專利名稱：雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的液體雙試劑試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及本發明屬于醫學免疫學領域，涉及一種免疫檢測試劑，進一步地，本發明涉及一種測定血清或尿液中免疫球蛋白游離輕鏈的試劑。
背景技術：
免疫球蛋白(Immunoglobulin，簡稱Ig)是具有抗體活性或化學結構與抗體類似的球蛋白統稱，大量存在于正常人血清中，尿液中也有微量存在。Ig分子結構由兩條重鏈 (Heavy chain, H鏈)和兩條輕鏈(Light chain, L鏈)以及二硫鍵構成的“Y”型球蛋白。 人的免疫球蛋白根據其重鏈不同分為IgM、IgG、IgA、IgD、IgE，對應的重鏈依次為μ、γ、 α、δ、ε ；輕鏈分κ (kappa)和λ (lambda) 2種類型，任何一種免疫球蛋白都含有兩條相同類型的輕鏈即κ型或λ型，人類總的κ (kappa)和λ (lambda)的比例約為2 1。免疫球蛋白輕鏈(κ或λ )是由漿細胞產生的一種小分子量(2. 2kD或4. 4kD)的蛋白質。健康人血中有近40%的游離輕鏈(Free light chain,FLC), κ FLC和λ FLC的含量分別為3 19mg/l和6 26mg/l，κ FLC/ λ FLC BP κ /λ正常比值在0.洸 1. 65之間。此外λ FLC較κ FLC更易通過二硫鍵形成二聚體，而后者通常保持單體狀態。正常情況下游離輕鏈和重鏈的分泌是平衡的，而當漿細胞發生單克隆惡性增殖時，會產生大量未和重鏈結合的FLC，改變了 κ/λ比值。若比值>1.65則表明κ輕鏈過量，患者產生單克隆κ輕鏈；若比值<0.沈則是λ輕鏈過量，患者產生單克隆λ輕鏈。 FLC可自由通過腎小球濾過膜，在腎小管被重吸收回到血循環中，所以正常人尿中只有少量 FLC存在。當代謝失調或發生多發性骨髓瘤時，血中出現大量FLC，并由尿中排出，即產生所謂的本周氏蛋白(Bence-Jones protein，BJP，亦稱M蛋白)。本周氏蛋白是迄今為止發現的第一個特殊的腫瘤標記物，可用來鑒定和監控包括多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)、淀粉樣變性(amyloidosis，AL)等多種B細胞惡性增殖疾病，具有較高的臨床價值。近年來，隨著多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)、淀粉樣變性(amyloidosis， AL)等多種B細胞惡性增殖疾病研究的不斷深入，臨床上的診斷指標逐步由對血中免疫球蛋白的監測，到血或尿中輕鏈(總輕鏈，包括游離型及免疫球蛋白的結合型)的監測，再到目前倡導的針對血中游離輕鏈的監測并計算κ/λ比值。研究之所以得出這樣一個結論， 主要有以下幾點依據一、對病人血清中游離輕鏈的監測比傳統的免疫球蛋白測定可以更快更好的作出診斷，原因是游離輕鏈的半衰期很短，平均只有2 6時，而免疫球蛋白的半衰期一般較長，IgG的半衰期更長達20-25天，是前者的上百倍。理論上游離輕鏈水平可以實時反映患者的病情及治療效果；二、單一的針對尿液中游離輕鏈的測定不能夠準確的對病情作出判斷，原因是正常情況下，FLC升高在尿液和血清中可同步檢測到，如果B細胞惡性增殖疾病患者中伴隨腎衰情況下，尿液中輕鏈檢測不到變化造成誤診，而血清中FLC的測定不會受到干擾，在診斷上更加準確。而且用尿做樣本時需收集病人的M小時尿，樣本量較大、穩定性較差。
盡管研究表明血中游離輕鏈監測的臨床意義很高，但受以下幾個方面影響，血清中游離輕鏈的測定發展較為緩慢。一、傳統方法靈敏度較低，不能準確定量，如電泳法、免疫固定電泳法等，本發明中使用的雙膠乳法具備了足夠高的靈敏度；二、特異性抗體制備技術，血清中免疫球蛋白的量是游離輕鏈的幾千倍，要準確測定血清中FLC的含量就要克服血清中大量免疫球蛋白的干擾，特異性抗體的選擇十分重要，如果選擇的抗體特異性差就會與完整免疫球蛋白的輕鏈發生交聯反應造成結果失真。早期制備的針對游離輕鏈隱蔽位點抗體可特異性識別結合相應的游離輕鏈，但單克隆抗體效價較低，一般不適用于免疫比濁法(膠乳增強法是免疫比濁法的一類，即單克隆抗體不適于膠乳增強免疫比濁法)，但現在可以自制或購買到針對游離輕鏈多個隱蔽位點的抗體，因此使膠乳增強免疫比濁法的應用成為可能；三、正常人體中血清中FLC的含量很低，但發生B細胞良性或惡性增殖病變時其含量會超出正常的幾十倍，因此要求FLC的測定方法不僅要具備靈敏度高、特異性強還要線性范圍寬。膠乳增強免疫比濁法是新近發展起來的一種應用較廣的免疫比濁法，比普通免疫比濁法具有更高的靈敏度。本發明中所使用的膠乳增強免疫比濁法又做了部分改進，采用兩種不同直徑的膠乳顆粒(即雙膠乳法)，能夠滿足特異性強、靈敏度高、線性范圍寬的要求，可以應用于各種全自動生化分析儀，符合臨床快速準確測定的要求。因此，本發明采用雙膠乳法，開發出可檢測血清和尿液中FLC的液體雙試劑，在臨床應用上有著巨大的應用價值，可為多發性骨髓瘤、多發性硬化癥、淀粉樣病變等多種B細胞良性或惡性增殖疾病的臨床診斷提供強有力的指標。據研究報道，不久的將來血清游離輕鏈的測定很可能成為臨床上的常規檢驗項目，可見血清游離輕鏈這一指標在臨床上的重要地位。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的缺點和不足，而提供一種FLC檢測試劑的改進，具有樣本(血清或尿液)無需稀釋、靈敏度高、特異性強、線性范圍寬、適用于各種類型的全自動生化分析儀的FLC檢測試劑盒，所述試劑盒包括試劑R1、試劑R2和已知濃度的 FLC校準品。一方面，本發明提供一種雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的試劑盒，試劑盒包括試劑R1、試劑R2和已知濃度的輕鏈抗原校準品，其中，a.本發明所述試劑盒的試劑Rl是一種使樣本中FLC特異的抗原位點充分暴露并可加快抗原抗體反應使其迅速達到反應終點，包含物質占其質量百分比為2% 8%高分子加速劑、0.01% 1.0%防腐劑、0. 1.0%表面活性劑、0. 0.5%反應促進劑、 0. 05 5. 0%穩定劑、0. 5. 0%電解質，及pH6. 5 8. 0的10 IOOmmol/L的緩沖液；b.本發明所述試劑盒的R2包含兩種不同直徑的膠乳顆粒，其膠乳顆粒直徑范圍分別在40 80nm和100 200nm之間，兩種膠乳顆粒上都交聯有特異性很強的κ型或λ 型抗FLC多克隆抗體，可識別并結合血清或尿液中FLC的單體和多聚體，但不與完整免疫球蛋白的結合型輕鏈結合。包括占其質量百分比為40 SOnm的膠乳顆粒1. 0% 5. 0%、 100 200nm的膠乳顆粒3. 0%~ 8. 0%,0. 01% 1. 0%防腐劑、0. 1. 0%表面活性齊[J、0. 1% 0. 5%反應促進劑、0. 5. 0%電解質、0. 05 5. 0%穩定劑，及pH6. 5 8. 0 的10 IOOmmol/L的緩沖液；
c.本發明所述的已知濃度的FLC校準品，用來與樣本比較進行結果計算，包括占其質量百分比為0. 01% 1.0%防腐劑、0. 5.0%電解質、0. 05 5.0%穩定劑、 3. 0% FLC(k型或λ型)抗原，及ρΗ6. 5 8. 0的10 1 (Ktoimol/L的緩沖液。本發明中κ型或λ型抗FLC多克隆抗體來自馬、羊、兔、鼠等哺乳動物。此多克隆抗體可特異的識別完整免疫球蛋白上結合型輕鏈所隱蔽了的多個抗原位點，因此能特異結合FLC單體和聚合體，而不結合完整免疫球蛋白上的結合型輕鏈。因此，該多克隆抗體既可以保障抗原抗體的高效親和力，也保障了試劑盒的特異性，提高了抗干擾能力。本發明使用的高分子加速劑可以是聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇 6000、聚乙二醇8000，優選聚乙二醇6000。本發明使用的反應促進劑可以是聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000、
溴化己二甲胺、聚凝胺的一種或多種。本發明優選羊抗人FLC(K型或λ型)抗體，可以自制或購買。本發明所使用的膠乳是包含兩種不同直徑的膠乳顆粒，分別為40 SOnm的膠乳顆粒1. 0% 5. 0%、100 200nm的膠乳顆粒3. 0% 8. 0%，通過調配兩種不同直徑膠乳顆粒的配比，達到提高靈敏度的同時也拓寬了試劑的線性范圍。本發明所述的膠乳為苯乙烯膠乳，有些地方將“苯乙烯膠乳”簡稱為膠乳，在本領域的人員中已達成共識，不再作進一步闡述。本發明中所使用的防腐劑選自疊氮鈉、苯酚、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、 乙基汞硫代硫酸鈉。 本發明中所使用的防腐劑為疊氮鈉。本發明中所使用的電解質可以是陽離子或陽離子。本發明中所使用的電解質優選氯化鈉。本發明中的穩定劑可以由乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、牛血清白蛋白、甘露糖醇中的一種或多種構成。本發明中所使用的穩定劑優選牛血清白蛋白。本發明所使用的表面活性劑選自非離子表面活性劑中的聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、Tween系列、Theist中的一種或幾種。本發明中所使用的非離子表面活性劑為Tween。本發明中所使用的緩沖液可以是磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、HEPES 緩沖液、PIPES緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液等。本發明中說使用的緩沖液優選三羥甲基氨基甲烷緩沖液，pH為6. 5 8. 0，優選 7. 8 8. O0本發明采用膠乳增強免疫比濁法，開發出可檢測血清和尿液中FLC的液體雙試劑。其反應原理是包被了高特異性抗體的膠乳顆粒，與樣本中相應的抗原發生特異性結合，形成抗原-抗體-膠乳顆粒的復合物，在特定的緩沖液中這種復合物形成一定的濁度， 濁度的增加程度與樣本中的抗原濃度成正比關系，在一定的波長下進行濁度測定，即可測得樣本中被檢抗原的含量。在本發明中，血清或尿液中的FLC(K型或λ型)抗原與結合在膠乳顆粒表面的高特異性羊抗人FLC (κ型或λ型)多克隆抗體結合，發生抗原抗體反應，在緩沖液中產生的抗原-抗體-膠乳顆粒的復合物形成一定濁度，測定此濁度在570nm波長處的吸光度，對照標準曲線即可求出樣本中FLC的含量。采用本發明所述的膠乳增強法測定血清或尿液中FLC的試劑盒進行測定時，先將樣本與試劑Rl混勻，讀取吸光度Al，之后加入R2，讀取吸光度A2，計算反應吸光度，最后得樣本中FLC的含量。更進一步的，本發明采用5點定標法，以樣條函數作為計算模式，根據吸光度與校準品所作的劑量/響應曲線，根據吸光度在劑量/響應曲線上計算出樣本中FLC含量。本發明的技術核心在于兩點一是，只針對游離型輕鏈而不結合完整免疫球蛋白結合型輕鏈的高特異性多克隆抗體的使用，使得在血清或尿液中遠高于自身濃度的免疫球蛋白存在下特異的識別FLC ；二是，高特異性抗體與兩種不同直徑的膠乳顆粒包被，通過調節兩種膠乳的配比，達到提高測試靈敏度的同時也拓寬了測試的線性范圍。進一步的，本發明所述的膠乳增強法測定血清或尿液中FLC試劑盒的突出優點在于特異性強、靈敏度高、線性范圍寬、操作簡便，適用于各種全自動生化分析儀，極大的滿足了臨床檢測的要求。
具體實施例方式實施例一雙膠乳法測定血清或尿液中游離kappa輕鏈試劑盒試劑盒的主要成分及配比如下試劑Rl 三羥甲基氨基甲烷緩沖液20mmol/L疊氮鈉(防腐劑)0.1%氯化鈉(電解質)154mmol/LPEG-6000 (高分子加速劑)3%Tween-20 (表面活性劑)0.2%牛血清白蛋白(穩定劑)0.5%試劑R2 三羥甲基氨基甲烷緩沖液20mmol/L疊氮鈉(防腐劑)0.1%氯化鈉(電解質)154mmol/L Tween-20 (表面活性劑)
0. 2%牛血清白蛋白(穩定劑)0.5%羊抗人kappa輕鏈多克隆抗體5 8%40 80nm的膠乳顆粒1. 0% 5. 0%、100 200nm的膠乳顆粒3. 0%. 抗體包被時，兩種膠乳分開單獨包被，保證抗體包被均勻。Kappa輕鏈校準品三羥甲基氨基甲烷緩沖液20mmol/L疊氮鈉(防腐劑)0.1%氯化鈉(電解質)154mmol/L
8. 0%,
牛血清白蛋白(穩定劑)0.5%純化的人血清kappa輕鏈0 3%試劑Rl為無色透明溶液，R2為均一的乳白色溶液，校準品也為無色透明溶液。使用本發明試劑盒時，基本參數設置為樣本量5. 0μ L ；試劑R1240y L ；試劑 R280yL;2點終點法，主波長570nm，副波長800nm;校準方式樣條函數Spline ；反應方向 上升反應；測定溫度37°C。定標方法為5點定標。定標第1點為儀器設置的水點，2、3、4 點為原始校準品稀釋8倍、4倍、2倍所得，第5點為校準品原液，所用的稀釋液為生理鹽水。Lambda輕鏈校準品三羥甲基氨基甲烷緩沖液20mmol/L疊氮鈉(防腐劑)0.1%氯化鈉(電解質)154mmol/L牛血清白蛋白(穩定劑)0.5%純化的人血清Lambda輕鏈0 3%試劑Rl為無色透明溶液，R2為均一的乳白色溶液，校準品也為無色透明溶液。使用本發明試劑盒時，基本參數設置為樣本量5. 0μ L ；試劑R1240y L ；試劑 R280yL;2點終點法，主波長570nm，副波長800nm;校準方式樣條函數Spline ；反應方向 上升反應；測定溫度37°C。定標方法為5點定標。定標第1點為儀器設置的水點，2、3、4 點為校準品原液稀釋8倍、4倍、2倍所得，第5點為校準品原液，所用的稀釋液為生理鹽水。實施例三本發明kappa游離輕鏈試劑盒的相關性、靈敏度及線性范圍
為更好比較本發明試劑的優越性，所選的臨床樣本均為醫院收集的病人血清，因為相對而言尿樣本的測定比血清容易。對照試劑采用“游離Kappa/Lambda輕鏈測定試劑盒”(見“武建國，王毓三.血清游離輕鏈測定中應考慮的問題[J]，臨床檢驗雜志，2004，(22)3 :165-167. ”)。該對照試劑的原理為單克隆抗體與均一的膠乳顆粒包被，在波長570nm處測定反應吸光度，根據校準曲線計算樣本中相應物質含量。其Rl為無色透明緩沖液；R2為乳白色單克隆抗體敏感的膠乳溶液。1相關性實驗分別使用本發明試劑和對照試劑采用日立7180全自動生化分析儀對50份人血清 (包含正常和異常標本)按各自參數同時進行測定，本發明試劑參數見實施例一。對測定值進行線性回歸，得回歸方程式為y = 1. 025x+2. 3421，相關系數為R2 = 0. 9935 (y為本發明試劑，χ為對照試劑)，結果表明本發明試劑與對照試劑相關性很好，進而說明本發明試劑具有很好的特異性和準確度。此外本試劑不僅適用于日立7180全自動生化分析儀，還可用于日立、奧林巴斯等其他系列的全自動和半自動生化分析儀，具體參數可據主要參數做適當調整。2靈敏度實驗表1、表2分別表示本發明試劑和對照試劑的靈敏度。計算95%置信區間的靈敏度分別為本發明的kappa游離輕鏈試劑0. 40mg/L，優于對照試劑0. 84mg/L0表1 本發明試劑靈敏度
權利要求
1.一種雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的試劑盒，試劑盒包括試劑R1、試劑R2和已知濃度的輕鏈抗原校準品，其中，a.試劑Rl包含占其質量百分比為2% 8%高分子加速劑、0.01% 1.0%防腐劑、 0. 05 5.0%穩定劑、0. 1.0%表面活性劑、0. 0. 5%反應促進劑、0. 5.0% 電解質，及PH6. 5 8. 0的10 IOOmmol/L的緩沖液；b.試劑R2包含兩種不同直徑的膠乳顆粒，其膠乳顆粒直徑范圍分別在40 SOnm和 100 200nm之間，兩種膠乳顆粒上都交聯有κ型或λ型抗FLC多克隆抗體，還包含占其質量百分比為0. 01% 1.0%防腐劑、0. 1.0%表面活性劑、0. 0.5%反應促進劑、0. 5. 0%電解質、0. 05 5. 0%穩定劑，及pH6. 5 8. 0的10 IOOmmol/L的緩沖液；c.已知濃度的輕鏈抗原校準品包含占其質量百分比為0.01% 1.0%防腐劑、 0. 1 % 5.0%電解質、0.05 5.0%穩定劑、0 3.0% κ型或λ型FLC抗原，及ρΗ6. 5 8. 0的10 IOOmmol/L的緩沖液。
2.根據權利要求1所述的雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的試劑盒，其中κ型或 λ型抗FLC多克隆抗體來自于哺乳動物，優選的哺乳動物包括馬、羊、兔、鼠，更優選為羊。
3.根據權利要求1所述的雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的試劑盒，其中膠乳包含兩種不同直徑的膠乳顆粒，分別為占試劑R2質量百分比為1. 0% 5. 0%的40 SOnm 的膠乳顆粒和占試劑R2質量百分比為3. 0% 8. 0%的100 200nm的膠乳顆粒。
4.根據權利要求1-4任一項所述的雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的試劑盒，其中所述的高分子加速劑選自聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000。
5.根據權利要求1-4任一項所述的雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的試劑盒， 其中所述的防腐劑選自疊氮鈉、苯酚、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯或乙基汞硫代硫酸鈉。
6.根據權利要求1-4任一項所述的雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的試劑盒，其中所述的電解質為陽離子或陽離子，優選為氯化鈉。
7.根據權利要求1-4任一項所述的雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的試劑盒， 其中所述的穩定劑選自乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、牛血清白蛋白、甘露糖醇中的一種或多種，優選為牛血清白蛋白。
8.根據權利要求1-4任一項所述的雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的試劑盒，其中所述的表面活性劑選自非離子表面活性劑中的聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、 聚氧乙烯烷基苯基醚、Tween系列、Theist中的一種或幾種，優選為Tween。
9.根據權利要求1-4任一項所述的雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的試劑盒，其中所述的緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、HEPES緩沖液、PIPES緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液等，優選為三羥甲基氨基甲烷緩沖液。
10.根據權利要求1-4任一項所述的雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的試劑盒， 其中所述的反應促進劑選自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000、溴化己二甲胺、聚凝胺的一種或多種。
全文摘要
本發明涉及雙膠乳法測定血清或尿液中游離輕鏈的液體雙試劑試劑盒。本發明提供的試劑盒包括試劑R1、試劑R2和已知濃度的輕鏈抗原校準品，其中試劑R1包含高分子加速劑、防腐劑、表面活性劑、反應促進劑、穩定劑、電解質及緩沖液；R2包含兩種不同直徑的膠乳顆粒，其膠乳顆粒直徑范圍分別在40～80nm和100～200nm之間，兩種膠乳顆粒上都交聯有κ型或λ型抗FLC多克隆抗體，還包含防腐劑、表面活性劑、反應促進劑、電解質、穩定劑及緩沖液；已知濃度的輕鏈抗原校準品包含防腐劑、電解質、穩定劑、κ型或λ型FLC抗原及緩沖液。本發明的試劑盒特異性強、靈敏度高、線性范圍寬、操作簡便，適用于各種全自動生化分析儀。
文檔編號G01N33/68GK102175871SQ201010615018
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者劉希, 徐麗, 高愛民 申請人:北京九強生物技術股份有限公司