專利名稱：β-銀環蛇毒素檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物學免疫方法的測定技術領域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法快速檢測β-銀環蛇毒素檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
銀環蛇(Bungarus multicinctus)屬動物界，脊索動物門，爬蟲綱，有鱗目，眼鏡蛇科，環蛇屬。全身背面是黑白相間的環紋，具30 50個白色或乳黃色窄橫紋，是世界十大毒蛇之一。屬前溝牙類毒蛇，其一次排毒46mg，Img干毒就能致人于死地。毒腺分泌的蛇毒含多種多肽成分，具有不同的生物學活性。隨著捕食者和被捕者的相互作用，毒素隨之進化， 功能性的生理活性發生相應的變化。銀環蛇毒素的主要成分為蛋白質和多肽，包括α-銀環蛇毒素(α -BGT)、β -銀環蛇毒素(α -BGT)、κ -銀環蛇毒素(κ -BGT)、γ -銀環蛇毒素 (Y-BGT)和磷脂酶A等酶類。β -銀環蛇毒素(Α鏈分子量為13500，B鏈分子量為7000)，由于可抑制神經末梢小體釋放傳遞物質，所以影響突觸傳導。銀環蛇毒素具有強烈的磷酸酶Α2活性，但只有在有鈣離子存在的條件下才顯活性。β -銀環蛇毒素主要用于醫學藥理學和分子免疫學，制備單克隆抗體，在蛇毒的檢測、蛇咬傷中毒的預防和救治等方面具有重要意義。測定蛇毒素有多種方法，例如生物質譜法、光學免疫分析、熒光免疫技術等，但由于不能夠適應各種不同的環境而受到很大限制。傳統的酶聯免疫吸附法(ELISA)需要酶聯儀等設備，在野外運用受到很大限制。本發明介紹了一種以膠體金免疫層析法快速檢測 β -銀環蛇毒素的檢測試劑盒及其制備方法，該方法具有簡單、快速，無需任何儀器設備，經濟實用等特點，適用于快速定性檢測樣本中是否含有銀環蛇毒素。膠體金免疫層析技術是20世紀九十年代以來在單克隆抗體技術、免疫層析技術及膠體金顯色技術基礎上發展起來的一項新型體外診斷技術。基于膠體金免疫層析技術可以制備膠體金試紙，膠體金試紙的原理是應用膠體金標記技術，以膠體金為示蹤物，利用抗原抗體特異性結合反應，利用特定的顯色反應在試紙上的顯色而判定檢測的結果，具有操作簡單、檢測快速、靈敏度高、特異性強，無須復雜的儀器等特點。
發明內容
本發明的目的在于提供一種簡單、快捷、靈敏度高、特異性強的β -銀環蛇毒素試劑盒及其制備方法，用于檢測待檢樣本中是否含有β -銀環蛇毒素。一種用于檢測β -銀環蛇毒素的檢測試劑盒，包括樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標記的β-銀環蛇毒素單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測線(Τ線)和質控線(C線)，其中檢測線 (Τ線)上包被了 β-銀環蛇毒素單克隆抗體，質控線(C線)上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗體；所述吸樣墊為吸水紙。
本發明提供了一種β -銀環蛇毒素檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟(1)制備β -銀環蛇毒素單克隆抗體采用β -銀環蛇毒素為免疫原免疫BALB/C小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗β -銀環蛇毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用 Protein G柱進行純化，獲得β -銀環蛇毒素單克隆抗體。(2)制備膠體金取0. 01%的氯金酸水溶液，加熱煮沸。根據需要迅速加入枸櫞酸三鈉水溶液 lml，繼續煮沸約5min，出現橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。(3)制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調至7. 0-8. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入β -銀環蛇毒素單克隆抗體，使β -銀環蛇毒素單克隆抗體的濃度為15-30 μ g/ml膠體金，混合均勻后，室溫放置30分鐘；力口入10%的牛血清蛋白(BSA)溶液使其濃度為10-30 μ 1/ml，混合均勻，室溫放置30分鐘； 12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30% -80%初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解，得到β-銀環蛇毒素單克隆抗體-膠體金標記物；將β-銀環蛇毒素單克隆抗體-膠體金標記物按ImL鋪40-70cm2聚酯膜的比例均勻鋪在聚酯膜上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于30%的條件下干燥對士2小時，制成膠體金墊。上述膠體金復溶液為含0. 01-0. 02%的Tris，1. 5-3. 0%的蔗糖、0. 1-0. 8%的BSA 以及0. 05-0. 3%的Triton X-100的0. 02M pH 7. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖溶液。(4)包被β -銀環蛇毒素單克隆抗體、羊抗鼠IgG多克隆抗體設定劃膜儀涂覆參數1 μ L/cm,分別用微量進樣器取濃度為0. 6-1. 8mg/ml的 β -銀環蛇毒素單克隆抗體、取濃度為0. 6-1. 5mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復運動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆β-銀環蛇毒素單克隆抗體(Τ線)、羊抗鼠IgG多克隆抗體 (C線)。劃線后于溫度38°C的烘箱中干燥對士2小時，保存，備用。(5)樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于0. OlM pH 7. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中20_40min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含0. 5-1.5% BSA, 0. 5-1.0% Tweeen-20，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用(6)組裝試劑盒在PVC支撐板上按順序依次粘附樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊，得到所述用于檢測β-銀環蛇毒素的試紙條，試紙條可以裝入塑料卡內，組裝成檢測卡。其中所述樣品墊為玻璃纖維，吸樣墊為吸水紙。本發明利用膠體金免疫層析技術及抗原抗體特異性反應，運用銀環蛇毒素單克隆抗體與被測樣品中可能含有的銀環蛇毒素結合，然后與檢測線(Τ線)上包被的 β -銀環蛇毒素單克隆抗體結合，形成雙抗體夾心復合物而顯色的原理檢測β -銀環蛇毒素。檢測樣品時，樣品因毛細管作用向吸樣墊一端層析。若被測樣品中含有銀環蛇毒素，當β -銀環蛇毒素層析到膠體金墊的位置時，與膠體金-β -銀環蛇毒素單克隆抗體形成“膠體金-β -銀環蛇毒素單克隆抗體-β -銀環蛇毒素”復合物，復合物繼續層析，當達到檢測線(T線)的位置時，與檢測線(T線)上包被的β-銀環蛇毒素單克隆抗體相結合， 形成“膠體金-β -銀環蛇毒素單克隆抗體-β -銀環蛇毒素-β -銀環蛇毒素單克隆抗體” 雙抗體夾心物而顯色，此時為陽性結果。若為陰性結果，膠體金銀環蛇毒素單克隆抗體不能與檢測線(Τ線)上包被的β-銀壞蛇毒素單克隆抗體結合，此時T線不顯色。無論被測樣品中是否含有β-銀環蛇毒素，膠體金標記物均會與包被在質控線(C線)上的羊抗鼠IgG多克隆抗體結合而顯色，C線顯色是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標準，同時也作為試劑的內控標準。本發明所述試劑盒的檢測方法為將被檢樣品平衡至室溫；取出β -銀環蛇毒素檢測裝置，水平放置；在樣品墊中加入2-3滴樣品，10-15分鐘時觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果。本發明所述的試劑盒采用膠體金免疫層析技術測定銀環蛇毒素，檢測時，將被測樣品加在試劑盒上的樣品墊上，可以直接觀察到免疫反應的結果，完成樣品檢測。本發明可用于檢測樣本中可能存在的銀環蛇毒素，具有使用方便、操作簡單、反應迅速、經濟實用等特點。
圖1 β -銀環蛇毒素檢測試劑盒結構示意圖；附圖符號說明1 樣品墊；2 膠體金墊(膠體金標記β -銀環蛇毒素單克隆抗體的聚酯膜)3 硝酸纖維素膜(Τ 包被了 β -銀環蛇毒素單克隆抗體的檢測線；C 包被了羊抗鼠IgG多克隆抗體的質控線)；4 吸樣墊；5:PVC 支撐板；圖2本發明試劑盒的檢測結果示意圖。自左至右依次為T、C兩條線陽性檢測結果；C 一條線陰性檢測結果；無效。
具體實施例方式實施例1 β -銀環蛇毒素檢測試劑盒的制備1. β -銀環蛇毒素單克隆抗體采用β -銀環蛇毒素為免疫原免疫BALB/C小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗β -銀環蛇毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用 Protein G柱進行純化，獲得β -銀環蛇毒素單克隆抗體。2.制備膠體金取0. 01%的氯金酸水溶液100ml，加熱煮沸。根據需要迅速加入1 %枸櫞酸三鈉水溶液1ml，繼續煮沸約5min，出現橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。3.制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液5ml，加入0. Iml 0. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的PH值調至7. 5，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入0. 022ml濃度為4. 5mg/ml的β-銀環蛇毒素單克隆抗體，混合均勻后，室溫放置30分鐘；加入0. Iml 10%的牛血清蛋白 (BSA)溶液，混合均勻，室溫放置30分鐘；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液， 棄去，剩余的沉淀用50%初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解，得到β-銀壞蛇毒素單克隆抗體-膠體金標記物；將β -銀環蛇毒素單克隆抗體-膠體金標記物按ImL鋪56cm2聚酯膜的比例均勻鋪在聚酯膜上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于30%的條件下干燥M 小時，制成膠體金墊。上述膠體金復溶液為含0.01%的Tris，2.0%的蔗糖、0.5%的BSA以及0. 1 %的 Triton X-100的0. 02M pH 7. 5的磷酸鹽緩沖溶液。4.包被β -銀環蛇毒素單克隆抗體、羊抗鼠IgG多克隆抗體設定劃膜儀涂覆參數1 μ L/cm,分別用微量進樣器取濃度為1. Omg/ml的β -銀環蛇毒素單克隆抗體、取濃度為0. 8mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體，按順序接到劃膜儀的A、B 管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復運動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆β -銀環蛇毒素單克隆抗體(Τ線)、羊抗鼠IgG多克隆抗體(C線)。劃線后于溫度38°C的烘箱中干燥M小時，保存，備用。5.樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于50ml 0. OlM pH 7. 5的磷酸鹽緩沖溶液處理液中30min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含1. 0% BSA, 0. 5% Tweeen-2，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用6.組裝試劑盒在PVC支撐板上按順序依次粘附樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊，得到所述用于檢測β-銀環蛇毒素的試紙條，試紙條可以裝入塑料卡內，組裝成檢測卡。其中所述樣品墊為玻璃纖維，吸樣墊為吸水紙。實施例2 β -銀環蛇毒素檢測試劑盒的應用評價1.最低檢出量用磷酸緩沖溶液(PBS0. 01mol/L、pH 7. 5)配制濃度為 0、50、100、150ng/mL 的 β -銀環蛇毒素標準品，各濃度分別進行10次平行檢驗，10分鐘時觀察檢測結果，Ong/mL、 50ng/mL的β -銀環蛇毒素標準品的檢測結果為T線不顯色，僅C線顯色且顯色度均一，為陰性結果；100ng/mL、150ng/mL的β -銀環蛇毒素標準品的檢測結果為T、C線均顯色，判定為陽性檢測結果；最終確定銀環蛇毒素檢測試劑盒的最低檢出量為lOOng/ml。2.陰性參考品符合率用磷酸緩沖溶液(PBS 0. 01mol/L,pH 7. 5)配制濃度為100ug/mL的眼睛蛇毒素標準溶液進行10次平行檢驗，10分鐘時觀察檢測結果，T線不顯色，C線呈現紅色條帶，結果為陰性。用磷酸緩沖溶液(PBS 0. 01mol/L、pH 7. 5)配制濃度為100ug/mL的金環蛇毒素標準溶液進行10次平行檢驗，10分鐘時觀察檢測結果，T線不顯色，C線呈現紅色條帶，結果為陰性。3.陽性參考品符合率用磷酸緩沖溶液(PBS0. 01mol/L、pH 7. 5)配制濃度為 100ng/mL、200ng/mL、 300ng/mL的β -銀環蛇毒素標準品，各濃度分別進行10次平行檢驗，10分鐘時觀察檢測結果，T線、C線均顯色，結果為陽性。4.重復性用磷酸緩沖溶液(PBS 0. 01mol/L、pH 7. 5)配制濃度為100ng/mL的β -銀環蛇毒素標準品，進行10次平行檢驗，10分鐘時觀察檢測結果，結果均為T線，C線均顯色，且顯色度均一，為陽性結果。5.穩定性37°C放置20天后，最低檢出量、陰性參考品符合率、陽性參考品符合率、重復性各項指標均符合以上要求，本試劑盒具有良好的穩定性。實施例3 β -銀環蛇毒素檢測試劑盒的檢測方法1.檢測方法取出β-銀環蛇毒素檢測試劑盒，水平放置；在樣品墊上滴入3滴樣品，10分鐘后觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果。2.結果判定陽性T線、C線均顯色，判定為陽性結果，說明被測樣品中β -銀環蛇毒素的含量高于 100ng/mLo陰性T線不顯色，僅C線顯色，說明樣品中β-銀環蛇毒素的含量低于lOOng/mL。無效C線不顯色，說明不正確操作或試劑盒已經變質損壞。
權利要求
1.一種銀環蛇毒素檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板組成；所述的樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標記的β-銀環蛇毒素單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被了 β-銀環蛇毒素單克隆抗體作為檢測線(τ線)，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質控線(C線)；所述的樣品墊為吸水紙。
2.—種權利要求1所述的銀環蛇毒素檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的β-銀環蛇毒素單克隆抗體由β-銀環蛇毒素免疫BALB/C小鼠獲得。
3.—種權利要求1所述的銀環蛇毒素檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑枸櫞酸三鈉作用下制成大小為20-40nm的膠體金顆粒。
4.一種權利要求1所述的銀環蛇毒素檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金墊的制備方法為取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的PH值調至7. 0-8. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入β -銀環蛇毒素單克隆抗體，使β-銀環蛇毒素單克隆抗體的濃度為15-30 μ g/ml膠體金，混合均勻后，室溫放置 30分鐘；加入10%的牛血清蛋白(BSA)溶液使其濃度為10-30 μ 1/ml，混合均勻，室溫放置 30分鐘；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30% -80% 初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解，得到β-銀環蛇毒素單克隆抗體-膠體金標記物；將 β -銀環蛇毒素單克隆抗體-膠體金標記物按ImL鋪40-70cm2聚酯膜的比例均勻鋪在聚酯膜上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于30%的條件下干燥對士2小時，制成膠體金墊。
5.一種權利要求1及權利要求5所述的銀環蛇毒素檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金復溶液為含0. 01-0. 02%的Tris，1. 5-3. 0 %的蔗糖、0. 1-0. 8%的 BSA 以及 0. 05-0. 3%的 Triton X-100 的 0. 02M pH 7. 0-8. 0 的磷酸鹽緩沖溶液。
6.一種權利要求1所述的銀環蛇毒素檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上的兩條線的包被方法為設定劃膜儀涂覆參數1 μ L/cm,分別用微量進樣器取濃度為0. 6-1. 8mg/ml的β -銀環蛇毒素單克隆抗體、取濃度為0. 6-1. 5mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復運動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆β -銀環蛇毒素單克隆抗體(Τ線)、羊抗鼠IgG多克隆抗體(C線)。劃線后于溫度38°C的烘箱中干燥對士2小時，保存，備用。
7.—種權利要求1所述的銀環蛇毒素檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的銀環蛇毒素檢測試劑盒的組裝方法為將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊由一端依次黏附在PVC支撐板上，即可形成檢測β -銀環蛇毒素的試劑條，試劑條也可以裝入塑料卡中形成卡型包裝。
全文摘要
本發明屬于生物學免疫方法的測定技術領域，特別涉及一種β-銀環蛇毒素檢測試劑盒及其制備方法。試劑盒包括樣品墊(1)、膠體金墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸樣墊(4)和PVC支撐板(5)。膠體金墊為膠體金標記的β-銀環蛇毒素單克隆抗體聚酯膜，硝酸纖維素膜上依次包被了β-銀環蛇毒素單克隆抗體作為檢測線(T線)，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質控線(C線)。本發明采用膠體金免疫層析技術制備β-銀環蛇毒素檢測試劑盒，制備方法簡單，可用于檢測樣本中可能存在的β-銀環蛇毒素，具有使用方便、操作簡單、反應迅速、經濟實用等特點。
文檔編號G01N33/558GK102539766SQ201010610908
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者李峰, 楊利, 陳立柱 申請人:北京寶瑞源科技孵化有限公司