抗SARS IgG等干擾抗體存在的條件下，本方法具有良好的特異 性。5、樣品的檢測能力本實用新型評價了蛋白懸浮芯片方法對人血清的檢測能力。通過對人血清的檢 測，初步證實了該方法在檢測人血清中鼠疫抗體的實用性。
圖1為本實用新型結構示意圖；圖2為043號微球包被鼠疫Fl蛋白檢測鼠疫抗體示意圖；圖3為蛋白懸浮芯片方法檢測兔抗鼠疫Fl抗體劑量-反應標準曲線圖；圖4為ELISA方法檢測兔抗鼠疫Fl抗體標準曲線圖；圖5為蛋白懸浮芯片與ELISA方法檢測兔抗鼠疫Fl抗體的相關性。
具體實施方式
如圖1至圖5所示，本實用新型一種檢測血清樣本中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系 統，包括芯片基體1、加液系統2、懸浮芯片檢測儀3和計算機4，其中，芯片基體1為96孔 濾板或者微量離心管，其內裝有相關緩沖溶液和待測抗體，相關緩沖液中設置有編碼微球 (圖中未示)，編碼微球上包被有鼠疫Fl蛋白，用于捕獲待檢測血清樣品中的待測抗體，如 果樣品中有鼠疫Fl抗體，鼠疫Fl抗體與編碼微球上的鼠疫Fl蛋白結合，再加入帶有生物 素標記的二抗，形成編碼微球-鼠疫Fl蛋白-鼠疫Fl抗體-二抗-生物素復合物，最后加 入鏈親和素-藻紅蛋白，鏈親和素與生物素結合，形成編碼微球-鼠疫Fl蛋白-鼠疫Fl抗 體-二抗-生物素-鏈親和素-藻紅蛋白復合物，通過懸浮芯片檢測儀對藻紅蛋白熒光信號 的檢測來達到對血清樣品中鼠疫Fl抗體的檢測，如果血清樣品中沒有鼠疫Fl抗體，包被有 鼠疫Fl蛋白的編碼微球不會與后面加入的生物素標記的二抗、鏈親和素-藻紅蛋白結合， 最后通過懸浮芯片檢測儀器進行檢測時無熒光信號或應該信號非常弱。上述芯片系統中，編碼微球在微球稀釋液，待測抗體在樣品稀釋液中，生物素標記 的二抗在抗體稀釋液中，熒光信號檢測物在SA-PE稀釋液中，懸浮芯片檢測儀檢測時編碼 微球復合物在檢測緩沖液中，每步結合之后均用微球清洗液洗滌微球，使得沒有結合的物 質清除體系。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比 例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏色，作為100種獨特的色彩編號，每顆 微球大小約5. 6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分 析等，并根據不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標記探針的微球與 待測物在96孔板中進行反應。反應后，利用機器自動將反應液吸起并通過一微細管檢測通 道，每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中設有兩道激光，一道為紅色，激發微球 基質中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一道為綠色，激發報告分子的顏色，記 錄信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道激光 所激發的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有微球中的激發光可被檢測到。 再通過機器與計算機自動統計分析兩道激光所激發的微球種類與數量，從而判定待測樣本 中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數 十種病原。懸浮芯片技術由于利用微球在溶液中反應，克服了片膜芯片在大分子檢測時受 表面張力、空間效應等對反應動力學的影響，同時利用激光檢測技術，大大提高了樣品檢測 的準確性和重復性，具有優于片膜芯片的操作簡便、重復性好等特點。本實用新型一種檢測血清樣本中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統，通過下面的具體 實施方式作進一步說明，但本實用新型不以任何方式受該實施例的限定。一、材料1.蛋白懸浮芯片的相關緩沖液(I)PBS 緩沖液(pH7. 4) :NaCl 137mmol/L ；KCl 2. 7mmol/L ；Na2HP04 10mmol/L ； KH2P04 2mmol/L。用 800mL 蒸餾水溶解 8gNaCl，0. 2gKCl，1. 44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04。 用HCl調節溶液的pH值至7. 4，加水至1L。分裝后在15psi (1. 05kg/cm2)高壓蒸汽20分 鐘，或過濾除菌，保存于室溫。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7· 4) ,0. 05% TWEEN-20。[0039](3)微球活化緩沖液 IOOmM NaH2P04 :3g NaH2P04,5N NaOH 1. 5mL，定容于 25OmL, pH 6. 2。(4)微球包被緩沖液 0. 05M MES, pH 5. 0 2. 44g MES, 5NNaOHO. 15mL,定容于 250mLo(5)微球保存液PBS-TBN :PBS，0· BSA，0. 02% TWEEN，0. 05%疊氮化物，pH 7.4。(6)微球封閉液 PBS-BN :PBS, 1% BSA,0. 05%疊氮化物，ρΗ7· 4。(7)檢測緩沖液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(8)抗體稀釋液 PBS，ρΗ7· 4。。(9)微球稀釋液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(10)樣品稀釋液 PVX :PBS,0. 5% PVA,0. 8% PVP ；(11) SA-PE 稀釋液:PBS (pH7. 4),1% BSA。2.抗原與抗體本實用新型所使用的抗原為鼠疫Fl蛋白，可購自青海省地方病預防控制所。本實用新型所使用檢測抗體為兔抗鼠疫Fl抗原多克隆抗體，可購自軍事醫學科 學研究院微生物流行病研究所，檢測抗體為生物素化羊抗兔IgG和生物素化羊抗人IgG，所 述的羊抗兔IgG和羊抗人IgG可購自北京鼎國生物技術公司。二、待測樣品的制備1、目標分析物樣品的制備目標分析物為兔抗鼠疫Fl IgG,干擾樣品或作為方法特異性測試的樣品是目標檢 測物外的其它抗體或其它蛋白質，包括兔抗結核血清、兔抗SARS IgG、兔抗禽流感H5W血 清、兔抗鼠疫IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。將上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液中，-4°C 保存。兔抗鼠疫FlIgG的儲備液濃度為0.08mg/mL。比較實驗中，相同樣品用于ELISA和蛋 白懸浮芯片的檢測。將待分析的兔抗鼠疫Fl IgG用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度樣品， 以繪制樣品檢測劑量-反應的標準曲線，其中幾個樣品濃度低于檢測的敏感度，高濃度樣 品應使編碼微球的結合位點處于飽和狀態。2、人血清樣本的處理分別將鼠疫病人血清樣本和人血清樣本用樣品稀釋1 10稀釋，例如血清樣本 5 μ L加樣品稀釋液50 μ L混勻后，作為待檢樣品進行蛋白懸浮芯片方法的檢測。實施例1、檢測鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片的制備1、捕獲抗原包被編碼微球本實用新型采用的043號編碼微球購自美國Bio-Rad公司，編碼微球用于標記可 以捕獲鼠疫抗體的鼠疫Fl蛋白抗原，即利用鼠疫Fl蛋白包被微球。Α、編碼微球的活化 取100 μ L (1. 25 X IO6個)編碼微球到1. 5mL離心管中，14000 X g離心，小心吸出并 棄去上清液。加入100 μ L的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000 Xg離心，小心吸出 并棄去上清液。加入100 μ L的微球活化緩沖液，接著先加入10 μ L新鮮配置的EDC(50mg/ mL)，再加入10 μ L新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室 溫震搖20分鐘。加入150 μ L的PBS (ρΗ7· 4)，震蕩后，14000 X g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7· 4)懸浮編碼微球。B、用抗原包被編碼微球取捕獲抗原西尼羅E蛋白抗原0. 1 M μ g加入到活化后的編碼微球中，用PBS緩 沖液定容至500 μ L，室溫震搖2小時。14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。用500 μ L 的PBS緩沖液洗一次，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L的封閉緩沖液 懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入500 μ L 的微球保存液洗滌編碼微球，16000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150yL的微 球保存液懸浮編碼微球，于4°C避光保存備用。C、包被微球的計數吸取適量微球，稀釋后，用血球計數板(0. 10mm;l/400mm2)在普通顯微鏡下計數。 根據公式(每個大格數Xio4X稀釋倍數X體積(mL))計算微球數量。2、檢測物標記生物素A、生物素的標記分別配制好濃度為IOmM生物素溶液和^iig/mL的待標記抗體溶液，將計算好體 積的生物素加入到待標記物溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時)，過柱脫鹽后分 裝，-20°C凍存備用。B、抗體的用量以標記ang/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約 27 μ 1。實施例2、蛋白懸浮芯片制備法條件的優化1、微球包被抗原包被量的選擇分另Ij以 0. 1μ g、2y g、4y g、6y g、8y g、10y g、12y g、16y g、20y g、24y g 的量包 被100 μ L編碼為043號的微球。經檢測效果比較，以0. 1 My g/1. 25 X 106個編碼微球 或0. 02 96ng/2500 5000個微球/測試，包被效果最好，顯微鏡下計數后避光冷藏保存 待用。如圖1所示，包被鼠疫Fl蛋白抗原的043號微球均落在其正確檢測區域內，并且獲 得高信噪比結果(MFI值遠大于2000)，說明優化的蛋白懸浮芯片檢測系統可成功用于鼠疫 Fl抗體的檢測。2、生物素化檢測物的優化本實用新型分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰胼(hydrazide)-生物素和羧基 活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標記檢測抗體，經質控過程檢 測效果比較，本實驗中Sulfo-NHS-生物素標記檢測物檢測效果較好，檢測效果的方法采用 本領域的常規方法或安裝制造商的產品說明書所述的方法。本實用新型人經過試驗驗證，發現ang/mL生物素化的抗體羊抗兔以1 500稀 釋作為檢測物進行檢測兔血清中的鼠疫Fl抗體，檢測結果顯示生物素化檢測物Bio-羊抗 兔抗體可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果；2mg/mL生物素化的檢測物Biotin-羊抗人 抗體以1 2500稀釋作為檢測人血清中鼠疫抗體的檢測物，檢測結果顯示生物素化檢測物 Biotin-羊抗人抗體可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果。實施例3、蛋白懸浮芯片樣品制備、檢測及結果判定1、待測樣品制備[0079]用樣品稀釋液將待測樣本配置為不同濃度樣本進行蛋白懸浮芯片檢測。2、樣品的檢測及結果判定檢測過程全部反應均在96孔濾板上進行，檢測過程如下1)每孔加入50 μ L含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化檢測物，混勻后室溫避 光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統讀取MFI數值并分析數據。3、檢測結果判定根據試驗研究結果與相關研究報道，本實用新型定義蛋白懸浮芯片方法檢測鼠疫 抗體的最低檢出限(L0D值)為檢測熒光強度臨界值(Cutoff)對應的檢測物濃度。其中， Cutoff的定義是采用空白對照樣品(Blank)熒光檢測信號MFI均值加3倍標準差(SD)，即 Cutoff值為=MFI (空白對照)+3倍標準差。若檢測結果高于LOD對應熒光強度值則判定 為鼠疫抗體檢測結果陽性；若檢測結果低于LOD對應熒光強度值則判定為鼠疫抗體檢測結 果陰性。實施例4、蛋白懸浮芯片對鼠疫Fl蛋白抗原特異性檢測應用蛋白懸浮芯片檢測方法分別對兔抗結核IgG、鼠抗流感NP IgG、兔抗SARS IgG、兔抗禽流感H5W血清、兔抗鼠疫Fl IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等進行檢測，根據實施 例3中檢測結果判定標準，僅兔抗鼠疫FlIgG為陽性，其余干擾抗體或蛋白均為陰性。說明 本實用新型所建立的鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片檢測方法與其它測試抗體均不發生交叉反 應或非特異反應。實施例5、蛋白懸浮芯片定量檢測模型的建立1、兔抗鼠疫FlIgG標準曲線樣品制備用樣品稀釋液將兔抗鼠疫Fl IgG標準品由滴度為0. 08mg/mL以4倍倍比梯度稀 釋至滴度為73. 6pg/mL成系列濃度樣品。2、劑量-反應標準曲線的繪制按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，并根據蛋白懸浮芯片系統檢 測結果繪制劑量-反應標準曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表抗體濃度，Y軸代表懸浮 芯片儀檢測的熒光值(MFI)。每個數據代表3次的檢測結果平均值，坐標軸以對數-對數關 系設定，圖2中兔抗鼠疫Fl IgG的濃度(ng/mL)分別為=Sl 0. 0763, S2 0. 305, S3 :1. 221， S4 4. 883，S5 :19. 531，S6 :78. 125，S7 :312. 5，S8 :1250. 0，S9 :5000. 0，SlO :20000. 0。蛋白懸浮芯片系統根據檢測結果擬合兔抗鼠疫FlIgG劑量-反應標準曲線方程FI = -7. 99831+(16838. 6+7. 99831)/[1+(Cone/1006. 33)^ 53611]°'1987013、蛋白懸浮芯片檢測兔抗鼠疫Fl IgG的靈敏度和動態范圍根據最低檢出限定義和劑量-反應標準曲線方程，本實用新型即蛋白懸浮芯片方 法檢測兔抗鼠疫 FlIgG 的靈敏度為50. 3pg/mL(Cutoff = 8，Blank = 8，SD = 0)。本實用新型定義最高檢出限為使編碼微球的結合位點處于飽和狀態的檢測物濃度。根據標準曲線隨著兔抗鼠疫FlIgG濃度的升高，其對應的MFI值也隨之遞增，當兔抗鼠 疫FlIgG濃度達到0. 02mg/mL時，抗原抗體的免疫反應達到飽和狀態，MFI值開始進入平臺 期，說明樣品中的待檢物濃度過高，需要將樣品稀釋后再檢測。因此，根據最低檢出限與最高檢出限可以判定本實用新型即蛋白懸浮芯片定量檢 測兔抗鼠疫Fl IgG的動態范圍為1. 22 20000ng/mL。實施例6、蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法檢測兔抗鼠疫Fl抗體的比較1、生物素-親和素ELISA (BAS-ELISA)檢測方法作為對比，生物素-親和素ELISA采用包括下列步驟1)向普通ELISA微孔板每 孔加入50 μ L用PBS緩沖液稀釋的鼠疫Fl蛋白1-50 μ g，4°C靜止過夜；2)加入封閉液，在37°C封閉2小時；3)洗液洗3次，拍干；4)加入檢測樣品，每孔50 μ L，室溫放置40分鐘；洗液洗3次，拍干；5)加入適量生物素化檢測物，每孔50 μ L，室溫放置30分鐘；洗液洗3次，拍干；6)加入適量SA/HRP (辣根酶標記鏈霉親和素)，50 μ L/孔，室溫放置3分鐘；洗液 洗3次，拍干；7)加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50 μ L/孔，室溫放置10 分鐘；8)用 2Μ H2SO4 終止反應；9)應用酶標儀測讀A450nm數值。2、樣品的蛋白懸浮芯片檢測方法采用間接法測抗體的免疫學檢測模式，檢測過程中全部反應均在96孔濾板上進 行。1)每孔加入50 μ L含相應編碼微球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾2次；2)加入50μ L檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾3次；3)加入50 μ L適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光 震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾3次；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。用清洗液洗滌并真空泵抽 濾3次；5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經蝸旋重懸混勻；6)用Bio-Plex蛋白懸浮芯片系統讀取MFI數值并分析數據。3、兩種檢測方法的靈敏度和動態范圍及相關性的比較制備的相同一組兔抗鼠疫Fl抗體樣品用樣品稀釋液4倍比稀釋同時應用懸浮芯 片和ELISA方法進行檢測。繪制ELISA方法檢測兔抗鼠疫Fl抗體的標準曲線(圖中橫坐 標為樣品滴度，縱坐標為吸光度值，坐標軸取對數-對數關系)，并與蛋白懸浮芯片方法結 果進行比較。根據兩種方法標準曲線蛋白懸浮芯片方法如，靈敏度為1.22ng/mL，線性檢測 范圍1. 22 20000ng/mL ；ELISA方法如圖3所示，靈敏度為312. 5ng/mL,線性檢測范圍 312. 5 20000ng/mL。可以得出結論檢測相同兔抗鼠疫Fl抗體樣品，蛋白懸浮芯片方法 比ELISA方法具有更高的檢測靈敏度，即高100倍；并且具有更寬的動態檢測范圍，即高2個數量級。另外，將兩種方法檢測結果在312. 5 20000ng/mL范圍內進行比較，如圖4所示 可以判定蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法有良好的相關性，相關系數為0. 9994。實施例7、人血清樣品的檢測1、人血清樣品的準備將人血清用樣品稀釋液1 10稀釋(人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L混 勻)后用于蛋白懸浮芯片檢測。2、人血清樣品的檢測1)每孔加入50 μ L含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L待檢測人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并 抽濾；3)加入50 μ L適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人抗體，混勻后室 溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統讀取MFI數值，根據標準曲線，確定待檢測人血清中鼠疫抗體 的濃度。經過多次重復試驗，生物素化羊抗人IgG稀釋比例選用1 2500稀釋，SA-PE稀 釋比例選用1 300稀釋，經過對94份人血清的檢測，所得的MFI值的均值與其標準差的 3倍之和為作為判斷陰陽性的界值，即C utoff值為632. 35，換算為濃度值是9. 6ng/mL，檢 測得到的MFI值如果大于632. 35，即血清中的西尼羅濃度超過9. 6ng/mL可視為鼠疫抗體陽 性可能被鼠疫感染，如果MFI值小于632. 35，即血清中的鼠疫抗體濃度低于9. 6ng/mL可判 斷為鼠疫抗體陰性，未感染鼠疫病毒或鼠疫病毒隱性攜帶者。
權利要求1.一種檢測血清中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統，其特征在于，該芯片系統包括芯 片基體、加液系統、懸浮芯片檢測儀和計算機，其中，芯片基體內裝有相關緩沖溶液和待測 抗體，相關緩沖液中設置有043號編碼微球，編碼微球上包被有捕獲抗原，懸浮芯片檢測儀 包括微細管檢測通道和檢測激光，計算機與懸浮芯片檢測儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢 測儀的測量結果。
2.如權利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統，其特征在于，所述相關緩沖溶液包括用于 所述待測抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素 標記的二抗所用的抗體稀釋液、每個反應之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋 液、檢測緩沖液。
3.如權利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統，其特征在于，所述捕獲抗原優選為鼠疫Fl蛋白。
4.如權利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統，其特征在于，所述待測抗體為血清樣品。
5.如權利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統，其特征在于，所述生物素標記的二抗優選 為Biotin-羊抗兔IgG和/或Biotin-羊抗人IgG0
6.如權利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統，其特征在于，所述熒光信號檢測物為鏈親 和素-藻紅蛋白。
7.如權利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統，其特征在于，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。
8.如權利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統，其特征在于，所述檢測激光包括用激發所 述編碼微球基質中的顏色、識別編碼微球分類編碼以確定檢測項目的紅色激光，用于激發 并識別待測分子的顏色信號、記錄信號強弱以檢測所述待測抗體的含量的綠色激光。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測血清中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統，包括芯片基體、加液系統、懸浮芯片檢測儀和計算機，芯片基體內裝有相關緩沖溶液和待測抗體，相關緩沖液中設置有編碼微球，編碼微球上包被捕獲抗原，加液系統依次向芯片基體中加入生物素標記的二抗和/或SPA、熒光信號檢測物，懸浮芯片檢測儀包括微細管檢測通道和檢測激光，編碼微球依次通過微細管檢測通道，檢測激光激發并識別編碼微球的顏色及其上待測物的顏色，計算機與懸浮芯片檢測儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測儀的測量結果。蛋白懸浮芯片技術利用微球在溶液中反應，利用激光檢測技術，提高了樣品檢測的準確性和重復性，具有優于片膜芯片的操作簡便、重復性好等特點。
文檔編號G01N21/64GK201917573SQ20102062841
公開日2011年8月3日 申請日期2010年11月24日 優先權日2010年11月24日
發明者張志華, 張曉龍, 楊宇, 楊永莉, 王靜 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院