專利名稱：華支睪吸蟲病trfia診斷試劑盒及其使用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用時間分辨熒光分析法檢測華支睪吸蟲病的TRFIA試劑盒及其使用。
背景技術：
華支睪吸蟲病是一種人獸共患寄生蟲病，成蟲寄生在肝膽管內，成蟲會破壞膽道上皮和粘膜下血管，并產生分泌排泄抗原，引起膽管和膽管周圍的炎癥反應，導致膽管局限性擴張和膽管上皮細胞增生。一些抗原成分還能夠通過膽管上皮細胞進入肝組織，引起炎癥反應和肝功能損傷。長期的嚴重感染會導致纖維組織增生和肝細胞的萎縮變性，甚至引起癌變、腹水和肝硬化。肝吸蟲阻塞膽管，使膽汁流出不暢，易合并細菌感染和出現膽石癥。肝吸蟲病的防治主要依靠綜合防治措施。在流行區強化對人群的普查普治，并加強疫苗的研制，以減少傳染源和保護易感人群。目前，肝吸蟲病防治研究的重點集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標、致病的分子機理研究。轉移酶類是催化底物之間進行某些基團的轉移或交換的酶類，是生物體內肝細胞結合反應(屬第二相反應)中重要的催化劑之一。谷胱甘肽轉移酶(glutathione S-transferase,GST) (EC2. 5. 1. 18)是廣泛存在于各種生物體內的由多個基因編碼的、多功能的同工酶，是催化谷胱甘肽與多種親電子化合物連接的酶家族，構成酶的亞單位至少有7 個，大部分酶存在于細胞質中以同二聚體或異二聚體形式存在。GSTs在生物體中的重要功能之一是對內、外源性毒物的解毒作用。包括人在內的生物體都暴露在大量外源化合物存在的環境中，一些化合物在代謝活化后有親電子反應性，導致與內源性分子共價結合，蛋白質是重要的生物大分子，外源分子與其結合后經常改變其功能。谷胱甘肽轉移酶主要通過酶催化作用促使谷胱甘肽與有害異物結合，或以非酶結合方式將體內各種具有潛在毒性的化學物質、染料、致癌物從體內排出，從而達到解毒目的，近年來發現谷胱甘肽轉移酶對于研究肝臟疾病的發生、發展、轉歸和預防有重要意義。 其催化反應特性決定了其在防止脂質過氧化損傷擴大、抵御及修復DNA損傷以降低腫瘤發生以及癌細胞耐藥性形成等方面的重要作用。GSTs是抗惡性瘧原蟲潛在的藥物靶標，蠕蟲的GSTs參與對由蟲體代謝和宿主免疫系統所產生的脂質過氧化物和細胞毒性的羰基的解毒，也被認為是免疫療法和化學療法的一個潛在的靶標。其中，主要定位于成蟲實質的血吸蟲GST16和GST-28，是WHO提出的 6個最具潛力的候選疫苗分子之一。在大腸桿菌中表達惡性瘧原蟲的重組GST有催化活性。 華支睪吸蟲的^KDa GSI^P ^kDa GST的編碼基因在原核表達也有催化活性，并且重組的 26kDaGST可用于檢測IgG和IgE抗體。因而，原核表達有活性的重組GST是可行的.并且易于得到大量的重組蛋白質以用于功能研究。本發明人經過廣泛而深入的研究，從華支睪吸蟲中分離了編碼谷胱甘肽轉移酶 2cDNA，并表達純化了谷胱甘肽轉移酶2，并進一步揭示了基于此多核苷酸與多肽的應用。
發明內容
本發明在提供分離的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2及其制備與應用的基礎上，提供一種華支睪吸蟲病TRFIA診斷試劑盒。本發明公開了一種分離的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2，它是具有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2編碼 DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA 合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的Iac或trp啟動子；入噬菌體PL 啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRS和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞大腸桿菌BL21/DE3 ；或是低等真核細胞， 如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0， COs. 293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。前述分離的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2的制備方法，一般來說有以下步驟(1) 用編碼本發明的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；( 在合適的培養基中培養的宿主細胞； (3)從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法〔如溫度轉換或化學誘導) 誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理〔鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。根據本發明實施例列舉的，一個恰當的制備華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2的方法為1)將華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2的編碼基因克隆入原核表達載體 pET-30a(+)；2)將重組的表達載體轉化大腸桿菌BL21/DE3感受態細胞后篩選陽性克隆；3)大腸桿菌BL21/DE3的誘導表達；4)收集大腸桿菌BL21/DE3的誘導表達后的培養液上清，經親和層析獲得純化的蛋白。上述華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2可用于制備華支睪吸蟲病診斷試劑盒。華支睪吸蟲病的診斷除了常規的病原生物學檢查，主要的方法是使用免疫學診斷試劑盒。主要有兩類酶聯免疫試劑盒(ELISA)和快速免疫膠體金試劑盒(ICT)。華支睪吸蟲病的診斷即可通過檢測血清或尿液中的循環抗原判斷現癥感染，也可通過檢測血清或唾液中的特異性抗體來快速篩查。由于華支睪吸蟲主要是寄生在組織外，所產生的抗原成分絕大部分隨著膽汁排入腸道，只有感染度高，蟲體對膽管阻塞嚴重，引起膽管上皮嚴重破損時，其分泌排泄物才能進入肝臟和外周血中。進入外周血中的循環抗原大部分被抗體所中和，只有少量游離的循環抗原可被檢測到。因此，檢測循環抗原的方法雖然能反映現癥感染，但是敏感性較低。目前，臨床用于輔助診斷的主要是抗體檢測試劑盒。檢測抗體的方法分為兩種，一是用標記二抗作為檢測試劑與被包被在反應板或反應膜上的抗原所捕獲的抗體相結合，一種是用標記的抗原作為檢測試劑。二抗作為檢測試劑，一般只能檢測一種抗體，而且非特異性結合比較高；標記抗原作為檢測試劑，能檢測多種抗體，特異性更高。本發明公開了一種華支睪吸蟲病診斷試劑盒，包括TRFIA反應板、陰性對照、陽性對照、銪標記物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和增強液，其中，TRFIA反應板上包被有上述華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2。所述華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2為基因工程重組表達的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2。所述銪標記物為銪標記抗人IgG4 二抗。較佳的，樣品稀釋液的配方為生理鹽水；濃縮洗滌液的配方為=Tris-HCl 緩沖液(PH7.8)，進一步的，所述樣品稀釋液中還含有防腐劑如硫柳汞0.01% (w/v, 0. 01g/100ml)。所述增強液可選自常規。除上述試劑外，華支睪吸蟲病診斷試劑盒中還可包括封板膜及說明書。本發明進一步公開了前述華支睪吸蟲病診斷試劑盒的使用方法，包括下列步驟1).配液將濃縮洗滌液稀釋配制洗滌液；2).加樣分別在TRFIA反應板的相應孔中加入待測樣品或陰、陽性對照并用樣品稀釋液稀釋；3).孵育用封板膜封板后置室溫平搖60分鐘；4).用洗滌液洗滌后每孔加入銪標記物；5).孵育用封板膜封板后置室溫平搖60分鐘。6).用洗滌液洗滌后每孔加入增強液混勻反應；7).測定測定各孔熒光值。
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本發明的華支睪吸蟲病診斷試劑盒以谷胱甘肽轉移酶2作為診斷抗原，采用時間分辨熒光分析法(間接法)檢測華支睪吸蟲病人血清中的IgG4抗體，其一抗血清和二抗銪標記物的孵育時間各需60分鐘(室溫即可)。
圖-1重組蛋白GST2的催化活性檢測中加入不同體積重組GST2的產物-時間曲線
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。實施例1 谷胱甘肽轉移酶2的克隆用NCBI的ORF FINDER程序尋找Unigene中完整的開放閱讀框(ORF)，用BLASTx 程序判定是否為全長基因，其中的全長基因是已知基因還是新基因，編號為C003el0a的最大的ORF為639bp，我們將它簡稱為GST2。1)華支睪吸蟲基因組的提取從貓肝中收集10條華支睪吸蟲成蟲，PBS洗凈后，離心去上清。勻漿后加入10倍體積的裂解緩沖液(STE，含2% SDS，0.2mg/ml，蛋白酶K)，混勻，37°C水浴過夜。次日，將溶液放至室溫，加入等體積平衡酚，上、下輕輕顛倒約lOmin，室溫IOOOOrpm離心15min，取上層水相，重復抽提2次，取上層水相，加入0. 1倍體積的3mol/L醋酸鈉(pH5. 2)和2倍體積的無水乙醇，混勻，12000rpm離心lOmin，棄上清，70%乙醇洗兩次，12000rpm離心5min， 棄上清，待乙醇揮發盡后，加 30μ 1 TE(10mmol/LTris-HCI, lmmol/L EDTA, pH8. 0)溶解，取 5μ 1用瓊脂糖凝膠分析，余下樣品-20°C保存備用。2)感受態細胞的制備從培養板上挑取BL21/DE3單菌落入5ml LB培養液中，37 °C 250轉/分(rpm)振搖過夜。次日取150 μ 1加至:3ml LB培養液中，37°C 250rpm振搖至A6tltl = 0.6。取出菌液， 冰浴30min, 4°C，4000rpm離心5min,棄上清，加入0. lmol/L的氯化鈣750 μ 1，冰浴30min, 4°C，4000rpm離心5min，棄上清，加入0. lmol/L的氯化鈣400 μ 1，分裝100 μ 1/管，4°C保存 24h內用或每管加入30%滅菌甘油混勻后-70°C保存，3個月內使用。3)GST2基因的擴增與克隆1. 1基因的擴增、原核表達質粒的構建及鑒定分別以文庫質粒cDNA和基因組DNA為模板，上游引物Pl 為 5 ‘ GCGAATTCCACATGAAACACAGACACTGTG3 ‘，引入了兩個保護性堿基和EcoR I酶切位點；下游引物P2為5' CGGTCGACGTTAATCGTCGCCACAGTC3‘，引入了兩個保護性堿基和 Sal I酶切位點。用TaKaRa Ex Taq 酶擴增該基因的反應條件如下95°C預變性:3min，94°C變性 lmin，61°C退火50sec，72°C延伸lmin，共30個循環，最后72°C延伸8min。PCR產物用12g/ L的瓊脂糖凝膠電泳分析驗證，獲得分子量為639bp的片段。PCR產物回收，進行EcoR I和 Sal I雙酶切，與進行同樣雙酶切的原核表達載體pET-30a(+)按物質量比3-4 1用T4DNA連接酶于16°C連接18h。取100 μ 1 BL21/DE3感受態細胞，加入上述連接產物，輕輕混勻后冰浴lh，42°C水浴90sec，冰浴5min，加入LB培養液400 μ 1，混勻后放入37°C水浴anin， 37°C 150rpm搖lh。所有菌液鋪至經預熱的含卡那霉素的LB平板中，在37°C溫箱倒置培養 12-16h。含陽性質粒的菌液用30%滅菌甘油_70°C凍存備用。鑒定測序結果表明，克隆入pET_30a(+)的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2的基因序列為 SEQ ID NO. 2。AATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTG GTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGG TACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCCACATGAAACACAGACACTGTGCGCTATTCT ATTTCAACGTCCGTGGCAGAGCTGAGGCGATTAGGATGGTACTGCACGCTAACGATGTTTCGTTTGAGGATGTGCGT TTCGATAAGGACCAATGGTCTGAACGCAAACACGAGTTTCCGGGTGGTAAATTACCGCTTCTCCAAGTAAGAGAAGA GGGATCACAAGAGAAGAAGACTTATACAGAGAGCATGGCGATCGCCCGAGTGCTCGCAAAACACTACAGTATGATGG GCGATTCTGAAGAGGAATATTACAAGATTGAACGAATGATTGGGCAGTGTGCCGATTTGGATAAGGAGTTTGTCAAT GTCTTTTTCGCACGAGAAGACCAAAAGAAAGAAGTACTTGAGAAAGCAATGGGTGGAGAGGTGCCGAGACTACTGGA ACTTATTTGCAAATCACTCTCTGAATCTGGTGGCAAGTTCGTCGCTGGTAACAAAGTAACTCTTGGAGACATATGCC TTATGGCATCCATGGAAAATGTACGGAGAGCGGACCCTCAGCTTTTGAAAACGAAATATTCGACATTATTGGCCCTC GAGGCGGAGGTGTTCAAGGTCCTGCCGAAACTTGCGGACTACGTCAAAACACGACCAGAAACCGTCCTGTGAAGCAG ACTGTGGCGACGATTAACGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGC TAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGT(SEQID NO. 2)1. 2CsGST2基因在大腸桿菌BL21/DE3的誘導表達以含空質粒pET_30a(+)的BL21/DE3為陰性對照。含重組質粒的 pET-30a(+)-CsGST2的BL21/DE3接種于含有卡那霉素的培養基，37°C，250rpm，振蕩培養過夜后按10ml/L轉接，在37°C，250rpm，振蕩培養至々_ = 0. 6，取出Iml作為誘導前樣品，其余菌液加入IPTG(終濃度為lmmol/L)誘導培養4- ，取出Iml作為誘導后樣品。所有樣品4°C，8000rpm, 15min離心后收集菌體，少許沉淀加5 μ 1 DTT, 95 μ 1 IX SDS, 30 μ 1上清加2μ 1 DTT,8y 1 4XSDS，重懸混勻，沸水浴5min，沉淀13000rpm離心lmin，上清稍點動即可，取上層液10μ 1行SDS-PAGE (分離膠150g/L，濃縮膠50g/L)，用考馬斯亮藍染色，觀察有表達后，蛋白在上清內有表達，沉淀內無表達，進行大量表達及純化。1. 3CsGST2基因在大腸桿菌BL21/DE3的大量誘導表達37°C，250rpm，振蕩培養過夜的菌液按20ml/L的比例轉接至1000ml LB培養液中，37°C，250rpm，振蕩培養至A6tltl = 0.6，加入IPTG (終濃度為lmmol/L)誘導培養4_5h， 用4°C，8000rpm，15min離心后棄盡上清培養液，收集菌體，加入IX結合緩沖液(5mM咪唑 +0. 5MNaCl+20mM Tris_HCl，PH7. 9) 12_15ml重懸混勻完全，收集，存于_20°C，次日超聲裂解細菌(功率 150W，持續 lsec，停 2sec，共 15min) A°C, 13000rpm, 15min,收集上清，0· 45 μ m 微孔濾膜過濾。1.4親和層析純化蛋白Ni-NTA 樹脂，梯度濃度咪唑 20mM、30mM、40mM、60mM、200mM 及 400mM 咪唑將洗脫出來的GST2蛋白行SDS-PAGE驗證為目的蛋白，取純度高、量大的收集在一起，裝入透析袋 (透析液為1 X PBS, PH7. 4)，4°C透析24h (換液2_3次)。透析后的溶液用0. 22 μ m微孔濾膜過濾，分裝，_80°C保存備用。鑒定蛋白測序結果表明，純化獲得蛋白的序列為SEQ ID NO. 1。MKHRHCALFYFNVRGRAEAIRMVLHANDVSFEDVRFDKDQWSERKHEFPGGKLPLLQVREEGSQEKKT YTESMAIARVLAKHYSMM⑶SEEEYYKIERMIGQCADLDKEFVNVFFAREDQKKEVLEKAMGGEVPRLLELICKSL SESGGKFVAGNKVTLGDICLMASMENVRRADPQLLKTKYSTLLALEAEVFKVLPKLADYVKTRPETVL(SEQ ID NO. 1)1. 5谷胱甘肽轉移酶2活性測定重組蛋白催化活性研究1).重組蛋白GST2的定量用Bradford法，以牛血清白蛋白為標準(參見Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt Biochem,1976,72 :248-254)。2).試劑的配制CDNB用無水乙醇配制成20mmol/L溶液。GSH用水配制成20mmol/L溶液。3).反應體系為0. lmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6. 5)，GSH, CDNB，重組蛋白，反應體積為:3ml，反應溫度為25°C (在加入無水乙醇配制的試劑時，應注意無水乙醇的體積不超過反應總體積的四分之一)(參見 Habig WH, Pabst MJ, Jacoby WB. Glutathione S-transferase :the first enzymatic mercapturic acid formation. J Biol Chem, 1974, 249 :7130-7139.)。空白對照用0. lmol/L磷酸鈉緩沖液，所有孵育反應做三管，取平均值。測最大反應速度時，以僅不加重組蛋白的反應體系作陰性對照，以華支睪吸蟲成蟲粗酶作陽性對照。用先加有緩沖液、 GSH和⑶NB的反應體系(GSH和⑶NB的終濃度均為lmmol/L)在25°C水浴中孵育5min，力口入不同體積重組蛋白啟動反應，測定l-5min的A34(1。選定合適的重組蛋白量后，用僅不加 ⑶NB的反應體系作陰性對照，將加有GSH(終濃度lmmol/L)、重組蛋白和緩沖液的反應體系在25°C水浴中孵育5min，加入不同濃度⑶NB啟動反應，測在25V反應5min的A34tl,根據產物S-O，4-二硝基苯)谷膚甘肽⑵的毫摩爾消光系數Ae = 9. 6L -ππιιοΓ1 κπΓ1，計算酶的 iSftl1·^ (#JAL Habig WH, Pabst MJ, Jacoby WB. Glutathione S-transferase :the first enzymatic mercapturic acid formation. J Biol Chem, 1974, 249 :7130-7139.)。米氏常數Km根據米氏方程用統計軟件SPSS13. 0以底物濃度的倒數作為自變量、速度的倒數作為應變量進行線性回歸計算獲得。4).重組蛋白GST2的催化活性在l-5min內，加入1、5、10 μ 1的重組蛋白GST2，生成產物量不同，如圖_1所示，當加入5 μ 1或10 μ 1 GST2反應5min，產物的量不再隨時間的延長而增加，GST2的活性單位為 22. 76 士 0. 096 μ mol .mg-1 .InirT1tj 5μ 1 GST2 在 25°C 催化不同濃度 CDNB 反應 5min A340 的上升值見表-1，同上處理數據得到GST2的平均Km為111 μ mol。 5 μ 1 GST2催化不同濃度CDNB的A340CDNB(mmol/L)_A340_
0.0250.182±0.002
0.0500.258±0.0050.1000.533±0.003
0.2500.710±0.004
0.5000.860±0.005
0.7500.870±0.003
_1.000_0.873±0.003表-1實施例2 谷胱甘肽轉移酶2的物理化學性質將親和層析純化的谷胱甘肽轉移酶2，用enterokinase酶切除載體序列后，經 SDS-PAGE電泳，和標準分子量曲線，測得其分子量約為30kDa ；利用Amerham等電聚焦電泳儀，經PH3-10和pH7-10梯度固定膠的等電聚焦電泳，測得其等電點為6. 97。蛋白質的結構穩定。實施例3 制備診斷試劑盒此前華支睪吸蟲抗體的檢測多采用粗抗原或分泌排泄抗原包被反應板，敏感性、 特異性均不十分理想，而本發明采用實施例1獲得的基因工程重組抗原GST2包被反應板， 用間接TRFIA法檢測華支睪吸蟲病人體內的IgG4抗體。試劑盒的裝配1.反應板的制備(96孔/板)將實施例1獲得的純化的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶-2 (GST2)用碳酸鹽包被緩沖液(ρΗ9· 6)配成2μ g/ml，96孔反應板，每孔加100 μ 1，包被后室溫平搖30分鐘，4°C過夜，次日早晨再次室溫平搖30分鐘后，倒掉包被液，拍干，0. 5% BSA(W/v)+3%海藻糖(w/ v)+PBS(PH7. 2)封閉，200μ1/孔，4°C封閉過夜。倒去封閉液，拍干，抽干鋁箔紙包裝備用。2.樣品稀釋液(1 Iml/瓶)生理鹽水，加硫柳汞0. 01 % (w/v)，0. 22 μ m濾膜過濾。3.血樣陰、陽性對照處理(0. IOml/瓶)陽性對照病人糞便經鏡檢(一糞三檢)證實有蟲卵，取病人靜脈全血室溫靜止2小時，4°C 過夜，4000rpm,離心10分鐘，分離上清_20°C保存備用，經ELISA實驗驗證OD值1. 9-2. 0的
血清；陰性對照糞便經鏡檢(一糞三檢)未發現有蟲卵，靜脈全血室溫靜止2小時，4°C過夜， 4000rpm,離心10分鐘，分離上清_20°C保存備用，并經ELISA實驗驗證OD值0. 1左右的血清。陰、陽性對照加硫柳汞0. 01 % (w/v)，0. 22 μ m濾膜過濾一次，每瓶0. IOml分裝備用。4.銪標記物(Ilml/瓶)銪標記抗人IgG4 二抗1 400稀釋，Ilml/瓶分裝。
5.濃縮洗滌液(30ml/瓶，25 X)Tris-HCl緩沖液(PH7. 8)，用0. 22 μ m濾膜過濾，用時加蒸餾水或去離子水作25
倍稀釋。6.增強液(6ml/瓶)同其他時間分辨熒光分析法試劑盒。7.封板膜3片。8.說明書1份。實施例4 試劑盒的使用4. 1試劑盒使用步驟1).配液將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水作1 25稀釋。2).加樣分別在相應孔中加入待測樣品或陰、陽性對照5μ1，然后每孔加入 95 μ 1樣品稀釋液。3).孵育用封板膜封板后置室溫平搖60分鐘。4).洗滌用洗滌液沖洗4次，拍干。5).加酶每孔加入銪標記物100 μ 1。6).孵育用封板膜封板后置室溫平搖60分鐘。7).洗滌用洗滌液沖洗6次，拍干。8).顯色每孔加入增強液100 μ 1，室溫平搖5分鐘。9).測定測定各孔熒光值。血清稀釋度為1 20，銪標記的二抗的稀釋度為1 400，一抗血清和二抗銪標記物的孵育時間各需60分鐘(室溫)，無需特殊的設備，反應條件易實現，使本試劑盒操作起來更便捷。4.2試劑盒敏感性檢測實驗取171份鏡檢陽性血清，采用上述試劑盒檢測，最終TRFIA結果為陽性者162份， 陽性檢出率為94. 74%。4. 3試劑盒特異性檢測實驗取258份陰性血清，采用上述試劑盒檢測，TRFIA結果測出233份陰性，陰性檢出率為 90. 31%。用本發明所描述試劑盒，按說明書所示方法，進行交叉反應實驗，結果見表-2:交叉反應實驗結果(Results of cross-reaction)
權利要求
1.一種華支睪吸蟲病診斷試劑盒，包括TRFIA反應板、陰性對照、陽性對照、銪標記物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和增強液，其特征在于，所述TRFIA反應板上包被有華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2，所述華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2是具有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽。
2.如權利要求1所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒，其特征在于，所述銪標記物為銪標記抗人IgG4 二抗。
3.如權利要求1所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液為生理鹽水。
4.如權利要求1所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為 pH7. 8 的 iTris-HCl 緩沖液。
5.如權利要求1-4任一權利要求所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒，其特征在于，所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒中還可包括封板膜及說明書。
6.如權利要求1-5任一權利要求所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒的使用方法，包括下列步驟.1).將濃縮洗滌液稀釋配制洗滌液；.2).分別在TRFIA反應板的相應孔中加入待測樣品或陰、陽性對照并用樣品稀釋液稀釋；.3).用封板膜封板后置室溫平搖孵育；.4).用洗滌液洗滌后每孔加入銪標記物；.5).用封板膜封板后置室溫平搖孵育；.6).用洗滌液洗滌后每孔加入增強液混勻反應；.7).測定各孔熒光值。
7.如權利要求6所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟3和 5的孵育時間均為60分鐘。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，公開了華支睪吸蟲病TRFIA診斷試劑盒及其使用。本發明的華支睪吸蟲病診斷試劑盒，包括TRFIA反應板、陰性對照、陽性對照、銪標記物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和增強液，所述TRFIA反應板上包被有華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2，所述華支睪吸蟲谷胱甘肽轉移酶2是具有SEQIDNO.1的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽。還進一步公開了該華支睪吸蟲病診斷試劑盒中的應用。本發明的華支睪吸蟲病診斷試劑盒具有特異性強、靈敏度高、準確度高等特點，可較好地運用于華支睪吸蟲病的診斷,本試劑盒的主要試劑均采用工作液形式，可直接使用，較傳統的病原學診斷方法優勢為操作準確、簡便、結果可信。
文檔編號G01N33/68GK102539781SQ20101061948
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者余新炳, 吳英松, 徐勁, 李來慶, 王征, 董志寧, 鄧傳歡 申請人:中山大學