一種測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法及試劑裝置的制作方法

            文檔序號:5885270閱讀:723來源:國知局
            專利名稱:一種測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法及試劑裝置的制作方法
            技術領域
            本發明申請涉及一種測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法及試劑裝置,屬于生物檢測 技術領域。
            背景技術
            抗中性粒細胞胞質抗體(antineutrophilcytoplasmic antibodies. ANCA)是目 前用于診斷原發性小血管炎最重要的血清學檢測指標,蛋白酶3 (proteinase 3,PR3)是 cANCA的主要靶抗原之一,約占C-ANCA的80% 90%。韋格納肉芽腫(Wegener' s granulomatosis,WG)是一種特殊類型的壞死性肉芽 腫性血管炎。其臨床的復雜性和診治的困難性一直是困擾風濕病專科醫師的問題。WG的診 斷主要依據臨床癥狀,而臨床表現復雜多樣、因人而異。抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)是 對WG最有診斷意義的自身抗體。過去WG的診斷主要是根據典型的臨床表現和病史,但有些患者,尤其是限局性的 患者很難診斷,病檢是確診WG的重要手段.但一次或單部位病檢陰性并不能排除WG。目 前的研究認為大部分WG患者的ANCA特異性靶抗原是冊3,抗PR3抗體與WG的診斷和疾病 活動密切相關。胞漿型ANCA (cytoplasmic ANCA, cANCA)和抗PR3抗體對WG診斷意義有高 度的敏感性和特異性。國外報道在活檢證實為WG的患者中,cANCA和抗PR3抗體特異性為 90%以上。敏感性是與疾病的活動性有關。通常.cANCA和抗PR3抗體滴度與疾病活動 一致,初期約為50%。而在活動期,全身性疾病的患者可達90%。活動期滴度較高,部分緩 解期滴度很低,完全緩解的患者多數測不到。緩解期cANCA或抗PR3抗體滴度的升高可能 預示著復發,并且有助于將感染和復發區分開。對于此病的檢測方法主要為間接免疫熒光法和酶聯免疫吸附法,但這些方法都存 在著不足之處;一、間接免疫熒光法該法的基本原理是用特異性的抗體與切片中的抗原結合后,繼用間接熒光抗體, 與前面的抗原抗體復合物結合,形成抗原抗體熒光復合物。在熒光顯微鏡下,根據復合物的 發光情況來確定所檢測的抗原。該方法評價由于結合在抗原抗體復合物上的熒光素抗體 增多,發出的熒光亮度強,因而其敏感性強。但是其不足也是明顯的(1)運用此法是可能出現假陽性。(2)在分析結果時無法根據分子量的大小區分非特異性識別。(3)操作相對復雜,需要價格較昂貴的熒光顯微鏡,在很多基層醫院難以推廣,也 不太適用于標本量較多的實驗室。(4)熒光測定中的本底較高,熒光免疫技術用于定量測定有一定困難。(5)結果判定需要有經驗的專業人員,分析結果的客觀性不足。二、酶聯免疫吸附法ELISA檢測抗PR3抗體,簡便易行,特異性高,與間接免疫熒光法聯合檢測,可為臨床對WG的診斷和治療提供更為客觀的實驗依據。但與其他生物檢測或免疫檢測比較,這種ELISA檢測方法、技術、工具或產品仍有 較多的不足而使其應用受限,這些不足主要包括以下幾個方面(1)使用12X8型、8X 12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原抑或抗體包被用 品和反應容器,在使用時只能分成12批次、8批次或整板一次使用;(2)定量測定所用的試劑可多達11種,每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝,并 且每使用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中,不但試劑瓶種類 多,加注試劑的操作也極為繁瑣,如果不使用全自動酶免分析儀的話,則全部操作都要用手 工來進行,而全自動酶免分析儀的價格十分昂貴,投入較大;(3)每一檢測或每次檢測無試劑信息的條形碼,只能通過查看試劑盒外包裝盒的 標識才能了解或知悉檢測試劑的生產批號及有效期信息,而且所知悉的信息在檢測過程中 不受控,具有很大的隨意性;(4)檢測試劑在檢測過程中為開放方式,容易引起各種試劑之間的交叉污染而影 響檢測結果;(5)在未采用全自動酶免分析儀進行檢測時的檢測過程為手工操作,試劑或樣品 的加量不很精確,操作過程極為繁瑣和復雜,容易發生操作差錯,檢測結果的不準確度和不 精密度高;(6)在檢測項目成套試劑的數量配置及使用上均為項目數X96人份,如果需要檢 測10個項目,則試劑的配置及使用數須為10X96人份,如果只有一份樣品需要檢測10個 不同的項目,也需要配置10X96人份的試劑。

            發明內容
            為了解決抗蛋白酶3抗體IgG分析檢測現有方法中存在的不足之處,本發明申請 提供一種新的檢測方法和試劑裝置及配套試劑。該方法基于酶聯免疫檢測技術,尋求一種 更加簡單、準確、有效的一套方法及試劑來進行定量檢測以滿足臨床診斷的需要。本方法基于酶聯免疫檢測的原理來實現抗蛋白酶3抗體IgG的免疫檢測,是一種 獨立的、單人份的、一次性的用于酶聯免疫檢測抗蛋白酶3抗體IgG的分析方法、試劑裝置 以及配套試劑,它可以將抗蛋白酶3抗體IgG酶聯免疫檢測所需要的多種試劑盛裝在一個 分析裝置上,通過這種方法可以更方便地根據檢測項目的使用需要進行相關的免疫學檢 測,為臨床應用提供了更好的依據。本發明申請提供一種測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法,是通過酶聯免疫檢測的分 析試劑裝置和配套試劑組成的試劑盒來實現的,這種分析試劑裝置包括設有8個孔位的基 體和位于基體一端的手柄,它通過專用特定分析儀器對試劑裝置各孔之間的各種特定試劑 溶液進行加注和吸棄,使樣品與試劑發生反應,然后測量發生反應后溶液色澤的數值,最終 通過對測量的數值進行處理而獲得檢測結果。所述的測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法,是將待測樣品中的待測抗蛋白酶3抗體 IgG與高度純化的人蛋白酶3抗原進行反應而形成第一免疫絡合物,該第一免疫絡合物與 酶標記的第二抗體進行反應形成第二免疫絡合物,將反應形成的第二絡合物與顯色底物進 行顯色對比分析,從而獲得待測抗蛋白酶3抗體IgG的含量。
            所述的測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法,其中,所述的第二抗體為辣根過氧化物酶 標記的抗人IgG抗體。本發明申請還提供一種測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置,設有8個孔位的基 體、位于基體一端的手柄,以及用于酶聯免疫法檢測抗蛋白酶3抗體IgG的分析試劑裝置以 及相應數量的配套試劑校準品、質控物和緩沖洗滌液的組份。所述的測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置,其中,所述基體一端的手柄上粘貼有 檢測試劑條形碼的標帖,所述條形碼的數值包含每項檢測所對應的檢測項目代碼、檢測試 劑生產批號、試劑有效期、定性校正值/定量測定標準曲線參數、酶聯免疫反應類型、試劑 及分析裝置的序列號的信息。所述的測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置中,所述孔位包括一個反應孔、一個樣 品孔、一個稀釋孔和五個試劑孔,其中,1)樣品孔盛容待測溶液;2)稀釋孔用于樣品的稀釋;3)反應孔為平底并具有很高的光源/光路通透性,當盛裝無色/空白試劑溶液時 對可見光/紫外光/熒光的吸光度值趨近于零,孔內包被有檢測抗蛋白酶3抗體IgG所需 的高度純化的蛋白酶3抗原,該孔用于盛容檢測樣品和檢測試劑,并與這些樣品和試劑發 生酶聯免疫反應,是酶聯免疫反應和色澤顯示及檢測的容器;4)每一個試劑孔盛裝有酶聯免疫法檢測抗蛋白酶3抗體IgG所需的一種試劑,加 注試劑后用密封薄膜將微孔的開放口緣進行封閉。所述的測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置,所述試劑孔內所盛裝酶聯免疫檢測 所需的試劑包括檢測抗蛋白酶3抗體IgG之酶聯免疫反應所需的免疫反應抑制劑/中和劑 /阻斷劑/吸附劑、酶結合物溶液、顯色底物溶液、顯色終止液、反應增強劑/促進劑、樣品稀 釋溶液。所述的測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置,所述樣品孔、反應孔、稀釋孔和試劑 孔剖面形狀包括平型、V型或U型,抑或是平型、V型和U型之間的任意組合。所述的測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法,所述的方法包括如下的步驟1)開機打開儀器開關后,儀器會自動地進行一系列檢查,從而為儀器的正常運 行做準備;2)檢查程序的準備按要求配置好相應的溶液,包括緩沖洗滌液、清洗液、消毒 液和蒸餾水或去離子水,配制完畢裝入相應的液體罐中;3)沖洗檢查4)預熱在開機后,儀器會啟動加熱程序,將溫度調至待檢溫度;5)與主機連機儀器通過RS232串口可以和主機相連,從而將儀器正常工作所得 結果交由集中式系統處理;6)抗蛋白酶3抗體IgG的檢測所述的檢測又包括如下的步驟i.從有密封口的一邊打開包裝袋,取用所需數量的分析裝置,排除空氣后將袋口 封緊;ii.檢查分析裝置試劑孔中的底物,應為無色澤改變,否則應棄掉;iii.分別在每個分析裝置的樣品孔中加50 100 μ L未稀釋的樣品,每更換一個批號的試劑,應取其中一個分析裝置及校準品進行儀器校準;iv.放置分析裝置到儀器中相應的分析裝置托盤中,按照使用說明書進行校準和 檢測;v.按照所需檢測的數量在分析裝置托盤中放入相對應數量的分析裝置,并在檢測 位置之前放入含有校準品和質控物的分析裝置,儀器可自動地識別分析裝置條碼、質控物 條碼和校準品條碼,選擇行可定位于“樣品”欄或“檢測”欄;vi.點擊開始,運行項目表,掃描各個分析裝置條碼,對質控物,校準品以及檢測樣 品進行編號;vii.運行檢測表,儀器根據條碼信息自動運行,根據條碼,儀器會選擇相應設置 好的標準曲線,程序首先檢測校準品,以此來校準儀器內預設的曲線;其次對質控物進行檢 測,如果其檢測結果在標示的范圍內,則表示內置曲線合格,可用于樣品的檢測,最后開始 樣品的檢測程序;viii.稀釋加注針會從樣品孔自動吸取樣品,刺破孔位密封薄膜自動吸取稀釋 液在稀釋孔進行樣品稀釋,動作完成后,被稀釋的樣品會被加注針移至試劑孔反應一段程 序設定的時間,之后移除液體;ix.洗滌加注針會從相應的液罐中吸取一定量的洗滌液對試劑孔進行三到五次 洗滌后移除液體;χ.加注針刺破試劑孔密封薄膜吸取一定量的辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗 體至試劑孔進行反應,反應一段程序設定的時間后移除液體;xi.重復步驟ix洗滌;xii.加注針刺破試劑孔密封薄膜吸取一定量的酶反應底物至試劑孔進行一段程 序設定的時間反應;xiii.加注針刺破試劑孔密封薄膜吸取一定量的終止液加注至試劑孔,在10分鐘 內于450nm讀取OD值,如果選擇雙波長法測定,參考波長為620nm 690nm ;7)檢測結果當檢測程序運行完畢,點擊與主機的數據傳輸,儀器會自動將正常 工作所得結果發送到主機交由外接數據處理軟件分析,最后生成報告單以便查閱;8)關機檢測結束后,在儀器關機前,必須啟動洗滌循環,這樣可以避免來自溶液 中的殘留鹽份在液路中結晶,避免損壞儀器或導致檢測結果無效,洗滌完成后,儀器電源自 動關閉。所述的分析試劑裝置是一種測定抗蛋白酶3抗體IgG的獨立的、單人份的、一次性 使用的專用于特定分析儀器的酶聯免疫分析試劑裝置。本發明申請所述的用于抗蛋白酶3抗體IgG酶聯免疫的檢測方法和配套試劑,其 中實現抗蛋白酶3抗體IgG免疫檢測的分析試劑裝置,是一種獨立的、單人份的、一次性使 用的專用于特定分析儀器的酶聯免疫檢測試劑裝置。本發明申請所述測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法及裝置,繼承了其他檢測方法 所具有的特異性強、靈敏度高,準確性好、成本較低、使用要求不高、操作較為簡便、獲得檢 測結果時間短、應用廣泛等特點,解決了其他檢測方法的諸多不足,具體體現在以下幾個方 1.這種檢測方法,它運用酶聯免疫分析原理,利用特定的分析儀器,采用配套專用的檢測試劑盒及分析試劑裝置,自動實現抗蛋白酶3抗體IgG的定性/定量測定,是一種全 新的、適用的、實用的、高效的、快速的檢測抗蛋白酶3抗體IgG的方案;2.它是一種獨立的、單人份的檢測試劑及分析裝置,無需像通用ELISA法那樣使 用12X8型、8X 12型或整板型96孔專用酶聯免疫微孔板作為抗原抑或抗體包被用品和反 應容器,在使用時只要有一份樣品即可進行對應項目的檢測而無試劑的浪費。如果樣品的 數量超過一份,按實際樣品數使用該試劑及分析裝置即可;3.無論是定性檢測還是定量檢測,它將每一檢測必須的試劑盛裝在一個分析試劑 裝置的試劑孔位內,而無須將檢測試劑分別用不同的試劑瓶來盛裝,不但操作極為簡便,而 且不容易造成操作差錯,從而保證檢測結果的正確性;4.它對每一個分析試劑裝置都有一個專用條形碼,條形碼的數值包含檢測所對應 的檢測項目代碼、檢測試劑生產批號、試劑有效期、定量測定標準曲線參數、具體的酶聯免 疫反應類型、試劑及分析裝置的序列號等信息,不能隨意被改變,使用時嚴格受控,尤其是 在使用超過有效期檢測試劑時,將被識別并阻止發出檢測報告,從而可以確保檢測的準確 性;5.它將每一檢測試劑進行有效分隔和密封,不會引起各種試劑之間的交叉污染而 影響檢測結果;6.它是一種專用于特定分析儀器的分析試劑裝置,在檢測過程中用全自動的精密 加液器來加注檢測試劑或樣品,操作自動化,加量精確,檢測結果的準確度和精密度高;7.在檢測項目成套試劑的數量配置及使用上,一切按實際使用需要來進行配備即 可,尤其是在對多項目檢測上,配備更為適量,不會出現超配置及使用情況;


            圖1是本發明申請所述測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置的一個實施例的剖面 結構示意圖;圖2是本發明申請所述測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置的一個實施例的平面 俯視圖;圖3是本發明申請所述測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置的另一個實施例的剖 面結構示意圖;圖4是本發明申請所述測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置的另一個實施例的平 面俯視圖;圖5和圖6是本發明申請所述測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置的其它實施例 的剖面結構示意圖;其中,1為樣品孔、2、3、4、5、6為試劑孔、7為反應孔、8為稀釋孔、9為手柄、10為密 封薄膜、11為基體、90為標貼。
            具體實施例方式以下結合具體的檢測裝置與實施步驟對本發明申請所述的檢測方法和試劑裝置 進行進一步的描述,目的是為了公眾更好的理解本發明申請所述的技術方案,而不是對所 述技術方案的限制。事實上,在本發明精神實質內,對所述方法步驟的改進,以及對相應試
            9劑裝置結構的增減、替換和改進都在本發明申請所要求保護的技術方案之內。實施例1檢測抗蛋白酶3抗體IgG的間接酶聯免疫檢測方法和試劑盒及試劑裝置本發明是基于酶聯免疫檢測技術上的一種更加簡單、準確、有效的一套方法,其采 用的基本原理為間接酶聯免疫法。將由高度純化的蛋白酶3抗原吸附于固相上,通過孵育 使稀釋的人血清中的特異性抗體與抗原結合,洗滌去除未與固相結合的抗體,加入用辣根 過氧化物酶標記的抗人免疫球蛋白酶聯物,孵育。去除未結合的酶聯物,加入酶色原底物。 產生的顏色與檢測樣本中的特異性抗體濃度成正比。這種方法主要是通過用于酶聯免疫檢 測的分析試劑裝置和配套試劑來實現抗蛋白酶3抗體IgG的免疫檢測。通過這種酶聯免疫 方法,同時運用特定分析儀器的分析試劑裝置和試劑,可快速,準確的做出判斷用于臨床診 斷的需要。其分析裝置具體結構如下如圖1-6所示,是本發明申請所述的一種測定抗蛋白酶3抗體IgG酶聯免疫檢測 分析的試劑裝置,包括基體11,在所述基體11上設有1 8個孔位(1、2、3、4、5、6、7、8),其 中孔位1是用于盛裝待測樣品的樣品孔,且其底面為“V”型凹槽底,其余孔位是反應孔7、稀 釋孔8、試劑孔0、3、4、5、6),所述反應孔7是用于接收檢測樣品和檢測試劑并作為酶聯免 疫反應和比色的容器的反應孔,該反應孔是光源/光路的通透孔,在所述基體一端設有手 柄9,在所述手柄上粘貼有檢測抗蛋白酶3抗體IgG試劑信息條形碼的標貼90。本實施例 中,所述標號為2、3、4、5、6是試劑孔,使用時,這些標號為2、3、4、5、6試劑孔中已盛裝有檢 測所需的試劑,且其開放口緣可為方形或圓形,其底面為“V”型凹槽底,盛裝試劑或空置后 用密封薄膜10封口,所述標號為8是稀釋孔,用于樣品的稀釋,上面沒有覆蓋密封薄膜。分析試劑裝置外的試劑盒中的其他試劑包括校準品、質控物、緩沖洗滌液、清洗 液、消毒液和蒸餾水或去離子水。實施例2試劑裝置或試劑盒的制作-間接法檢測抗蛋白酶3抗體IgG以孔位1作為待測樣品盛裝容器,在使用時加入液體樣品,供檢測時取用;以孔位2作為空孔,用密封薄膜封口,供檢測備用;以孔位3作為試劑容器,加入樣本稀釋試劑后用密封薄膜封口,供檢測時取用;以孔位4作為試劑容器,加入終止試劑后用密封薄膜封口,供檢測時用;以孔位5作為試劑容器,加入辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體試劑后用密封 薄膜封口,供檢測時用;以孔位6作為試劑容器,加入酶反應底物試劑后用密封薄膜封口,供檢測時用;以孔位7作為包被物孔/反應容器/比色孔,已包被有高度純化的人蛋白酶3抗 原,并作為反應容器加注待測的液體樣品和檢測試劑及洗滌液,最后加入酶反應底物孵育 后進行吸光度測定;以孔位8作為樣品稀釋容器,供稀釋樣品時用;在手柄9粘貼有抗蛋白酶3抗體IgG檢測試劑及分析裝置信息的條形碼90,該條 形碼包括檢測項目代碼、檢測試劑生產批號、試劑有效期、定性校正系數/定量檢測校正系 數、酶聯免疫反應類型、試劑及分析裝置的序列號。按照上述方法制備若干分析裝置,另外制備相應的試劑,包括校準品、質控物、緩 沖洗滌液、清洗液、消毒液和蒸餾水或去離子水等。這樣即構成了完整的抗蛋白酶3抗體 IgG測定試劑盒組分。將檢測抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置及配套使用組份裝入試劑盒的外包裝盒,即制成檢測抗蛋白酶3抗體IgG試劑盒。實施例3通過全自動分析儀實現對樣本抗蛋白酶3抗體IgG檢測的分析操作流程全自動分析儀包括一個分析裝置托盤,它是與分析裝置的形狀相配套的,一共有 30個位置可供分析裝置放置,用于檢測分析。此外還包括模塊式集成機械電子結構,可實現 自動化的加樣,稀釋,孵育,洗滌以及讀數過程。每個位置獨立定量分析,且有200余個電子 傳感器監控儀器運行,保證結果的準確性。儀器運行后,分析裝置托盤會自行轉動到不同的 位置進行加樣,稀釋,孵育,洗滌以及讀數的步驟。(1)開機打開儀器開關后,儀器會自動地進行一系列檢查,從而為儀器的正常運行做準備。(2)檢查程序的準備按要求配置好相應的溶液,包括緩沖洗滌液、清洗液、消毒液和蒸餾水或去離子 水,配制完畢裝入相應的液體罐中。(3)沖洗檢查(4)預熱在開機后,儀器會啟動加熱程序,將溫度調至待檢溫度。(5)與主機連機儀器通過RS232串口可以和主機相連,從而將儀器正常工作所得結果交由集中式 系統處理。(6)抗蛋白酶3抗體IgG的檢測1)從有密封口的一邊打開包裝袋,取用所需數量的分析裝置,排除空氣后將袋口 封緊;2)檢查分析裝置試劑孔6中的底物,應為無色澤改變,否則應棄掉;3)分別在每個分析裝置的樣品孔1中加50 100 μ L未稀釋的樣品,每更換一個 批號的試劑,應取其中一個分析裝置及校準品進行儀器校準;4)放置分析裝置到儀器中相應的分析裝置托盤中,按照使用說明書進行校準(若 有必要)和檢測;5)按照所需檢測的數量在分析裝置托盤中放入相對應數量的分析裝置,并在檢測 位置之前放入含有校準品和質控物的分析裝置,儀器可自動地識別分析裝置條碼、質控物 條碼和校準品條碼,選擇行可定位于“樣品”欄或“檢測”欄;6)點擊開始,運行項目表,掃描各個分析裝置條碼,對質控物,校準品以及檢測樣 品進行編號;7)運行檢測表,儀器根據條碼信息自動運行,根據條碼,儀器會選擇相應設置好的 標準曲線,程序首先檢測校準品,以此來校準儀器內預設的曲線;其次對質控物進行檢測, 如果其檢測結果在標示的范圍內,則表示內置曲線合格,可用于樣品的檢測;最后開始樣品 的檢測程序;8)稀釋加注針會從樣品孔1自動吸取樣品,刺破孔位密封薄膜10,自動吸取稀釋 液在稀釋孔8進行樣品稀釋,動作完成后,被稀釋的樣品會被加注針移至試劑孔3反應一段 程序設定的時間,之后移除液體;9)洗滌加注針會從相應的液罐中吸取一定量的洗滌液對試劑孔3進行三到五次
            11洗滌后移除液體;10)加注針刺破試劑孔5密封薄膜吸取一定量的辣根過氧化物酶標記的抗人IgG 抗體至試劑孔3進行反應,反應一段程序設定的時間后移除液體;11)重復步驟9)洗滌;12)加注針刺破試劑孔6密封薄膜吸取一定量的酶反應底物至試劑孔3進行一段 程序設定的時間反應;13)加注針刺破試劑孔4密封薄膜吸取一定量的終止液加注至試劑孔3,在10分 鐘內于450nm讀取OD值,如果選擇雙波長法測定,參考波長為620nm 690nm ;(7)檢測結果當檢測程序運行完畢,點擊與主機的數據傳輸,儀器會自動將正常工作所得結果 發送到主機交由外接數據處理軟件分析,最后生成報告單以便查閱;(8)關機檢測結束后,在儀器關機前,必須啟動洗滌循環,這樣可以避免來自溶液中的殘留 鹽份在液路中結晶,避免損壞儀器或導致檢測結果無效,洗滌完成之后,儀器電源自動關 閉。實施例4患者樣品的檢測應用、結果分析以及檢測的質控采用實施例3的操作方法與程序,使用方法使用實施例2所述的試劑盒,可用于定 量測定人血清中的抗蛋白酶3抗體IgG水平。蛋白酶3是一種絲氨酸蛋白酶,來源于中性粒細胞的嗜天青顆粒(溶酶體),其分 子量為^kDa。此陽離子蛋白對彈力蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白VII具有蛋白水解活性,還 可通過蛋白酶G促進血小板的活化,抑制Cl抑制劑。蛋白酶3自身抗體是韋格納肉芽腫病 (WG)的血清特異標記物。盡管其病因和病理尚不明了,但是抗蛋白酶3抗體與韋格納肉芽 腫病的形成有重要關聯。抗蛋白酶3抗體的滴度與該疾病的活動度有密切關系,可抑制蛋 白酶的蛋白水解活性。因此我們可根據檢測的結果來進行臨床診斷,初步判斷患者患病的 情況,最終確診應結合臨床表現或其他診斷方法/指標進行綜合考慮。以下為檢測結果的分析(1)參考值(參考范圍)正常參考值0 15AU/mL ;檢測一定數量(具有統計學意義)的陰性樣本,結果的 平均值加3倍標準偏差(即I + 3SD)為正常參考值的上限。建議各實驗室根據實際情況, 建立自己的正常參考值范圍。為了方便臨床應用,我們推薦樣本值< 12AU/mL陰性12AU/mL彡樣本值彡18AU/mL 可疑樣本值> 18AU/mL陽性(2)檢測結果的解釋結果解釋樣本值> 18AU/mL時,表明抗體濃度明顯升高,應結合臨床表現或其他 診斷方法/指標確診是否患有韋格納肉芽腫病;樣本值< 12AU/mL時,表明機體抗蛋白酶3 抗體I gG水平無明顯上升;12AU/mL彡樣本值彡18AU/mL時,應重新檢測,若仍為可疑,2_3 周后重新采集樣本檢測。
            以下是將實施例3的檢測過程重復檢測陽性和陰性質控血清,檢查結果的再現
            性,獲得如下的結果
            陽性質控物
            權利要求
            1.一種測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法,其特征在于所述方法是通過酶聯免疫檢測 的分析試劑裝置和配套試劑組成的試劑盒來實現的,這種分析試劑裝置包括設有8個孔位 的基體和位于基體一端的手柄,它通過專用特定分析儀器對試劑裝置各孔之間的各種特定 試劑溶液進行加注和吸棄,使樣品與試劑發生反應,然后測量發生反應后溶液色澤的數值, 最終通過對測量的數值進行處理而獲得檢測結果。
            2.根據權利要求1所述的測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法,其特征在于所述的方法是 將待測樣品中的待測抗蛋白酶3抗體IgG與高度純化的人蛋白酶3抗原進行反應而形成第 一免疫絡合物,該第一免疫絡合物與酶標記的第二抗體進行反應形成第二免疫絡合物,將 反應形成的第二絡合物與顯色底物進行顯色對比分析,從而獲得待測抗蛋白酶3抗體IgG 的含量。
            3.根據權利要求2所述的測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法,其特征在于所述的第二 抗體為辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體。
            4.一種用于測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置,其特征在于所述的試劑裝置設有 8個孔位的基體、位于基體一端的手柄,以及用于酶聯免疫法檢測抗蛋白酶3抗體IgG的分 析試劑裝置以及相應數量的配套試劑校準品、質控物和緩沖洗滌液的組份。
            5.根據權利要求4所述的用于測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置,其特征在于所述 基體一端的手柄上粘貼有檢測試劑條形碼的標帖,所述條形碼的數值包含每項檢測所對應 的檢測項目代碼、檢測試劑生產批號、試劑有效期、定性校正值/定量測定標準曲線參數、 酶聯免疫反應類型、試劑及分析裝置的序列號的信息。
            6.根據權利要求4所述的用于測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置,其特征在于所 述孔位包括一個反應孔、一個樣品孔、一個稀釋孔和五個試劑孔,其中,1)樣品孔盛容待測溶液;2)稀釋孔用于樣品的稀釋;3)反應孔為平底并具有很高的光源/光路通透性,當盛裝無色/空白試劑溶液時對可 見光/紫外光/熒光的吸光度值趨近于零,孔內包被有檢測抗蛋白酶3抗體IgG所需的高 度純化的蛋白酶3抗原,該孔用于盛容檢測樣品和檢測試劑,并與這些樣品和試劑發生酶 聯免疫反應,是酶聯免疫反應和色澤顯示及檢測的容器;4)每一個試劑孔盛裝有酶聯免疫法檢測抗蛋白酶3抗體IgG所需的一種試劑,加注試 劑后用薄膜將微孔的開放口緣進行封閉。
            7.根據權利要求6所述的用于測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置,其特征在于所 述試劑孔內所盛裝酶聯免疫檢測所需的試劑包括檢測抗蛋白酶3抗體IgG之酶聯免疫反應 所需的免疫反應抑制劑/中和劑/阻斷劑/吸附劑、酶結合物溶液、顯色底物溶液、顯色終 止液、反應增強劑/促進劑、樣品稀釋溶液。
            8.根據權利要求6所述的用于測定抗蛋白酶3抗體IgG的試劑裝置,其特征在于所 述樣品孔、反應孔、稀釋孔和試劑孔剖面形狀包括平型、V型或U型,抑或是平型、V型和U型 之間的任意組合。
            9.根據權利要求1所述的測定抗蛋白酶3抗體IgG的方法,其特征在于所述的方法 包括如下的步驟1)開機打開儀器開關后,儀器會自動地進行一系列檢查,從而為儀器的正常運行做準備;2)檢查程序的準備按要求配置好相應的溶液,包括緩沖洗滌液、清洗液、消毒液和 蒸餾水或去離子水,配制完畢裝入相應的液體罐中;3)沖洗檢查4)預熱在開機后,儀器會啟動加熱程序,將溫度調至待檢溫度;5)與主機連機儀器通過RS232串口可以和主機相連,從而將儀器正常工作所得結果 交由集中式系統處理;6)抗蛋白酶3抗體IgG的檢測所述的檢測又包括如下的步驟i.從有密封口的一邊打開包裝袋,取用所需數量的分析裝置,排除空氣后將袋口封緊; .檢查分析裝置試劑孔中的底物,應為無色澤變化,否則應棄掉;iii.分別在每個分析裝置的樣品孔中加50 100μ L未稀釋的樣品,每更換一個批號 的試劑,應取其中一個分析裝置及校準品進行儀器校準;iv.放置分析裝置到儀器中相應的分析裝置托盤中,按照使用說明書進行校準和檢測;v.按照所需檢測的數量在分析裝置托盤中放入相對應數量的分析裝置,并在檢測位置 之前放入含有校準品和質控物的分析裝置,儀器可自動地識別分析裝置條碼、質控物條碼 和校準品條碼,選擇行可定位于“樣品”欄或“檢測”欄;vi.點擊開始,運行項目表,掃描各個分析裝置條碼,對質控物,校準品以及檢測樣品進 行編號;vii.運行檢測表,儀器根據條碼信息自動運行,根據條碼,儀器會選擇相應設置好的標 準曲線,程序首先檢測校準品,以此來校準儀器內預設的曲線;其次對質控物進行檢測,如 果其檢測結果在標示的范圍內,則表示內置曲線合格,可用于樣品的檢測,最后開始樣品的 檢測程序;viii.稀釋加注針會從樣品孔自動吸取樣品,刺破孔位密封薄膜自動吸取稀釋液在 稀釋孔進行樣品稀釋,動作完成后,被稀釋的樣品會被加注針移至試劑孔反應一段程序設 定的時間,之后移除液體;ix.洗滌加注針會從相應的液罐中吸取一定量的洗滌液對試劑孔進行三到五次洗滌 后移除液體;X.加注針刺破試劑孔密封薄膜吸取一定量的辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體至 試劑孔進行反應,反應一段程序設定的時間后移除液體; xi.重復步驟ix洗滌;χ .加注針刺破試劑孔密封薄膜吸取一定量的酶反應底物至試劑孔進行一段程序設 定的時間反應;xiii.加注針刺破試劑孔密封薄膜吸取一定量的終止液加注至試劑孔,在10分鐘內于 450nm讀取OD值,如果選擇雙波長法測定,參考波長為620nm 690nm ;7)檢測結果當檢測程序運行完畢,點擊與主機的數據傳輸,儀器會自動將正常工作 所得結果發送到主機交由外接數據處理軟件分析,最后生成報告單以便查閱;8)關機檢測結束后,在儀器關機前,必須啟動洗滌循環,這樣可以避免來自溶液中的殘留鹽份在液路中結晶,避免損壞儀器或導致檢測結果無效,洗滌完成后,儀器電源自動關 閉。
            全文摘要
            本發明提供一種基于酶聯免疫檢測的原理來實現抗蛋白酶3抗體IgG的免疫檢測的方法及其試劑裝置,是一種獨立的、單人份的、一次性的用于酶聯免疫檢測抗蛋白酶3抗體IgG的分析方法、試劑裝置以及配套試劑。它可以將抗蛋白酶3抗體IgG酶聯免疫檢測所需要的多種試劑盛裝在一個分析裝置上,通過這種方法可以更方便地根據檢測項目的使用需要進行相關的免疫學檢測,為臨床應用提供了更好的依據。
            文檔編號G01N33/573GK102147412SQ20101061965
            公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
            發明者伍堅, 何林, 潘蕎, 肖燦 申請人:深圳市亞輝龍生物科技有限公司
            網友詢問留言 已有0條留言
            • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
            1
            婷婷六月激情在线综合激情,亚洲国产大片,久久中文字幕综合婷婷,精品久久久久久中文字幕,亚洲一区二区三区高清不卡,99国产精品热久久久久久夜夜嗨 ,欧美日韩亚洲综合在线一区二区,99国产精品电影,伊人精品线视天天综合,精品伊人久久久大香线蕉欧美
            亚洲精品1区 国产成人一级 91精品国产欧美一区二区 亚洲精品乱码久久久久久下载 国产精品久久久久久久伊一 九色国产 国产精品九九视频 伊人久久成人爱综合网 欧美日韩亚洲区久久综合 欧美日本一道免费一区三区 夜夜爽一区二区三区精品 欧美日韩高清一区二区三区 国产成人av在线 国产精品对白交换绿帽视频 国产视频亚洲 国产在线欧美精品 国产精品综合网 国产日韩精品欧美一区色 国产日韩精品欧美一区喷 欧美日韩在线观看区一二 国产区精品 欧美视频日韩视频 中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97 视频一二三区 欧美高清在线精品一区二区不卡 国产精品揄拍一区二区久久 99久久综合狠狠综合久久aⅴ 亚洲乱码视频在线观看 日韩在线第二页 亚洲精品无码专区在线播放 成人亚洲网站www在线观看 欧美三级一区二区 99久久精品免费看国产高清 91麻豆国产在线观看 最新日韩欧美不卡一二三区 成人在线观看不卡 日韩国产在线 在线亚洲精品 亚洲午夜久久久久中文字幕 国产精品成人久久久久久久 精品国产一区二区在线观看 欧美精品国产一区二区三区 中文在线播放 亚洲第一页在线视频 国产午夜精品福利久久 九色国产 精品国产九九 国产永久视频 久久精品人人做人人综合试看 国产一区二区三区免费观看 亚洲精品国产电影 9999热视频 国产精品资源在线 麻豆久久婷婷国产综合五月 国产精品免费一级在线观看 亚洲国产一区二区三区青草影视 中文在线播放 国产成人综合在线 国产在线观看色 国产亚洲三级 国产片一区二区三区 久久99精品久久久久久牛牛影视 亚洲欧美日韩国产 四虎永久免费网站 国产一毛片 国产精品视频在 九九热在线精品 99精品福利视频 色婷婷色99国产综合精品 97成人精品视频在线播放 精品久久久久久中文字幕 亚洲欧美一区二区三区孕妇 亚洲欧美成人网 日韩高清在线二区 国产尤物在线观看 在线不卡一区二区 91网站在线看 韩国精品福利一区二区 欧美日韩国产成人精品 99热精品久久 国产精品免费视频一区 高清视频一区 精品九九久久 欧美日韩在线观看免费 91欧美激情一区二区三区成人 99福利视频 亚洲国产精品91 久热国产在线 精品久久久久久中文字幕女 国产精品久久久久久久久99热 成人自拍视频网 国产精品视频久久久久久 久久影院国产 国产玖玖在线观看 99精品在线免费 亚洲欧美一区二区三区导航 久久久久久久综合 国产欧美日韩精品高清二区综合区 国产精品视频自拍 亚洲一级片免费 久久久久久九九 国产欧美自拍视频 视频一区二区在线观看 欧美日韩一区二区三区久久 中文在线亚洲 伊人热人久久中文字幕 日韩欧美亚洲国产一区二区三区 欧美亚洲国产成人高清在线 欧美日韩国产码高清综合人成 国产性大片免费播放网站 亚洲午夜综合网 91精品久久一区二区三区 国产无套在线播放 国产精品视频网站 国产成人亚洲精品老王 91在线网站 国产视频97 欧美黑人欧美精品刺激 国产一区二区三区免费在线视频 久久久国产精品免费看 99re6久精品国产首页 久久精品91 国产成人一级 国产成人精品曰本亚洲 日本福利在线观看 伊人成综合网 久久综合一本 国产综合久久久久久 久久精品成人免费看 久久福利 91精品国产91久久久久久麻豆 亚洲精品成人在线 亚洲伊人久久精品 欧美日本二区 国产永久视频 国产一区二 一区二区福利 国产一毛片 亚洲精品1区 毛片一区二区三区 伊人久久大香线蕉综合影 国产欧美在线观看一区 亚洲国产欧洲综合997久久 国产一区二区免费视频 国产91精品对白露脸全集观看 久久亚洲国产伦理 欧美成人伊人久久综合网 亚洲性久久久影院 久久99国产精一区二区三区! 91精品国产欧美一区二区 欧美日韩亚洲区久久综合 日韩精品一二三区 久久久夜色精品国产噜噜 国产在线精品福利91香蕉 久久久久久久亚洲精品 97se色综合一区二区二区 91国语精品自产拍在线观看性色 91久久国产综合精品女同我 日韩中文字幕a 国产成人亚洲日本精品 久久国产精品-国产精品 久久国产经典视频 久久国产精品伦理 亚洲第一页在线视频 国产精品久久久久三级 日韩毛片网 久久免费高清视频 麻豆国产在线观看一区二区 91麻豆国产福利在线观看 国产成人精品男人的天堂538 一区二区三区中文字幕 免费在线视频一区 欧美日韩国产成人精品 国产综合网站 国产资源免费观看 亚洲精品亚洲人成在线播放 精品久久久久久中文字幕专区 亚洲人成人毛片无遮挡 国产一起色一起爱 国产香蕉精品视频在 九九热免费观看 日韩亚洲欧美一区 九九热精品在线观看 精品久久久久久中文字幕专区 亚洲欧美自拍偷拍 国产精品每日更新 久久久久国产一级毛片高清板 久久天天躁狠狠躁夜夜中文字幕 久久精品片 日韩在线毛片 国产成人精品本亚洲 国产成人精品一区二区三区 九九热在线观看 国产r级在线观看 国产欧美日韩精品高清二区综合区 韩国电影一区二区 国产精品毛片va一区二区三区 五月婷婷伊人网 久久一区二区三区免费 一本色道久久综合狠狠躁篇 亚洲综合色站 国产尤物在线观看 亚洲一区亚洲二区 免费在线视频一区 欧洲精品视频在线观看 日韩中文字幕a 中文字幕日本在线mv视频精品 91精品在线免费视频 精品国产免费人成在线观看 精品a级片 中文字幕日本在线mv视频精品 日韩在线精品视频 婷婷丁香色 91精品国产高清久久久久 国产成人精品日本亚洲直接 五月综合视频 欧美日韩在线亚洲国产人 精液呈暗黄色 亚洲乱码一区 久久精品中文字幕不卡一二区 亚洲天堂精品在线 激情婷婷综合 国产免费久久精品久久久 国产精品亚洲二区在线 久久免费播放视频 五月婷婷丁香综合 在线亚洲欧美日韩 久久免费精品高清麻豆 精品久久久久久中文字幕 亚洲一区网站 国产精品福利社 日韩中文字幕免费 亚洲综合丝袜 91精品在线播放 国产精品18 亚洲日日夜夜 伊人久久大香线蕉综合影 亚洲精品中文字幕乱码影院 亚洲一区二区黄色 亚洲第一页在线视频 一区二区在线观看视频 国产成人福利精品视频 亚洲高清二区 国内成人免费视频 精品亚洲性xxx久久久 国产精品合集一区二区三区 97av免费视频 国产一起色一起爱 国产区久久 国产资源免费观看 99精品视频免费 国产成人一级 国产精品九九免费视频 欧美91精品久久久久网免费 99热国产免费 久久精品色 98精品国产综合久久 久久精品播放 中文字幕视频免费 国产欧美日韩一区二区三区在线 精品久久蜜桃 国产小视频精品 一本色道久久综合狠狠躁篇 91在线免费观看 亚洲精品区 伊人成综合网 伊人热人久久中文字幕 伊人黄色片 99国产精品热久久久久久夜夜嗨 久久免费精品视频 亚洲一区二区三区高清不卡 久久久久国产一级毛片高清板 国产片一区二区三区 久久狠狠干 99久久婷婷国产综合精品电影 国产99区 国产精品成人久久久久 久久狠狠干 青青国产在线观看 亚洲高清国产拍精品影院 国产精品一区二区av 九九热在线免费视频 伊人久久国产 国产精品久久久久久久久久一区 在线观看免费视频一区 国产精品自在在线午夜区app 国产精品综合色区在线观看 国产毛片久久久久久国产毛片 97国产免费全部免费观看 国产精品每日更新 国产尤物视频在线 九九视频这里只有精品99 一本一道久久a久久精品综合 久久综合给会久久狠狠狠 国产成人精品男人的天堂538 欧美一区二区高清 毛片一区二区三区 国产欧美日韩在线观看一区二区三区 在线国产二区 欧美不卡网 91在线精品中文字幕 在线国产福利 国内精品91久久久久 91亚洲福利 日韩欧美国产中文字幕 91久久精品国产性色也91久久 亚洲性久久久影院 欧美精品1区 国产热re99久久6国产精品 九九热免费观看 国产精品欧美日韩 久久久久国产一级毛片高清板 久久国产经典视频 日韩欧美亚洲国产一区二区三区 欧美亚洲综合另类在线观看 国产精品自在在线午夜区app 97中文字幕在线观看 视频一二三区 精品国产一区在线观看 国产欧美日韩在线一区二区不卡 欧美一区二三区 伊人成人在线观看 国内精品91久久久久 97在线亚洲 国产在线不卡一区 久久久全免费全集一级全黄片 国产精品v欧美精品∨日韩 亚洲毛片网站 在线不卡一区二区 99re热在线视频 久久激情网 国产毛片一区二区三区精品 久久亚洲综合色 中文字幕视频免费 国产视频亚洲 婷婷伊人久久 国产一区二区免费播放 久久99国产精品成人欧美 99国产在线视频 国产成人免费视频精品一区二区 国产不卡一区二区三区免费视 国产码欧美日韩高清综合一区 久久精品国产主播一区二区 国产一区电影 久久精品国产夜色 国产精品国产三级国产 日韩一区二区三区在线 久久97久久97精品免视看 久久国产免费一区二区三区 伊人久久大香线蕉综合电影网 99re6久精品国产首页 久久激情网 亚洲成人高清在线 国产精品网址 国产成人精品男人的天堂538 香蕉国产综合久久猫咪 国产专区中文字幕 91麻豆精品国产高清在线 久久国产经典视频 国产精品成人va在线观看 国产精品爱啪在线线免费观看 日本精品久久久久久久久免费 亚洲综合一区二区三区 久久五月网 精品国产网红福利在线观看 久久综合亚洲伊人色 亚洲国产精品久久久久久网站 在线日韩国产 99国产精品热久久久久久夜夜嗨 国产综合精品在线 国产区福利 精品亚洲综合久久中文字幕 国产制服丝袜在线 毛片在线播放网站 在线观看免费视频一区 国产精品久久久精品三级 亚洲国产电影在线观看 最新日韩欧美不卡一二三区 狠狠综合久久综合鬼色 日本精品1在线区 国产日韩一区二区三区在线播放 欧美日韩精品在线播放 亚洲欧美日韩国产一区二区三区精品 久久综合久久网 婷婷六月激情在线综合激情 亚洲乱码一区 国产专区91 97av视频在线观看 精品久久久久久中文字幕 久久五月视频 国产成人福利精品视频 国产精品网址 中文字幕视频在线 精品一区二区三区免费视频 伊人手机在线视频 亚洲精品中文字幕乱码 国产在线视频www色 色噜噜国产精品视频一区二区 精品亚洲成a人在线观看 国产香蕉尹人综合在线 成人免费一区二区三区在线观看 国产不卡一区二区三区免费视 欧美精品久久天天躁 国产专区中文字幕 久久精品国产免费中文 久久精品国产免费一区 久久无码精品一区二区三区 国产欧美另类久久久精品免费 欧美精品久久天天躁 亚洲精品在线视频 国产视频91在线 91精品福利一区二区三区野战 日韩中文字幕免费 国产精品99一区二区三区 欧美成人高清性色生活 国产精品系列在线观看 亚洲国产福利精品一区二区 国产成人在线小视频 国产精品久久久久免费 99re热在线视频 久久久久久久综合 一区二区国产在线播放 成人国产在线视频 亚洲精品乱码久久久久 欧美日韩一区二区综合 精品久久久久免费极品大片 中文字幕视频二区 激情粉嫩精品国产尤物 国产成人精品一区二区视频 久久精品中文字幕首页 亚洲高清在线 国产精品亚洲一区二区三区 伊人久久艹 中文在线亚洲 国产精品一区二区在线播放 国产精品九九免费视频 亚洲二区在线播放 亚洲狠狠婷婷综合久久久久网站 亚洲欧美日韩网站 日韩成人精品 亚洲国产一区二区三区青草影视 91精品国产福利在线观看 国产精品久久久久久久久99热 国产一区二区精品尤物 久碰香蕉精品视频在线观看 亚洲日日夜夜 在线不卡一区二区 国产午夜亚洲精品 九九热在线视频观看这里只有精品 伊人手机在线视频 91免费国产精品 日韩欧美中字 91精品国产91久久久久 国产全黄三级播放 视频一区二区三区免费观看 国产开裆丝袜高跟在线观看 国产成人欧美 激情综合丝袜美女一区二区 国产成人亚洲综合无 欧美精品一区二区三区免费观看 欧美亚洲国产日韩 日韩亚州 国产欧美日韩精品高清二区综合区 亚洲午夜国产片在线观看 精品久久久久久中文字幕 欧美精品1区 久久伊人久久亚洲综合 亚洲欧美日韩精品 国产成人精品久久亚洲高清不卡 久久福利影视 国产精品99精品久久免费 久久久久免费精品视频 国产日产亚洲精品 亚洲国产午夜电影在线入口 精品无码一区在线观看 午夜国产精品视频 亚洲一级片免费 伊人久久大香线蕉综合影 国产精品久久影院 久碰香蕉精品视频在线观看 www.欧美精品 在线小视频国产 亚洲国产天堂久久综合图区 欧美一区二区三区不卡 日韩美女福利视频 九九精品免视频国产成人 不卡国产00高中生在线视频 亚洲第一页在线视频 欧美日韩在线播放成人 99re视频这里只有精品 国产精品91在线 精品乱码一区二区三区在线 国产区久久 91麻豆精品国产自产在线观看一区 日韩精品成人在线 九九热在线观看 国产精品久久不卡日韩美女 欧美一区二区三区综合色视频 欧美精品免费一区欧美久久优播 国产精品网址 国产专区中文字幕 国产精品欧美亚洲韩国日本久久 日韩美香港a一级毛片 久久精品123 欧美一区二区三区免费看 99r在线视频 亚洲精品国产字幕久久vr 国产综合激情在线亚洲第一页 91免费国产精品 日韩免费小视频 亚洲国产精品综合一区在线 国产亚洲第一伦理第一区 在线亚洲精品 国产精品一区二区制服丝袜 国产在线成人精品 九九精品免视频国产成人 亚洲国产网 欧美日韩亚洲一区二区三区在线观看 在线亚洲精品 欧美一区二区三区高清视频 国产成人精品男人的天堂538 欧美日韩在线观看区一二 亚洲欧美一区二区久久 久久精品中文字幕首页 日本高清www午夜视频 久久精品国产免费 久久999精品 亚洲国产精品欧美综合 88国产精品视频一区二区三区 91久久偷偷做嫩草影院免费看 国产精品夜色视频一区二区 欧美日韩导航 国产成人啪精品午夜在线播放 一区二区视频在线免费观看 99久久精品国产自免费 精液呈暗黄色 久久99国产精品 日本精品久久久久久久久免费 精品国产97在线观看 99re视频这里只有精品 国产视频91在线 999av视频 亚洲美女视频一区二区三区 久久97久久97精品免视看 亚洲国产成人久久三区 99久久亚洲国产高清观看 日韩毛片在线视频 综合激情在线 91福利一区二区在线观看 一区二区视频在线免费观看 激情粉嫩精品国产尤物 国产成人精品曰本亚洲78 国产成人精品本亚洲 国产精品成人免费视频 国产成人啪精品视频免费软件 久久精品国产亚洲妲己影院 国产精品成人久久久久久久 久久大香线蕉综合爱 欧美一区二区三区高清视频 99热国产免费 在线观看欧美国产 91精品视频在线播放 国产精品福利社 欧美精品一区二区三区免费观看 国产一区二区免费视频 国产午夜精品一区二区 精品视频在线观看97 91精品福利久久久 国产一区福利 国产综合激情在线亚洲第一页 国产精品久久久久久久久久久不卡 九色国产 在线日韩国产 黄网在线观看 亚洲一区小说区中文字幕 中文字幕丝袜 日本二区在线观看 日本国产一区在线观看 欧美日韩一区二区三区久久 欧美精品亚洲精品日韩专 国产日产亚洲精品 久久综合九色综合欧美播 亚洲国产欧美无圣光一区 欧美视频区 亚洲乱码视频在线观看 久久无码精品一区二区三区 九九热精品免费视频 久久99精品久久久久久牛牛影视 国产精品成久久久久三级 国产一区福利 午夜国产精品视频 日本二区在线观看 99久久网站 国产亚洲天堂 精品国产一区二区三区不卡 亚洲国产日韩在线一区 国产成人综合在线观看网站 久久免费高清视频 欧美在线导航 午夜精品久久久久久99热7777 欧美久久综合网 国产小视频精品 国产尤物在线观看 亚洲国产精品综合一区在线 欧美一区二区三区不卡视频 欧美黑人欧美精品刺激 日本福利在线观看 久久国产偷 国产手机精品一区二区 国产热re99久久6国产精品 国产高清啪啪 欧美亚洲国产成人高清在线 国产在线第三页 亚洲综合一区二区三区 99r在线视频 99精品久久久久久久婷婷 国产精品乱码免费一区二区 国产在线精品福利91香蕉 国产尤物视频在线 五月婷婷亚洲 中文字幕久久综合伊人 亚洲精品一级毛片 99国产精品电影 在线视频第一页 久久99国产精品成人欧美 国产白白视频在线观看2 成人精品一区二区www 亚洲成人网在线观看 麻豆91在线视频 色综合合久久天天综合绕视看 久久精品国产免费高清 国产不卡一区二区三区免费视 欧美国产中文 99精品欧美 九九在线精品 国产中文字幕在线免费观看 国产一区中文字幕在线观看 国产成人一级 国产精品一区二区制服丝袜 国产一起色一起爱 亚洲精品成人在线 亚洲欧美精品在线 国产欧美自拍视频 99精品久久久久久久婷婷 久99视频 国产热re99久久6国产精品 视频一区亚洲 国产精品视频分类 国产精品成在线观看 99re6久精品国产首页 亚洲在成人网在线看 亚洲国产日韩在线一区 久久国产三级 日韩国产欧美 欧美在线一区二区三区 国产精品美女一级在线观看 成人午夜免费福利视频 亚洲天堂精品在线 91精品国产手机 欧美日韩视频在线播放 狠狠综合久久综合鬼色 九一色视频 青青视频国产 亚洲欧美自拍一区 中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97 日韩免费大片 996热视频 伊人成综合网 亚洲天堂欧美 日韩精品亚洲人成在线观看 久久综合给会久久狠狠狠 日韩精品亚洲人成在线观看 日韩国产欧美 亚洲成aⅴ人片在线影院八 亚洲精品1区 99久久精品免费 国产精品高清在线观看 国产精品久久久免费视频 在线亚洲欧美日韩 91在线看视频 国产精品96久久久久久久 欧美日韩国产成人精品 91在线亚洲 热久久亚洲 国产精品美女免费视频观看 日韩在线毛片 亚洲永久免费视频 九九免费在线视频 亚洲一区网站 日本高清二区视频久二区 精品国产美女福利在线 伊人久久艹 国产精品久久久久三级 欧美成人精品第一区二区三区 99久久精品国产自免费 在线观看日韩一区 国产中文字幕一区 成人免费午夜视频 欧美日韩另类在线 久久99国产精品成人欧美 色婷婷中文网 久久天天躁夜夜躁狠狠躁2020 欧美成人伊人久久综合网 国产精品福利资源在线 国产伦精品一区二区三区高清 国产精品亚洲综合色区韩国 亚洲一区欧美日韩 色综合视频 国语自产精品视频在线区 国产高清a 成人国内精品久久久久影 国产在线精品香蕉综合网一区 国产不卡在线看 国产成人精品精品欧美 国产欧美日韩综合精品一区二区三区 韩国电影一区二区 国产在线视频www色 91中文字幕在线一区 国产人成午夜免视频网站 亚洲综合一区二区三区 色综合视频一区二区观看 久久五月网 九九热精品在线观看 国产一区二区三区国产精品 99久热re在线精品996热视频 亚洲国产网 在线视频亚洲一区 日韩字幕一中文在线综合 国产高清一级毛片在线不卡 精品国产色在线 国产高清视频一区二区 精品日本久久久久久久久久 亚洲国产午夜精品乱码 成人免费国产gav视频在线 日韩欧美一区二区在线观看 欧美曰批人成在线观看 韩国电影一区二区 99re这里只有精品6 日韩精品一区二区三区视频 99re6久精品国产首页 亚洲欧美一区二区三区导航 欧美色图一区二区三区 午夜精品视频在线观看 欧美激情在线观看一区二区三区 亚洲热在线 成人国产精品一区二区网站 亚洲一级毛片在线播放 亚洲一区小说区中文字幕 亚洲午夜久久久久影院 国产自产v一区二区三区c 国产精品视频免费 久久调教视频 国产成人91激情在线播放 国产精品欧美亚洲韩国日本久久 久久亚洲日本不卡一区二区 91中文字幕网 成人国产在线视频 国产视频91在线 欧美成人精品第一区二区三区 国产精品福利在线 久久综合九色综合精品 欧美一区二区三区精品 久久国产综合尤物免费观看 久久99青青久久99久久 日韩精品免费 久久国产精品999 91亚洲视频在线观看 国产精品igao视频 色综合区 在线亚洲欧国产精品专区 国产一区二区三区在线观看视频 亚洲精品成人在线 一区二区国产在线播放 中文在线亚洲 亚洲精品第一国产综合野 国产一区二区精品久久 一区二区三区四区精品视频 99热精品久久 中文字幕视频二区 国产成人精品男人的天堂538 99精品影视 美女福利视频一区二区 久久午夜夜伦伦鲁鲁片 综合久久久久久久综合网 国产精品国产欧美综合一区 国产99视频在线观看 国产亚洲女在线精品 婷婷影院在线综合免费视频 国产亚洲3p一区二区三区 91成人爽a毛片一区二区 亚洲一区二区高清 国产欧美亚洲精品第二区首页 欧美日韩导航 亚洲高清二区 欧美激情观看一区二区久久 日韩毛片在线播放 亚洲欧美日韩高清中文在线 亚洲日本在线播放 国产精品一区二区制服丝袜 精品国产一区二区三区不卡 国产不卡在线看 国产欧美网站 四虎永久在线观看视频精品 国产黄色片在线观看 夜夜综合 一本色道久久综合狠狠躁篇 欧美亚洲综合另类在线观看 国产91在线看 伊人久久国产 欧美一区二区在线观看免费网站 国产精品久久久久三级 久久福利 日韩中文字幕a 亚洲午夜久久久久影院 91在线高清视频 国产亚洲一区二区三区啪 久久人精品 国产精品亚洲午夜一区二区三区 综合久久久久久 久久伊人一区二区三区四区 国产综合久久久久久 日韩一区精品视频在线看 国产精品日韩欧美制服 日本精品1在线区 99re视频 无码av免费一区二区三区试看 国产视频1区 日韩欧美中文字幕一区 日本高清中文字幕一区二区三区a 亚洲国产欧美无圣光一区 国产在线视频一区二区三区 欧美国产第一页 在线亚洲欧美日韩 日韩中文字幕第一页 在线不卡一区二区 伊人久久青青 国产精品一区二区在线播放 www.五月婷婷 麻豆久久婷婷国产综合五月 亚洲精品区 久久国产欧美另类久久久 99在线视频免费 伊人久久中文字幕久久cm 久久精品成人免费看 久久这里只有精品首页 88国产精品视频一区二区三区 中文字幕日本在线mv视频精品 国产在线精品成人一区二区三区 伊人精品线视天天综合 亚洲一区二区黄色 国产尤物视频在线 亚洲精品99久久久久中文字幕 国产一区二区三区免费观看 伊人久久大香线蕉综合电影网 国产成人精品区在线观看 日本精品一区二区三区视频 日韩高清在线二区 久久免费播放视频 一区二区成人国产精品 国产精品免费精品自在线观看 亚洲精品视频二区 麻豆国产精品有码在线观看 精品日本一区二区 亚洲欧洲久久 久久中文字幕综合婷婷 中文字幕视频在线 国产成人精品综合在线观看 91精品国产91久久久久福利 精液呈暗黄色 香蕉国产综合久久猫咪 国产专区精品 亚洲精品无码不卡 国产永久视频 亚洲成a人片在线播放观看国产 一区二区国产在线播放 亚洲一区二区黄色 欧美日韩在线观看视频 亚洲精品另类 久久国产综合尤物免费观看 国产一区二区三区国产精品 高清视频一区 国产精品igao视频 国产精品资源在线 久久综合精品国产一区二区三区 www.五月婷婷 精品色综合 99热国产免费 麻豆福利影院 亚洲伊人久久大香线蕉苏妲己 久久电影院久久国产 久久精品伊人 在线日韩理论午夜中文电影 亚洲国产欧洲综合997久久 伊人国产精品 久草国产精品 欧美一区精品二区三区 亚洲成人高清在线 91免费国产精品 日韩精品福利在线 国产一线在线观看 国产不卡在线看 久久99青青久久99久久 亚洲精品亚洲人成在线播放 99久久免费看国产精品 国产日本在线观看 青草国产在线视频 麻豆久久婷婷国产综合五月 国产中文字幕一区 91久久精品国产性色也91久久 国产一区a 国产欧美日韩成人 国产亚洲女在线精品 一区二区美女 中文字幕在线2021一区 在线小视频国产 久久这里只有精品首页 国产在线第三页 欧美日韩中文字幕 在线亚洲+欧美+日本专区 精品国产一区二区三区不卡 久久这里精品 欧美在线va在线播放 精液呈暗黄色 91精品国产手机 91在线免费播放 欧美视频亚洲色图 欧美国产日韩精品 日韩高清不卡在线 精品视频免费观看 欧美日韩一区二区三区四区 国产欧美亚洲精品第二区首页 亚洲韩精品欧美一区二区三区 国产精品视频免费 在线精品小视频 久久午夜夜伦伦鲁鲁片 国产无套在线播放 久热这里只精品99re8久 欧美久久久久 久久香蕉国产线看观看精品蕉 国产成人精品男人的天堂538 亚洲人成网站色7799在线观看 日韩在线第二页 一本色道久久综合狠狠躁篇 国产一区二区三区不卡在线观看 亚洲乱码在线 在线观看欧美国产 久久福利青草精品资源站免费 国产玖玖在线观看 在线亚洲精品 亚洲成aⅴ人在线观看 精品91在线 欧美一区二三区 日韩中文字幕视频在线 日本成人一区二区 日韩免费专区 国内精品在线观看视频 久久国产综合尤物免费观看 国产精品系列在线观看 一本一道久久a久久精品综合 亚洲免费播放 久久精品国产免费 久久人精品 亚洲毛片网站 亚洲成a人一区二区三区 韩国福利一区二区三区高清视频 亚洲精品天堂在线 一区二区三区中文字幕 亚洲国产色婷婷精品综合在线观看 亚洲国产成人久久笫一页 999国产视频 国产精品香港三级在线电影 欧美日韩一区二区三区四区 日韩国产欧美 国产精品99一区二区三区 午夜国产精品理论片久久影院 亚洲精品中文字幕麻豆 亚洲国产高清视频 久久免费手机视频 日韩a在线观看 五月婷婷亚洲 亚洲精品中文字幕麻豆 中文字幕丝袜 www国产精品 亚洲天堂精品在线 亚洲乱码一区 国产日韩欧美三级 久久999精品 伊人热人久久中文字幕 久热国产在线视频 国产欧美日韩在线观看一区二区三区 国产一二三区在线 日韩国产欧美 91精品国产91久久久久 亚洲一区小说区中文字幕 精品一区二区免费视频 国产精品视频免费 国产精品亚洲综合色区韩国 亚洲国产精品成人午夜在线观看 欧美国产日韩精品 中文字幕精品一区二区精品