專利名稱：檢測人全血中他克莫司藥物濃度的酶標板及試劑盒的制作方法
技術領域：
實用新型涉及人全血中他克莫司藥物的檢測，特別涉及一種檢測人全血中他克莫 司藥物濃度的試劑盒。
背景技術：
他克莫司(tacrolimus)是大環內酯類免疫抑制劑，1989年首次應用于臨床。他 克莫司與其結合蛋白FKBP12相結合，而在細胞內蓄積產生效用。FKBP12-他克莫司等復合 物會專一性地結合以及抑制鈣調神經磷酸酶的活性，阻斷T細胞激活過程，同時還有他克 莫司所不具備的T-細胞依賴性抗體的生成，阻斷細胞因子的轉錄，呈現雙重的免疫抑制作 用，其免疫抑制作用較他克莫司強100倍，其臨床上主要用于肝腎等器官移植后的免疫排 斥抑制治療。他克莫司的個體吸收率和清除率差別很大，且用藥劑量與血藥濃度之間缺乏 緊密的相關性，在高血濃度時有一定的毒性，主要是神經毒性、腎毒性和糖代謝異常等。由 于其治療窗窄，給臨床治療增加了相當的難度，因此需要反復測定期血中濃度以調整用藥 劑量。大部分(75% 80% )的他克莫司藥物連結在紅細胞上，導致全血藥物濃度較血 漿藥物濃度為高，兩者不相關，全血和血漿中藥物濃度的分布與多種因素有關。藥代動力學 研究表明，他克莫司全血而非血漿濃度能夠更好的表明他克莫司的藥代動力學特征，故血 液檢測中以該藥品以全血藥物濃度為依據。如前所述，他克莫司在血液中主要和紅細胞上的結合蛋白結合，因此在他克莫 司血液濃度檢測前，必須對全血樣本進行處理，使紅細胞破裂，他克莫司與其綁定蛋白分 離。由于他克莫司水溶性較差，目前常用有機溶劑如甲醇、DMSO裂解沉淀法，酶消化法來提 取他克莫司，這些方法都需要使用離心機對樣品進行高速離心以除去沉淀蛋白，這使得他 克莫司不能直接在自動化平臺上檢測，而需要前處理操作。同時這一前處理方式有很多缺 點，如所用有機溶劑往往有毒性，操作需謹慎，同時這些有機溶劑易于揮發，如果在樣品前 處理完成后不能及時檢測，結果將有較大變化等等。為了實現他克莫司檢測的完全自動化， 同時克服有機溶劑提取前處理法的缺點，科學家已經找到一些無需有機溶劑沉淀和離心的 方法。在美國專利7186518中，作者合成了一個他克莫司的衍生物，該化合物能夠競爭性的 與他克莫司結合蛋白結合，將他克莫司從其結合蛋白中置換出來，但是卻不與他克莫司單 克隆抗體結合，研究表明雷帕霉素也可以起到這樣的作用。因此作者首先將全血樣品用超 聲波進行破碎，然后在樣品中加入含一定濃度的他克莫司衍生物的提取液，混合均勻，樣品 即可用于檢測，結果顯示此法的結果優于有機溶劑提取法。在美國專利2007/0087396中， 作者用分別用非離子去垢劑如Triton XlOO作為紅細胞裂解劑，膽酸鹽作為提取劑來處理 樣品，處理過的樣品可以直接用于他克莫司檢測而無需其他任何處理。這兩項技術使得使 用自動化平臺全過程檢測他克莫司成為可能，同時也為他克莫司的快速半定量檢測提供了 樣品處理的方法目前測定全血Π(506濃度的方法主要有，受體結合法、高效液相-質普測定法(HPLC-MS)、酶聯免疫吸附法(ELISA)、微粒子酶聯免疫測定法(MELA)以及化學發光微粒子 免疫法等。其中受體結合法主要用于藥物研究；液質聯用是目前最準確、靈敏度最高、具有 特異性的冊506濃度分析方法，最低檢測限為0. 2 μ g/L，但其穩定性不是很好且成本較高， 需要大型設備儀器，仍主要用于科研領域；微粒子酶聯免疫測定法(MELA)以及化學發光微 粒子免疫法(CMIA)是目前最常用的檢測方法，這兩種方法檢測結果準確，操作相對簡便， 但是試劑目前均需要進口，價格高昂，而且必須配以昂貴的專有設備使用，因此只適用于一 些大型醫院使用。目前所用的ELISA試劑盒也依賴進口，價格昂貴。使用過程反應時間較 長，需要對樣品進行酶消化、震蕩等處理，使用不是很方便。基于以上情況，目前僅有一些大型醫療機構可以進行他克莫司藥物濃度的檢測， 遠離大城市的患者往往需要長途跋涉到達醫院或是通過郵寄標本的方式才能進行此項測 試，費時費力，而且不能得到及時的檢測。即使在大型醫院，由于使用大型機器成本的問題， 往往也是積攢夠一定數量樣品后，才進行檢測，檢測往往被延誤，以至于醫生不能即使指導 病人用藥。因此市場急切的需要一種快捷簡單、價格低廉、不依賴任何儀器設備，同時又能 準備、靈敏的檢測他克莫司濃度范圍的手段，這一手段可以供所有醫療機構甚至患者自己 使用，為患者提供血藥濃度范圍的基本信息，為是否需要進行下一步精確檢測提供依據。
實用新型內容本實用新型根據上述領域的空白及需求，提供一種檢測人全血中他克莫司藥物濃 度的試劑盒。檢測人全血中他克莫司藥物濃度的酶標板，其特征在于所述酶標板的反應孔內 包被有他克莫司半抗原與載體蛋白分子的偶聯物。檢測人全血中他克莫司藥物濃度的試劑盒，包括盒內支架和酶標板，其特征在于 所述盒內支架上設置有酶標板放置槽，所述酶標板放置槽中放置上述酶標板。所述盒內支架上設置若干試劑容器槽，試劑容器槽中放置的容器分別為盛裝他克 莫司抗體液、酶標記抗體液、樣品前處理液、樣品稀釋液、底物液終止液、濃縮洗液和/或他 克莫司標準品的是試劑瓶或試劑管。本實用新型提供一種檢測人全血中他克莫司藥物濃度的酶標板，該酶標板的反應 孔內包被的物質為他克莫司半抗原與載體蛋白分子的偶聯物。檢測時，采用間接競爭ELISA 法檢測人全血中他克莫司的濃度，向微孔板中加入樣品稀釋液，待測樣品和他克莫司抗體 液，樣品中的他克莫司與包被在微孔板上的他克莫司競爭結合他克莫司抗體，反應終止后 洗滌，加入酶標二抗，反應后洗滌，再加入底物液顯色，顯色終止后，用酶標儀測定吸光度， 樣品中他克莫司的濃度將與吸光度值呈負相關，用校準品擬合標準曲線，樣品與標準曲線 比較即可得到他克莫司的濃度。酶標板可以同時檢測包括標準品在內的很多個樣品，適合 批量檢測。本實用新型進一步提供一種包括上述酶標板的試劑盒，試劑盒內設置了 一個用于 存放各種試劑容器的盒內支架，盒內支架上設置若干試劑管放置槽，其中一個為酶標板槽， 用于放置上述酶標板，該設計便于試劑盒的存放和運輸。本實用新型優選所述盒內支架上設置若干試劑容器槽，所述若干試劑容器槽中的 容器分別為盛裝他克莫司抗體液、酶標記抗體液、樣品前處理液、樣品稀釋液、底物液、終止液、濃縮洗液、他克莫司標準品的試劑瓶或試劑管。這些試劑為檢測中的必須試劑，因此在 試劑盒中設置了放置盛裝這些試劑的容器的位置，最大程度地提供便捷的即用型檢測試劑 盒，只要有酶標儀，買到本實用新型試劑盒就可以檢測。
圖1.本實用新型檢測人全血中他克莫司藥物濃度的試劑盒內部結構俯視示意圖圖2.本實用新型試劑盒檢測的校準品曲線。其中1-盒內支架，2-酶標板，3-反應孔，4-他克莫司半抗原與載體蛋白分子的偶 聯物，5-試劑管放置槽。
具體實施方式
如圖1所示，本實用新型檢測人全血中他克莫司藥物濃度的酶標板，其特征在于 所述酶標板2的反應孔3內包被有他克莫司半抗原與載體蛋白分子的偶聯物4。檢測時，在 反應孔3中加入抗他克莫司抗體液與待測樣品的混合液，包被的他克莫司半抗原與載體蛋 白分子的偶聯物4與樣品中的他克莫司競爭性地域抗體液中的抗體結合，反應結束后，加 入洗液洗掉沒有與包被有他克莫司半抗原與載體蛋白分子的偶聯物4結合的物質，然后加 入二抗及顯色底液，在酶標儀上檢測顯色吸光值，樣品中他克莫司的濃度將與吸光度值呈 負相關，在校準標準曲線上找到該吸光值對于的他克莫司濃度。本實用新型提供的酶標板 能夠一次完成包括制備標準曲線在內的標準品及其其它若干樣品，一次得出若干樣品的檢 測值。本實用新型還提供了包括上述酶標板2的試劑盒，試劑盒內設置了一個用于存放 各種試劑容器的盒內支架1，盒內支架1上設置若干試劑管放置槽5，其中一個為酶標板槽， 用于放置上述酶標板2，該設計便于試劑盒的存放和運輸。本實用新型優選所述盒內支架1上設置若干試劑容器槽5，所述若干試劑容器槽 中的容器分別為盛裝他克莫司抗體液、酶標記抗體液、樣品前處理液、樣品稀釋液、底物液、 終止液、濃縮洗液、他克莫司標準品的試劑瓶或試劑管。這些試劑為檢測中的必須試劑，因 此在試劑盒中設置放置盛裝這些試劑的容器的位置，最大程度地提供便捷的即用型檢測試 劑盒，只要有酶標儀，買到本實用新型試劑盒就可以檢測。實驗例1.試劑盒組分的制備與試劑盒組建1. 1.抗原制備稱取250mg FK506，15mg 琥珀酸酐，6mg 吡啶(4-dimethylaminopyridine)溶于 6. 25ml新蒸餾的二氯甲烷。邊攪拌邊加入42ul三乙胺。室溫繼續攪拌2小時。以上混合 物用二氯甲烷稀釋到20ml。分別用等量的0. 1當量鹽酸、純化水、飽和的氯化鈉各洗一次。 在分液漏斗內靜止分層，然后過濾收集下層液(二氯甲烷)。所得到的有機相放在無水硫酸 鎂上干燥，用磁力攪拌器持續攪拌30分鐘，然后用砂芯漏斗抽濾以除掉硫酸鎂。用旋轉蒸 發儀濃縮，直至呈輕微黃色泡沫。用少量二氯甲烷重溶并過硅膠色譜柱，二氯甲烷與甲醇按 9 1的比例混合做流動相，收集第一個流出的組分。在旋轉蒸發儀上將進行干燥，得到淡 黃色Π(506半琥珠酸酯。稱取35mg FK506半琥珠酸酯，5. 4mg N-羥基琥珀酰亞胺和8. 8mg N，N- 二環己基碳化二亞胺溶于5ml乙酸乙酯，在磁力攪拌器上繼續攪拌24小時。6000rpm
5離心5分鐘以除去中的沉淀物。在旋轉蒸發儀上干燥中的上清，得到含有活性酯的反應混合物。上述材料無需進 一步純化活性。稱取Img活性酯溶于2. 5ml N，N- 二甲基甲酰胺。量取0. 14ml與0. 62ml N，N- 二 甲基甲酰胺混合并逐滴加入到IOml (含IOmg)卵清蛋白中。用磁力攪拌器于室溫混合2. 5 小時，然后加入lmll. 8M Tris0用S印hadex G-25層析純化。1. 2.包被酶標板制備用包被緩沖液(pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液)將他克莫司與卵清蛋白偶聯 物稀釋到1. 5ug/ml，加入到酶標板中，每孔100ul，37°C反應2小時，甩掉包被液，用洗滌液 清洗2次，每次30秒。每孔加入200ul封閉液，37°C反應2小時，甩掉封閉液，拍干，于30°C 干燥箱烘干3-5小時，用鋁箔袋真空包裝保存。1. 3.他克莫司抗體選擇Fitzgerald公司生產的FK506單克隆抗體mouse monoclonal anti-Tacromilus antibody，IgM，，用抗體稀釋液進行1 10000稀釋，制備成使用濃度液。1.4.酶標二抗選擇KPL公司生產的HRP標記的羊抗鼠IgM抗體HRP-labeled GoatAnti-Mouse IgM(y )，用二抗稀釋液稀釋8000倍到工作濃度。1.5.樣品稀釋液為含0. 3M NaCl 的 50mM Tris 緩沖液，pH8. 0。1. 6.樣品前處理液為含60mM硫酸鋅ZnSO4的甲醇與乙二醇混合液1. 7.顯色底物液底物液分為A、B 二液，A為過氧化脲溶液，B為四甲基聯苯胺(TMB)溶液1. 8.終止液終止液為2N硫酸溶液1. 9.濃縮洗液濃縮洗液為含10 %吐溫20的磷酸鹽緩沖液。1. 10.他克莫司標準品他克莫司標準品為含有不同濃度他克莫司的人全血溶液，他克莫司濃度分別為0、 3、6、12、20、30ng/ml。1. 11.在以上10個步驟制備的基礎上，分別取酶標板(96人份)1塊，他克莫司抗 體3ml/瓶酶標二抗3ml/瓶，樣品稀釋液12ml/瓶，樣品前處理液18ml/瓶，底物液A 6ml/ 瓶，底物液B6ml/瓶，終止液12ml/瓶，濃縮洗液30ml/瓶，他克莫司標準品4ml/瓶(A-F共 6瓶)，即可組成一個他克莫司濃度檢測試劑盒(競爭酶聯免疫法)實驗例2人全血樣品中他克莫司濃度的檢測1. 12.樣品前處理從冰箱拿出IMx普樂可復II校準品(瓶上分別標示為A、B、C、D、E、F)和待測 樣品，在振蕩器上充分振蕩混勻以上液體，立即精確吸取150μ 1每個樣品到相應的離心管中，將150μ 1的樣品前處理液分別加到每個離心管后立即蓋好管帽，用旋渦混合儀高速旋 轉，確保每個樣品充分混勻。將離心管放入離心機，離心時間和速度一定要保證(13000轉， 6分鐘)。1. 13.樣品檢測在酶標板待測孔每孔加入樣品稀釋液60ul，加入處理過的樣品以及校準品20ul， 加入他克莫司抗體20ul，充分混勻，用封板膜封板，37°C溫箱反應30min。甩去液體，每孔加 入洗液300ul，放置30秒，拍干。重復5次。每孔加入酶標二抗100ul，37°C反應30分鐘。 甩去液體，每孔加入洗液300ul，放置30秒，拍干。重復5次。每孔加入底物液A、B各50ul 混勻，37°C避光反應10分鐘，每孔加入終止液lOOul，用酶標儀雙波長讀值(A45cia53q)。1. 14.結果分析以校準品濃度標示值為X軸，以檢測吸光度值為Y，進行四參數擬合，得到擬合曲 線圖2，將待測樣品吸光度帶入，即可求得樣品濃度，四參數擬合所得相關系數R2需大于 0. 99。所得曲線見圖2以樣品檢測結果表2 表1標準曲線參數
表2校準品測試數據 10%。間差。
從結果看，本試劑盒檢測結果非常準確，所測樣品結果與已知濃度值偏差均小于 實驗例3試劑盒精密性
分別以試劑盒重復檢測標示值為5和20的質控品，計算其檢測結果的批內差，批 表3.第一個批號[0059] 表4.第二個批號 用標識值為20的質控品計算批間差。批間差=20. 51/((20. 51+20. 71)/2)= 0. 97% .結果顯示，試劑盒批內差、批間差均小于15%。
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權利要求檢測人全血中他克莫司藥物濃度的酶標板，其特征在于所述酶標板的反應孔內包被有他克莫司半抗原與載體蛋白分子的偶聯物。
2.檢測人全血中他克莫司藥物濃度的試劑盒，包括盒內支架，其特征在于所述盒內支 架上設置有酶標板放置槽，所述酶標板放置槽中放置有權利要求1所述的檢測人全血中他 克莫司藥物濃度的酶標板。
3.根據權利要求2所述的檢測人全血中他克莫司藥物濃度的試劑盒，其特征在于所 述盒內支架上設置若干試劑容器槽，所述試劑容器槽中放置的容器分別為盛裝他克莫司抗 體液、酶標記抗體液、樣品前處理液、樣品稀釋液、底物液終止液、濃縮洗液和/或他克莫司 標準品的是試劑瓶或試劑管。
專利摘要本實用新型“檢測人全血中他克莫司藥物濃度的酶標板及試劑盒”，屬于醫學檢測領域。所述酶標板的反應孔內包被有他克莫司半抗原與載體蛋白分子的偶聯物。檢測時，在反應孔內加入待測血樣品與抗他克莫司抗體的混合液，最后加入二抗及顯色底物，酶標儀檢測吸光值，通過標準曲線測得他克莫司濃度，吸光值與他克莫司濃度呈反比。即采用競爭性免疫反應原理定量檢測全血中的他克莫司含量。本實用新型還提供了包括上述酶標板和檢測反應所需的必須試劑的試劑盒，最大限度地提高了檢測的便捷性。
文檔編號G01N33/543GK201681077SQ20102019739
公開日2010年12月22日 申請日期2010年5月18日 優先權日2010年5月18日
發明者李全, 焦守恕 申請人:同昕生物技術(北京)有限公司