專利名稱：磺胺二甲氧嘧啶elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及檢測(cè)磺胺二甲氧嘧啶殘留量的試劑盒，特別是檢 測(cè)動(dòng)物源性食品中磺胺二甲氧嘧啶殘留量的酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)試劑盒，ELISA(Enzyme Linked ImmunosorbnentAssay)是酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定的簡(jiǎn)稱，它是繼免疫熒光和放射免 疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種酶免技術(shù)。( 二)磺胺二甲氧嘧啶是應(yīng)用廣泛的抗菌素，對(duì)畜禽疾病控制和治療起到重要作 用。但由于磺胺二甲氧嘧啶存在嚴(yán)重副作用，人體中長(zhǎng)期存在磺胺藥物會(huì)導(dǎo)致許多細(xì)菌對(duì) 磺胺藥物產(chǎn)生抗藥性，且有潛在的致癌性。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件規(guī)定其殘留限量為 100μ g/kg，由于高效液相色譜等儀器分析方法樣本前處理及測(cè)定操作繁瑣和費(fèi)用高，推廣 使用受到限制。(三)實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的問(wèn)題是提供一種小巧輕便的磺胺二 甲氧嘧啶殘留量檢測(cè)試劑盒，其操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需 要的技術(shù)含量不高，可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品中磺胺二甲氧嘧啶殘留量的測(cè)定，減少了檢 測(cè)樣本所需要的時(shí)間。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種磺胺二甲氧嘧啶ELISA檢測(cè)試劑盒，包括盒體和 盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份 說(shuō)明書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在于酶標(biāo)板采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微 孔條上預(yù)包被磺胺二甲氧嘧啶偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板，14瓶試劑分別為7瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、 酶標(biāo)二抗、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶 位共15個(gè)。酶標(biāo)板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆 裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，下凹瓶位由塑料泡沫 制成，以塑料硬膜為蓋板膜，蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致，將14瓶試劑用不同大 小、不同顏色的塑料瓶盛裝并固定在下凹瓶位中與酶標(biāo)板、蓋板膜、自封袋、說(shuō)明書、質(zhì)控報(bào) 告一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于攜帶和運(yùn)輸。14瓶試劑分別為7瓶Iml標(biāo)準(zhǔn)品溶液、7ml酶 標(biāo)二抗、7ml抗體工作液、7ml顯色液A液、7ml顯色液B液、7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、 50ml濃縮復(fù)溶液。每一個(gè)試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96次測(cè)定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，既可進(jìn) 行一次連續(xù)多個(gè)樣品的檢測(cè)，也可以將板孔拆開(kāi)多次檢測(cè)。將剩下的放回鋁箔袋中用自封 袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測(cè)時(shí)，樣本中的磺胺二甲氧嘧啶將和酶 標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的磺胺二甲氧嘧啶偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗磺胺二甲氧嘧啶抗體，加入酶標(biāo)二 抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中磺胺二甲氧嘧啶的殘留量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn) 曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中磺胺二甲氧嘧啶殘留量，其操作簡(jiǎn)便 易行。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒具有很高的靈敏度動(dòng)物組織(肌肉、肝臟等)、雞蛋、蝦、魚(yú) 樣本的最低檢測(cè)限為ι μ g/kg ；蜂蜜樣本的最低檢測(cè)限為ι μ g/kg ；牛奶樣本的最低檢測(cè)限 為20 μ g/kg ；樣本的回收率范圍均在60% 100%之間。相對(duì)于其他磺胺二甲氧嘧啶檢測(cè) 方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、離心機(jī)、振蕩機(jī)和微量加樣器等，同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備，所需成本較低。本實(shí)用新型的有益效果是能快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確地用于磺胺二甲氧嘧啶殘留 量的檢測(cè)。
圖1為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面縱剖面圖(長(zhǎng)為8. 55cm)；圖2為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面橫剖面圖(長(zhǎng)為12. 8cm)；圖3為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的俯視圖；圖4為本實(shí)用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實(shí)用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖7為本實(shí)用新型盒體與固定泡沫模具的側(cè)視圖。參見(jiàn)附圖酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被磺胺二甲氧嘧啶偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標(biāo) 板的外框支撐架(1)上，酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴 或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時(shí)封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)，蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；透明 帽的半透明PE塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍(lán)色帽的半透明PE塑料試劑 瓶(5)用于封裝50ml濃縮復(fù)溶液；白色帽(6)的白色PE塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯 色液A液，紅色帽(6)的黑色PE塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液B液，黃色帽(6)的 白色PE塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色PE塑料試劑瓶(8)用于封裝 7ml酶標(biāo)二抗，綠色帽的白色PE塑料試劑瓶(8)用于封裝7ml抗體工作液，黑色帽的半透 明PE塑料試劑瓶(9)用于封裝Iml/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個(gè)下凹瓶 位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(18)，50ml濃縮復(fù)溶液(11)，7ml顯色液A液瓶 位(14)，7ml顯色液B液瓶位(13)，7ml終止液瓶位(12)，7ml抗體工作液瓶位(16)，7ml酶 標(biāo)二抗瓶位(15)，7個(gè)Iml/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位(17)，盒體為(19)是硬紙盒。
具體實(shí)施方式
一、樣本的前處理1.配液配液1:2M氯化鈉溶液稱取11. 69g氯化鈉加去離子水溶解定容至100ml。配液2 0. 02M磷酸鹽緩沖液 稱取2. 58g十二水合磷酸氫二鈉和0. 44g 二水磷酸二氫鈉加去離子水溶解定容至 500ml (用于樣本提取后的復(fù)溶)；配液3 :乙腈-水溶液(動(dòng)物組織、雞蛋專用)量取84ml無(wú)水乙腈加入到16ml去離子水中混勻配液4 提取工作液用去離子水將20X濃縮提取液按1 19體積比進(jìn)行稀釋(1份20X 濃縮提取液 +19份去離子水)用于低脂肪樣本提取用，提取工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。配液5 洗滌工作液[0027]用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 19體積比進(jìn)行稀釋(1份20X濃縮洗滌液 +19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。2.樣本處理步驟動(dòng)物組織(肌肉、肝臟等)、雞蛋、蝦、魚(yú)等用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；稱取3. 0士0. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加 入9ml乙腈-水溶液，用振蕩器振蕩10min，3000g以上15°C離心IOmin ；取上清液至另 一個(gè)50ml聚苯乙烯離心管中，加入aiil 2M氯化鈉溶液和7ml乙酸乙酯，用振蕩器混合振蕩 IOmin, 3000g以上15°C離心5min ；將上層液轉(zhuǎn)至IOml干凈的玻璃試管中，于50 60°C水 浴氮?dú)饬飨麓蹈桑患尤?. 02M磷酸鹽緩沖液Iml用振蕩器混合振蕩lmin，再用正己烷Iml混 合2min，3000g以上15°C離心5min，除去上層液；取50 μ 1下層用于分析。蜂蜜樣本稱取1. 0 士0. 05g蜂蜜樣本于50ml聚苯乙烯離心管中，加入^iil 0. 02M磷酸鹽緩 沖液溶解；加入8ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩10min，3000g以上室溫離心IOmin ；取上層液 體于細(xì)1至IOml干凈的玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈?，加Iml 0. 02M磷酸鹽 緩沖液溶解干燥的殘留物；取50 μ 1用于分析。牛奶樣本取牛奶樣本，3000g以上，10°C離心lOmin，吸除上層脂肪；取Iml離心后的牛奶樣 本，用0. 02M磷酸鹽緩沖液按1 19的體積比進(jìn)行稀釋(即20 μ 1牛奶+380 μ 1 0. 02磷 酸鹽緩沖液)；取50 μ 1用于分析。二、使用試劑盒的操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫Q0-25°C )平衡30min以上，注意每種 液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號(hào)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記 錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μ 1到對(duì)應(yīng)的微孔中，隨即加入酶標(biāo)二抗 50 μ 1/孔，在加入抗體工作液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境 中反應(yīng)60min。6、洗板小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ 1/孔，充分洗滌 4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)。7、顯色加入底物液A液50μ 1/孔，再加底物液B液50μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用 蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min。8、測(cè)定加入終止液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙 波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測(cè)定每孔OD值。(若無(wú)酶標(biāo)儀，則不加終止 液用目測(cè)法可進(jìn)行判定)。三、結(jié)果判定結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣 本吸光值與磺胺二甲氧嘧啶殘留量成負(fù)相關(guān)。[0046]1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較即可得出其濃度范圍(μ g/L)。 假設(shè)樣本1的吸光度值為0. 113，樣本2的吸光度值為0. 554，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是 0 μ g/L 為 2. 155 ； 1 μ g/L 為 1· 345 ;3 μ g/L 為 0· 891 ;9 μ g/L 為 0. 340 ；27 μ g/L 為 0. 131 ； 81 μ g/L為0. 060。則樣本1的濃度范圍是27 μ g/L-81 μ g/L再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即 可得出樣本中磺胺二甲氧嘧啶殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是3 μ g/L-9 μ g/L再乘 以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中磺胺二甲氧嘧啶殘留量的濃度范圍。2、定量分析 (1)百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸 光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值(%) = ΒX 100%
B0B-標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0-O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以磺胺二甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μ g/L)的半對(duì)數(shù) 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本 所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺二甲氧嘧啶實(shí)際殘留量。四、測(cè)定前的注意事項(xiàng)1、室溫低于20°C或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(20_25°C )會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值 偏低。2、在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性， 重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。3、每加一種試劑前需要將其搖勻。4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。5、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒;也不要使用過(guò)了有效期的試劑盒中的任何試劑， 摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。6、儲(chǔ)存條件保存試劑盒于2_8°C，不要冷凍；將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質(zhì)的跡象顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0. 5個(gè)單位 (A450nm < 0. 5)時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色30min即可。若顏色較淺，可延長(zhǎng) 反應(yīng)時(shí)間，但不得超過(guò)40min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25°C，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度 發(fā)生變化。
權(quán)利要求1.一種磺胺二甲氧嘧啶ELISA檢測(cè)試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一 張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說(shuō)明書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特 征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被磺胺二甲氧嘧 啶偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板，14瓶試劑分別為7瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、抗體工作液、顯色 液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶位共15個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標(biāo) 板，放于真空鋁箔袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標(biāo)準(zhǔn)品溶液用黑色帽的半透明PE塑料瓶，酶標(biāo) 二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，顯色液A液用白色 帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑 料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽的半透明PE塑料瓶， 下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的 可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔；蓋板膜大小 與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液7瓶，Iml/瓶；酶標(biāo)二抗1瓶，7ml ；抗體工作液1瓶， 7ml ；顯色液A液1瓶，7ml ；顯色液B液1瓶，7ml ；終止液1瓶，7ml ；濃縮洗滌液1瓶，40ml ； 濃縮復(fù)溶液1瓶，50ml。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中磺胺二甲氧嘧啶殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、磺胺二甲氧嘧啶抗體工作液、7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、蓋板膜、自封袋、說(shuō)明書和質(zhì)檢報(bào)告。采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的磺胺二甲氧嘧啶將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗磺胺二甲氧嘧啶抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中磺胺二甲氧嘧啶的殘留量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點(diǎn)，可在磺胺二甲氧嘧啶的殘留量檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/543GK201852831SQ20102058656
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者何方洋, 余厚美, 馮月君, 劉福林, 羅貴昆, 蒲小容, 趙正苗 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司